一种猪链球菌2型五基因缺失株及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于家畜传染病基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种猪链球菌2型五基 因缺失株及应用。
【背景技术】
[0002] 猪链球菌属革兰氏阳性菌，兼性厌氧，呈链状或成对存在，是一种重要的病原微生 物，按照荚膜抗原的不同，共分为35个血清型（1-34和1/2)，其中，猪链球菌2型被认为是 毒力最强、临床分离率最高的一种血清型（Wertheim HF et al.，Streptococcus suis:an emerging human pathogen. Clin Infect Dis 2009;48:617-25·)。能导致急性败血症及 一系列炎症，比如脑膜炎、关节炎、支气管炎、心内膜炎等。自从1954年首次被报道，目前为 止，猪链球菌致病的案例在30多个国家和地区均有发生，中国曾经有过多次猪链球菌病大 爆发，给养猪产业造成极大损失。猪链球菌在猪的呼吸道和扁桃体中具有很高的分离率， 致病的季节性不强，全年都有可能发生，且病死率极高，即使是妊娠母猪也可带菌，多见于 阴道和子宫，这将导致猪幼崽面临极大的感染风险。此外，自从1968年首次有报道人感染 猪链球菌导致脑膜炎，目前有不少于1600个人感染病例（Feng Y et al.，Streptococcus suis infection An emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases ? Virulence, 2014, 5(4) :477-497.)，主要症状有化脓性脑膜炎、耳聋、运动功能 紊乱等，更有甚者出现中毒休克样综合征，导致多脏器衰竭及死亡。人感染猪链球菌主要存 在于北欧及东南亚的国家，中国国土庞大人口众多，且喜食猪肉，对猪的需求量巨大，因此， 猪链球菌带来的危害也更大。
[0003] 与抗菌药物相比，通过接种疫苗防治猪链球菌病是当前公认的有效的、可持续发 展的方法。目前在临床上应用较多的是全菌灭活疫苗，但它存在一些瓶颈问题。第一，灭活 疫苗缺乏部分有效组分，免疫效果受限。已有文献报道病原菌的部分重要毒力因子在体外 培养时并不表达，只有在进入宿主体内才受到诱导表达，而这部分蛋白可能在感染过程中 发挥重要作用并且是重要的免疫原性蛋白。第二，灭活疫苗一般需要通过多次免疫才能获 得较好的免疫效果。第三，灭活疫苗中某些组分以及佐剂成分共同作用会导致动物产生全 身的或局部的不良反应。随着猪链球菌病流行的日益严重，针对猪链球菌尤其是影响与危 害最大的猪链球菌2型，制备一种新型、安全、有效的基因工程减毒活疫苗尤为重要。
[0004] 荚膜多糖（Capsular polysaccharide, CPS)是猪链球菌公认的毒力因子，在抵 抗免疫细胞的吞噬杀伤中发挥重要作用。学者们期望通过以猪链球菌荚膜缺失菌株研发 减毒活疫苗，然而Wisselink HJ等发现无荚膜的猪链球菌制备活疫苗诱导的抗体水平较 低，并且最后证明无荚膜菌株不能给猪提供保护力（Wisselink HJ et al.，Assessment of protective efficacy of live and killed vaccines based on a non-encapsulated mutant of Streptococcus suis serot ype 2. Vet Microbiol. 2002 ;84 (1-2):155-68.)〇 此外，由于荚膜良好的免疫原性和反应原性，已有多位学者建立了以猪链球菌荚膜多糖为 包被抗原的酶联免疫吸附方法（CPS-ELISA) (del Campo Sepiilveda EM et al.，Detection of antibodies against Streptococcus suis capsular type 2using a purified capsular polysaccharide antigen-based indirect ELISA. Vet Microb iol. 1996 ； 52(1-2) : 113-25.)，并且有公司生产了相应的酶联免疫吸附试剂盒。以上研究表明在猪链 球菌疫苗和检测试剂盒的研发中应该充分考虑猪链球菌荚膜多糖的重要性，破坏猪链球菌 的荚膜多糖将影响到疫苗的效果和在检测试剂盒中的应用。
[0005] 然而，早期发现与猪链球菌致病性密切相关的部分毒力因子，却显著影响荚膜 多糖的形成。例如：Li Μ和付忠琳等人发现SalK/R双组份系统的基因缺失株抵抗中性 粒细胞杀伤的能力和毒力显著降低，同时发现该菌株不能形成荚膜，证明双组分调控系 统SalK/R通过调控荚膜的形成来抵抗免疫细胞的吞噬杀伤（Li M et al.，SalK/SalR，a Two-Component Si gnal Transduction System, Is Essential for Full Virulence of Highly Invasive Streptococcus suis Serotype 2.PloS ONE,2008 ；3 (5):e2080.) (付忠琳等，2型猪链球菌双组分调控系统SalK/SalR抗吞噬机制的初步研究，细胞与 分子免疫学杂志，2013第（29)卷第（6)期570-573页）。有学者发现新型毒力因子 HP0197通过减少荚膜多糖的形成，降低猪链球菌的抗吞噬杀伤能力和致病力（Zhang A et al. , HP0197contributes to CPS synthesis and the virulence of Streptococcus suis via CcpA.PLoS 0ne，2012,7(ll):e50987)。综上所述，尽管以上毒力因子对应的基因缺失 株毒力显著降低，却导致猪链球菌的重要抗原一一荚膜多糖消失或含量降低，一定程度上 限制了这些基因缺失株在基因工程减毒疫苗上的进一步应用。此外，也限制了该类基因工 程缺失株在检测试剂盒中的应用。
[0006] 因此，获得一种能荚膜多糖正常表达的减毒菌株在猪链球菌基因工程减毒活疫苗 的研发中显得尤其重要。为实现以上目标，可通过设计并构建一种降低猪链球菌免疫逃逸 能力并且不影响猪链球菌荚膜多糖合成的减毒菌株实现，这也是本申请的重要创新点之 〇
[0007] 在宿主抵抗病原菌的感染中，中性粒细胞（Polymorphonuclear neutrophil)是 免疫系统抵抗感染的第一道防线。当病原入侵造成感染时，中性粒细胞可以迅速向感染部 位募集，对入侵的病原菌发挥吞杀伤和清除作用（Chabot-Roy G et al.，Phagocytosis and killing of St reptococcus suis by porcine neutrophils. Microb Pathog, 2006 ； 41 (1) :21-32.)。但是，猪链球菌具有免疫逃逸机制，能够逃避中性粒细胞的吞噬杀伤和清 除作用。因此，如果能通过基因工程的方法缺失猪链球菌免疫逃逸相关基因，减弱甚至消除 猪链球菌的免疫逃逸功能，不仅有助于宿主免疫系统在第一时间吞噬和清除猪链球菌，而 且有助于免疫细胞快速递呈相关抗原，激活宿主的获得性免疫系统，使宿主得到免疫保护 作用。经过研究和筛选，本研究通过缺失Sly、ScpA、SsnA、Fhb和SsadS 5个不影响猪链球 菌荚膜多糖形成的基因来减弱猪链球菌的免疫逃逸作用。5个基因的基本功能如下：
[0008] 猪链球菌溶血素（Sly)是很多毒力菌株生长过程中释放的一种分泌型蛋白，溶 血素基因以单拷贝形式存在。溶血素是胆固醇结合类细胞毒素，其活性能被还原剂活 化，被氧化剂和胆固醇抑制，被氧化剂抑制的活性遇到还原剂时可重新恢复。溶血素对 红细胞的裂解能力具有物种特异性，人的〇型红细胞对其最易感，其次是马、绵羊、牛、和 猪的红细胞。溶血素对不同的宿主细胞都具有细胞毒性，如不同的上皮细胞系、微血管 内皮细胞、巨噬细胞。溶血素在猪链球菌裂解和侵入寄主细胞的过程中起到了重要的 作用(He Z et al. , Increased production of suilysin contributes to invasive infection of the Streptococcus suis strain 05Z YH33. Molecular Medicine Reports, 2014, (10):2819-2826)〇
[0009] 猪链球菌中的C5a肽酶类似物（ScpA)被认为与脑膜炎有关，用重组的ScpA蛋白 刺激巨噬细胞，结果表明可以刺激巨噬细胞分泌细胞因子IL-1 β，IL-6, TNF-α，CXCL8and CCL5。而该蛋白灭活后仍然具有此功能，表明ScpA刺激巨噬细胞是通过非蛋白酶水解途 径。特定激酶抑制剂实验表明，ScpA可能是通过促分裂原活化蛋白激酶信号转到途径起 作用。有证据表明ScpA能够降解细胞因子CCL5。此外，ScpA能降解明胶，还可通过水解 纤维蛋白原的的Αα链来阻止凝血酶的纤维蛋白的形成，还表现出对脑微血管内皮细胞毒 性。缺少该基因后，猪链球菌在全血杀菌实验中表现出较高的敏感性，小鼠攻毒实验表明该 基因缺失对毒力有较大影响。（Kaqawa TF et al·，Model for substrate interactions in C5a pepti dase from Streptococcus pyogenes:A 1. 9 A crystal structure of the active form of ScpA. . Journal of Molecular Biology, 2008, 386 (3):754-772.)
[0010] 分泌型核酸酶（SsnA)不仅在猪链球菌2型中有表达，而且在致病性猪链球菌血清 型1-9都有表达。氨基酸序列分析发现，该核酸酶含有3个较为保守的序列，分别是一段编 码35个氨基酸的信号肽序列、一段编码22个氨基酸的DNA结合区域以及一段革兰氏阳性 菌细胞壁的特有基序。研究表明，SsnA在整个猪链球菌的生长过程中都表达。用SsnA制 备的抗血清能中和SsnA的活性。利用核酸电泳和Western印迹分析菌株SX332和它的缺 失株的亚细胞成分，表明Ssn