包括1995位c缺失的cyp2d6基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用的制作方法

包括1995位c缺失的cyp2d6基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物学领域，涉及CYP2D6等位基因第1995位的单碱基缺失突变，所述位点的碱基C缺失。具体地，本发明涉及包含该突变位点的核酸片段及其相应编码的蛋白质片段、鉴定所述突变位点的试剂、检测方法和该位点的应用，特别是鉴定该位点在指导用药中的应用。
【专利说明】包括1995位C缺失的CYP2D6基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物学领域，涉及CYP2D6等位基因第1995位的单碱基缺失突变。更具体地，本发明涉及包含该突变位点的核酸片段及其相应编码的蛋白质片段、鉴定所述突变位点的试剂、检测方法和鉴定该位点在指导用药中的应用。
【背景技术】
[0002]细胞色素P4502D6 (CYP2D6)是CYP酶家族重要的成员之一。其基因位于第22号染色体上，包括9个外显子，基因全长9432bp (GenBank注册号M33388，外显子区位于第1620-5909位，SEQ ID N0.24 ;基因编码序列见SEQ ID N0.25)。人体内该细胞色素的量只占肝脏酶总量的2%-4%，却参与临床上20%-30%药物的代谢，这样药物包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、镇痛药、止咳药、止吐药、抗糖尿病药及β受体阻滞药等，研究其代谢多态性具有十分重要的临床应用价值(参见参考文献I)。
[0003]CYP2D6基因具有高度多态性。目前为止，NCBI SNP数据库中已经收录了超过300个突变位点。由CYP450国际命名委员命名的等位基因也已有150多个，另外还有多种新发现的突变型尚未被命名(http://www.cypalleles.k1.se/cyp2d6.htm)。每个等位基因都不同程度涉及点突变、缺失、插入、重排等，从而影响CYP2D6的活性，进而影响对药物的代谢活性，产生不同程度的药物效应。除去野生型CYP2D6*1外，目前研究较多且临床意义较大的突变型主要包括以下7种:CYP2D6*2、*3、*4、*5、*10、*17、*41，其中人种分布最广、研究最多、中国 人群研究资料相对最丰富的突变型是CYP2D6*2 (28500T ;4180G>C)和CYP2D6*10 (IOOOT ；4180G>C)(参见参考文献 1、2、3)。
[0004]根据目前的临床研究显示，CYP2D6基因的这种多态性是造成CYP2D6酶活性在个体之间差异显著的主要原因，携带不同CYP2D6基因型的个体间可引起药物疗效的极大差异，甚至产生严重的药物毒副作用或治疗不充分。因此，研究CYP2D6基因多态性对药物疗效的影响将对临床合理用药提供重要的科学依据(参见参考文献3、4)。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供CYP2D6基因的新的单碱基突变位点，包含该突变位点的核酸片段、其编码的蛋白质片段及鉴定该突变位点在用药指导中的应用。
[0006]本发明的第一个方面是提供核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ ID N0.1的第1994位G和第1995位T的两个连续核苷酸，且是SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸；其中较野生型(SEQ ID N0.24)第1995位缺失I个碱基C，通过检测对应于SEQ ID N0.1的第1994位G和第1995位T的两个连续核苷酸可间接反映该缺失碱基C ;或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID N0.2的第653位G和第654位T的两个连续核苷酸，且是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸；其中较野生型(SEQ ID N0.25)第654位缺失I个碱基C，通过检测对应于SEQ ID N0.2的第653位G和第654位T的两个连续核苷酸可间接反映该缺失碱基C ;或者所述核酸片段为上述核酸片段的反向互补序列。
[0007]本发明的第二个方面是提供与含有对应于SEQ ID N0.1的第1994位G和第1995位T的两个连续核苷酸或对应于SEQ ID N0.2的第653位G和第654位T的两个连续核苷酸的等位基因片段或其反向互补序列全部或部分杂交的等位基因特异性寡核苷酸，所述等位基因片段是SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其反向互补序列。[0008]本发明的第三个方面是提供用于检测和/或分析本发明的单碱基缺失突变的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的核酸片段或等位基因特异性寡核苷酸，或包含能够作为引物扩增对应于SEQ ID N0.24的第1995位或SEQ ID N0.25的第654位的核苷酸但不包含该核苷酸的核酸片段。
[0009]本发明的第四个方面是提供本发明的核酸片段或寡核苷酸在检测CYP2D6基因突变中的应用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针或引物；或者本发明的核酸片段或寡核苷酸用于制备检测CYP2D6基因突变的药物的应用；或者本发明的核酸片段或寡核苷酸用作检测CYP2D6基因突变的检验标志物的应用。
[0010]本发明的第五个方面是提供一种用药指导，包括检测待测样品中CYP2D6基因的对应于SEQ ID N0.24的第1995位或SEQ ID N0.25的第654位的碱基C是否缺失，根据检测到的突变，调整由CYP2D6代谢的药物的给药量。
[0011 ] 本发明的第六个方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID N0.24的序列的核酸中对应于第1995位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID N0.25的序列的核酸中对应于第654位的核苷酸。当该位置碱基C缺失时，分别对应于SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2序列中的核苷酸。
[0012]本发明的第七个方面是提供CYP2D6蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQID N0.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID N0.3的第220位-223位氨基酸，并且为SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。
[0013]本发明提供了包含新的单碱基突变的CYP2D6基因和编码序列。该基因在对应于SEQ ID N0.24的第1995位或SEQ ID N0.25的第654位的碱基C缺失，致使翻译时从第218个密码子开始发生移码突变，导致编码的蛋白质与野生型相比从第220位开始生成序列完全不同的氨基酸残基，并在第224位时终止，即，该突变的基因编码的蛋白质序列仅包含223个氨基酸(正常的CYP2D6蛋白有497个氨基酸)。该突变的CYP2D6蛋白(命名为218FS或CYP2D6.92)对药物的代谢活性与野生型相比明显降低，几乎为零。该单碱基突变对携带此突变位点的个体的用药具有重要指导意义。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1是实施例1中的对应于本发明的SEQ ID N0.1序列的杂合子携带者测序图谱，其中箭头所指为CYP2D6基因第1995位核苷酸；
[0015]图2是实施例2构建的双基因表达载体pIRES-Gluc-2D6的结构示意图谱；
[0016]图3是实施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突变体)、CYP2D6.10(缺陷型突变体)和本发明的CYP2D6.92蛋白针对右美沙芬及丁呋洛尔的代谢能力检测结果，其中*表示P值〈0.05 ；
[0017]图4是实施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突变体)、CYP2D6.10(缺陷型突变体)和本发明的CYP2D6.92蛋白针对右美沙芬代谢的典型LC-MS/MS检测图谱；箭头所指处分别为底物右美沙芬(右)及其代谢产物去甲基右美沙芬(左)的信号峰；其中横坐标表示保留时间，右美沙芬和去甲基右美沙芬的保留时间分别为7.5和4.8分钟，纵坐标表不信号响应值Cps ;
[0018]图5是实施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突变体)、CYP2D6.10(缺陷型突变体)和本发明的CYP2D6.92蛋白针对丁呋洛尔代谢的典型LC-MS/MS检测图谱；箭头所指处分别为底物丁呋洛尔(右)及其代谢产物I’-羟基丁呋洛尔(左)的信号峰；其中横坐标表示保留时间，丁呋洛尔和羟基丁呋洛尔的保留时间分别为6.9和5.1分钟，纵坐标表不信号响应值cps。
【具体实施方式】
[0019]通过下述【具体实施方式】说明本发明，但本
【发明内容】
不限于此。
[0020]如无其它说明，本发明的“核酸片段”由核苷酸或其类似物组成，可以是DNA、RNA或其类似物的片段；可以是单链或双链；可以是天然的(如基因组的)或合成的。
[0021]本发明中，“突变”指在检测的基因，即CYP2D6基因中存在与野生型CYP2D6基因序列不同的核苷酸位点。“突变位点”指碱基发生突变的位置。在本发明中，所述突变位点是对应于SEQ ID N0.24所示序列的第1995位或SEQ ID N0.25所示序列中的第654位，该位点碱基C缺失。
[0022]国际P450等位基因命名委员会关于CYP2D6等位基因命名规则中规定:以CYP2D6基因组DNA参考序列(GenBank注册号M33388)中起始密码子ATG的第一个碱基A作为CYP2D6等位基因的第I位(起始密码子的第一个碱基A位于M33388序列的第1620位)，则本发明确定的突变点位于CYP2D6等位基因的第1995位。
[0023]本
【发明内容】
涉及CYP2D6基因的非同义突变。由于该突变位点位于基因的编码序列中，因此，本领域技术人员可知，所述突变位点既可以在基因组DNA中表现，也可以在编码序列(即CDS)中表现。本领域技术人员根据待检测样品，可以在基因组DNA或mRNA水平上对该突变位点进行检测。本申请中，SEQ ID N0.24是以国际P450等位基因命名委员会的规定定义的CYP2D6等位基因序列，其中第1995位是本发明涉及的突变位点。SEQ IDN0.25是CYP2D6基因的cDNA序列，其中第654位是本发明涉及的突变位点。SEQ ID N0.1是SEQ ID N0.24缺失了第1995位碱基C后的序列，SEQ ID N0.2是SEQ ID N0.25缺失了第654位碱基C后的cDNA序列，其编码产物SEQ ID N0.3仅包含223个氨基酸，该编码产物被命名为218FS或CYP2D6.92。
[0024]本领域技术人员可知，在本文中，对应于SEQ ID N0.24的第1995位位点和对应于SEQ ID N0.25的第654位位点同义互用。同理，对应于SEQ ID N0.1的第1994位位点和对应于SEQ ID N0.2的第653位位点同义互用，对应于SEQ ID N0.1的第1995位位点和对应于SEQ ID N0.2的第654位位点同义互用。
[0025]在本发明中，“等位基因特异性”指特异地与等位基因杂交，如在严谨条件下进行杂交，使得鉴定对应于SEQ ID N0.24所示序列的第1995位或SEQ ID N0.25所示序列的第654位碱基C缺失。
[0026]本发明中，核苷酸和氨基酸的缩写采用本领域公知的缩写方式，如核苷酸中A表示腺嘌呤，G表示鸟嘌呤，C表示胞嘧啶，T表示胸腺嘧啶。氨基酸中，A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬酰胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，Q表示谷氨酰胺，E表示谷氨酸，G表示甘氨酸，H表示组氨酸，I表示异亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示赖氨酸，M表示蛋氨酸，F表不苯丙氨酸,P表不脯氨酸，S表不丝氨酸,T表不苏氨酸，W表不色氨酸，Y表不酪氨酸，V表示缬氨酸。
[0027]本发明的内容是基于CYP2D6基因的新的单碱基突变位点。所述突变位点是位于CYP2D6基因的编码区内，对应于SEQ ID N0.25的第654位，该位点的碱基C缺失，造成从第218位密码子开始发生移码突变；此外，由该突变的CYP2D6基因编码的蛋白与野生型相比从第220位开始发生变化，并仅有223个氨基酸(命名为218FS或CYP2D6.92)。
[0028]在第一个方面，本发明提供核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ ID N0.1的第1994位G和1995位T的两个连续核苷酸，且是SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸；其中较野生型(SEQ ID N0.24)第1995位缺失I个碱基C，通过检测对应于SEQ ID N0.1的第1994位G和第1995位T的两个连续核苷酸，可间接反映对应于SEQ IDN0.24的第1995位碱基C的缺失；或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID N0.2的第653位G和654位T的两个连续核苷酸，且是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸；其中较野生型(SEQ ID N0.25)第654位缺失I个碱基C，通过检测对应于SEQ IDN0.2的第653位G和第654位T的两个连续核苷酸，可间接反映对应于SEQ ID N0.25的第654位碱基C的缺失；或者为上述核酸片段的反向互补序列。
[0029]在一种实施方式中，所述核酸片段的长度可以是如10-100、101-200、201-500或501-1000个核苷酸。优选地，所述核酸片段的长度是10-20、21-30、31-40、41-50、51-60、61-100或101-300个核苷酸。
[0030]所述两个连续核苷酸可以位于所述核酸片段的任何位置。
[0031]在另一种实施方式中，所述核酸片段是SEQ ID N0.1所示的序列。
[0032]在另一种实施方式中，所述核酸片段是SEQ ID N0.2所示的序列。
[0033]在其它实施方式中，所述核酸片段可以是SEQ ID N0.14-18所示的序列。
[0034]本发明的第二个方面是提供与含有对应于SEQ ID N0.1的第1994位G和1995位T的两个连续核苷酸或对应于SEQ ID N0.2的第653位G和654位T的两个连续核苷酸的等位基因片段或其反向互补序列全部或部分杂交的等位基因特异性寡核苷酸，所述等位基因片段是SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其反向互补序列。
[0035]在一种实施方式中，所述的寡核苷酸用作探针。所述探针能够在严谨条件下与包含所述两个连续核苷酸的靶序列特异性杂交。本领域技术人员已知，所述探针不需要与靶序列完全互补，只要能与靶序列特异杂交即可。在优选的实施方案中，所述杂交条件可以满足使探针仅与靶序列特异性杂交。所述探针的长度可以是5-100个核苷酸，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。所述两个连续核苷酸对应位点可以出现在探针的任何位置。在优选的实施方式中，所述两个连续核苷酸对应位点出现在探针序列的中心或大约中心处。
[0036]在另一种实施方式中，所述寡核苷酸用作指导DNA合成的引物，如本领域公知的测序引物或合成引物等。所述引物不需要与模板完全互补，但应当与模板互补杂交以指导DNA合成。所述引物的长度可以是15-40个核苷酸长度，优选地为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。所述两个连续核苷酸的对应位点可以出现在所述引物的任何位置；优选地，出现在所述引物的3’末端。
[0037]在一些优选的实施方式中，所述寡核苷酸是如SEQ ID N0.19_23所示的序列。
[0038]基于此，本发明的第三个方面是提供用于检测和/或分析碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的核酸片段或等位基因特异性寡核苷酸，或包含能够作为引物扩增对应于SEQ ID N0.24的第1995位或SEQ ID N0.25的第654位的核苷酸但不包含该核苷酸的核酸片段。优选地，所述试剂盒包含SEQ ID N0.4和/或SEQ ID N0.5和/或SEQ IDN0.10所示的序列片段。
[0039]本发明的第四个方面是提供本发明的核酸片段或寡核苷酸用于检测CYP2D6基因突变的应用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针或引物；或者本发明的核酸片段或寡核苷酸用于制备检测CYP2D6基因突变的药物的应用；或者本发明的核酸片段或寡核苷酸用作检测CYP2D6基因突变的检验标志物的应用。
[0040]本发明的第五个方面是提供用药指导，包括检测待测样品中CYP2D6基因的对应于SEQ ID N0.24的第1995位或SEQ ID N0.25的第654位的核苷酸。当检测到所述位点的碱基C缺失时，相对应地调整经CYP2D6代谢的药物的给药量。在具体的实施例中，当CYP2D6基因在SEQ ID N0.25的第654位的碱基C缺失时，该基因编码的CYP2D6蛋白酶活性下降，故需要调整经CYP2D6代 谢的药物的给药量，如下调给药量。
[0041]本发明中所述的经CYP2D6代谢的药物包括:β受体阻滞剂，普萘洛尔、美托洛尔、烯丙洛尔、丁呋洛尔、噻吗洛尔、布尼洛尔、卡维地洛、阿普洛尔、奈必洛尔；抗心律失常药，英卡胺、司巴丁、氟卡胺、普罗帕酮、阿普林定、美西律、恩卡胺、普鲁卡因胺；抗高血压药，异喹胍、吲哚拉明；抗心绞痛，哌克昔林、特罗地林；镇痛药，曲马多；抗精神药，氯丙嗪、奋乃静、氟哌啶醇、利培酮、硫利达嗪、珠氯噻醇、阿立哌唑；三环类抗抑郁药，阿米替林、丙咪嗪、氯丙咪嗪、地昔帕明、去甲替林；其他抗抑郁药，氟西汀、帕罗西汀、文拉法辛、氟伏沙明、阿米夫胺、米安色林、溴法罗明、马普替林、托莫西汀、苯丙胺、西酞普兰、氟戊肟胺、米那普林、度洛西汀、吗氯贝胺；止咳平喘药，双氢可待因、乙基吗啡、可待因、右美沙芬；抗糖尿病药，苯乙双胍；其他，扑尔敏、甲氧氯普胺、阿托西汀、右旋芬氟拉明、昂丹司琼、安非他命、利多卡因、奥坦西隆、非那西丁、三苯氯胺、右芬氟拉明、异丙嗪。
[0042]本发明的第六个方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID N0.24的序列的核酸中对应于第1995位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID N0.25的序列的核酸中对应于第654位的核苷酸。
[0043]在一种实施方式中，所述方法可以是限制性片段长度多态性分析(RFLP)。本领域技术人员可以根据本
【发明内容】
设计实验以分析SEQ ID N0.24的序列的核酸中的第1995位的碱基C或SEQ ID N0.25的序列的核酸中的第654位的碱基C是否缺失。
[0044]在另一种实施方式中，所述方法可以是测序法，包括分离并测定来自基因组DNA或RNA的核酸序列，分析其中包含对应于SEQ ID N0.24的序列的核酸中的对应于第1995位的核苷酸或包含对应于SEQ ID N0.25的序列的核酸中的对应于第654位的碱基C是否缺失。测序法可以是本领域已知的任何可用的测序方法。测序引物可以根据本领域技术人员的常识进行设计，如在待检测位点的上下游适当位置处设计引物，以扩展包含该待测位点的片段，从而判断该位点的核苷酸。也可以采用本发明的寡核苷酸作为引物序列。
[0045]在另一种实施方式中，所述方法是利用探针杂交的方法，特异性地鉴定检测样品中包含对应于SEQ ID N0.24的序列的核酸中的对应于第1995位的碱基C或包含对应于SEQ ID N0.25的序列的核酸中对应于第654位的碱基C是否缺失；所述方法中采用的探针是本发明的寡核苷酸。例如，从待测样品中分离出核酸，在允许探针与核酸中可能存在的特异性靶序列杂交的条件下使探针与核酸接触；可被检测的杂交可以通过使用由可检测的试剂标记过的探针来实现；例如，用放射性同位素、荧光染料或能催化形成可检测产物的酶来标记探针。标记探针、用标记探针检测样品中是否存在靶序列的方法都是本领域技术人员所熟知的。
[0046]在一种具体的实施方式中，提供以Taqman探针SNP检测法检测对应于SEQ IDN0.24的第1995位的核苷酸的方法，包括:
[0047]I)设计引物用于特异性扩增包含对应于SEQ ID N0.24的第1995位的PCR产物，同时设计两条Taqman-MGB探针，分 别针对对应于SEQ ID N0.24的第1995位的C和对应于SEQ ID N0.1的缺失型等位基因。
[0048]引物设计原则为:
[0049](I)序列选取应在基因的保守区段；
[0050](2)避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；
[0051](3)引物长度在18到24个核苷酸；
[0052](4) Tm 值在 55-65°C，GC 含量在 40%_60% ；
[0053](5 )引物之间的Tm值相差避免超过2 V ；
[0054](6)引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的喊基；
[0055](7) PCR 扩增片段长度在 50bp — 150bp ；
[0056](8)引物末端最后5个核苷酸不能有超过2个的G和C。
[0057]Taqman MGB探针设计原则为:
[0058](I)探针的5’端避免出现G ;
[0059](2) Tm 值应为 65-67O ；
[0060](3)尽量缩短Taqman MGB探针,但探针长度不少于13bp ；
[0061](4)尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，避免出现4个或4个以上的G重复出现；
[0062](5)将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。
[0063]荧光基团可以采用FAM、VIC等来标记两个等位基因。
[0064]2)利用上述引物和探针，对待测样本进行实时定量PCR。
[0065]PCR条件:95°C预变性10分钟后进入30个扩增循环:92°C变性12秒，60°C退火及延伸I分钟(此阶段检测荧光信号)。[0066]3)数据分析。
[0067]分析实验结果，根据样本两种荧光的强弱判定待测样本CYP2D6基因是否存在1995位C缺失突变。
[0068]本发明中，所述样品可以是任何包含核酸的样品，如血液；优选所述样品来自于人。所述核酸可以是DNA或编码RNA，优选为基因组DNA。本发明的分析核酸的方法可以以DNA或RNA为目标物。本领域技术人员可知，当以DNA为检测目标物时，分析待测样品中的包含对应于SEQ ID N0.24的序列的核酸中对应于第1995位的核苷酸，所使用的探针或引物根据SEQ ID N0.24的序列设计；当以RNA为检测目标物时，分析待测样品中的包含对应于SEQ ID N0.25的序列的核酸中对应于第654位的核苷酸，所使用的探针或引物根据SEQID N0.25的序列设计。
[0069]本发明的第七个方面是提供CYP2D6蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQID N0.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID N0.3的第220-223位氨基酸，且为SEQ ID N0.3所示氨基酸序列的至少10个连续氨基酸，如10_20、21_50或51-100个
氨基酸。
[0070]下面将通过具体的实施例进一步说明本发明，但以下具体的实施例仅出于示例性的目的。
[0071]实施例1:人CYP2D6基因新的突变位点的鉴定
[0072]本实施例中，采集汉族正常健康人群血液样本，提取血液中的基因组DNA，设计测序引物对CYP2D6基因的9个 外显子进行序列扩增、测序，分析其CYP2D6基因是否存在突变位点。
[0073]I)提取 DNA:
[0074]从被测者采取5ml静脉EDTA抗凝血液样本；然后按照普通盐析法和/或采用专门的DNA提取试剂盒(购自美国Omega公司的DNA提取试剂盒)提取待测血样的基因组DNA。
[0075]2) PCR 扩增:
[0076]设计扩增引物，对获得的基因组DNA样品中CYP2D6基因的9个外显子序列进行扩增。所述扩增引物对序列见表I。
[0077]采用30yL PCR反应体系，包括:I XGC PCR缓冲液、1.5mM MgCl2、IOOng的基因组DNA、上下游引物均为0.2 μ M、dNTP为0.2mM,TaKaRa公司的LATaq DNA聚合酶1.5U。使用美国ABI公司的GeneAmp PCR System9700扩增仪扩增。PCR扩增循环参数如下:94°C预变性2分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，68°C延伸3分钟，35个循环后再延伸3分钟。引物序列信息见表I。
[0078]表1:扩增引物对序列信息
[0079]
【权利要求】
1.核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQID N0.1的第1994位G和第1995位T的两个连续核苷酸，且是SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸；或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID N0.2的第653位G和第654位T的两个连续核苷酸，且是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸；或者为上述核酸片段的反向互补序列。
2.根据权利要求1所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的长度是10-100、101-200,201-500或501-1000个核苷酸；优选地，所述核酸片段的长度是10_20、21_30、31-40,41-50,51-60,61-100或101-300个核苷酸；进一步优选地，所述核酸片段是SEQ IDN0.1、2、14-18所示的序列。
3.等位基因特异性寡核苷酸，所述寡核苷酸与含有对应于SEQID N0.1的第1994位G和第1995位T的两个连续核苷酸或对应于SEQ ID N0.2的第653位G和第654位T的两个连续核苷酸的等位基因片段或其反向互补序列全部或部分杂交；所述等位基因片段是SEQID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其反向互补序列。
4.根据权利要求3所述的等位基因特异性寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸是探针或引物；优选地，当所述寡核苷酸是探针时，所述寡核苷酸的长度是5-100个核苷酸；当所述寡核苷酸是引物时，所述寡核苷酸的长度是15-40个核苷酸；优选地，当所述寡核苷酸是探针时，所述两个连续核苷酸位于探针序列的中心或大约中心处；当所述寡核苷酸是引物时，所述两个连续核苷酸位于引物的3’末端。
5.根据权利要求 4所述的等位基因特异性寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸是如SEQ ID N0.19-23所示的序列。
6.一种用于检测和/或分析单碱基缺失突变的试剂盒，包括根据权利要求1或2所述的核酸片段或根据权利要求3-5任一项所述的等位基因特异性寡核苷酸，或包含能够作为引物扩增对应于SEQ ID N0.24的第1995位或SEQ ID N0.25的第654位的核苷酸但不包含该核苷酸的核酸片段；优选地，所述试剂盒包含SEQ ID N0.4和/或SEQ ID N0.5和/或SEQ ID N0.10所示的序列片段。
7.根据权利要求1或2所述的核酸片段或根据权利要求3-5任一项所述的等位基因特异性寡核苷酸在检测CYP2D6基因突变中的应用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针或引物；或者在制备检测CYP2D6基因突变的药物中的应用；或者用作检测CYP2D6基因突变的检验标志物的应用。
8.一种用药指导，包括检测待测样品中CYP2D6基因的对应于SEQ ID N0.24的第1995位或SEQ ID N0.25的第654位的核苷酸，当所述位点的碱基C缺失时，调整经CYP2D6代谢的药物的给药量。
9.一种分析核酸的方法，所述方法包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID N0.24的序列的核酸中对应于第1995位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID N0.25的序列的核酸中对应于第654位的核苷酸；优选地，所述方法是测序法、限制性片段长度多态性分析或探针杂交法。
10.CYP2D6蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQ ID N0.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID N0.3的第220位-223位氨基酸，且为SEQ ID N0.3所示的C末端氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。
【文档编号】C12N15/53GK103451213SQ201310404385
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】蔡剑平, 胡国新, 戴大鹏, 耿培武, 蔡杰 申请人:蔡剑平