专利名称：基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种诊断地中海贫血的方法，特别涉及一种基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用。
背景技术：
地中海贫血(简称地贫)是世界上最常见的人类单基因遗传性血液病，是一组由于珠蛋白基因缺失或点突变，使血红蛋白中珠蛋白肽链合成减少或不能合成所致的遗传性溶血性贫血。本病主要见于西自地中海沿岸，中经土耳其、中东各国，东至和东南亚各国和我国南部。我国长江以南各省发病率最高，其中以广东、广西、四川、云南、海南、香港、台湾多见。根据本病缺乏的珠蛋白链的种类及缺乏程度给以命名和分类，分为α、β等几种类型，其中以α、β地中海贫血最多见，也最严重。本病由于珠蛋白缺失的多样性，所致缺乏的珠蛋白链的类型、数量不一，临床表现呈多样性，轻重程度也不同，有在胎儿及婴幼儿即因极重的溶血性贫血致死的，也有需要反复输血进行治疗，也有虽有血红蛋白异常而一生无任何临床症状的。目前该病尚无有效的治疗方法，且一股的治疗费用昂贵，给患者及家庭带来巨大的经济负担和精神痛苦。因此遗传咨询、产前诊断以及在我国南方开展大人群的分子筛查是防治该疾病的首要途径，对控制重型地贫患儿的出生，提高出生人口素质具有重要意义。随着对地中海贫血的研究的深入，临床上各种地贫表型的分子基础也逐步地被人们认识。目前全世界已报道的珠蛋白基因突变类型有1000多种(http://gl0bin. cse. psu. edu/hbvar/)。其中α -地中海贫血主要是缺失突变，也有少数的非缺失型突变。在中国人群中常见的α-地中海贫血缺失型突变是α基因上的-α 3. 7、-α 4. 2和-SEA三种片段缺失；常见的α-地中海贫血非缺失型点突变主要为Hb CS, Hb QS和HbWS三种。β-地中海贫血的基因突变大多数属于非缺失型，是由于β基因点突变造成珠蛋白合成异常。 β-地中海贫血突变位点较多。这些突变具有种族特异性，各个种族都有几种常见的突变类型。中国大陆人群常见的突变频率较高的突变类型有十几种，其中常见突变位点有8个，大约占中国大陆人群突变发生频率的90%以上(如表1和2所示)。表1中国人群β珠蛋白基因常见8个突变位点
权利要求
1. 一种基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)设计PCR引物和探针序列，在与探针互补的链的PCR引物的5’端进行生物素修饰 PCR引物序列如下SEAFor 5，-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’ ；SEARev 5，-CCAAGCCCACGTTGTGTTCATG-3‘；αFor:5'-CCCCTCGCCAAGTCCACC-3‘；α‘Rev:5'-TCAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3‘；α4-! For:5'-CAGTTTACCCATGTGGTGCCT-3‘；α4-! Rev:5'-CCCGTTGGATCTTCTCATTTCC-3’ ；α 2For 5，-CACAGTGAACCACGACCTCTA-3，；α 2Rev 5，-CACAGAAGCCAGGAACTTGTC-3‘；α -M For:5’ -CTCTTCTCTGCACAGCTCCTAA-3‘；α -M Rev:5’ -CTGCCCACTCAGACTTTATTCAAA-3β -Ml For 5‘ -CCAATCTACTCCCAGGAGCAG-3，； β -Ml Rev :5， -TGAGGTTGTCCAGGTGAGC-3’ ； β -Μ2 For 5‘ -CCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAAT-3，； β -Μ2 Rev 5' -GCAGAATGGTAGCTGGATTGTAG-3’ ； 探针序列如下，探针5’末端进行Aminolinker C12修饰α-mutI(N)5-GCGGTGCACGCCTCCC-3’ ；α-mutI(M)5-TGCGGTGCAGGCCTCCC-3，；α-mut2 (N)5-CACGCCTCCCTGGACAAGTTC-3’α-mut2 (M)5-CACGCCTCCCCGGACAAGTT-3’α-mut3 (N)5-GCAAATACCGTTAAGCTGGAGCC-3α-mut3 (M)5-GCAAATACCGTCAAGCTGGAGC-3yα-delSEA5，-TGACGCTGTCTGCTTAAGGCCC-3’α-del4. 25，-CATGCCTGTAAACCCACCTACT-3’α-del3. 75，-TGGAGGAGGGAAAGTGGAGCCA-3，α2 :5，-CCGCGCAGGCCCCGCCCGGGAC-3，；β-mutI(N)5-CAGGGCTGGGCATAAAAGTCA-3’β-mutI(M)5-CCAGGGCTGGGAATAAAAGTCA-3yβ-mut2 (N)5-GGGCTGGGCATAAAAGTCAGG-3’β-mut2 (M)5-GGCTGGGCACAAAAGTCAGG-3’β-mut3 (N)5-GGCTGGGCATAAAAGTCAGGG-3’β-mut3 (M)5-GCTGGGCATGAAAGTCAGGG-3’β-mut4 (N)5-GCTGGGCATAAAAGTCAGGGC-3’β-mut4 (M)5-CTGGGCATAGAAGTCAGGGCA-3’β-mut5 (N)5-CTAGCAACCTCAAACAGACACCA-3β-mut5 (M)5-CACTAGCAACCTCAGACACCATG-3β-mut6 (N)5-ACAGACACCATGGTGCATCTG-3'β-mut6 (M)5，-ACAGACACCAGGGTGCATCT-3，；β-mut7 (N)5，-TACTGCCCTGTGGGGCAAG-3，；β-mut7 (M)5，-TACTGCCCTGGTGGGGCA-3‘；β-mut8 (N)5，-CTGTGGGGCAAGGTGAACG-3‘；β-mut8 (M)5，-CTGTGGGGCTAGGTGAACG-3‘；β-mut9 (N)5，-AGTTGGTGGTGAGGCCCTG-3，；β-mut9 (M)5，-AGTTGGTGGTAAGGCCCTGG-3‘；β-mutIO(N)5-GTGGTGAGGCCCTGGGC-3‘；β-mutIO(M)5-TGGTGAGGCCCCTGGGC-3，；β-mutIl(N)5-CCCTGGGCAGGTTGGTATCAA-3‘；β-mutIl(M)5-CCCTGGGCAGTTTGGTATCAAG-3‘；β-mut12 (N)5-TGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTA-3‘；β-mut12 (M)5-TGGGCAGGTTGCTATCAAGGTTA-3‘；β-mut13 (N)5-ACCCTTAGGCTGCTGGTGG-3，；β-mut13 (M)5-CACCCTTAGGTGCTGGTGGT-3‘；β-mut14 (N)5-ACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTT-3‘；β-mut14 (M)5-GGACCCAGAGGTTGAGTCCTTT-3’ ；β-mut15 (N)5-GAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGG-3’ ；β-mut15 (M)5-GAGGTTCTTTTAGTCCTTTGGGGA-3‘；β-mut16 (N)5-CGGTGCCTTTAGTGATGGCC-3’ ；β-mut16 (M)5-CGGTGCCTTTAAGTGATGGCC-3’ ；β-mut17 (N)5-CTGGGTTAAGGCAATAGCAATATC-3’ ；β-mut17 (M)5-CTGGGTTAAGGTAATAGCAATATCTC-3N表示正常探针，M表示突变探针；(2)液相芯片的制备将荧光编码微球与步骤(1)中所述的探针分别偶联，然后根据检测目的将偶联好探针的荧光编码微球混合，得到液相芯片；(3)标本检测从标本中提取基因组DNA，根据检测目的选择步骤(1)中所述的PCR引物分别进行缺失型突变的α珠蛋白基因片段和非缺失型突变的α、β珠蛋白基因片段扩增，分别得到缺失型突变的α珠蛋白基因片段的PCR扩增产物和非缺失型突变的α、β珠蛋白基因片段的 PCR扩增产物；接着将两种PCR扩增产物混合后与步骤( 得到的液相芯片进行杂交，得到杂交产物；再用藻红蛋白对杂交产物进行标记，通过液相芯片检测仪读出检测结果。
2.根据权利要求1所述的基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法，其特征在于所述的荧光编码微球为MicroPlex 微球。
3.根据权利要求1所述的基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法，其特征在于所述的偶联好探针的荧光编码微球通过如下步骤进行制备将荧光编码的微球与0. 1Μ、ρΗ值 4. 5的2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液，混勻，得到偶联体系；接着在偶联体系中加入探针和二氯乙烷，避光反应，得到偶联好探针的荧光编码微球。
4.根据权利要求3所述的基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法，其特征在于所述的偶联好探针的荧光编码微球通过如下步骤进行制备将荧光编码的微球与0. 1Μ、ρΗ值 4. 5的2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液，混勻，得到偶联体系；接着在偶联体系中加入探针和二氯乙烷，避光反应30min ；再加入二氯乙烷再次进行避光反应30min ；探针在偶联体系中的终浓度为0. 02mM，二氯乙烷在偶联体系中的终浓度为0.8 lmg/ml ；接着用吐温_20溶液和十二烷基硫酸钠溶液洗涤，得到偶联好探针的荧光编码微球。
5.根据权利要求4所述的基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法，其特征在于所述的吐温-20溶液的浓度为体积百分比0. 02% ；所述的十二烷基硫酸钠溶液的浓度为质量体积比0. 1%。
6.根据权利要求1所述的基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法，其特征在于 步骤(3)中所述的非缺失型突变的α、β珠蛋白基因片段的扩增条件为95°C 10分钟；(95 °C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 30 秒)X 45 次循环；72°C 10 分钟；所述的缺失型突变的α珠蛋白基因片段的扩增条件为95°C 10分钟；(95°C45秒、 600C 1分15秒、72°C 2分30秒)X 30次循环；72°C 10分钟；步骤(3)中所述的杂交的反应条件为95°C变性5min后，55°C杂交15min ； 步骤(3)中所述的藻红蛋白为链霉亲和素R-藻红蛋白；步骤(3)中所述的液相芯片检测仪为Luminex液相芯片检测仪，参数设置为CoimtlOO ； Doublet Discriminator Gate Value 为 5437-24807。
7.实现权利要求1 6任一项所述的基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的PCR引物、权利要求1所述的探针和荧光编码微球。
8.根据权利要求7所述的基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括PCR引物和液相芯片，液相芯片为权利要求7中所述的探针分别与不同颜色的荧光编码微球偶联后得到的44种偶联好探针的荧光编码微球混合得到。
9.根据权利要求8所述的基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法的试剂盒，其特征在于所述的液相芯片为将44种偶联好探针的荧光编码微球分散在1. 5XTMAC杂交液得到，每种偶联好探针的荧光编码微球的浓度为100个/μ 1。
10.权利要求9所述的基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法的试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤(I)PCR扩增根据检测目的，选择PCR引物分别进行PCR，得到PCR扩增产物；其中 缺失型α-地中海贫血检测的引物选择为α 37For和α 3_ 7Rev检测-α 3. 7缺失型突变；α 42For和α 42Rev检测-α 4. 2缺失型突变；SEA For和SEA Rev检测-SEA缺失型突变；α 2For和α 2Rev检测正常α 2珠蛋白基因；非缺失型α、β -地中海贫血检测的引物选择为β -Ml For, β -Ml Rev、β _M2 For和 β-Μ2 Rev共同检测β地中海贫血非缺失型突变；α-M For和α-M Rev检测的是非缺失型α-地中海贫血点突变Hb CS、Hb QS和Hb WS ；空白对照用无菌水代替标本基因组DNA进行PCR反应；非缺失型突变的α、β珠蛋白基因片段PCR扩增条件为95°C 10分钟；(95°C 30秒、 55 0C 30 秒、72°C 30 秒)X 45 次循环；72°C 10 分钟；缺失型突变的α珠蛋白基因片段PCR扩增条件为95°C 10分钟；(95°C 45秒、60°C 1 分15秒、72°C 2分30秒)X 30次循环；72°C 10分钟；(2)杂交杂交反应体系由如下组成33μ 1液相芯片，7μ 1 pH8. 0的1ΧΤΕ，10μ 1 PCR产物混合物；杂交程序为95°C 5min，55°C 15min，循环1次，加入25 μ 1 IX TMAC杂交液稀释的 0.04 yg链霉亲和素R-藻红蛋白，混勻，55°C 5min ；(3)上机检测使用Luminex液相芯片检测仪，参数设置为Count100 ； DoubletDiscriminator Gate Value 为 5437-24807，通过 Luminex 附带 XPonent 3. 1 数据收集软件检测突变探针和正常探针的荧光强度比值分析判断；判断标准如下①非缺失型突变判读标准A、正常标本各位点相应的突变探针和正常探针比值< 0. 5，各位点相应的正常探针和空白对照正常探针比值彡3;B、突变杂合标本有突变的基因位点相应的突变探针和正常探针比值0. 5彡(M/N)彡1. 5，无突变的基因位点相应的突变探针和正常探针比值< 0. 5，各位点相应的正常探针和空白对照正常探针比值彡3 ；C、突变纯合标本有突变的基因位点相应的突变探针和正常探针比值> 2，无突变的基因位点相应的突变探针和正常探针比值< 0. 5，各位点相应的正常探针和空白对照正常探针比值> 3 ；D、突变探针和正常探针比值不在上述判断标准范围内的标本的突变类型可疑，需进一步确证；②α-地中海贫血缺失型突变判读标准检测α -地贫缺失型突变的探针有4种α -del SEA、α -del 4. 2、α -del 3. 7和α 2， 它们的信号值与相应空白对照比值> 3判读为阳性，信号值与相应空白对照比值< 3为阴性；Α、正常标本α 2探针为阳性，其它3种探针均为阴性；B、杂合型缺失α 2探针为阳性，其它3种探针有一个为阳性，即为该探针的杂合型缺失；C、纯合型缺失α 2探针为阴性，其它3种探针有一个为阳性，即为该探针的纯合型缺失；D、同时两种缺失类型α 2探针为阴性，其它探针中有2种探针为阳性，即发生了两种类型的缺失。
全文摘要
本发明公开了一种基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用。本发明设计出用于检测α、β地中海贫血基因缺陷类型的探针，这些探针分别与不同颜色的荧光编码微球交联、混合后得到诊断α、β地中海贫血的液相芯片。本发明通过用本发明的特异性引物对待检样品进行PCR扩增后，得到生物素标记的PCR产物，然后将其与本发明的液相芯片进行杂交，再用藻红蛋白进行荧光标记，最后通过液相芯片检测仪读出检测结果。本发明所述的试剂盒包括PCR引物和特异性探针，能同时检测缺失型和非缺失点突变型α、β地中海贫血，可以极大地缩短临床地中海贫血的诊断时间，提高诊断效率和诊断准确性，且通量高，市场潜力大。
文档编号G01N21/64GK102277419SQ201110084698
公开日2011年12月14日 申请日期2011年4月6日 优先权日2011年4月6日
发明者何天文, 叶宁, 尹爱华, 张亮, 张小庄, 张彦, 杜丽, 梁驹卿, 符振华, 骆明勇 申请人:广东省妇幼保健院