用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括一对可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段的特征序列A1和α2区段的特征序列A2的引物，一对扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的引物，一对扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI基因型的引物；一条特异性检测α1区段的特征序列A1的荧光探针，一条特异性检测α2区段的特征序列A2的荧光探针，一条特异性检测--SEA基因型扩增产物的荧光探针，以及一条特异性检测--THAI基因型扩增产物的荧光探针。本发明所述试剂盒对α-地中海贫血珠蛋白基因缺失检测具有高度的灵敏性、稳定性、准确性及较高的特异性。
【专利说明】用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学检测【技术领域】，具体涉及一种用于检测常见缺失型α -地中海贫血的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]地中海贫血简称地贫，是最常见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有α-地贫和β_地贫，分别由α-蛋白基因簇和β_珠蛋白基因簇异常表达引起。在我国，广西、广东和海南是地中海贫血的高发省份，其中广西α-地贫的发病率是15.5%。中国人群中，缺失型α-地贫的基因型常见基因型为--SEA、-α 37和-α42，以及广西区内相对常见的泰国型缺失(一ΤΗΑΙ)。
[0003]同源基因定量技术是一种根据基因的同源性，采用共同的扩增引物对同源基因进行扩增，最后采用荧光标记法或者探针法对基因的含量进行相对定量的方法。α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)由调控因子(HS-40)，α基因(α I和α 2)，ζ基因(ζ 2)，假基因(Ψ ζ I, Ψ α 2 and Ψ α I)和 Θ 组成，其排列顺序为:HS40 - ζ2-Ψζ1-Ψα2_Ψα1-α 2 - α 1- Θ。α地中海贫血基因据其同源性，可划分为XI，Χ2，Yl, Υ2，Zl和Ζ2区间，其中-α 3 7(也称为右侧缺失)的形成源于Zl和Ζ2之间的同源重组，其DNA结构表现为仅仅包含一个α I区段，而-α 4 2 (也称为左侧缺失)则来源于Xl和Χ2之间的同源重组，如图1所示,其DNA结构表现为存在一个α 2-α I的融合基因。对-α 3 7和-α 4 2携带者而言,其表现型及危害相似。然而，由于-α 3 7和-α 4 2均由大区段同源基因重组产生，因而不同个体所携带的- α 3 7或- α 4 2基因序列并不一致，因此，目前常用的诊断方法为通过跨越断点式PCR(Gap-PCR)将其扩增出来，但因其区段长度较长，导致检测时间也较长。另一方面，由于- α 3 7和- α 4 2的危害相似，如果可以将其简并进行检测，则可以实现短区段快速扩增检测。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法。采用该试剂盒可以相对定量检测α-珠蛋白基因簇中α?和α2功能基因的拷贝数及拷贝数的变化。
[0005]本发明所述的用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，所述的扩增引物为:一对可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α I区段的特征序列Al和α 2区段的特征序列Α2的引物A1A2-F和A1A2-R，一对扩增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R，以及一对扩增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ基因型的Gap-PCR引物THA1-F和THA1-R ;所述的荧光探针为:一条特异性检测α I区段的特征序列Al的荧光探针Al-Prob，一条特异性检测α 2区段的特征序列Α2的荧光探针A2_Prob，一条特异性检测一SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob，以及一条特异性检测一THAI基因型扩增产物的荧光探针THA1-Prob ；
[0006]其中:
[0007]所述的可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α I区段的特征序列Al和α 2区段的特征序列Α2的引物对中，
[0008]AIA2-F: 5，-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3，；
[0009]A1A2-R:5， -GCAGGCA GTGGCTTAGGA-3，；
[0010]所述的扩增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物对中，
[0011]SEA-F: 5，-CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3，；
[0012]SEA-R:5’ -CAGTGTTGTAGTCATGGCTTA-3’ ；
[0013]所述的扩增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ基因型的Gap-PCR引物对中，
[0014]THA1-F:5，-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3，；
[0015]THA1-R:5’ -CTTGGATCTGCACCTCTG-3’ ；
[0016]所述的特异性检测特α I区段的征序列Al的荧光探针Al-Prob为:
[0017]Al-Prob:5’ 6-FAM-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3’ BHQ-1 ；
[0018]所述的特异性检测α 2区段的特征序列Α2的荧光探针A2_Prob为:
[0019]A2-Prob:5’ ROX - CCTGGGCCGCACTGACCCTC-3’ BHQ-2 ；
[0020]所述的特异性检测一SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob为:
[0021]SEA-Prob:5’ -HEX-TCCTCCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3’ ；
[0022]所述的的特异性检测一THAI基因型扩增产物的荧光探针THA1-Prob为:
[0023]THA1-Prob:5’ -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’。
[0024]本发明所述的荧光探针中，FAM指羧基荧光素，HEX指六氯-6-甲基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，CY5是指花青染料分子5，BHQ-1和BHQ-2是指荧光淬灭基团。
[0025]上述技术方案中，所述α I区段的序列为:5’ -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCGCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3’ ；该 α I 区段的特征序列 Al为:5 ’-GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3，。
[0026]上述技术方案中，所述α 2区段的序列为:5’ -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCTCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3’ ；该 α 2 区段的特征序列 Α2 区段为:5’ -GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3，。
[0027]本发明所述的用于检测常见缺失型α -地中海贫血的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、MgCl2和dNTP等，具体的，酶液即为DNA聚合酶，具体可采用康为世纪所生产的GoldStar Taq DNA Polymerase,缓冲液为与GoldStar TaqDNA Polymerase配套的缓冲液。
[0028]本发明还提供采用上述试剂盒进行快速检测常见缺失型α-地中海贫血(如一SEA、-α和一ΤΗΑΙ)的方法，包括以下步骤:
[0029]I)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；
[0030]2)配制反应体系，具体为:
[0031]取可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α I区段的特征序列Al和α 2区段中的特征序列Α2的引物A1A2-F和A1A2-R、扩增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R、扩增α -珠蛋白基因簇中一?ΑΙ基因型的Gap-PCR引物THA1-F和THA1-R ；特异性检测α I区段的特征序列Al的荧光探针ΑΙ-ΡιχΛ、特异性检测α 2区段的特征序列Α2的荧光探针Α2-ΡιχΛ、特异性检测一SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob、特异性检测一?1基因型扩增产物的荧光探针THA1-Prob ；以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2, dNTP、水和DNA模板配制成反应体系；
[0032]3)样本检测:分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可以反映所检测模板数的多少)；
[0033]4)数据分析及结果判定:根据定量检测所获得的Cq值，以正常基因型样本为对照标本，按下述公式进行计算:
[0034]待检样本的基因ACq = Cq_A2-Cq_A1 ；
[0035]待检样本的基因Δ Δ Cq =八Cq_待检样本_ Δ Cq_正常样本；
[0036]待检样本的Al和A2相对拷贝数比值R = 2_Λ Δε<1 ；
[0037]根据R的值结合下述表1中进行结果判定:
[0038]表1:
[0039]
【权利要求】
1.用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其特征在于: 所述的扩增引物为:一对可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α I区段的特征序列Al和α 2区段的特征序列Α2的引物A1A2-F和A1A2-R，一对扩增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R，以及一对扩增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ基因型的Gap-PCR 引物 THA1-F 和 THA1-R ； 所述的荧光探针为:一条特异性检测α I区段的特征序列Al的荧光探针ΑΙ-ΡιχΛ，一条特异性检测α 2区段的特征序列Α2的荧光探针Α2-ΡιχΛ，一条特异性检测__SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob，以及一条特异性检测一THAI基因型扩增产物的荧光探针THA1-Prob ； 其中: 所述的可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α I区段的特征序列Al和α 2区段的特征序列Α2的引物对中，
A1A2-F:5’ -GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3’ ；
A1A2-R:5， -GCAGGCAGTGGCTTAGGA-3，； 所述的扩增α-珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物对中，
SEA-F:5’ -CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3’ ；
SEA-R:5’ -CAGTGTTGTAGTCATGGCTTA-3’ ； 所述的扩增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ基因型的Gap-PCR引物对中，
THA1-F:5’ -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3’ ；
THA1-R:5’ -CTTGGATCTGCACCTCTG-3’ ； 所述的特异性检测特α I区段的征序列Al的荧光探针Al-Prob为:
Al-Prob:5’ 6-FAM-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3’ BHQ-1 ； 所述的特异性检测α 2区段的特征序列Α2的荧光探针A2-Prob为:
A2-Prob:5’ ROX - CCTGGGCCGCACTGACCCTC-3’ BHQ-2 ； 所述的特异性检测一SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob为:
SEA-Prob:5’ -HEX-TCCTCCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3’ ； 所述的的特异性检测一THAI基因型扩增产物的荧光探针THA1-Prob为:
THA1-Prob:5’ -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于: 所述αI区段的序列为:
5’ -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCGCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3，； 所述α 2区段的序列为:
5’ -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCTCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTΤΑΑ-3，。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于: 所述α I区段的特征序列Al为:
5’ -GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3，； 所述α 2区段的特征序列Α2为:
5’ -GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3，。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的试剂盒，其特征在于:所述的试剂盒还包括PCR缓冲液、酶液、MgCl2和dNTP。
5.采用权利要求1所述试剂盒进行快速检测常见缺失型α-地中海贫血的方法，包括以下步骤: 1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板； 2)配制反应体系，具体为: 取可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α I区段的特征序列Al和α 2区段的特征序列Α2的引物A1A2-F和A1A2-R、扩增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R、扩增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ基因型的Gap-PCR引物THA1-F和THA1-R ;特异性检测α I区段的特征序列Al的荧光探针ΑΙ-ΡιχΛ、特异性检测α 2区段的特征序列Α2的荧光探针A2-Pi*0b、特异性检测一SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob、特异性检测一?1基因型扩增产物的荧光探针THA1-Prob ；以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反应体系； 3)样本检测:分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq ； 4)数据分析及结果判定:根据定量检测所获得的Cq值，以正常基因型样本为对照标本，按下述公式进行计算: 待检样本的基因ACq = Cq_A2-Cq_A1 ； 待检样本的基因Δ Δ Cq = Δ〇口_待检样本-Δ 0口_正常样本；待检样本的Al和A2相对拷贝数比值R = 2_Δ Δε<1 ； 根据R的值结合下述表1中进行结果判定:
其中，当R在1.8~2.5范围时，其结果匹配上表理论值中的“2”;当R在0.75~1.26范围时，其结果匹配上表理论值中的“I”；当R在0.37~0.55范围时，其结果匹配上表理论值中的“0.5”;若R的计算结果不在上述定义的R值范围内时，应采用其他方法进行辅助判断。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:步骤3)中，PCR扩增条件为:95°C预变性8~10分钟，然后95°C 15~30秒，60°C退火50~70秒，39~49个循环。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:PCR扩增条件为:95°C预变性10分钟，然后95°C 15秒，60°C退火60秒，40个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK104178573SQ201410417585
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】龙驹 申请人:龙驹