专利名称：α,β-地中海贫血的突变基因联合检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因领域，具体是一种α，β-地中海贫血的突变基因联合检测试剂
品.ο
背景技术：
地中海贫血(下称地贫)是由于人体基因突变或者缺失而导致α，β _珠蛋白肽链合成速率的不平衡，从而引起的溶血性贫血。地贫为全世界的高发病率遗传病之一，广泛分布于地中海国家及其他疟疾曾经高发地区。我国以长江以南各省发病率高，除广东、广西、海南省等发病率最高外，贵州、云南、四川等也是高发区。地贫常见的两种类型是α-地贫和β-地贫。α-地贫是由于常染色体遗传性缺陷，使α珠蛋白基因缺失或功能障碍导致α 珠蛋白肽链合成减少或不合成引起的慢性溶血病。α珠蛋白基因位于第16号染色体短臂末端的α珠蛋白基因簇中，该基因包括二个重复的α基因(％和、)、一个胚胎期类α 基因(ζ 2)、三个假基因(Ψ ζ ρ Ψ α 2和Ψ α D和一个功能未知的基因(θ 1)，其排列顺序为5' -ζ2-Ψ ζ α 2-Ψ Q1-Q ^a1-O1-S'，全长约30Kb。就一个单倍体而言地贫可分为三类缺陷地贫1，缺失两个基因(一/)；地贫2，缺失一个基因(-α/)；非缺失性a 基因发生点突变或少数几个碱基的缺失(ατα或a ατ)。目前已鉴定的α地贫缺失类型至少36种，东南亚缺失型(一SEA)、右侧缺失(-α3·7)和左侧缺失(-α4·2)是中国人最常见的3种缺失型。非缺失型α地贫点突变类型有30多种，在中国人群中最常见的Constant Spring (CS)禾口 Quong Sze(QS)0β-地贫是由于血红蛋白的β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白肽链缺失(β ° ) 或合成不足(β+)，从而引起的遗传性溶血性贫血病。β珠蛋白基因位于11号染色体短臂(11ρ15)，基因排列顺序为5' -ε-6γ-Αγ-Ψβ-δ-β-3'，长度约60Kb。绝大多数 β地贫是由于点突变所致，少数为基因缺失所致。β °珠蛋白生成障碍性贫血，突变导致 β链的合成完全受抑制，无β链生成；β +珠蛋白生成障碍性贫血，突变导致β链的合成部分受抑制，有少量β链合成；非典型β珠蛋白生成障碍性贫血，分子缺陷位于β珠蛋白基因启动区或位点控制区(LCR)，导致β珠蛋白表达受影响。全世界已报道170种左右 β珠蛋白基因的突变型，导致中国人群β地贫发生的突变基因有23种。最主要的6种为 CD41-42 (-4bp)，IVS-II-654 (C-T)，CD17 (A-T)，CD71-72 (+A)，-28 (A-G)以及 CD26 (G-A)，占中国人β地贫突变基因总数的80%以上，而且这些不同的β地贫基因在不同地区的发生率也有所不同。该病在我国的患者及基因携带者大约有3000万，对我国的人口素质及国民健康造成了极大威胁。据前些年调研，仅在广西α-地贫基因携带率高达15%，β-地贫基因携带率也达到5%，全广西地贫基因携带者约900多万，广东地贫基因携带者也是近千万。按照该病的遗传规律，如果夫妻二人均为相同类型地中海基因携带者，则有25%的几率生出重型或中间型地贫患儿，也就是说，每年全国有成千上万的重型或中间型地贫患儿出生。广西医科大学曾对广西40个县10万多中小学生及幼儿园儿童进行抽样调查，结果发现地贫基因携带者竟高达20% ；2005年，南宁市对5000对已婚夫妻进行地贫筛查，结果显示地贫基因检出率高达25. 88%。广东梅州地区地贫发生的频率及类型调查发现，6215例中共检出α地贫杂合子623例，检出率为10. 02%，检出β -地贫杂合子192例，检出率为3. 09%， 地贫总发生率是13. 50%。广东惠州曾对新婚夫妇进行筛查，9375例中，红细胞脆性试验异常818例，占8. 84%。夫妇均异常51对，初筛风险率为1.09%。血红蛋白(HbA 2定量) 电泳测定41对，其中轻型β -地贫20例，夫妇同为轻β -地贫2对；α -地贫杂合子18 列，夫妇同为α-地贫杂子8例对。进行地贫基因诊断7例(其中α诊断5对，β基因诊断2对)诊断为轻型β-地贫2例，无夫妇同为β-地贫轻型者，α-地贫10例，夫妇同为 α-地贫3对。高风险率为0.11%。我国广东省发病率约10%，位居全国第二。地贫症的临床表型多样，可以从正常到需要反复输血，甚至危及生命，导致患者在未成年前夭折甚至死胎。该病在我国南方的高发病率，对社会和家庭产生巨大的精神和经济压力。然而目前该病尚缺乏理想的治疗方法，筛查是降低致病基因在人群中传递及降低患病率最有效的方法。研究和检测地贫对开展地贫人群筛查、遗传咨询和产前诊断、提高人口素质和促进整个社会的经济发展有着重要的意义。α -地贫传统的临床血液学检测方法如常规参数检测分析、红细胞渗透脆性试验、 血红蛋白稳定性试验等特异性不高，较易产生假阴性；而肽链分析、HPLC、ELISA等检测方法由于检测单一、操作繁琐等原因正被技术日益成熟的基因检测所替代。传统基因诊断技术主要采用Southern印迹杂交方法，灵敏度高、准确率高，但操作时间长、要求DNA量多、需要同位素等原因使其只用于研究，不能进行大规模筛查。而普通PCR电泳技术，其方法与传统的Southern分子杂交相比操作简易、快速、准确、经济且易推广，为α -地贫基因诊断提供了较为有效的方法，但特异性较低，无法检测出常见的CS、QS点突变，而且易出现假阴性或假阳性。地贫常用诊断技术有RFLP (限制性片段长度多态性)连锁分析，寡核苷酸探针技术，等位基因特异性核苷酸(ASO)探针杂交技术，等位基因特异性扩增技术(ASPCR 或ARMS)，反向杂交技术(RDB)，PCR斑点杂交法以及基因芯片等技术。由于杂交分析检测技术特异性高，因而被广为推崇。DNA杂交是高密度基因芯片之核心分析方法，能在同一芯片上同时分析千万个不同的基因片段，大大加速了研究的速度。 而在临床的应用上，低密度芯片更能达到灵敏度、特异性双高的严格要求，该方法已用于遗传病的基因分析许多年，其特异性在分辨单一碱基(SNP)多态性中已达到100%的准确，故特别适用于基因分型。鉴于α-地贫主要以缺失类型为主，β-地贫的突变类型较多，因此采用先PCR扩增，再进行杂交是最简便快捷的筛查地贫基因的方法，同时避免Gap-PCR体系设计以 及单碱基突变的捕获的困难。杂交技术和PCR扩增技术结合，具有技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低的特点。杂交法能提升DNA分析的特异性，但是大多数杂交方法耗时耗力，无法达到临床快速检测的要求。将PCR检测灵敏性高的特点配合特异性极高的反斑点杂交技术以一种简单、快速且省钱的方式结合起来，利用了导流杂交技术(美国专利5，741，647和6，020，187 ； 中国专利02102795. 1)，该技术可大大提高杂交的效率，且操作方便，从而避免了传统杂交方法冗长的操作过程。至今为止，临床上尚未出现α，β-地贫同步联合检测产品。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种用于检测α，β-地中海贫血的突变基因联合检测试剂盒，包括(1) 一个基因芯片，其上带有探针，探针为SEQ ID Nos 1-31和与SEQ ID Nos 1-31互补的序列；(2)引物，为 SED ID No. 32-42。探针序列如下
权利要求
1.一种用于检测α，地中海贫血的突变基因联合检测试剂盒，其特征在于，包括(1)一个基因芯片，其上带有探针，探针为SEQ ID Nos :1-31和与SEQ ID Nos:l_31互补的序列；(2)引物，为SED ID No. 32-42。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物的5'端标记有生物素。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测α，β-地中海贫血的突变基因联合检测试剂盒，包括(1)一个基因芯片，其上带有探针，探针为SEQ ID Nos1-31和与SEQ ID Nos1-31互补的序列；(2)引物，为SED ID No.32-42。本发明所述地贫基因检测试剂盒提供了检测α-地贫(三种缺失型和两种突变型)以及β-地贫的16种突变基因的平台，可实现同步联合检测、提高检测特异性、降低成本、缩短检测时间，对开展地贫人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。
文档编号C12Q1/68GK102181560SQ20111011756
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者朱娟娟, 李烈军, 邱美兰 申请人:潮州凯普生物化学有限公司