一种mody型糖尿病基因检测试剂盒及突变位点的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种MODY型糖尿病基因检测试剂盒及突变位点，所述试剂盒针对HNF1A、GCK和KCNJ11基因。所述突变位点为c.160C>T、c.932C>A、c.8C>T、c.51C>G或c.823G>A。经过本发明试剂盒的检测，通过判断突变位点即可辅助了解青少年糖尿病的遗传因素背景，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
【专利说明】
-种MODY型糖尿病基因检测试剂盒及突变位点
技术领域
[0001] 本发明属于M0DY型糖尿病领域，特别设及一种M0DY型糖尿病基因检测试剂盒及突 变位点。
【背景技术】
[0002] 流行病学调查表明中国青少年糖尿病患病率为3.2-4.5% (18-30周岁），世界范围 内青少年T1DM的发病率呈现逐年上升趋势，目前成人T1DM发病率的流行病学资料较少，W册 DIAMOND 1990-1994年的研究表明，全球小于15岁儿童的T1DM发病率每年的增长速率为 3.4%，其中欧洲增长速率为3.2%，北美地区为5.3%，亚洲为4.0%。我国15岁W下儿童的 T1DM发病率为0.1-4.5/10万人年，是世界上T1DM发病率最低的国家之一，低于北欧高加索 人约365倍。中国预防医学科学院1988年至1996年的研究表明，我国T1DM发病率为0.59/10 万人年，整体呈南低北高的变化规律。较近的一项对上海1997-2011年的回顾性研究表明， 14岁W下儿童T1DM发病率为3.1/10万人年，发病率平均每年增长14.2%。相比于西方国家， 中国的T1DM患病率极低，但发病率增长明显，且我国人口基数大，病例绝对数并不少。此外， 随着我国经济的快速发展和人民生活方式的改变，与肥胖密切相关的T2DM的低龄化倾向也 在日渐明显。特殊类型的糖尿病中，W青少年起病的成人型糖尿病（maturity onset diabetes of the young,MODY)最受关注。MODY是一种常染色体显性遗传的单基因遗传病， 主要是由于膜岛β细胞葡萄糖刺激下的膜岛素分泌功能障碍所致，通常于青春期及青年期 发病。在欧洲，MODY的发病率占总糖尿病人群的1 %~2%，在18-45岁的人群中，发病率为百 万分之108。
[0003] 在特殊类型糖尿病中，MODY发病率相对较高，且有明确的遗传规律，因此研究MODY 具有重要意义。首先，MODY的诊断有助于设计更个体化的治疗方案。例如，M0DY2患者大多不 需要药物治疗，仅通过饮食和运动即可良好控制血糖;而M0DY3患者则对较小剂量横脈类药 物治疗敏感。其次，MODY的正确诊断有助于判断患者预后，例如，M0DY2患者虽然高血糖持续 存在，在随后的数年中血糖无持续增高趋势，且长期随访慢性并发症少见，预后良好。运将 极大减轻患者的屯、理和经济负担；而M0DY3患者血糖随着病程延长而增高，β细胞功能呈进 行性降低，可出现各种慢性并发症，特别是微血管并发症，尤W视网膜和肾脏病变最为常 见。明确的分子遗传学诊断可为MODY患者及其亲属提供遗传学指导。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种MODY型糖尿病基因检测试剂盒及突变位 点，经过本发明试剂盒的检测，通过判断突变位点即可辅助了解青少年糖尿病的遗传因素 背景，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
[0005] 本发明的一种MODY型糖尿病基因检测试剂盒，所述试剂盒针对HNF1A、GCK和 KCNJ11基因，含有下列引物对：
[0006] HNF1A：1F：GGGTGCAAGGAGTTTGGTTTGT；
[0007] 1R:CCCTTCCCAGCAACTAGGCTAA;
[0008] 2F：CCATACCTCACCGTCCCTGAGT；
[0009] 2R：TGCAGGTTGAATCCCACTGACT；
[0010] 3F：AAGTGATGGCATGTGTGCTGTG；
[0011] 3R：CGAGGAATGGGCTTAGGTTCAA；
[0012] 4F：ATGGAGAGACTGAGGTCAGACA；
[00。] 4R:GAGTGATAAGGAGTGGCATGAA;
[0014] 5-6F：AAGTGCTGAGGGCTGTGGAG；
[0015] 5-6R：ATGTAGCACAGTGACTGGTCCAG；
[0016] 7F：GAGGGGGAATGACTTGCCAG；
[0017] 7R：CCCTCAATCACGGAAACACA；
[001 引 8-9F：TCTGGAGCCTCCAGTTTTGA；
[0019] 8-9R：CTGCCAGTGCTTCCTCACAG；
[0020] 1OF：AAGAACCGAGGGTAGAGGTGTG；
[0021] 1OR：TGCTCCTAGCTCTCCACGAC；
[0022] GCK：lAF：CCGACTCGTTGGAGAACAAT；
[0023] lAR：TCCAAAGCTGGATGGGTCTG；
[0024] 1邸：GGGCAGAGTATTTGAGCAGC;
[00 巧]1BR:CATGTGCCTCCTTCCAAGGT;
[0026] 1CF：TCCCACTGCTATCCAACCTG；
[0027] 1CR：GGCTGTCCTAACAATCCCTGTG；
[00 巧]2F:GGGGTCAGAAGACAGAAGGA;
[00 巧]2R:GCCCAAGTCGAGGACTTCAT;
[0030] 3F：TTCCCTGGTTGACCTTTGAC；
[0031] 3R：GATGGTGACTGTGGGACTTG；
[00；32] 4F:AGCAGCAGCGGAAGAGGAGA;
[0033] 4R：TCCAGATCTCCCTTCTGAGCAC；
[0034] 5-6F：AGAATCGTTCCCAAAACCTCTC；
[0035] 5-6R：GGCGTTGAAATGCTTCCTACTG；
[0036] 7F：CCACTGAAGCAACCCAGGTC；
[0037] 7R：TGGAGCTTACGAACGGATTG；
[0038] 8F：GCACGTTCCTAATCCCTGAC；
[0039] 8R：GGCCCTAGTTTCCCATCC；
[0040] 9-1OF：CTGGCGGAAACGCTTTGG；
[0041 ] 9-lOR GCTGTCCCACCGAAAAACTG；
[0042] KCNJl1：1-lF：AGTGAAGTGGGACCCAGGTG；
[0043] 1-lR：CTTGCGTACCACCTGCATGT；
[0044] 1-2F：CATCGTGCAGAACATCGTG；
[0045] 1-2F：TAACACCCTGGATGAGCAG 〇
[0046] 所述试剂盒还包括DM提取试剂、Taq DM聚合酶、PCR缓冲液和dNTP混合物。
[0047] 所述试剂盒的PCR反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性Imin，退火lmin，72°C延 伸Imin，最后72 °C延伸5min，30个循环;恢复至4°C。
[0048] 本发明的一种M0DY型糖尿病基因检测试剂盒检测得到的突变位点，所述突变位点 为C. 160C〉T、c. 932C〉A、c. 8C〉T、c. 510G或 C. 823G〉A。
[00例有益效果
[0050] 经过本发明试剂盒的检测，通过判断突变位点即可辅助了解青少年糖尿病的遗传 因素背景，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
【附图说明】
[0051] 图1为患者A测序结果；其中，左图箭头处示HNF1A基因（c.l60C〉T)杂和突变，右图 为该位点正常对照；
[0052] 图2为患者B测序结果；其中，左图箭头处示HNF1A基因（C.160OT)杂和突变，右图 为该位点正常对照；
[0053] 图3为患者C测序结果；其中，左图箭头处示HNF1A基因（C.9320A)杂和突变，右图 为该位点正常对照。
【具体实施方式】
[0054] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0化5] 实施例1
[0056]研究人群:70个就诊或者既往被确诊为糖尿病的患者，年龄限于12-30岁，男女不 限。
[0化7] 1.外周血DNA抽提：
[005引取-80°C冻存邸TA抗凝管全血，使用QiAAmp如NA Blood MinAit抽提DNA。
[0化9] 1)取200U1已添加抗凝剂的血液样品至1.5ml离屯、管中，再加入40U1蛋白酶K溶液， 再加入200ul AL Buffer,立刻祸旋振荡充分混匀15秒；
[0060] 2)在56°C 烘箱放置 30min;
[0061] 3)从烘箱中取出裂解后的标本，短甩；
[0062] 4)加入200U1无水乙醇，立刻润旋振荡充分混勾，短甩；
[0063] 5)将上一步混合物(包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管 中），盖上盖子，8,000巧m离屯、Imin,换收集管；
[0064] 6)加入500ul AWlBuffer，盖上盖子，最大转速离屯、3min，接着再最大转速离屯、 Imin，换收集管；
[0065] 7)加入500ul AW2Buffer，盖上盖子，8，000巧m离屯、Imin，倒掉收集管的液体，空柱 子干甩Imin;
[0066] 8)取出吸附柱，放入一个消过毒的新离屯、管中，把装有滤液的收集管扔掉。在吸附 柱内加入lOOul AE Buffer,室溫放置30min左右，然后8,000巧m离屯、1.5min [0067] 9)加入lOOul AE Buffer,室溫放置lOmin左右，然后8,000巧m离屯、1.5min.
[006引10)扔掉吸附柱，测0D值，储存于4°C冰箱备用。
[00例 2.PCR扩增基因：
[0070] 引物、相应退火溫度及扩增片段长度见表1
[0071] 表1测序基因扩增引物序列
[0072]
[0073]
[0074]
[00巧]2)PCR反应体《（24ul)配制：
[0076] DM模板lul;
[0077] Taq DM聚合酶0.15ul(TaKaRa);
[007引 10 X PCR缓冲液(MghpLus) 2.加1 (TaKaRa);
[00巧]dNTP MixUire 2ul(TaKaRa);
[0080] 上游引物0.加1;
[0081 ] 下游引物0.加1;
[0082] 去离子Ξ蒸水17.3加1。
[0083] 3)PCR扩增参数设置：
[0084] 94°C 预变性 5min;94°C 变性 Imin，退火 lmin，72°C 延伸 Imin，最后 72°C 延伸 5min，30 个循环;恢复至4°C。
[0085] 4)将PCR扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳(300￥，3〇111111)，紫外分析仪显示有清晰 的目的条带后送上海销尚生物技术有限公司进行正、反向直接测序，测序系统采用美国AB 公司（Applied Biosystems,i^ster City,CA)ABI 3730化测序仪。
[00化]4.序列比对和分析
[0087] 1)基因序列比对
[0088] 基因组参考序列来源于UCSC数据库化ttp://genome, ucsc.edu/)和NCBI数据库 (http://www.ncbi .nlm.nih.gov/pubmed)。通过 NCBI 数据库（http:// blast. ncbi . nlm. nih. gov/Blast. cgi)将测序结果txt文本与测序图进行在线序列比对。
[0089] 2)单核昔酸多态性(SNP)及突变位点的数据库检索
[0090] 采用化SNP数据库和千人基因组数据库（lOOOGenomes)检索是否为SNP位点，采用 人类基因突变数据库(HGMD，2015年4月）检索是否为新发现变异。
[0091] 3).新发现变异的功能预测
[0092] 检索后明确为新发现变异的，同时采用生物信息学软件
[0093] Polyphen-2( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和SIFT化ttp:// sift, jcvi .org/)进行在线功能学预测。PolyPhen_2软件根据评分的高低将突变分为很可 能有害（probablydamaging)、可能有害（possibly damaging)和良性（benign)S个等级， SIFT软件根据评分高低将突变分为有害(damaging)和可耐受(tolerated)两种。
[0094] 5.结果
[00M] (1)基因检测结果
[0096] 对70例糖尿病患者进行版)DY2(GCK)、M孤Y3化NF1A)、M0DY13化CNJ11)基因测序。确 诊M0DY患者3例，均为HNF1A基因突变导致的M0DY3，占所有未分型患者的4.3 %。2例M0DY家 系的遗传模式均为常染色体显性遗传，1例为de novo突变。突变来源家系及基因检测的具 体结果见表2。如表2所见，HNF1A基因突变最常发生在1号和4号外显子，突变形式W无义突 变和错义突变出现。
[0097] 糖尿病患携带4个已知2型糖尿病易感SNP位点，为HNF1A基因 rsll69288(I2化， c.79A乂）、rs2464196(S487N，c.l460G〉A)及KCNJll基因 rs5219化23E，c.67A〉G)、rs5215 (V337I，c100 9G〉A)。携带rsll69288和/或rs2464196位点的先证者有28例，占40% ;携带 rs5219和/或rs5215位点的先证者有47例，占67.1 % dSNP位点的携带情况如表3所示。
[009引表2糖尿病患者GCK、HNF1A和KCNJ11基因检测结果
[0102] 注:HGMD'编号来自HGMD数据库(2015年4月）。
[0103] (2)新发现变异的生物信息学分析
[0104] 上述2个HNF1A突变位点均为己经报道过的突变，并明确基因相关功能。经与HGMD 数据库及化SNP数据库比对，确认3个为新发现的HNF1A遗传变异形式，分别为S3F(c. 8C〉T)、 LI化(。.5106)、62751(((3.8236〉4)。采用生物信息学软件对新发现的变异位点进行突变有 害性分析。PolyPhen-2和SIFT软件都对S3F和L1化给出了良性的预测，而对E275K，两种软件 都给出了巧害性"的结论。
[0105] (3)结论
[0106] 本实施例选择M0DY2化肥14)、]\?)0￥3(60〇、]\?)0￥13化〔附11)运^个基因进行筛查。
[0107] 本实施例基因测序发现3例由HNF1A基因突变导致的M0DY3,其中两例相互独立的 患者发生exonl的无义突变354乂((3.16001')。1?54乂((3.16001')首次在英国的1'101家系中发 现，该研究对18个连续立代1101家系进行HNF1A基因测序，发现1例R54X突变，未做功能学研 究。文献显示，该突变也见于汉族的M0DY家系。3D构象显示，该位点的无义突变导致HNF1A蛋 白截断。正常情况下，HNF1A基因编码631个氨基酸的蛋白质和至少3个结合模体，其中包括 DNA结合模体，54位氨基酸上发生无义突变造成了严重截断，从而丧失了 DNA结合模体结合 DNA的功能。本研究的另一例M0DY3为exon4的错义突变A311D(c.932C〉A)，该突变首次在中 国人群中发现，该研究在146个相互独立的M0DY家系中筛查M0DY1、M0DY2和M0DY3，发现13例 M0DY3和两例M0DY2,其中A311D(c.932C〉A)使用Chou-Fasman方法预测能够影响HNFIA蛋白 功能，未做功能学研究。上述两个突变位点都见于中国的M0DY家系，可见运两种突变形式是 中国较为高发的M0OT3形式。
[0108] 本实施例中1例患者(A)的父母均未携带R54X突变，因此该患者发生了 denovo突 变。斯洛伐克和捷克近期的一项研究对150例没有明确两代或W上家族史的先证者筛查 Μ孤Y1、M0DY2和M0DY3，发现58例有M0DY基因突变，其中28例无法收集家系，19例患者的父母 是无症状的突变携带者，而11例患者是denovo突变，即至少有7.3%的患者发生了M0DY基因 的denovo突变。因此，M0DY基因的denovo突变频率可能比预期要高。在临床上，对于符合其 他条件而缺乏家族史的患者，仍然应该考虑筛查M0DY基因。
[0109] 本实施例新发现Ξ个变异形式，其中S3F(c.8C〉T)和1^化((3.5106)用生物信息学 软件化ly化en-2和SIFT分析得到了良性的预测，而对E275K(c.823G〉A)，两种软件都给出了 "有害性"的结论。有两例患者发生E275K变异，分别是患者B和C，患者B14岁，男，BMI 24.92kg/m2，FCP 1.24ng/ml，抗体均为阴性，目前使用二甲双脈治疗，外公有糖尿病史。患 者C31岁，男，BMI 22.2化g/m2，FCP1.61ng/ml，抗体均为阴性，目前使用沙格列汀治疗，母 亲、外公、二舅有糖尿病史。明确E275K是否是新发现的M0DY基因需要进一步收集家系，验证 正常人中的携带情况W及功能验证。
[0110] 本实施例并未发现GCK突变导致的M0DY2和KCNJ11突变导致的M0DY13。考虑与W下 原因有关:其一，M0DY2患者的临床症状较轻，仅空腹血糖轻度升高，往往是通过查体偶然发 现的，一般通过饮食调整即可控制，且很少发生酬症等急性并发症。而本实施例中70%的患 者来自于病房，入选的病人大多血糖相对较高，病情较重，因此不容易纳入M0DY2患者。其 二，KCNJ11基因在2012年被命名为M0DY13,至今共发现4个M0DY13家系，可见发病率不高。 M0DY3由肝细胞核因子Ια突变所致，该基因突变可导致B细胞发育不良，进行性功能丧失。患 者"Ξ多"症状明显，餐后化血糖水平高，患者高血糖随着病程延长而增高，可给予小剂量横 脈类药物治疗。大多数M0DY3患者的血清高敏C反应蛋白化sCRP)水平降低，可将hsCRP作为 辅助临床诊断的标志物，敏感性90%，特异性80%。
[0111] 本实施例共发现3例由HNF1A基因突变导致的M0DY3,4个与2型糖尿病易感有关的 SNP位点，W及3个新的HNF1A遗传变异形式，促进更深入了解青少年糖尿病的遗传因素背 景，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
【主权项】
1. 一种MODY型糖尿病基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒针对HNF1A、GCK和 KCNJ11基因，含有下列引物对： HNF1A：IF：GGGTGCAAGGAGTTTGGTTTGT； 1R：CCCTTCCCAGCAACTAGGCTAA； 2F：CCATACCTCACCGTCCCTGAGT； 2R：TGCAGGTTGAATCCCACTGACT； 3F：AAGTGATGGCATGTGTGCTGTG； 3R：CGAGGAATGGGCTTAGGTTCAA； 4F：ATGGAGAGACTGAGGTCAGACA； 4R：GAGTGATAAGGAGTGGCATGAA； 5-6F：AAGTGCTGAGGGCTGTGGAG； 5-6R：ATGTAGCACAGTGACTGGTCCAG； 7F：GAGGGGGAATGACTTGCCAG； 7R：CCCTCAATCACGGAAACACA； 8-9F：TCTGGAGCCTCCAGTTTTGA； 8- 9R：CTGCCAGTGCTTCCTCACAG； 10F：AAGAACCGAGGGTAGAGGTGTG； 1OR：TGCTCCTAGCTCTCCACGAC； GCK：1AF：CCGACTCGTTGGAGAACAAT； 1AR：TCCAAAGCTGGATGGGTCTG； 1BF：GGGCAGAGTATTTGAGCAGC； 1BR：CATGTGCCTCCTTCCAAGGT； 1CF：TCCCACTGCTATCCAACCTG； ICR：GGCTGTCCTAACAATCCCTGTG； 2F：GGGGTCAGAAGACAGAAGGA； 2R：GCCCAAGTCGAGGACTTCAT； 3F：TTCCCTGGTTGACCTTTGAC； 3R：GATGGTGACTGTGGGACTTG； 4F：AGCAGCAGCGGAAGAGGAGA； 4R：TCCAGATCTCCCTTCTGAGCAC； 5-6F：AGAATCGTTCCCAAAACCTCTC； 5-6R：GGCGTTGAAATGCTTCCTACTG； 7F：CCACTGAAGCAACCCAGGTC； 7R：TGGAGCTTACGAACGGATTG； 8F：GCACGTTCCTAATCCCTGAC； 8R：GGCCCTAGTTTCCCATCC； 9- 10F：CTGGCGGAAACGCTTTGG； 9-10R GCTGTCCCACCGAAAAACTG； KCNJ11：1-1F：AGTGAAGTGGGACCCAGGTG； 1-1R：CTTGCGTACCACCTGCATGT； 1-2F：CATCGTGCAGAACATCGTG； 1-2F：TAACACCCTGGATGAGCAG 〇2. 根据权利要求1所述的一种MODY型糖尿病基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒 还包括DNA提取试剂、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液和dNTP混合物。3. 根据权利要求1所述的一种M0DY型糖尿病基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒 的PCR反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性lmin，退火lmin，72°C延伸lmin，最后72°C延 伸5min，30个循环;恢复至4°C。4. 一种如权利要求1所述的M0DY型糖尿病基因检测试剂盒检测得到的突变位点，其特 征在于:所述突变位点为 c · 160C>T、c · 932C>A、c · 8C>T、c · 51C>G或 c · 823G>A。
【文档编号】C12Q1/68GK106011268SQ201610527671
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】宁光, 顾卫琼, 缪海韬, 叶蕾, 崔斌, 顾斌, 洪洁, 张翼飞
【申请人】上海市内分泌代谢病研究所, 上海交通大学医学院附属瑞金医院