一种胰腺癌遗传易感基因检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公布了一种胰腺癌遗传易感基因检测试剂盒，包括检测X射线交错互补修复基因1XRCC1上Arg194Trp SNP位点、胸腺嘧啶合成酶基因TS上SNP位点的引物、特异性荧光探针对，本发明通过检测XRCC1基因上Arg194Trp SNP位点和胸腺嘧啶合成酶基因TS上SNP位点的多态性实现对胰腺癌遗传易感性风险的评估检测，且检测灵敏度、准确度均较高。
【专利说明】
一种胰腺癌遗传易感基因检测试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种胰腺癌遗传易感基因检测试剂合
ΙΤΓΤ.0
【背景技术】
[0002]胰腺癌恶性程度高，不易早期发现，转移早且快、预后差。据统计，在确诊后只有12%?15%的病例可进行手术根治，术后5年生存率仅O?2%，而90%以上的病人在确诊后I年内死亡，平均存活期少于6个月。过去，人们常说，肝癌是“癌中之王”，而胰腺癌则是“王中之王”。胰腺癌早期无明显症状，或仅仅有上腹部不适和食欲减退。癌肿发展到一定程度后开始出现症状，有上腹痛、黄疸和体重减轻。另外，由于消化功能紊乱，还可出现恶心、呕吐、腹胀、腹泻或便秘等消化道症状。
人类X射线交错互补修复基因IXRCCl是第一个分离到的影响细胞对电离辐射敏感性的哺乳动物基因，该基因广泛参与DNA损伤的修复。XRCCl基因Argl94Trp是该基因第6号外显子上的一个C/T多态位点，引起XRCCl基因编码蛋白的第194个氨基酸由Arg变为Trp。该位点有三种基因型，分别为CC(Arg/Arg)、CT(Arg/Trp)、TT(Trp/Trp)，其中CT(Arg/Trp)、TT(Trp/Trp)被确定为胰腺癌的风险基因型。研究显示，当个体携带风险基因型时XRCCl蛋白的活性降低，碱基切除修复能力降低，DNA损伤增多，胰腺癌患者的总生存期的变短。
[0003 ] TS基因编码的胸腺嘧啶合成酶参与叶酸代谢通路。叶酸代谢:在从叶酸转变生成5-甲基四氢叶酸的过程中涉及四个基本的生化步骤。TS基因的启动子区存在一个28bp的串联重复多态(2R/3R)。最近有研究发现，当该位点的串联重复为3R时，第2个重复片段会出现一个G/C多态，因此形成双重多态。以上两种多态组成六种基因型:3Rg/3Rg、3Rg/3Rc、3Rg/2R、3Rc/2R、2R/2R、3Rc/3Rc，其中现已确定3Rc/3Rc为胰腺癌的风险基因型。研究显示，TS基因2R/3R多态可以调节TS基因表达，其中3R等位基因的第2个重复片段的G/C多态与TS表达水平下降有关，而TS酶活性下降将减少dUMP甲基化生成dTMP，破坏dNTP池(S卩dATP，dTTP，dCTP，dGTP的比例)的平衡，增加尿嘧啶错误渗入DNA的机会，尿嘧啶经切除修复导致DNA双链断裂，引起染色体损伤和脆性位点的产生。有研究表明，携带3Rc/3Rc基因型者患胰腺癌的风险明显增加。
基于此，研发一种通过检测相应SNP位点的胰腺癌遗传易感基因检测试剂盒。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种胰腺癌遗传易感基因检测试剂盒，该试剂盒检测精密性高、稳定性好。
[0005]本发明的通过下述技术方案实现:
一种胰腺癌遗传易感基因检测试剂盒，包括检测X射线交错互补修复基因IXRCCl上Arg194Trp SNP位点、胸腺嘧啶合成酶基因TS上SNP位点的引物、特异性荧光探针对。
[0006]优选，所述试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件:Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、去离子水，酶切常规组件:反应缓冲液、去离子水。
[0007]优选，所述检测试剂盒还包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
[0008]优选，所述检测试剂盒中各组分及其含量为:10XPCR反应缓冲液2.5μ1，25πιΜdNTP混合液0.2μ1，25πιΜ MgC12溶液I.5μ1，5unitsAU Taq DNA聚合酶0.125μ1，20μΜ特异性引物对每条引物各0.25μ1，去离子水18.675μ1。
[0009]本发明所述的检测试剂盒，保存温度为-20°C。
[0010]本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果:
本发明通过检测XRCCl基因上Argl94Trp SNP位点和胸腺嘧啶合成酶基因TS上SNP位点的多态性实现对胰腺癌遗传易感性风险的评估。
【具体实施方式】
[0011]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
[0012]实施例1:
胰腺癌遗传易感基因检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤:
(I)DNA模板的抽取
使用硅胶吸附法提取口腔上皮细胞的基因组DNA。
[0013](2):电泳检测分型
检测试剂盒中的电泳检测套装，反应体系为总体积25μ1，包含浓度为12.5ng/yl的DNA模板 1μ1、10Χ PCR 反应缓冲液 2.5μ1，25πιΜ dNTP 混合液 0.2μ1，25mM MgC12 溶液 1.5μ1，5unitsM Taq DNA聚合酶0.125μ1，20μΜ电泳检测引物对每条引物各0.25μ1，去离子水18.675μ10
[0014]反应条件为:在PCR扩增仪上进行反应，94°C、12分钟，进行30个循环的94°C、30秒，60 0C、30秒，72 °C、30秒，然后进行72 °C、1分钟。
利用电泳技术，进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带的数量。
[0015](3):荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，分别进行2次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10μ1，包含浓度为20ngAU的DNA模板2μ1、1μ1 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、Ο.?μ? 25mM dNTP混合液、0.6μ1 25mM MgC12溶液、0.025yl(5unitsAU)Taq DNA聚合酶、20μΜ的有义引物和反义引物各0.225μ1、ΙΟμΜ的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μ I，去尚子水5.325μ1。
[0016]在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、1分钟，进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
[0017](4)基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
[0018]熟悉电泳检测技术的本领域技术人员能够通过辨识电泳图上DNA条带的位置和数量来确定所检测的SNP位点的基因型。 熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
[0019]以上所述的【具体实施方式】，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的【具体实施方式】而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种胰腺癌遗传易感基因检测试剂盒，其特征在于，包括检测X射线交错互补修复基因IXRCCl上Argl94Trp SNP位点、胸腺嘧啶合成酶基因TS上SNP位点的引物、特异性荧光探针对。2.根据权利要求1所述的一种胰腺癌遗传易感基因检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。3.根据权利要求2所述的一种胰腺癌遗传易感基因检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中各组分及其含量为:1X PCR反应缓冲液2.5μ1，25mM dNTP混合液0.2μ1，25mMMgC12溶液1.5μ1，5unitsAU Taq DNA聚合酶0.125μ1，20μΜ特异性引物对每条引物各0.25μI，去尚子水18.675μ1 ο
【文档编号】C12Q1/68GK106048061SQ201610652159
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月10日 公开号201610652159.0, CN 106048061 A, CN 106048061A, CN 201610652159, CN-A-106048061, CN106048061 A, CN106048061A, CN201610652159, CN201610652159.0
【发明人】周炜, 欧阳小峰, 毛家丽, 周宇
【申请人】四川金域医学检验中心有限公司