与胰腺癌相关的基因家族(lbfl313)的制作方法

专利名称：：与胰腺癌相关的基因家族(lbfl313)的制作方法
技术领域：
：本发明涉及来自胰腺癌病人的胰腺癌组织中基因表达的变化。本发明特别涉及与相应的正常胰腺组织和其它恶性肿瘤相比在胰腺癌组织中差异表达的人基因。
背景技术：
：胰腺癌无论在男性和女性中均为癌症致死的第四大原因，它是发达国家中一个主要的健康问题，且预后非常差(Faint等人，(2004)DatamonitorDMHC2045;Garcea等人，(2005)Pancreatology5:514誦529;Kem等人，(2002)CancerBiolTherapy1:607-613;Laheru和Jaffee,(2005)NatureRevCancer5:59-467;Li等人，(2004)Lancet363:1049-1057)。据估计每年大约有30,000美国人患上且死于此疾病。尽管有有效的手术和药物治疗，但对于患有局部和区域疾病的病人来说其平均预期寿命为大约15~18个月，而患有转移性疾病的病人为36个月。接近100%的胰腺癌病人会发生转移且死于由于其过度生长而使病人虚弱的代谢效应，不进行切除手术的病人组的全部五年存活率明显少于百分之五。对非特异性的始发症状和困难的早期诊断尤其严重。胰腺癌的早期检测方法还处在研究中并且在实践上还不存在，而常规的癌症疗法对预后和疾病后果几乎没有影响。胰腺癌的预后差是由于其晚期显露的倾向、强烈的局部侵袭、早期转移以及对化学疗法的效果差。与许多其它恶性病一样，胰腺癌是由后天获得性突变的累积引起的。在胰腺癌的发生、持续生长和转移中涉及多种基因和表观遗传变化，包括原癌基因的激活、肿瘤抑制基因的失活和保守基因的异常。人们相信在这些基因上累积的突变是在"PanINs"(胰脏上皮瘤形成)阶段中的可预测的时间过程中发生的(Hruban等人，(2000)ClinCancerRes6:2969-2972;Kern等人，(2002)CancerBiolTherapy1:607-613;Li等人，(2004)Lancet363:1049-1057)。K-ras的突变发生于PanIN-1中期。PanIN-2阶段由K-ras突变的速度增加和其它变化以及大量p16异常为标志，可能说明了p53突变存在的p53蛋白过表达偶尔在更深入的PanINs中出现。肿瘤抑制基因TP53、DPC4和BRCA2的丢失是在胰脏瘤形成发展的晚期PanIN-3中发生。超过85%的胰导管癌在胰腺癌发展中激活的K-ras基因的点突变(Li等人，(2004)Lancet363:1049-1057;Xiong(2004)CancerChemPharm54:S69-77)。K-ras突变导致一条细胞内信号通路Ras-Raf-MEK-ERK的组成型激活，引起细胞增生且因此将含有这个基因点突变的细胞赋予转化性质。Ras突变与肿瘤期或预后无关，说明K-ras致癌基因可能与致癌作用的起始有关，但是与人胰腺癌的恶性潜在性和促进作用无关。磷酸肌醇3激酶(PI3K)是Ras家族的关键下游靶点之一。PI3K的激活与胰腺癌对化学疗法或分子靶向药物诱导的凋亡的耐受性有关。pl6肿瘤抑制基因的失活稍晚发生。事实上在所有导管腺癌中pl6基因通过突变、纯合子缺失或启动子曱基化相关的转录沉默而失活(Kern等人，(2002)CancerBiolTherpy1:607誦613;Maitra等人，(2006)BestPractResClinGastroenterol20:211-226)。p16蛋白通过pl6/Rb通路调节细胞周期，因此p16基因的遗传失活意味着在胰腺癌中失去了细胞周期的关键调节子。也就是说，p16基因的遗传突变是家族性非典型多痣黑素瘤(FAMMM)综合征的原因，并且增加了FAMMM病人患上黑素瘤和胰腺癌的危险。TP53基因失活几乎总是由一个等位基因上的基因内突变以及第二个等位基因的丢失而产生的(Maitra等人，(2006)BestPractResClinGastroenterol20:211-226)。p53的机能障碍意味着细胞数量的两个关键控制即Gl/S细胞周期的检查点和G2/M期停顿的维持，在大多数胰腺癌中失去了调节。DPC4基因也就是众所周知的SMAD4,在超过一半的胰腺癌中遗传失活，35%由纯合子缺失引起，200/()由基因内突变以及剩余等位基因的丢失引起((Maitra等人，(2006)BestPractResClinGastroenterol20:211-226;Wilentz等人，(2000)AmJPathol156:37-43)。然而，DPC4的遗传失活在其它类型胂瘤中仅有极少出现。dpc4蛋白在通过TGF-B通路的信号传导和生长控制中起重要作用。与DNA修复有关的BRCA2基因仅以胰腺癌中很小百分比(10。/。)为靶，但是导致胰腺癌的家族性聚集((Maitm等人，(2006)BestPractResClinGastroenterol20:211-226;Murphy等人，(2002)CancerRes62:3789-3793)。BRCA2基因的单个碱基对的携带者(称为6174delTBRCA2基因突变)患上胰腺癌的危险增加10倍。核因子kB(NF-kB)是一神主要以p65(RelA)/p50异源二聚体存在的转录因子，它也被认为是胰腺癌相关基因之一(Garcea等人，(2005)Pancreatology5:514-529;Xiong(2004)CancerChemPharm54:S69-77)。RelA是NF-kB的p65亚基，它在大约67%的胰腺癌中被组成型激活，但在健康胰腺组织中不被激活，而IkB(X在人胰腺胂瘤组织和细胞系中均过表达。RelA的组成型激活似乎与胰腺肿瘤细胞中的上游信号传导通路例如Ras有关。这说明NF-KB在对胰腺癌中的细胞毒素剂诱导的凋亡的肿瘤耐受性起重要作用。其它结果也说明NF-kB促进胰腺细胞生长的主要机制是通过抑制凋亡。在本领域中仍然需要能够更准确诊断胰腺癌的材料和方法。此外在本领域中还需要治疗的方法和鉴别能够有效治疗此疾病的药物的方法。本发明符合这些和其它需要
发明内容技术问题本发明提供了一种准确诊断胰腺癌的材料和方法。本发明还提供了一种有效治疗胰腺癌的治疗方法。技术方案本发明涉及一种新基因(以下称为"LBFL313"),与正常胰腺组织相比它在胰腺癌组织中差异表达。本发明提供了(a)—种包含SEQIDNO:1的经分离的核酸分子、(b)—种编码SEQIDNO:2的经分离的核酸分子、(c)一种显示了与SEQIDNO:1至少95%核苷酸序列同一性的经分离的核酸分子和(d)—种包含其补体的经分离的核酸分子。本发明还提供了可操作地连接于一个或多个表达控制元件上的核酸分子，包括载体，所述载体包含被分离的核酸分子。本发明还提供了被转化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的核酸分子以及制备蛋白质的方法，此方法包含在该蛋白质表达的条件下培养用本发明的核酸分子转化的宿主细胞的步骤。本发明还提供了一种经分离的多肽或蛋白质，它包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或显示了与SEQIDNO:2至少95%氨基酸序列同一性。本发明还提供了鉴别药物的方法，所述药物调节编码本发明的蛋白质的核酸分子的表达。本发明还提供了鉴别药物的方法，所述药物调节本发明的一个蛋白质的浓度或至少一个活性。本发明还提供了调节编码本发明的蛋白质的核酸分子的表达的方法。本发明还提供了鉴别本发明的蛋白质的结合伴侣的方法。本发明还提供了鉴别能够阻断或调节本发明的蛋白质与结合伴侣连接的药物的方法。本发明还提供了降低或阻断本发明的蛋白质与一个或多个其结合伴侣的连接的方法。本发明还提供了非人转基因动物，通过改良使之含有本发明的核酸分子或通过改良使之含有突变的核酸分子从而阻止本发明的编码多肽的表达。本发明还提供了非人转基因动物，其中包含全部或部分SEQIDNO:l的基因的全部或部分已从动物基因组中敲除或删除。本发明还提供了包含稀释液和多肽或蛋白质的组合物，其中多肽或蛋白质包含氨基酸序列SEQIDNO:2或显示了与SEQIDNO:2至少95%的氨基酸序列同一性。本发明的基因和蛋白质可用作诊断药物或标记物以检测胰腺癌或从试样中区分正常组织和胰腺癌。它们还可用作调节基因表达或活性的药物靶点。例如，可以鉴别能调节与肿瘤生长有关的生物进程包括胰腺癌的增生过程的药物。A.与胰腺癌有关的蛋白质本发明提供了分离的蛋白质、这些蛋白质的等位变异体以及这些蛋白质的保守的氨基酸置换。如本文所用，"蛋白质"或"多肽，，部分涉及具有SEQIDNO:2表示的人氨基酸序列的蛋白质。这些术语还涉及天然产生的等位变异体和与以上特别描述的蛋白质具有轻微不同的氨基酸序列的蛋白质。虽然与以上描述的蛋白质具有轻微不同的氨基酸序列，但等位变异体仍具有相同或类似的与这些蛋白质相关的生物功能。如本文所用，涉及SEQIDNO:2的人氨基酸序列的蛋白质家族涉及从除了人以外的有机体分离出的蛋白质。用于鉴别和分离与这些蛋白质相关的此蛋白质家族其它成员的方法在下面描述。本发明的蛋白质优选为被分离的形式。如本文所用，当使用物理、机械或化学方法从通常与蛋白质相关的细胞组分中移除蛋白质时，认为蛋白质是分离的。一个熟练的技术人员可以容易地使用标准纯化方法获得分离的蛋白质。本发明的蛋白质还包括SEQIDNO:2的插入、缺失或保守氨基酸的置换变异体。如本文所用，保守的变异体涉及氨基酸序列的改变，其中该氨基酸序列的改变不负面影响蛋白质生物功能。当改变的序列阻止或中断了与蛋白质相关的生物功能时，认为置换、插入或缺失负面影响了蛋白质。例如，蛋白质的总电荷、结构或疏水/亲水性质，在特定情况下，可能改变但不影响生物功能。相应地，氨基酸序列可以改变例如使多肽更疏水或亲水，而不负面影响蛋白质的生物功能。通常，等位变异体、保守置换变异体和蛋白质家族的成员具有与SEQIDNO:2的序列至少有大约50%、60%、70%或75%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，更优选至少大约80-90%,更为优选至少大约92-94%,最优选至少大约95%、98%或99%序列同一性。关于这些序列的同一性或同源性在本文中定义为与SEQIDNO:2相同的候选序列中氨基酸残基的百分比，如果有必要，在排列序列和引入gaps后，达到最大百分比同源性，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性部分(参见有关参数B部分)。融合蛋白、或N-末端、C-末端或内部的延伸、缺失、或插入至肽序列不认为影响同源性。因此，本发明的蛋白质包括具有在SEQIDNO:2中公开的氨基酸序列的分子；其片段，所述片段具有至少大约3、4、5、6、10、15、20、25、30、35或更多这些蛋白质的氨基酸残基的连续序列；氨基酸序列变异体，其中将一个或多个氨基酸残基插入至N-或C-末端或所公开的编码序列内；和所公开的序列的氨基酸序列变异体，或它们如以上定义的至少置换一个残基的片段。这些片段，也称为肽或多肽，可含有抗原区域、鉴别为符合已知蛋白质结构域的氨基酸序列区域的蛋白质的功能区域以及显著亲水性的区域。使用常规获得的蛋白质序列分析软件例如MacVector(OxfordMolecular)能够容易地识别所有这些区域。预期的变异体还包括那些含有通过例如同源重组、定点或PCR诱变预定突变的变异体，和其它动物物种包括但是不限于兔、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、马和非人灵长类物种的蛋白质，和蛋白质家族的等位基因或其它天然产生的变异体；和衍生物，其中除了天然产生的氨基酸蛋白质部分通过置换、化学、酶学或其它适当的方法共价修饰(例如可检测部分如酶或放射性同位素)。本发明还提供了包含本发明的蛋白质或多肽和稀释剂的组合物。适合的稀释剂可以是水或非水溶剂或它们的组合，并且可以包含其它组分，例如水溶性盐或甘油，它们有助于蛋白质或多肽的稳定性、溶解性、活性和/或保存。如下描述，蛋白质家族的成员可用于(l)鉴别能调节蛋白质水平或至少一个活性的药物，(2)鉴别蛋白质的结合伴侣，(3)作为培养多克隆或单克隆抗体的抗原，(4)作为治疗药物或耙点和(5)作为胰腺癌和其它增生性疾病的诊断试剂或标记物。B.核酸分子本发明还提供了核酸分子，所述的核酸分子编码具有SEQIDNO:2的蛋白质，以及本文描述的相关蛋白质，优选分离的形式。如本文所用，"核酸"定义为编码如上定义的蛋白质或肽的RNA或DNA、它与编码这些肽的核酸序列互补、与SEQIDNO:1核酸杂交并且在适当的严格条件下与其稳定结合、它编码的多肽与SEQIDNO:2的肽序列至少有大约50%、60%、70%或75%、优选至少大约80-90%、更优选至少大约92-94%和最优选至少大约95%、98%、99%或更多的同源性或在SEQIDNO:1的整个开;^欠阅读框内有至少大约50%、60%、70%或75%、优选至少大约80-90%、更优选至少大约92-94%和最优选至少大约95%、98%、99%或更多核酸序列的同一性。本发明还包括与SEQIDNO:1补体特异性杂交的经分离的核酸分子，特别是在整个开放阅读框上特异性杂交的分子。这些与SEQIDNO:1补体特异性杂交的分子通常在严格的杂交条件下这样做。不管是来自天然来源或合成，基因组DNA、cDNA、mRNA和反义分子以及基于可变骨架或包括可变碱基的核酸是特异性设计的。然而，这些杂交或互补的核酸在任何现有技术下还认为是新的和非显而易见的核酸，包括那些在适当的严格条件下编码、杂交的或与编码根据本发明的蛋白质的核酸互补的核酸。在核苷酸或氨基酸序列水平上的同源性或同一性由BLAST(基本局部序列检索工具)分析，使用特定用于序列相似性检索的blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx软件(Altschul等人，(1997)，NucleicAcidsRes.25:3389-3402，和Karlin等人，(1990),Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268,两篇均全文引入以作参考)运算确定。BLAST软件使用的方法首先考虑在查询序列和数据库序列之间、有或没有gaps的相似的片段，然后评价所有被鉴别的配对的统计学显著性，最后仅总结那些满足显著性预设阈值的配对。对于序列数据库的相似性检索中的基本问题的讨论，参见Altschul等人，(1994),Nat.Genet.6:119-129,全文引入已作参考。直方图、描述、排列、预期(例如报告对数据库序列配对的统计学意义阈值)、断面、矩阵和过滤(低复杂性)的^r索参数使用缺省设置。使用blastp、blastx、tblastn和tblastx的缺省评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等人，(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919，全文引入已作参考)，用于长度超过85个核苦酸或氨基酸的查询序列。对于blastn,评分矩阵以M(例如配对残基的奖励分数)和N(例如错误配对残基的惩罚分数)的比例设置，其中M和N的缺省值分别是5和-4。四个blastn参数如下调整Q=10(gap建立惩罚)；R=10(gap延伸惩罚)；wink-l(随着查询在每个winkth位置产生字采样数)；和gapw^l6(设置窗宽在其中产生gapped排列)。相应Blastp参数设置是Q=9;R=2;wink=l;和gapw=32。GCG软件包10.0版本可获得的序列之间的Bestfit比对使用DNA参数GAP=50(gap生成惩罚)和LEN=3(gap延伸惩罚)而蛋白质比对中的相应参数是GAP二8和LEN二2。"严格条件"是指(l)使用低离子强度和高温度洗涤，例如0.015MNaCl/0.0015M枸橼酸钠/0.1。/。SDS在50°C,或(2)在杂交期间使用变性剂如曱酰胺，例如含有0.1%牛血清白蛋白的50。/0(体积/体积)曱酰胺/0.1。/。聚蔗糖/0.1。/o聚乙烯吡咯酮/pH6.5含有750mMNaCl和75mM枸橼酸钠的50mM磷酸钠緩冲液在42°C。另一个实例是在50%曱酰胺、5xSSC(0.75MNaCl,0.075M枸橼酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1%焦磷酸钠、5xDenhardt，s溶液、超声处理的鲑精DNA(50^g/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖中在42。C杂交，且在42。C在0.2xSSC和0.P/。SDS中洗涤。一个熟练的技术人员能够容易地确定和适当改变严格条件以获得清晰和可检测的杂交信号。优选的分子是那些在以上条件下与SEQIDNO:1的补体杂交和编码功能或全长蛋白质的分子。更优选的杂交分子是那些在以上条件下与SEQIDNO:1的开放阅读框的互补链杂交的分子。如本文所用，当核酸分子基本上从编码其它多肽的污染核酸分子中分离出来时，该核酸分子称为"被分离的"。本发明还提供了所公开的核酸分子的片段。如本文所用，核酸分子的片段涉及编码或非编码序列的一小部分。片段大小由预期用途决定。例如，如果选择片段用来编码蛋白质的活性部分，这个片段需要足够大以编码蛋白质的功能区域。例如，可以制备编码与预测抗原区域相应的肽的片段。如果片段是用作核酸探针或PCR引物，那么选择片段长度以获得探测/启动期间相对小量的假阳性(参见G部分讨论)。用作聚合酶链反应(PCR)的探针或特异性引物的、或合成编码本发明的蛋白质的基因序列的本发明的核酸分子的片段(例如合成的寡核苷酸)能够通过化学技术例如Matteucci等人((1981)J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191)的亚磷酰胺法或使用自动化合成方法容易地合成。此外，较大的DNA片段能够通过众所周知的方法容易制备，例如定义多种基因的多种模块片段的寡核芬酸组的合成，随后连接寡核香酸以构建完整的修饰基因。本发明的核酸分子还可被修饰以含有用于诊断或探测目的的可检测标记。多种这些标记在本领域内公知且能够容易地与本文描述的编码分子一起使用。适合的标记包括但是不限于生物素、放射标记或萸光标记的核香酸等等。一个熟练的技术人员能够容易地使用任何这种标记来获得本发明的核酸分子的标记的变异体。C.其它相关核酸分子的分离如上所述，具有SEQIDNO:1的核酸分子的识别和鉴定允许一个熟练的技术人员分离出除了本文描述的序列外编码本蛋白质家族其他成员的核酸分子。此外，本发明公开的核酸分子允许一个熟练的技术人员分离的核酸分子能编码除了具有SEQIDNO:2的蛋白质的其它本蛋白质家族成员。例如，一个熟练的技术人员能够容易地使用SEQIDNO:2的氨基酸序列以产生抗体探针筛选由适当的细胞制备的表达文库。通常，来自于哺乳动物例如纯化蛋白质免疫的兔(如下描述)的多克隆抗血清或单克隆抗体可用于探测哺乳动物cDNA或基因组表达文库，例如Xgtll文库，以获得蛋白质家族其它成员的适当的编码序列。克隆的cDNA序列可表达为融合蛋白，使用其自身调控序列直接表达，或使用对用于酶表达的特殊宿主适合的调控序列的构建体进行表达。或者，可以合成本文描述的编码序列的一部分且将其用作探针从任何哺乳动物组织中回收编码蛋白质家族成员的DNA。制备含有大约18-20个核苷酸的寡聚物(编码大约6-7个氨基酸延伸)且将其用于筛选基因组DNA或cDNA文库以获得严格条件下或足够严格而消除过度水平的假阳性的条件下的杂交。此外，可制备寡核苷酸引物对以用于PCR来选择性克隆编码核酸分子。使用这些PCR引物的PCR变性/退火/延伸循环在本
技术领域：
中众所周知且能够容易改变以用于分离其它的编码核酸分子。编码本蛋白质家族的其它成员的核酸分子还可以在现有的基因组或其它序列信息中使用任何可用的计算方法进行鉴别，包括但是不限于PSI-BLAST(Astschul等人，(1997)Nucl.AcidsRes.25:3389-3402);PHI-BLAST(Zhang等人，(1998),Nucl.AcidsRes.26:3986-3990);3D-PSSM(Kelly等人，(2000),J.Mol.Biol.299:499-520);和其它计算分析方法(Shi等人，(1999),Biochem.Biophys.Res.Commun.262:132-138和Matsunami等人，(2000),Nature404:601-604)。D.含有核酸分子的rDNA分子本发明还提供了含有编码序列的重组DNA分子(rDNAs)。如本文所用，rDNA分子是在原位进行了分子操作的DNA分子。产生rDNA分子的方法在本领域内众所周知，例如,参见Sambrook等人,MolecularCloning-ALaboratoryManual,ThirdEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001。在优选的rDNA分子中，编码的DNA序列可操作地连接于表达调控序列和/或载体序列。本发明的蛋白质家族编码序列之一可操作地连接的载体和/或表达控制序列的选择正如本领域众所周知的直接取决于预期的功能性质例如蛋白质表达和待转化的宿主细胞。本发明设计的栽体至少能够将包括在rDNA分子中的结构基因直接复制或插入至宿主染色体，优选还可表达。用于调节一个可操作地连接的蛋白质编码序列的表达的表达控制元件在本领域公知，包括但是不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号和其它调节元件。优选地，诱导型启动子容易被调控，例如对宿主细胞的培养基中的营养物起反应。在一个实施方案中，含有编码核苷酸分子的载体包括原核复制子，例如在转化的原核宿主细胞例如细菌宿主细胞中具有指导自主复制和染色体外维持重组DNA分子能力的DNA序列。这些复制子在本领域中众所周知。此外，包括原核复制子的载体还可包括其能表达可检测的标记如耐药性的基因。细菌耐药性基因一般是那些对氨千西林、卡那霉素、氯霉素或四环素具有抗性的基因。包括原核复制子的载体还可包括能够在细菌宿主细胞例如大肠杆菌中指导编码基因序列表达(转录和翻译)的原核的或噬菌体启动子。启动子是一种表达调控元件，它由允许RNA聚合酶的结合和转录发生的DNA序列形成。与细菌宿主相容的启动子序列一般在含有用于本发明的DNA片段插入的方便的限制性酶切位点的质粒载体中提供。这些载体质粒一般是可从BioRadLaboratories,(Richmond,CA)获得的pUC8、pUC9、pBR322和pBR329、可从Pharmacia(Piscataway,NJ)获得的pPL和pKK233。与真核细胞相容的表达载体，优选那些与脊推动物细胞相容的，还可用于形成含有编码序列的rDNA分子。真核细胞表达载体，包括病毒载体，是本领域众所周知的且可从数个商业来源获得。通常，这些载体含有用于插入预想的DNA片段的方便的限制性酶切位点。这些载体一般是pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-l/pML2d(InternationalBiotechnologies,Inc)、pTDTl(ATCC,#31255)、本文描述的载体pCDM8等等真核表达载体。如果需要，载体可修饰为包括组织特异性启动子。用于构建本发明的rDNA分子的真核细胞表达载体还可包括在真核细胞中有效的可选标记，优选耐药性选择标记。优选的耐药性标记是在新霉素耐药性中表达结果的基因，例如新霉素磷酸转移酶(neo)基因(Southern等人，(1982)，J.Mol.Anal.Genet1:327-341)。或者，可选标记可在分离的质粒中存在，两个载体通过宿主细胞共转染引入，并且由可选标记的适合药物的培养来选择。E.含有外源性补充编码核酸分子的宿主细胞本发明还提供了用编码本发明的蛋白质的核酸分子转换的宿主细胞。宿主细胞既可以是原核的也可以是真核的。用于本发明的蛋白质表达的真核细胞没有限制，只要细胞抹与细胞培养方法相容且与表达载体的繁殖和基因产物的表达相容。优选的真核宿主细胞包括但是不限于酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选脊推动物细胞例如来源于小鼠、大鼠、猴或人细胞系。优选的真核宿主细胞包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞CCL61、可从美国典型培养物保藏中心获得的NIH瑞士小鼠胚芽细胞(NIH/3T3)CRL1658、幼地鼠肾细胞(BHK)等等真核组织培养细胞抹。任何真核宿主可用于表达编码本发明的蛋白质的rDNA分子。优选的真核宿主是大肠杆菌。适合的细胞宿主用本发明的rDNA分子转化通过众所周知的取决于使用的载体类型和使用的宿主系统的方法来完成。关于真核宿主细胞的转化，一般使用电穿孔法和盐处理法(参见例如Cohen等人，(1972),Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2110;和Sambrook等人，如前)。关于用含有rDNAs的载体转化脊推动物细胞，一般使用电穿孔法、阳离子脂或盐处理法，参见例如Graham等人，(1973)，Virol.52:456;Wigler等人，(1979)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:1373-1376。成功转化的细胞，例如含有本发明的rDNA分子的细胞，可通过众所周知的技术包括可选标记的选择来鉴别。例如，引入本发明的rDNA的细胞可克隆产生单个克隆体。可收集、裂解这些克隆体中的细胞且使用某方法例如Southern,(1975)J.Mol.Biol.98:503或Berent等人，(1985)Biotech.3:208描述的方法来检测它们的DNA内容物中rDNA的存在或通过免疫方法检测细胞中制备的蛋白质。本发明者制备了大肠杆菌DH5a/p313-JF3，且于2006年6月5日将它们存放在韩国生命科学院(保存号KCTC10954BP)。F.使用rDNA分子制备重组蛋白质本发明还提供了使用本文描述的核酸分子制备本发明的蛋白质的方法。总体来说，蛋白质重组体形式的制备一般包括以下步骤首先，获得编码本发明蛋白质的核酸分子，例如包含、基本上组成或组成SEQIDNO:1、或SEQIDNO:1的53-643或53-640核苷酸的核酸分子。如果编码序列通过内含子是连续的，和这些开放阅读框一样，那么它直接适合于任何宿主的表达。然后核酸分子优选置于与如上所述的适合的调控序列的可操作地连接中以形成含有蛋白质开放阅读框的表达单位。表达单位用于转化适合的宿主，而转化的宿主在允许重组蛋白质生成的条件下培养。重组蛋白质任选自培养基或细胞中分离；蛋白质的回收和纯化在一些杂质可容忍的情况下可以不是必要的。上述每个步骤都可以以多种方法完成。例如，预期的编码序列可从基因组片段中获得且直接在适合的宿主中使用。在多种宿主中可用的表达载体的构建使用适当的复制子和控制序列如上所述地完成。控制序列、表达载体和转化方法取决于用于表达基因的宿主细胞的种类且在前面已详细讨论。适合的限制性酶切位点，如果不是正常获得，可以加入编码序列的末端以提供可切割的基因来插入至这些载体中。一个熟练的技术人员可以容易地改变任何本领域公知的宿主/表达系统与本发明的核酸分子一起使用来制备重组蛋白质。G.鉴别能调节编码胰腺癌相关基因的核酸的表达的药物的方法本发明的另一个实施方案提供了鉴别能调节编码本发明蛋白质例如具有SEQIDNO:2氨基酸序列的蛋白质的核酸表达的药物的方法。这些检测方法可使用任何可获得监测本发明的核酸表达水平变化的方法。如本文所用，如果药物能够在细胞中上调或下调核酸的表达，那么称它能调节本发明的核酸的表达。在一个4企测方法中，可制备含有报告基因融合和/或5，和/或3'调节元件和任何可检测的融合伴侣的细胞抹，其中所述的报告基因融合位于由SEQIDNO:1的53-643核苷酸定义的开放阅读框内的核苷酸间。许多可检测的融合伴侣是公知的且容易地获得，其中包括萤火虫荧光素酶基因和编码氯霉素乙酰转移酶的基因(Alam等人，(1990)，Anal.Biochem.188:245-254)。然后在适当的条件和时间下使含有报告基因融合的细胞林与待测试药物接触。接触药物的样品和对照样品间报告基因的差异表达鉴别出调节本发明的核香酸表达的药物。其它检测方法可用于监测药物调节编码本发明蛋白质例如具有SEQIDNO:2的蛋白质的核酸表达的能力。例如，mRNA表达可通过与本发明的核酸杂交直接监测。在适当的条件和时间下检使细胞林接触待测药物，而总RNA或mRNA通过那些公开于Sambrook等人，MolecularCloning_ALaboratoryManual,ThirdEd"ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001的标准程序分离。优选的细胞是来源于人组织的，例如癌症病人的活检组织或培养细胞。可以使用细胞抹例如美国典型培养物保藏中心乳腺导管癌细胞林(目录号CRL-2320、CRL-2338和CRL-7345)、美国典型培养物保藏中心大肠腺癌细胞抹(目录号CCL-222、CCL-224、CCL-225、CCL-234、CRL-7159和CRL-7184)、美国典型培养物保藏中心肺腺癌细胞抹(目录号CRL-5944、CRL-7380和CRL-5907)、美国典型培养物保藏中心卯巢腺癌细胞抹(目录号HTB-161、HTB-乃和HTB_76)、美国典型培养物保藏中心胰腺癌细胞林(目录号HTB-79、HTB-80和CRL-2547)、美国典型培养物保藏中心前列腺癌细胞抹(目录号CRL-1435、CRL-2422和CRL-2220)和美国典型培养物保藏中心胃腺癌细胞林(目录号CRL-1739、CRL-1863和CRL-1864)。或者，可以使用其它可用细胞或细胞林。检测接触药物的细胞和对照细胞间RNA表达差异的探针可用本发明的核酸制备。优选，但是不是必须的，设计仅与靶核酸在高度严格条件下杂交的探针。在高度严格条件下仅形成高度互补的核苷酸杂交物。相应地，检测条件的严格性决定了为了形成杂交物两条核酸链间应存在的互补性的数量。应当选择严格性以使探针:靶杂交物和探针:非靶杂交物之间稳定性的差异最大化。探针可通过本领域公知的方法从本发明的核酸中设计出来。例如，探针的G+C含量和探针长度可影响探针结合其靶序列。优化探针特异性的方法通常可从Sambrook等人,如前，或Ausubel等人,ShortProtocolsinMolecularBiology,FourthEd.,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,1999中获得。根据每个探针的需要使用公知方法例如那些描述于Sambrook等人和Ausubel等人的方法改良杂交条件。总的细胞RNA或富集polyARNA的RNA的杂交可用任何可用方法完成。例如，总的细胞RNA或富集polyARNA的RNA可附着在固相载体上，而此固相栽体在该探针特异性杂交的条件下接触至少一种包含至少一个或一个本发明序列的一部分的探针。或者，包含至少一个或一个本发明序列的一部分的核酸片段可附着在固相载体例如硅片、多孔玻璃薄片或膜上。然后在附着序列特异性杂交的条件下使固相载体与样品中的总细胞RNA或polyARNA接触。这些固相载体和杂交方法可广泛得到，例如公开于Beattie,(1995)WO95/11755。通过检测所提供探针与来自于未处理细胞群和接触药物细胞群的RNA样品的特异性杂交的能力，鉴别出上调或下调编码具有SEQIDNO:2序列的蛋白质的核酸表达的药物。用于定性或定量分析mRNAs的杂交还可通过使用核糖核酸酶保护测定法(例如RPA,参见Ma等人，(1996)，Methods10:273-238)来进行。简要的说，包含编码基因产物的cDNA和噬菌体特异性DNA依赖性RNA聚合酶启动子(例如T7、T3或SP6RNA聚合酶)的表达载体在cDNA分子的3'末端、噬菌体启动子下游线性化，其中这个线性化的分子随后用作cDNA通过体外转录的标记的反义转录物合成的模板。标记的转录物随后与分离的RNA(例如总或部分的mRNA)的混合物在包含80%曱酰胺、40mMPipes、pH6.4、0.4MNaCl和1mMEDTA的緩沖液中45。C过夜培养杂交。获得的杂交物随后用包含40吗/ml核糖核酸酶A和2吗/ml核糖核酸酶的緩冲液消化。灭活和提取外源蛋白质后，样品上样至尿素/聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。在另一个检测方法中，为了鉴别影响瞬时基因产物表达的药物，首先鉴别生理学上表达本发明的基因产物的细胞或细胞抹。这样鉴别出的细胞和/或细胞抹预期包含必需的细胞结构以便在药物与适当的表面转导机制和/或胞质级联外源性接触的时候保持转录装置调节的精确性。此外，这些细胞或细胞抹将会用表达载体(例如质粒或病毒载体)的构建体进行转导或转染，其中该构建体包含编码瞬时基因产物的结构基因的一个可操作的非翻译的5'含启动子末端，此瞬时基因产物非常特殊，与一个或多个抗原片段融合，其中所述片段在所述启动子的转录控制下且表达为分子重量可与天然产生的多肽有区别的或还可包含一个特殊免疫标签或其它可检测标记物的多肽。这个过程在本领域中众所周知(参见Sambrook等人，如前)。如上所述转导或转染的细胞或细胞林随后在适当条件下接触药物。例如，在药学上可接受的辅药中的药物在生理水緩冲液例如生理pH下的磷酸盐緩沖液(PBS)、生理pH下的Eagles平衡盐溶液(BSS)、含有血清的PBS或BBS或含有PBS或BBS和/或血清的条件培养基中与细胞接触，37。C培养。所述条件可由本领域技术人员认为必要而修改。随后用药物与细胞接触，破坏所述细胞且将裂解液的多肽分级收集以便收集某一部分的多肽并且用抗体接触通过免疫方法(例如ELISA、免疫沉淀或蛋白质印迹法)进一步处理。从"药物接触的"样品中分离出来的蛋白质库与仅用辅药接触细胞的对照样品比较，与对照相比"药物接触的"样品中免疫生成信号的增加和减少用来区别药物的作用。H.鉴别能调节胰腺癌相关蛋白质的浓度或至少一种活性的药物的方法本发明的另一个实施方案提供了鉴别能调节本发明蛋白质例如具有SEQIDNO:2氨基酸序列的蛋白质的浓度或至少一种活性的药物的方法。这些方法或检测法可使用任何监测或检测预期活性的方法且对鉴别治疗胰腺癌的药物特别有用。在一个方法中，可检测与未处理的对照细胞群相比用待测药物处理的细胞群中本发明蛋白质的相对量。在这个方法中，使用探针例如特异性抗体来监测在不同细胞群中此蛋白质的差异表达。细胞抹或群在适当的条件和时间下用待测药物处理。细胞裂解物可用处理的细胞抹或群和未处理细胞林或群的对照来制备。然后用探针分析细胞裂解物。抗体探针通过使用本发明的肽、多肽或蛋白质在适当的免疫方案下免疫适合的哺乳动物宿主来制备如果它们具有足够长度，或如果希望或需要增强免疫原性，则与适合的载体缀合。制备连有载体例如BSA、KLH或其它载体蛋白质的免疫原性缀合物的方法在本领域中众所周知。在一些情况下，使用例如碳二亚胺试剂直接缀合可能有效；在其它情况下，可能希望获得连接试剂例如PierceChemicalCo.(Rockford,IL)所提供的试剂来得到半抗原。半抗原肽即可在氨基末端也可在羧基末端用半胱氨酸残基延长或用半胱氨酸残基散开以例如便于载体的连接。一般通过在一个适合的时间期限内注射和使用适合的佐剂来进行免疫原的处理，正如本领域内一般了解的那样。在免疫接种期间，根据抗体滴定度来确定足够的抗体形成。虽然以此法制备的多克隆抗血清可能满足一些应用，对于药学组合物，优选使用单克隆制剂。正如一^L公知的那样，分泌预期单克隆抗体的无限增殖化细胞林可使用Kohler和Milstein((1975)Nature256:495-497)的标准方法或影响淋巴细胞或脾细胞的无限增殖化的改良法来制备。分泌预期抗体的无限增殖化细胞林用免疫测定法来筛选，其中抗原是肽半抗原、多肽或蛋白质。当适当的无限增殖化细胞培养分泌的预期抗体被鉴别时，细胞即可在体外培养也可在腹水(ascitesfluid)中培养。然后从培养上清液或腹水上清液中收集预期的单克隆抗体。含有免疫显著性(抗原结合)部分的单克隆抗体或多克隆抗血清的片段以及完整抗体可用作拮抗剂。通常优选使用免疫活性(抗原结合)抗体片段，例如Fab、Fab，或F(ab，)2片段，特别是在治疗背景下，因为这些片段一般比完整免疫球蛋白免疫原性低。还可使用现有技术通过重组方法制备抗体或抗原结合片段。特异性结合蛋白质的预期区域的抗体区域还可以用多种种类来源的嵌合体形式制备，例如人化抗体。用以上方法检测的药物可随机选择或合理选择或设计。如本文所用，当不考虑与本发明蛋白质本身或其相关底物、结合伴侣等等连接有关的特异性序列随机选择药物时，认为药物是随机选择的。随机选择药物的实例是使用化合物库或肽组合物库或生物体的生长肉汤培养基。如本文所用，当在考虑靶位点序列和/或其与药物作用的构象的非随机基础上选择药物时，认为药物是合理选择的。药物可通过使用组成这些位点的肽序列合理选择或合理设计。例如，合理选择的肽药物可以是与任何功能共有序列位点的氨基酸序列相同或是其衍生物的肽。本发明的药物可以是，例如，肽、小分子、维生素衍生物以及碳水化合物。可以引入显性负性蛋白质、编码这些蛋白质的DNAs、这些蛋白质的抗体、这些蛋白质的肽片段或这些蛋白质的模拟物至细胞中来影响功能。如本文所用的"模拟物"涉及肽分子的一个区域或多个区域的修饰以提供与原始肽不同的化学结构但与原始肽的拓朴学和功能类似(参见Grant:MolecularBiologyandBiotechnology,Meyers,ed.,pp.659-664，VCHPublishers,Inc.,NewYork,1995)。一个熟练的技术人员能够容易地认识到对本发明药物的结构性质没有限制。本发明的肽药物可使用本领域公知的标准固相(或液相)肽合成方法来制备。此外，编码这些肽的DNA可使用商业获得的寡核苦酸合成仪器来合成和使用标准重组生产系统来重组制备。如果包括非基因编码的氨基酸，则必须使用固相肽合成来生产。本发明药物的另一种类是与本发明蛋白质的关键部位免疫反应的抗体。抗体药物通过用含有作为抗原区域、预计为抗体靶点的这些蛋白质部分的肽来免疫接种适合的哺乳动物受体而获得。I.调节胰腺癌相关蛋白质的表达或至少一种活性的药物的使用如实施例中所提供，本发明的蛋白质和核酸，例如具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白质，在胰腺癌组织中差异表达。上调或下调或调节蛋白质表达或蛋白质至少一种活性的药物，例如激动剂或拮抗剂，可用来调节与蛋白质功能和活性相关的生物和病理过程。这包括使用本发明的同系物和同型物鉴别的药物。如本文所用，受体可以是任何哺乳动物，只要此哺乳动物需要调节本发明的蛋白质介导的病理或生物过程。术语"哺乳动物"定义为属于哺乳动物纲的个体。本发明对治疗人类受体尤其有效。病理过程涉及产生有害作用的生物过程范畴。例如，本发明蛋白质的表达可与细胞生长或增生相关。如本文所用，当药物降低生物过程的程度或严重性时，称为药物调节病理过程。例如，通过施用能上调或下调或以某种方式调节本发明蛋白质的表达或至少一种活性的药物，癌症可以被预防或疾病过程被调节。本发明的药物可单独提供，或以其它调节特定病理过程的药物组合提供。例如，本发明的药物可与其它已知药物组合用药。如本文所用，当两种药物同时给药或单独给药但会同时起作用时，称两种药物组合给药。本发明的药物可通过胃肠外、皮下、静脉、肌内、腹膜内、经皮或口腔途径给药。或者，可以同时通过口服给药。给药剂量取决于年龄、健康和受体重量、如果有的话，共存的治疗类型、治疗频率和预期结果的性质。本发明还提供了含有调节本发明蛋白质的表达或至少一种活性的一种或多种药物的组合物。本领域技术人员根据个体不同需要来确定每个组分的有效量的最佳范围。一般剂量包含0.1-100pg/kg体重。优选剂量包含0.1-10吗/kg体重。最优选剂量包含0.1-1吗/kg体重。除了药理学活性成分，本发明的组合物可含有适当的药学上可接受的载体，包括赋型剂和辅料，它们可使活性化合物利于加工为药学上可用于输送至作用位点的制剂。适合的胃肠外给药制剂包括活性化合物为水溶形式的水溶液，例如水溶性盐。此外，活性化合物混悬液可用作适合的油剂注射混悬液给药。适合的亲脂溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯。水剂注射混悬液可含油增强混悬液粘度的基质包括例如羧曱基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，混悬液还可含有稳定剂。脂质体还可用于包裹药物以运输至细胞。根据本发明的全身给药的药学制剂可以制成肠内、胃肠外或外用给药。事实上，所有三种制剂可同时使用以完成活性成分的全身给药。口服给药的适合制剂包括硬或软胶嚢、丸剂、片剂包括包衣片、酏剂、混悬液、糖浆剂或吸入剂和它们的控释形式。在实施本发明的方法中，本发明的化合物可单独使用或组合使用，或与其它治疗或诊断药物组合使用。在一些优选的实施方案中，本发明化合物可与其它在这些条件下根据一般承认的医疗实践通常建议的化合物同时给药。本发明的化合物通常在哺乳动物例如人、羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠中可用于体内，或体外使用。J.鉴别结合伴侣的方法
技术领域：
：本发明的另一个实施方案提供了用于分离和鉴别本发明蛋白质的结合伴侣的方法。一般来说，本发明的蛋白质与潜在的结合伴侣或细胞提取物或组分在允许潜在的结合伴侣与本发明蛋白质结合的条件下混合。混合后，与本发明蛋白质结合的肽、多肽、蛋白质或其它分子从混合物中分离出来。然后结合于本发明蛋白质的结合伴侣可以被移出并进一步分析。为了鉴别和分离结合伴侣，可以使用整个蛋白质，例如包含SEQIDNO:2整个氨基酸序列的蛋白质。或者可以使用蛋白质片段。如本文所用，细胞提取物涉及由裂解的或破坏的细胞制备的制剂或组分。细胞提取物的优选来源是来源于人肿瘤的细胞或转化细胞，例如活检组织或来自癌的组织培养细胞。或者，细胞提取物可以从正常组织或可获得的细胞抹中制备。许多方法可用来获得细胞提取物。细胞可使用物理或化学破坏方法来破坏。物理破坏方法的实例包括但是不限于超声处理和机械断裂。化学裂解方法的实例包括但是不限于清洁剂裂解和酶裂解。一个熟练的技术人员可以容易地改变制备细胞提取物的方法以获得本方法中使用的提取物。一旦制备好细胞提取物，在蛋白质和结合伴侣可以发生结合的条件下混合提取物和本发明蛋白质。可以使用多种条件，最优选条件是接近类似人细胞的细胞质中发现的条件。特点例如同渗浓度、pH、温度和使用的细胞提取物浓度可以是不同的以优化蛋白质与结合伴侣的结合。在适当条件下混合后，结合的复合物从混合物中分离。可以使用多种技术来分离混合物。例如，特异于本发明蛋白质的抗体可用来免疫沉淀结合伴倡复合物。或者可以使用标准化学分离技术例如色语法或密度/沉淀离心法。除去在提取物中发现的非结合细胞组分后，结合伴侣可以使用常规方法从复合物中分离。例如，可通过改变盐浓度或混合物的pH来完成分离。为了帮助从混合物的提取物中分离出结合的结合伴侣对，本发明蛋白质可在固相载体上固定。例如，蛋白质可连接在硝基纤维素基质或丙烯酸珠上。蛋白质与固相载体的连接有助于将肽/结合伴侣对与提取物中的其它组分进行分离。鉴别的结合伴估可以是单独的蛋白质或两个或多个蛋白质组成的复合物。或者，结合伴侣可以使用Far-Western检测法根据Takayama等人，(1997),MethodsMol.Biol.69:171-184或Sauder等人，(1996),J.Gen.Virol.77:991-996的操作程序或通过使用表位标记的蛋白质或GST融合蛋白来鉴别。或者，本发明的核酸分子可用于酵母双杂交系统或其它体内蛋白质-蛋白质检测系统。酵母双杂交系统已用于鉴别其它蛋白质伴侣对且可以容易地改变以使用本文描述的核酸分子。K.胰腺癌相关蛋白质的结合伴侣的用途一旦被分离出来，使用上述方法获得的本发明蛋白质的结合伴侣，以及其同系物或同型物可以用于多种目的。结合伴倡可以用于使用本领域公知技术产生与结合伴倡结合的抗体。与结合伴侣结合的抗体可用于检测本发明蛋白质的活性，作为治疗药物调节本发明蛋白质介导的生物或病理过程，或纯化结合伴侣。这些用途将在下面详细描述。L.鉴别能阻断结合伴侣和胰腺癌相关蛋白质结合的药物的方法本发明的另一个实施方案提供了用于鉴别能降低或阻断本发明蛋白质与结合伴侣结合的药物的方法。具体来说，本发明蛋白质与结合伴侣在待测药物的存在和不存在下混合。在允许蛋白质结合的条件下混合后，分析两个混合物并比较确定是否药物降低或阻断了本发明蛋白质与结合伴估的结合。阻断或降低本发明蛋白质与结合伴估结合的药物鉴别为降低了含有待测药物的样品中存在的结合数量。如本文所用，当药物存在避免或降低与本发明蛋白质结合的结合伴侣程度时，称为药物能降低或阻断本发明蛋白质和结合伴侣间的结合。一类药物将通过与结合伴估结合来降低或阻断结合，而另一类药通过与本发明蛋白质结合来降低或阻断结合。以上方法中使用的结合伴侣既可以是分离的且具有全部特征的蛋白质也可以是与本发明蛋白质结合的具有部分特征的蛋白质或鉴别为在细胞提取物中存在的结合伴侣。对本领域技术人员来说，只要结合伴侣明显具有可鉴别的性质的特征例如分子量，即可使用本方法。在以上方法中检测的药物可以随机选择或合理选择或设计。如本文所用，当不考虑本发明蛋白质与结合伴侣的结合相关的特异性序列随机选择药物时，认为药物是随机选择的。随机选择药物的实例是使用化合物库或肽组合物库或生物体的生长肉汤培养基。如本文所用，当在考虑靶位点序列和/或其与药物作用的构象的非随机基础上选择药物时，认为药物是合理选择和设计的。药物可通过使用构成结合伴侣与本发明蛋白质的接触位点的肽序列来合理选择或合理设计。例如，合理选择的肽药物可以是本发明蛋白质和结合伴侣的接触位点氨基酸序列相同的肽。这样的药物将会通过与结合伴侣结合来降低或阻断本发明蛋白质与结合伴侣的结合。本发明的药物可以是，例如，肽、小分子、维生素衍生物以及碳水化合物。一个熟练的技术人员可以容易地认识到本发明药物的结构性质没有限制。本发明的一类药物是肽药物，其氨基酸序列根据本发明蛋白质的氨基酸序列选择。本发明的肽药物可以使用本领域公知的标准固相(或液相)肽合成法制备。此外，编码这些肽的DNA可以使用商业获得的寡核苷酸合成仪器合成和使用标准重组生产系统重组制备。如果包括非基因编码的氨基酸，则必须使用固相肽合成制备。本发明的另一类药物是与本发明蛋白质或结合伴侣的关键部位免疫反应的抗体。如上所述，抗体通过用含有作为抗原区域、预计为抗体靶点的这些本发明蛋白质部分或结合伴侣的肽免疫接种适合的哺乳动物受体而获得。关键区域包括与本发明蛋白质和结合伴侣的结合有关的接触位点。如以下讨论，将与本发明蛋白质的活性相关的重要的残基最小序列定义为功能性线性结构域，它能够有效用作诱饼以用于潜在相关分子的两次杂交筛选和鉴别。这些片段的使用与使用全长分子相比将显著增强筛选特异性，因而优选使用。相似的，线性序列还可用作亲合基质以便使用生化亲合提纯策略分离结合蛋白质。M.阻断结合伴侣和胰腺癌相关蛋白质间结合的药物的用途如实例中所提供的，本发明蛋白质和核酸，例如具有SEQIDN0:2氨基酸序列的蛋白质，在胰腺癌组织中差异表达。降低或阻断本发明蛋白质与结合伴侣的相互作用的药物，包括那些使用此蛋白质同系物或同型物鉴别的药物，可用于调节蛋白质功能和活性相关的生物和病理过程。如本文所用，受体可以是任何哺乳动物，只要该哺乳动物需要调节本发明蛋白质介导的病理或生物过程。术语"哺乳动物"意为属于哺乳动物纲的个体。本发明对治疗人受体尤其有效。病理过程涉及产生有害作用的生物过程范畴。例如，本发明蛋白质的表达与细胞生长和或增生有关。如本文所用，当药物降低该过程的程度或严重性时，认为药物调节病理过程。例如，通过施用能降低或阻断本发明蛋白质与结合伴侣的相互作用的药物预防胰腺癌或调节疾病过程。本发明的药物可以通过胃肠外、皮下、静脉、肌内、腹膜内、经皮或口腔途径给药。或者，可同时口服给药。给药剂量取决于受体年龄、健康和体重、如果存在共存治疗类型、治疗频率和预期作用的性质。本发明还提供了含有一种或多种阻断本发明蛋白质和结合伴侣结合的药物的组合物。本领域技术人员根据个体不同需要来确定每个组分的有效量的最佳范围。一般剂量包含0.1-100ng/kg体重。优选剂量包含0.1-10吗/kg体重。最优选剂量包含0.1-1^g/kg体重。除了药理学活性成分，本发明的组合物可含有适合的药学可接受的载体，包含能促进活性化合物加工为制剂的赋型剂和辅料，药学上可将该制剂运输至作用位点。适合的胃肠外给药制剂包括活性化合物为水溶形式的水溶液，例如水溶性盐。此外，活性化合物混悬液可用作适合的油剂注射混悬液给药。适合的亲脂溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯。水剂注射混悬液可含有增强混悬液粘度的基质包括例如羧曱基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，混悬液还可含有稳定剂。脂质体还可用于包裹药物以运输至细胞。根据本发明的全身给药的药学制剂可以制成肠内、胃肠外或外用给药。事实上，所有三种制剂可同时使用以完成活性成分的全身给药。口服给药的适合制剂包括硬或软胶嚢、丸剂、片剂包括包衣片、酏剂、混悬液、糖浆剂或吸入剂和它们的控释形式。在实施本发明的方法中，本发明的化合物可单独使用或组合使用，或与其它治疗或诊断药物组合使用。在一些优选的实施方案中，本发明化合物可与其它在这些条件下根据一般承认的医疗实践通常建议的化合物同时给药。本发明的化合物通常在哺乳动物例如人、羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠中可用于体内，或体外使用。N.合理药物设计和组合化学本发明还包含合理药物设计和组合化学。在鉴别可被开发为胰腺癌治疗中使用的化合物方面本领域技术人员可利用和开发本发明的特点发现合适的方法。关于多肽的合理药物设计需要鉴别和定义与设计的药物相互作用的第一个肽，并且使用第一个目标肽来定义第二个肽的需求。根据被定义的这些需求，人们可以寻找和制备符合所有或基本上所有定义的需求的适当的肽或非肽。因此，合理药物设计的一个目标是制备目的生物活性多肽或与它们相互作用的小分子(例如激动剂、拮抗剂、无效化合物)的结构或功能类似物以得到药物例如或多或少有效形式的配体。(参见例如Hodgson(1990)，Bio.Technology9:19-21)。组合化学是一系列合成和检测化合物生物活性的科学，而不是一个一个的。其目标是比从前更快和更廉价地发现药物和材料。由于计算机辅助蛋白质建模和药物开发方法的发展，合理药物设计和组合化学在近年来更紧密地联系在一起。(参见例如美国专利4,908,773;5,884,230;5,873,052;5,331,573;和5,888,738)。由于计算机图形学的来临，显著增加了分子模型作为合理药物设计和组合化学的工具的使用。不仅有可能在计算机屏幕上看到三维分子，还有可能检查大分子例如酶和受体与待测的合理设计的衍生分子的相互作用。(参见Boorman(l"2)，Chem.Eng.News70:18-26)。现在可获得大量的便于使用的软件和硬件，并且事实上所有制药公司都有计算机模型设计组进行合理药物设计。例如，MolecularSimulationsInc.(www.msi.com)出售数个高级软件,其允许用户从氨基酸序列开始、建立蛋白质或多肽的二维或三维模型、将其与其它二维或三維模型比较且用实时三维模型分析化合物、药物和肽的相互作用。相应地，在本发明的一些实施方案中，使用软件来比较本发明蛋白质和与其相互作用的分子(全部称为"结合伴侣"-例如抗蛋白质抗体)和这些分子的片段或衍生物的区域和其它分子例如肽、肽模拟物和化学药物，从而预测和设计治疗的相互作用。(参见Schneider(1998),GeneticEngineeringNewsDecember:page20;Tempczyk等人，(1997),MolecularSimulationsInc.SolutionsApril;和Butenhof(1998),MolecularSimulationsInc.CaseNotes(August1998)讨论分子建模)。O.基因治疗在另一个实施方案中，基因治疗可用作调节蛋白质功能和活性相关的生物和病理过程的方法。这包含将基因构建体插入癌细胞中，其中基因构建体编码包含所有或至少部分SEQIDNO:2序列的蛋白质、或者基因构建体包含所有或部分SEQIDNO:1非编码区域，可操作地连接于启动子或增强子元件上，因此所述蛋白质的表达导致所述癌的抑制且其中所述启动子或增强元件是调节所述基因构建体的启动子或增强子元件。在所描述的构建体中，所述蛋白质的表达可由任何适合的启动子指导(例如人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属疏蛋白启动子)且由任何适当的哺乳动物调节元件调节。例如，如果需要，已知在神经细胞、T细胞或B细胞中优选指导基因表达的增强子可用于指导表达。使用的增强子可包括但不限于那些特征为在表达中为组织或细胞特异性的。或者，如果LBFL313基因克隆用作治疗构建体(例如分离后用前述的本发明核酸分子杂交)，调节可通过同族调节序列来介导，或如果需要通过来源于异源的调节序列包括任何前述的启动子或调节元件来介导。将构建体插入癌细胞中在体内完成，例如使用病毒或质粒载体。这些方法还可用于体外用途。因此，本发明的方法容易地用于不同形式的基因治疗，无论细胞是经离体基因修饰然后应用于宿主或是使用包含特别适合于这些治疗的载体的多种适合方法的任何一个体内进行基因修饰。逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其它病毒载体和适当的可能与癌症有关的细胞(例如上皮细胞)的趋向性可用作治疗基因构建体的基因转移运输系统。大量对此目的有用的载体一般公知(CozziPJ等人，(2002)Prostate,53(2):95-100;BitzerM,LauerU.，(2002)DtschMedWochenschr.127(31-32):1623-1624;Mezzina和Danos(2002),TrendsGenet8:241-256;Loser等人，(2002)Curr.GeneTher.2:161-171;Pfeifer和Verma(2001)，Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.2:177-211)。逆转录病毒载体尤其很好的开发且已用于临床环境(Anderson等人，(1995),美国专利5,399,346)。非病毒方法还可用于引入治疗DNA至另外预测癌变的细胞中(Jeschke等人，(2002)Curr.GeneTher.1:267-278;Wu等人，(1998),J.Biol.Chem.263:14621-14624;Wu等人，(1989),J.Biol.Chem.264:16985-16987)。例如，基因可通过脂质转染法、asialorosonucoid多聚赖氨酸缀合、或较不优选的显微注射法在手术条件下引入神经或T细胞中。对于以上描述的任何应用方法，治疗的核酸构建体优选应用于癌位点(例如注射)。然而，还可应用于临近癌的组织或供给预测癌变的细胞的血管。P.转基因动物本发明还包括转基因动物，所述的转基因动物含有与SEQIDNO:1的cDNA序列、或编码SEQIDNO:2多肽序列的开放阅读框、或它们具有至少大约3、4、5、6、10、15、20、25、30、35或更多个氨基酸残基的连续序列的片段相应的突变、敲除或修饰基因。转基因动物是基因经修饰的动物，其中已经实验性的转入了重组、外源或克隆的基因材料。这些基因材料通常称为"转基因"。转基因的核酸序列，在这里是SEQIDNO:1的形式，可整合于特定核酸序列在其他正常情况下不会被发现的基因座上或转基因的正常部位。转基因可由来源于同种和与目标动物不同种的基因组的核酸序列组成。在一些实施方案中，可构建其中包含SEQIDNO:1的全部或部分基因缺失的转基因动物。在对应SEQIDNO:1的基因含有一个或多个内含子的情况下，整个基因-所有外显子、内含子和调节序列可以缺失。或者，可以缺失比整个基因少的基因。例如，单个外显子和/或内含子可以缺失，以生成表达本发明蛋白质的修饰形式的动物。术语"生殖细胞系转基因动物"涉及遗传改变或遗传信息引入生殖细胞系从而影响转基因动物转移遗传信息至后代的能力的转基因动物。如果这种后代事实上具有其改变或遗传信息的一些或所有，那么它们都是转基因动物。遗传信息的改变对于受体所属的动物种类来说可以是外源的、仅对具体个体受体是外源的、或可能受体已具有遗传信息。在后一种情况下，改变或引入的基因可与天然基因差异表达。转基因动物可通过多种不同方法制备包括转染、电穿孔法、显微注射法、在胚胎干细胞上基因靶向和重组病毒和逆转录病毒感染(参见例如美国专利4,736,866;美国专利5,602,307;Mullins等人，(1993),Hypertension22:630-633;Brenin等人，(1997),Surg.Oncol.6:99-110;RecombinantGeneExpressionProtocols(MethodsinMolecularBiology,Vol.62),Tuan,ed.,HumanaPress,Totowa,NJ.1997)。已制备大量重组或转基因小鼠，包括那些表达活化癌基因序列的(美国专利4,736,866);表达猿猴SV40T抗原的(美国专利5,728,915);缺少干扰素调节因子l(IRF-l)表达的(美国专利5,731,490);显示多巴胺机能障碍的(美国专利5,723,719);表达至少一个参与血压控制的人基因的(美国专利5,731,489);显示与天然发生的阿尔茨海默病中存在的情况更多相似性的(美国专利5,720,936);具有降低介导细胞黏附的能力(美国专利5,602,307);具有牛生长激素基因的(Clutter等人，(1996),Genetics143:1753-1760);或能够产生全部人抗体应答的(McCarthy(1997),Lancet349:405)。尽管小鼠和大鼠仍是大多数转基因实验中动物的选择，但在一些情况下优选或甚至是必须使用不同的动物种类。转基因操作已成功地在多种非鼠类动物中进行，包括绵羊、山羊、猪、狗、猫、猴、猩猩、仓鼠、兔、牛和豚鼠(参见例如Kim等人，(1997)，Mol.Reprod.Dev.46:515-526;Houdebine(1995)，Repord.Nutr.Dev.35:609-617;Petters(1994),Reprod.Fertil.Dev.6:643-645;Schnieke等人，(1997),Science278:2130-2133;和Amoah(1997),J.AnimalSci.75:578-585)。引入核酸片段至重组感受态哺乳动物细胞中的方法可使用任何利于多个核酸分子共转化的方法。本领域技术人员可容易地获得制备转基因动物的详细操作，包括美国专利5,489,743和美国专利5,602,307说明书。Q.诊断方法由于本发明的基因和蛋白质在胰腺癌组织中与非癌胰腺组织相比差异表达，本发明的基因和蛋白质可用于诊断或监测胰腺癌、跟踪疾病进程、或从非癌胰腺组织样品中区分胰腺组织。使用本发明的核酸分子或蛋白质诊断癌症的一个方法包括从生命体中获取组织。检测本发明的核酸或蛋白质分子的检测法可以是任何可用方法。核酸分子的一般检测法包括基于杂交或PCR的方法。检测本发明的蛋白质、多肽或肽的一般检测法包括在任何可用方法例如原位结合测定法等等中使用抗体探针(参见Harlow&Lane,Antibodies-ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1988)。在优选的实施方案中，检测在适当的对照下进行。一般来说，本发明的诊断可以根据实施方案是否是基于核酸或蛋白质的方法来分类。一些诊断方法检测本发明核苷酸或蛋白质的有助于癌畸变的突变或同质多晶现象。其它诊断方法通过检测本发明RNA或蛋白质在测定生物体中的浓度与患病如癌症生物体中本发明RNA或蛋白质的浓度类似、或通过检测测定生物体中RNA或蛋白质的浓度与未患病生命体中不同来鉴别和区别蛋白质活性的缺损。此外，设计制备试剂盒，所述试剂盒包括以下实施方案描述的试剂和方法以允许快速检测和鉴别蛋白质活性或浓度的变化。诊断试剂盒包括核酸探针或抗体或它们的组合，它们特异性检测本发明蛋白质或核酸探针或抗体或它们的组合的突变形式，可用于确定一个或多个本发明蛋白质的蛋白质表达或RNA浓度。这些试剂盒的检测组分一般由一个或多个以下试剂组合提供。通常还提供能够吸收或结合DNA、RNA或蛋白质的载体。可用载体包括特征为具有正电荷取代基阵列的硝基纤维素、尼龙或衍生尼龙膜。这些试剂盒可提供一个或多个限制性内切酶、对照试剂、緩冲液、扩增酶和非人多核苷酸如小牛胸腺或鲑精DNA。有用的基于核酸的诊断技术包括但是不限于定向DNA序列分析、梯度凝胶电泳、DNA印迹分析、单链构象分析(SSCA)、核糖核酸酶保护测定法、点印迹分析、核酸扩增、等位基因特异性多聚酶链反应和这些方法的组合。这些分析的起点是从生物样品中分离或纯化的核酸。预计活组织检查将会提供良好的样品来源。核酸从样品中提取且可用DNA扩增技术例如多聚酶链反应(PCR)使用引物扩增。本领域技术人员可容易地想到可用于证实同质多晶现象存在的方法。此外，任何本领域公知的固定阵列技术可用于本发明的此方面。一个多核苷酸阵列的具体实施方案已知为GenechipsTM,且大体描述于美国专利5，143，854;PCT出版号WO90/15070和92/10092。本领域技术人员公知多种标记和缀合技术，且可用于多种核酸检测法。有数个方法制备用于杂交或PCR的标记核酸，包括但是不限于寡聚物标记、缺口转译、末端标记或使用标记的核苷酸PCR扩增。或者，编码本发明蛋白质的核酸可克隆至栽体中制备mRNA探针。本领域公知这些载体，可商业获得，且可用于通过加入适当的RNA聚合酶例如T7、T3或SP6和标记的核芬酸体外合成RNA探针。许多公司例如PharmaciaBiotech(Piscataway,NJ)、Promega(Madison,WI)和U.S.BiochemicalCorp(Cleveland,OH)提供商业试剂盒和这些操作的实验设计。适合的报告分子或标记物包括放射性核素、酶、荧光的、化学发光的或显色试剂以及底物、辅助因子、抑制剂、磁性颗粒等等。在一个优选的基于蛋白质的诊断中，本发明抗体结合于有序芯片的载体上，其中大量抗体连接于载体的不同区域之间并且彼此不重叠。本领域技术人员容易地想到基于蛋白质的诊断可用方法。蛋白质获得自生物样品且用常规方法标记(例如放射性、比色或荧光)。使用已知浓度的突变和/或野生型本发明蛋白质标记的标准物，研究者可精确地确定样品中本发明蛋白质的浓度且从此信息可评价蛋白质具体形式的表达水平。光密度法的常规方法还可用来更精确地确定此蛋白质的浓度和表达水平。这些方法还便于自动化使用本领域技术人员公知的高通量诊断分析技术。如前详述，任何本领域公知的固定阵列技术可用于本发明的此方面且显示了蛋白质在芯片上的排列，目的在于使抗体结合模式和诊断信息最大化。如前所述，本发明基因或蛋白质中同质多晶现象的存在和检测可提供生物体中癌症或类似疾病的诊断。其它实施方案包括制备诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含检测组分例如特异于本发明基因或蛋白质的特定的多态变异体的抗体。检测组分通常和一个或多个以下试剂组合提供。通常提供能够吸收或结合RNA或蛋白质的载体。此目的的可用栽体包括但是不限于特征为具有正电荷取代基阵列的硝基纤维素、尼龙或衍生尼龙膜、和GenechipsTM或它们的同等物。试剂盒中可提供一种或多种酶，例如逆转录酶和/或Taq聚合酶，以及dNTPs、緩沖液或非人多核苷酸如小牛胸腺或鲑精DNA。试剂盒检测得到的结果可由医疗保健提供者或诊断实验室解释。或者，诊断试剂盒可制备并出售给私人来自我诊断。除了根据同质多晶现象的存在和不存在来诊断疾病，包括癌症的一些疾病起因于特定组织中本发明蛋白质或基因的倾斜浓度或本发明蛋白质表达的异常模式。通过监测多个组织中的表达水平，例如可进行诊断或鉴别疾病状态。相似地，通过确定特殊组织中多个本发明蛋白质的表达水平比例(例如表达模式)，可进行健康或疾病的预测。确定在健康个体以及患有癌症的个体中多个组织中本发明蛋白质的表达水平。这些数值可记录在数据库中且可与受试个体得到的数值比较。此外，在健康和疾病个体的多个组织中表达的比例和模式也记录在数据库中。这些分析称为"疾病状态图"，通过比较一个疾病状态图(例如从健康或疾病个体中)与受试个体的疾病状态图，临床医生可以快速诊断疾病存在与否。如前描述的基于核酸和蛋白质的诊断技术可用于检测组织中本发明基因表达或蛋白质的水平或数量或比例。通过例如定量RNA印迹杂交、原位分析、免疫组化、ELISA、基因芯片阵列技术、PCR和蛋白质印迹法，本发明特定蛋白质(野生型或突变)的RNA或蛋白质表达的数量或浓度可以快速地确定，且可以根据这些信息确定表达比例。或者，待分析的本发明蛋白质可以是当前未知但根据前述的一个或多个同源区的性质鉴别的家族成员。附图简述图1图1显示了分泌LBFL313(SEQIDNO:2)的预测信号序列。使用SignalIP3.0Server(www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/)进行了分析。图2图2是蛋白质印迹分析的结果，显示了在细胞的培养上清液中检测到LBFL313。图3图3显示了在CHO细胞中LBFL313的过表达对细胞增生(图A)、游动性(图B)和侵入性(图C)的影响。图4图4显示了在棵小鼠中LBFL313的过表达对肿瘤发生(图A)和微血管形成(B图)的影响。图5图5显示了使用胰腺活组织检查样品和抗LBFL313抗体免疫组化分析LBFL313表达的代表性结果。图6图6描述了显示多克隆抗LBFL313抗体对胰腺癌细胞抹侵入性的影响的图。最佳实施方式在没有进一步说明的情况下，相信本领域谱通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例制备和使用本发明化合物并且实践要求保护的方法。因此以下的工作实施例，特别是本发明指出的优选实施方案，不能解释为以任何方式限制本说明书的其他部分。实施例实施例1在胰腺癌中鉴别mRNA的差异表达病人组织样品来源于韩国病人且分为两组。一组由已诊断为胰腺癌的病人组成。这一组里的病人，包括六男三女，年龄范围为51-70。第二组病人已诊断为正常胰腺。这组中三男，病人年龄范围是63-66。每个组织样品进行组织学分析且样品分为非癌和癌范畴。根据最小改变，样品制备方案按照AffymetrixGeneChipExpressionAanlysisManual手册实施。冷冻组织首先使用SpexCertiprep6800冷冻粉碎制成粉末。然后使用Trizol(LifeTechnologies)提取总RNA。随后，使用OligotexmRNAMidi试剂盒(Qiagen)分离mRNA。使用1-5mgmRNA用SuperscriptChoice系统(Gibco-BRL)制备双链cDNA。第一条cDNA链的合成用T7-(dT24)寡核普酸引导。然后酚-氯仿抽提cDNA,乙醇沉淀得到终浓度1mg/ml。从2mgcDNA开始，根据标准程序合成cRNA。为了生物素标记cRNA,加入核苦酸Bio-ll-CTP和Bio-16-UTP(EnzoDiagnostics)至反应中。37。C培养6小时后，根据RneasyMini试剂盒实验设计(Qiagen)纯化标记的cRNA。然后cRNA在94°〇断裂35分钟(5，断裂緩冲液200mMTris-醋酸盐(pH8.1),500mMKOAc,150mMMgOAc)。55mg断裂cRNA在一套AffymetrixHumanGenomeU133sets芯片上在45。C杂交烘箱中以60rpm杂交24小时。冲洗小芯片然后用链霉抗生物素蛋白藻红蛋白(SAPE)(分子探针MolecularProbes)在Affymetrix流控操作台上染色。为了放大染色，加入两次SAPE溶液，并在两次之间有一个抗链霉抗生物素蛋白生物素化的抗体(VectorLaboratories)染色步骤。与探针芯片的杂交通过荧光扫描(HewlettPackard基因芯片扫描仪)检测。杂交和扫描后，分析微芯片图像进行质量控制，寻找杂交信号中的主要芯片缺陷或异常。最后，所有芯片通过QC、AffymetrixMicroarraySuite(v5.0)和LIMS(v3.0)。基因在癌和非癌胰腺样品中的差异表达通过使用Affymetrix人GeneChipsetsUl33用以下统计方法来确定。(l)对于每个基因，U133的信号值通过AffymetrixMicroarray31Suite(v5.0)来确定，对个每个GeneChip单位还设置"Absent"(=未检测到)、"Present"(=检测到)或"Marginal"(=不清楚Absent或Present)信号。(2)在胰腺癌样品组中使用至少40%存在信号的标准，选择基因组进行进一步分析。(3)所有信号值转化为对数尺度。(4)方差分析(AN0VA)方法用于数据分析(Steel等人，PrinciplesandProceduresofStatistics:ABiometricalApproach,ThirdEd.,McGraw-Hill,1997)。芯片数据分析显示与来自正常胰腺组织的样品相比胰腺癌样品中标记物LBFL313的表达显著性上调(11.13倍，p=0)。这些数据显示LBFL313的上调可以诊断为胰腺癌。LBFL313(SEQIDNO:l)的表达水平可通过芯片序列片段编号228058—at在AffymetrixGeneChipU133上测量。通过组合4乞掘以上凄丈才居与GeneLogic,Inc.(Gaithersburg,MD)的GeneExpressOncologyDatasuiteTM,与正常对照组织相比，228058—at在多种恶性肿瘤中的表达水平在表l中显示，其中还显示了变化倍数和变化方向(上或下调)。超过1.5的变化倍数认为是显著性的。GeneChip表达结果，由结合于芯片序列片段编号228058_at的样品确定，通过定量RT-PCR(Q-RT-PCR)使用Taqman⑧检测法(Perkin-Elmer)确证。由特异性Affymetrix片段(228058—at)的序列信息文件设计的PCR引物在此检测中使用。每个RNA样品(IOng总RNA)中的靶基因相对外源性刺突(spiked)参照基因测定。为了这个目的，四环素耐药性基因用作外源插入刺突。这个方法提供了相对于Tet刺突Ct的常量值靶mRNA周期阈值(Ct)测量的相对表达。样品组包括在U133GeneChips上分析的组织RNAs。此外，数个未在GeneChip上分析的新样品通过Q-RT-PCR用于表达确证。Q-RT-PCR数据证实了与正常胰腺活检样品相比在胰腺癌中观察到的LBFL313的上调。表1LBFL313在恶性肿瘤中的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>实施例2对应差异表达的mRNA种类的全长人cDNA(LBFL313)的克隆具有SEQIDNO:1的全长cDNA通过寡-拉(oligo-pulling)方法获得。简言之，基因特异性寡聚物是基于LBFL313的序列设计的。寡聚物用生物素标记且用于与2昭单链质粒DNA(cDNA重组体)杂交，所述单链质粒DNA按照Sambrook等人的操作来自人胎盘库。杂交的cDNAs通过链霉抗生物素蛋白-缀合的小珠分离且加热洗脱。洗脱的cDNA转化为双链质粒DNA且用于转化大肠杆菌细胞(DH10B),并且筛选最长的cDNA。通过使用基因特异性引物的PCR确证正向选择后，对cDNA克隆进行DNA序列分析。对应以上^f全测的差异调节的mRNA的全长人cDNAs的核苷酸序列在SEQIDNO:1中列出。cDNA包含777个碱基对。SEQIDNO:1的cDNA核苦酸序列内的开放阅读框，在53-640位核脊酸(53-643包括终止密码子)上，编码一个196个氨基酸的蛋白质。对应SEQIDNO:l编码的预计蛋白质的氨基酸序列在SEQIDNO:2中列出。SEQIDNO:2含有一个类Jacalin凝集素结构域含有此结构域的蛋白质是凝集素。发现这些蛋白质内的1-6个拷贝。这个结构域还在动物前列腺精胺结合蛋白质(Raval等人，(2004)Glycobiology14:1247-1263)中发现。图1显示了使用SignalIP3.0Server(www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/)信号序列分析的结果。潜在的分泌信号序列断裂位点预测在40位(Ala)和41位(Gly)的氨基酸之间。进行RNA印迹分析以确定对应LBFL313的mRNA转录物的大小。使用含有来源于多种人组织的总RNAs的RNA印迹分析(人12道MTN印迹，Clontech，PaloAlto，CA)，并且通过随机引物方法放射性标记一个含有228058—at序列的EST,用于探测印迹。印迹在50%曱酰胺、5xSSPE、0.1%SDS、5xDenhart，s溶液和0.2mg/ml绯精DNA中42。C杂交且用含有0.1%SDS的0.2xSSC在室温冲洗。RNA印迹显示了这个基因的单个转录物，大约0.8kb大小。这对应于LBFL313克隆(SEQIDNO:l)的大小。实施例3LBFL313转染细胞抹的制备LBFL313的编码区域通过PCR使用正向引物(5'-TTGGGATCCGTATAAAGGCGATGTGGAGG-3，)插入BamHI位点和反向引物(5'-ACCATCTAGAGCGACCCACGGGTGAGT-3，)插入Xbal位点扩增。PCR使用TaqPlus精密DNA聚合酶(Stratagene,CA)根据厂商说明书进行。PCR扩增循环包括最初94。C变性2分钟，和27圈；94°C30秒、50°C30秒，72°C1分钟，随后72°C10分钟最终延伸。PCR产物克隆至哺乳动物表达载体pcDNA3.1-mycHis(Invitrogen)的BamHI和Xbal位点。克隆的质粒(pLFG250)通过克隆位点的区域序列分析以确证其一级结构。分汇合培养(Subconfluent)的CHO细胞用pLFG250或pcDNA3.1-mycHis载体与LipofectaminePLUS试剂(Invitrogen)—起使用根据厂商说明书稳定转染。24小时后，转染细胞在含有10%FBS和400吗/mlG418(Sigma)的Ham'sF12(Invitrogen)中培养以选择。每两天改变一次选择培养基，10-12天后使用克隆环分离阳性克隆。进一步扩大培养基并检测LBFL313表达。细胞在含有50mMHEPES(pH7.2)、150mMNaCl、25mMp-glyserophosphate、25mMNaF、5mMEGTA、lmMEDTA、l%NP-40、1mM原钒酸钠、0.1mMPMSF和蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂合剂(亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽、抑肽酶和抗痛素各5ng/ml)的裂解緩冲液中裂解。培养基通过10kcut-offmicrocon(Amicon)浓缩至15体积。蛋白质在4xSDS上样緩沖液中于95。C培养5分钟还原。多肽以10mA/凝胶在12。/。SDS-PAGE凝胶上溶解且在4。C以200mA/凝胶2小时电泳转染至0.45pmlmmobilonP-转移膜(Millipore)。膜在含有5。/。(w/v)脱脂乳的TBST緩冲液(25mMTris,pH7.5;125mMNaCl和0.P/o(v/v)吐温-20)中封闭1小时。然后用抗HisHRP抗体(SantaCruz)过夜探测印迹。然后用增强型化学发光(ElpisBiotech)根据厂商说明书显影免疫反应物质。如图2所示，LBFL313蛋白质仅在培养上清液而未在细胞提取物中检测到。这证实了LBFL313编码一个分泌性蛋白质的预测。实施例4细胞增殖、移动和侵入中LBFL313过表达的分析为了确定LBFL313过表达对细胞增殖的影响，通过细胞计数测量生长速率。在12孔板中，接种4xl(^个细胞。平板在37。C和5%C02中培养12天且细胞数量用血细胞计数器每天计数。结果用平均值+3次的标准偏差表示。如图3A所示，在CHO细胞中，LBFL313的过表达诱导较快的增殖。类似作用在LBFL313-过表达的PANC-1胰腺癌细胞林中观察到。通过博伊登室方法研究移动和侵入。两个检测均在48孔博伊登室NeuroProbe48孔小室(Neuroprobe)中进行。细胞受胰蛋白酶消化且重悬在胰蛋白酶抑制剂，大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma)溶液中。细胞沉淀且重悬在无血清培养基中至终浓度为2xl(^个细胞/ml。小室中较低的孔用30pl标准培养基充满。使用聚碳酸酯滤器组合小室(聚碳酸酉旨，8pm大小孔直径，Neuroprobe)。对于细胞侵入检测，1mg/mlMatrigel基底膜(BDbiosciences)铺在每个滤器(500吗/滤器))上且空气干燥。50nl细胞悬液样品(lx105个细胞/孔)加入上层室中。小室在37。C和5%C02中培养且培养时间根据待分析的细胞类型而不同在CHO移动测定下培养24小时，CHO侵入测定下培养48小时和PANC-1移动和侵入测定下培养18小时。在培养结束时，滤器上表面的细胞机械移除。滤器用曱醇固定且用姬姆萨染料，改良溶液(Sigma)染色。在光学显微镜(01ympus)下计数每个视野(100x)中移动细胞的数量。每个样品测定三次。如图3B和图3C所示，CHO细胞运动性和侵入性通过LBFL313的过表达增强了。类似作用在LBFL313-过表达的PANC-1胰腺癌细胞抹中也观察到。实施例5LBFL313过表达对棵小鼠的肿瘤发生的作用确定了LBFL313过表达对体内胂瘤生长的生物作用。给免疫缺乏的棵小鼠的侧腹皮下注射CHO细胞。融合的CHO细胞，未转染或用LBFL313栽体(pLGF250)或单独载体稳定转染，用胰蛋白酶消化且以3.3xl0个细胞/ml的密度重悬于PBS中。每类CHO细胞皮下注射500万个至5-8周大的雌Balb/C(nu/nu)小鼠侧腹。在小鼠生长过程中，测量肿瘤的长度和宽度。用公式肿瘤体积-(长度)x(宽度)2/2来计算肿瘤体积。37天后，处死小鼠和分析肿瘤。如图4A所示，LBFL313-转染细胞产生的肿瘤比模拟对照细胞形成的肿瘤5倍还大。为了确定肿瘤诱发血管生成的程度，肿瘤异种移植物的石蜡切片用抗因子VIII单克隆抗体(Dako)染色。获得自每组小鼠的肿瘤的石蜡包埋的组织切片(3-5pm厚)在二曱苯中去石蜡且在分级乙醇系列(100-卯-80-70-50-30%)中再水合和PCS冲洗。内源性过氧化物酶通过将玻片在室温浸入0.3。/c)(v/v)过氧化氢曱醇溶液中15分钟封闭。用PBS冲洗三次每次4分钟后，切片通过室温下在10。/c)(v/v)正常驴血清PBS溶液中侵入1小时来封闭。用PBS冲洗三次每次4分钟后，封闭的切片在抗因子VIII单克隆抗体(血管假性血友病因子，l:50稀释)(Dako)中室温培养2小时。2小时后，用PBS冲洗三次每次4分钟，玻片与生物素化的Linkuniversal在室温培养30分钟，用PBS冲洗三次每次4分钟，用链霉抗生物蛋白-HRP缀合的(Dako)室温培养15分钟。用PBS冲洗三次后，切片用色原体培养且用蒸馏水沖洗。因子VIII切片不复染。微血管的数量如Padro描述的(Padro等人，(2000)Blood95:2637-2644)确定。微血管计数由两个独立的熟练研究者使用光学显微镜同时评定。研究者不知道临床病理结果。整个切片系统地扫描，例如一个视野接一个视野，以xl00放大倍数来寻找显示血管形成最强烈的区域。然后改变放大倍数为x200或x400,直至在x400视野内出现最多数量的微血管即允许研究者复位切片。在两个研究者意见一致后定义这个区域为神经瘤点(hotspot),从而降低微血管计数的观测者间错误。在每个神经瘤点，两个研究者独立进行在x400视野的微血管计数。如图4B所示，结果显示在LBFL313-转染细胞注射的小鼠的肿瘤中比模拟对照细胞有更多的微血管计数。体内实验显示了LBFL313的侵略性的胂瘤形成和增强的血管生成。实施例6多克隆抗LBFL313抗体的制备LBFL313全长cDNA通过PCR使用正向引物(5，-CTAAGGCCCAGCCGGCCGGGAAGATGTATGGCCCTGGA-3，)和反向引物(5'陽CATAGGCCCCACCGGCCGAGCGACCCACGGGTGAGTT-3，)来扩增。PCR使用TaqPlus精密DNA聚合酶(Stratagene，CA)根据厂商说明书来进行。PCR扩增循环包括起始94°C5分钟变性，和30个周期；94。C30秒，58°C30秒，72。C30秒，随后是72。CIO分钟的最后延伸。PCR产物在1.5%TAE凝胶上显影，然后使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(ZymoResearch,CA)根据厂商说明书纯化凝胶。将被纯化的DNA插入pLFG106载体的Sfil位点以制备重组LBFL313-Fc融合蛋白。pLFG106是含有信号序列、人IgGFc区域和pcDNA3.1(Invitrogen)骨架的DHFR基因的表达载体。PLFG106还含有克隆位点和Fc区域间的凝血酶识别序列。LBFL313-Fc表达质粒使用ExGen500试剂(Fermentas,Lithuania)根据厂商说明书稳定转染至DHFR缺乏的CHO突变细胞抹中。稳定转染的细胞在没有核苦酸的含有800pg/mlG418(Invitrogen,CA)和10。/。透析FBS的MEM-a(Invitrogen,CA)中选择2星期。稳定的转染子在浓度为100nM的曱氨蝶呤(Sigma，MO)中进一步适应2星期。分泌至培养基中的重组LBFL313-Fc融合蛋白通过蛋白质印迹分析和ELISA使用抗人Fc抗体(Sigma,MO)鉴别。重组LBFL313-Fc融合蛋白的大量表达使用滚瓶(1750cm、进行。表达重组LBFL313-Fc融合蛋白的稳定转染子在添加了5%FBS的IMDM中生长。滚瓶培养接种3乂108个细胞且装置以5rpm在37。C培养箱中旋转。细胞培养5天，培养基每三天用无血清培养基更换。收集的无血清培养基中的细胞碎片通过6000rpm离心10分钟移除。为了纯化重组LBFL313-Fc融合蛋白，无细胞培养基通过使用离心机ProFluxM12(Amicon)离心通过10K分子量筛膜Pellicon2(Millipore)进一步处理。浓缩的培养基然后通过10ml蛋白质A琼脂糖柱(Pierce)，在20mM磷酸钠pH8.0中预平衡。未结合的蛋白质用20mM磷酸钠緩冲液从柱中冲洗下来。用0.1M枸橼酸盐pH3.0洗脱柱子，在含有500pl1MTris-HClpH9.0的试管中收集4.5ml级分。收集含有级分的重组LBFL313-Fc融合蛋白且用分子筛析色傳法使用琼脂糖200HR树脂(Amersham,IL)进一步纯化。C-末端Fc从重组LBFL313-Fc融合蛋白上通过Thrombin断裂捕获试剂盒(Novagen)断裂，然后用ImmunoPureR固定的蛋白质A(Pierce)除去。简言之，重组LBFL313-Fc融合蛋白用生物素化的凝血酶在20。C培养过夜。蛋白质水解后，生物素化的凝血酶用链霉抗生物蛋白琼脂糖小珠除去。得到的溶液是重组LBFL313和Fc的混合物，将其通过两次ImmunoPureR固定的蛋白质A柱(Pierce)分离。重组LBFL313的纯度用SDS-PAGE凝胶检测。纯化的重组LBFL313用来根据标准技术免疫两只兔。收集免疫血清，然后使用ImmunoPureR(APlus)IgG纯化试剂盒(Pierce)根据厂商说明书纯化。使用AminoLinkR(APlus)固定试剂盒(Pierce)连接重組人Fc进行进一步纯化。纯化的多克隆抗体在获得自表达LBFL313的胰腺癌细胞的条件培养基的蛋白质印迹中检测到大约21kDa的蛋白质。抗体特异性进一步证实获得自LBFL313转染PANC-1细胞的条件培养基的LBFL313蛋白质检测增强，而仅转染载体的PANC-1细胞没有增强。实施例7LBFL313表达的免疫组化分析组织微阵列玻片在二曱苯中去石蜡且在分级乙醇中再水合。内源性过氧化物酶活性用含有0.3%过氧化氢的甲醇在室温下封闭20分钟。微波抗原回收在枸橼酸盐緩冲液(0.01M,pH6.0)中进行4分钟。然后切片用10%正常驴血清溶液培养1小时已降低背景非特异性染色。一级抗体是多克隆抗LBFL313抗体，以1:500稀释。封闭的切片在一级抗体中4°C过夜培养。后续反应使用LSAB+试剂盒(DakoCytomation,Carpinteria,CA,USA)和推荐的操作程序进行。最后，切片用3-氨基-9-乙基。卡唑(DakoCytomation,Carpinteria,CA,USA)培养且用Harris苏木精溶液，改良版(Sigma-Aldrich，Inc.,St.Louis,MO，USA)复染色。在所有情况下，免疫反应性在肿瘤细胞的细胞质中观察到。免疫反应性用H评分方法评价。染色强度评为0、1、2和3分别对应阴性存在、弱、中等和深棕色染色。确定不同强度染色细胞的百分比，随后用公式H评分=(染色强度评分1的细胞百分数)+2x(染色强度评分2的细胞百分数)+3x(染色强度评分3的细胞百分数)。肺瘤组织和附近非肿瘤组织的H评分用Wilcoxon符号秩和检验来分析。如图5所示，胂瘤组织比附近非肿瘤组织具有显著性的更高的LBFL313表达(16个案例中14个)(p0.05)。实施例8抗LBFL313抗体对胰腺癌细胞侵入性的影响为了确定抗LBFL313抗体对人胰腺癌细胞林侵入性的影响，博伊登室方法在抗LBFL313抗体或正常兔IgG的存在下进行。简言之，五种胰腺癌细胞林，CFPAC-1、MiaPaCa-2、PANC-1、AsPC-l和BxPC-3受胰蛋白酶消化且在胰蛋白酶抑制剂(Sigma)溶液中重悬。细胞沉淀且在PBS、抗LBFL313抗体或正常兔IgG存在下在无血清培养基中混悬，终浓度为l~5xl0"田胞/ml。小室的较低孔用30^1标准培养基充满。小室使用上层用1mg/mlMatrigelTM基底膜基质(BDbiosciences)包被的孔直径8pm的聚碳酸酯滤器(Neuroprobe)组合。50pl细胞悬液加入上层室中。小室在37。C和5%C02中培养24小时。培养结束时，机械移除滤器上表面的细胞。滤器用曱醇固定且用姬姆萨染料，改良溶液(Sigma)染色。每个视野(l00x)中移行细胞的数量在光学显微镜下(Olympus)计数。每个样品检测三次。如图6所示，抗LBFL313抗体以剂量依赖的方式有效抑制人胰腺癌细胞抹的侵入性。类似作用也在胃癌细胞抹AGS和N87中观察到。工业应用尽管本发明在以上实施例中详细描述，应当理解在不偏离本发明的精神的情况下进行多种改变。相应地，本发明仅由以下权利要求限制。所有引用的专利、专利申请和本发明中涉及的出版物全文引入本文已作参考。权利要求1.一种分离的核酸分子，选自包括下列的组(a)包含SEQIDNO1的分离的核酸分子，(b)编码SEQIDNO2的分离的核酸分子，(c)编码在癌症中表达的蛋白质且显示了与SEQIDNO1的全部连续序列至少大约95％核苷酸序列同一性的分离的核酸分子，和(d)包含(a)、(b)或(c)的核酸分子的补体的分离的核酸分子。2.根据权利要求l所述的分离的核酸分子，其中所述的核酸分子包含SEQIDNO:1的53-640位核香酸。3.根据权利要求l所述的分离的核酸分子，其中所述的核酸分子包含SEQIDNO:1的53-643位核香酸。4.根据权利要求l-3中任意一项所迷的分离的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接于一个或多个表达调控元件上。5.包含权利要求1-3中任意一项所述的分离的核酸分子的载体。6.经转化含有权利要求1-3中任意一项的核酸分子的宿主细胞。7.包含权利要求5所述载体的宿主细胞。8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自包括原核宿主细胞和真核宿主细胞的组。9.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌DH5a/p313-JF3(保藏编号KCTC10954BP)。10.—种制备多肽的方法，包含培养用权利要求l-3中任意一项所述的核酸分子转化的宿主细胞。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞选自包括原核宿主细胞和真核宿主细胞的组。12.通过权利要求10所述的方法制备的分离的多肽。13.分离的多肽或蛋白质，选自包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白质和具有与SEQIDNO:2至少大约95%氨基酸序列同一性的蛋白质的组。14.与权利要求13所述的多肽结合的分离的抗体或抗原结合抗体片段。15.根据权利要求14所述的抗体，其中所述抗体是单克隆或多克隆抗体。16.鉴别能调节编码权利要求13所述的蛋白质的核酸表达的药物的方法，包含使表达所述核酸的细胞与所述药物接触；和确定所述药物是否能调节所述核酸的表达，从而鉴别能调节编码所述蛋白质的核酸表达的药物。17.鉴别能调节权利要求13所述的蛋白质的水平或至少一种活性的药物的方法，包含使表达所述蛋白质的细胞与所述药物接触；确定所述药物是否能调节所述蛋白质的水平或至少一种活性，从而鉴别能调节所述蛋白质的水平或至少一种活性的药物。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述药物能调节所迷蛋白质的一种活性。19.能调节编码权利要求13所述的蛋白质的核酸表达的方法，包含施用有效量的能调节编码所述蛋白质的核酸表达的药物。20.调节权利要求13所述蛋白质的至少一种活性的方法，包含施用有效量的能调节所述蛋白质至少一种活性的药物。21.鉴别权利要求13所述的蛋白质的结合伴侣的方法，包含使所述蛋白质和潜在的结合伴侣接触；和确定所述的潜在的结合伴侣是否与所述蛋白质结合，从而鉴别该蛋白质的结合伴侣。22.鉴别能调节权利要求21所述的结合伴侣和权利要求13所述的蛋白质间相互作用的药物的方法，包含使所述蛋白质和所述伴侣与所述药物接触；和确定所迷药物是否能调节所述结合伴侣与所迷蛋白质的结合，从而鉴别所述药物是否能调节一个结合伴侣与所述蛋白质的结合。23.调节权利要求21所述的结合伴侣和权利要求13所述的蛋白质间相互作用的方法，包含施用有效量的能调节结合伴侣与所迷蛋白质的结合的药物。24.—种非人转基因动物，所述动物被改良以含有权利要求l-3所述的核酸分子。25.根据权利要求24的转基因动物，其中所述的核酸分子含有阻止编码蛋白质表达的突变。26.包含稀释剂和多肽或蛋白质的组合物，其中所述的多肽或蛋白质包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或显示了与SEQIDNO:2至少大约95%的氨基酸序列同一性。全文摘要本发明大体涉及人胰腺癌中基因表达的变化。本发明特别涉及在胰腺癌组织中与相应非癌胰腺组织相比差异表达的人基因家族。文档编号C12N15/12GK101495634SQ200780022204公开日2009年7月29日申请日期2007年6月13日优先权日2006年6月14日发明者全顺福,宋始英,朴义铁,李良顺,金善雅,金荣建,高祥锡申请人:Lg生命科学株式会社