表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9d的毕赤酵母工程菌株的制作方法
【专利摘要】本发明是一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum热稳定热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9d的毕赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS-CT-9D。通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum获得糖苷水解酶基因CtAA9d，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，然后将得到的糖苷水解酶基因CtAA9d表达载体pPIC9K/CtAA9d导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基因CtAA9d的酵母工程菌GS-CT-9D。该工程菌表达的糖苷水解酶CtAA9D对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，混合酶比原始内切酶N24的降解纤维素的活性提高1.6倍。在Mn2+条件下，CtAA9D和CtAA9D+N24的纤维素酶活性可分别提高15倍和2.5倍。CtAA9D具有良好的热稳定性和提高纤维素酶活力的能力，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。
【专利说明】表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9d的毕赤酵母工程菌株 (-)【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达具体地说是以嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9d的毕赤酵母工程菌株Pichia pastor is GS-CT-9D。
(二)【背景技术】
[0002]糖苷水解酶(英语:Glycoside hydrolases,又称糖苷酶)是一种专门水解配糖键 (glycosidic bond)，并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。
[0003]嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50°C条件下可以产生热稳定的纤维素酶和9家族糖苷水解酶。
[0004]嗜热毛壳菌产生的9家族糖苷水解酶CtAA9D具有微弱的纤维素酶活性，但对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，可使其活性提高1.6倍。在不同金属离子如Mn2+的作用下，CtAA9D和CtAA9D+N24的活性可分别提高15倍和2.5倍。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得内切(6-1, 4-葡聚糖酶基因的cDNA序列全长，命名为CtAA9d，CtAA9d基因DNA全长870bp，包括信号肽序列，起始密码子和终止密码子，无内含子，编码224个氨基酸，具有信号肽序列(l-22aa MKLSLASLLTAALSVQGHAIFQ)。将CtAA9d编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。
[0006]构建重组表达 质粒载体pPIC9K/CtAA9d，利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GSl 15，在MD和丽培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-CT-9D。该工程菌株接种于含 BMGY培养基中，在28°C 200rpm/min摇床培养6d后，糖苷水解酶的表达量为2.51mg/ml，分子量为25KDa，酶活力为0.0862U/ml, CtAA9D在65°C下是稳定的，处理60min后仍有95%以上的酶活性；70°C处理30min后仍保持72.8%的活性；80°C处理30min后保持20.4%的活性；90°C处理30min活性几乎完全丧失。
[0007]9家族糖苷水解酶CtAA9D对嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum内切纤维素酶 N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力提高1.1倍。 不同金属离子对CtAA9D和CtAA9D+N24混合酶活性具有促进或抑制作用，其中在Mn2+条件下，CtAA9D和CtAA9D+N24的纤维素酶活性可分别提高33倍和2.5倍。
(四)【专利附图】
【附图说明】:[0008]图19家族糖苷水解酶CtAA9D的SDS-PAGE分析
[0009]泳道1:低分子量蛋白标准
[0010]泳道2:纯化的9家族糖苷水解酶CtAA9D
[0011]图2 A: 9家族糖苷水解酶CtAA9D的最适温度
[0012]B: 9家族糖苷水解酶CtAA9D的热稳定性测定
[0013]图3 9家族糖苷水解酶CtAA9D对内切纤维素酶N24活性的促进作用
[0014]图4金属离子Mn2+对CtAA9D纤维素酶及混合酶活性的影响
(五)【具体实施方式】
[0015]实施例1:嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum的分离鉴定
[0016](1)标本采集:从堆肥中采集。
[0017](2)分离培养:将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50°C培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson (1964)文献。
[0018](3)鉴定:参考 Cooney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文献。
[0019]实施例2:糖苷水解酶基因CtAA9d的克隆
[0020](I)嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum总RNA的提取:参照Trizol试剂盒说明。
[0021](2)cDNA 第一条链的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0 试剂盒说明书进行:取I~2 ii g总RNA，加RNase Free ddH20至9.5 y L，将RNA样品在 75°C变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分:10mmol/L dNTP Mixture2 u L, IOXRT Buffer (Mg2+) 2 y L，25mmol/L MgCl24 u L, Oligo d(T)-Adaptor PrimerlU L, RNase Inhibiter0.5 U L, AMV Reverse TranscriptaselU L (Final Volume20 u L),将反应液混合后，室温下放IOmin,然后42°C温育60min,再煮沸 5min以灭活反转录酶。加入180 ii L DEPC处理的ddH20，稀释至200 y L，混匀，稍微离心，保存于-20°C，备用。
[0022](3光0?反应(251^):。0嫩2111，10XBuffer2.5 u L, IOmmoI/L dNTP2 u L, 25mmol/ LMgCl2 L，上、下游引物各 L，Taq DNA 聚合酶 0.5 y L (5U/y L)，ddH2012 y L。反应条件为 94°C 5min 预变性；94°C 40s, 57°C 40s, 72°C lmin,共 32 个循环，72°C延伸 10min,4°C保存。
[0023]上游引物:5’ -ATGAAACTTTCCTTGGCGTCAC-3 ’
[0024]下游引物:5’ -TTAGCACGTGATGGGAGCCG-3 ’
[0025](4)基因克隆:取0.5iil PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照TAKARA 公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 a菌株，在表面涂有氨卞青霉素 (100 u g/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
[0026](5)质粒DNA的提取:碱法提取质粒DNA。'
[0027](6)序列测定:DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序列引物为M13启动子引物。嗜热毛壳菌CtAA9d基因cDNA全长869bp，包含起始密码子和终止密码子，无内含子，编码175个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。该序列如下:[0028](A) SEQ ID NO I 的信息
[0029](a)序列特征:*长度:870碱基对；*类型:核酸；*链型:双链；*拓扑结构:线性
[0030](b)分子类型:DNA
[0031](C)假设:否
[0032](d)反义:否
[0033](e)最初来源:嗜热毛壳菌 Chaetomium thermophilum
[0034](f)序列描述:
[0035]
【权利要求】
1.一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9d的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9d,将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体PPIC9K，获得表达重组质粒pPIC9K/CtAA9d，转化毕赤酵母GSl 15，从中筛选出表达热稳定糖苷水 解酶基因CtAA9d的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9D，该糖苷水解酶CtAA9D对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用。
【文档编号】C12N15/81GK103602604SQ201310422852
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】李多川, 韩超 申请人:山东农业大学