专利名称：：非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，具体是涉及一种非洲爪蟾基因，更具体是涉及非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein的d)NA全长克隆及它在非洲爪蟾胚胎发育过程中的时空表达，这种新基因的提取方法、其核苷酸序列及编码的多肽、两个RT-PCR引物、RT-PCR方法和整体原位杂交技术。
背景技术：
：神经发生(neurogenesis)是动物形态发生过程中最早也是最重要的阶段之一。研究神经发生过程中一些重要基因表达调控，对揭示形态发生的分子机理非常重要。G蛋白连接的受体激酶(Gprotein-coupledrec印torkinases,GRK)通过产生第二信使如cAMP，介导它们的生物反应，并通过磷酸化有活性的受体来进行它们的脱敏作用的下游水平的调控(PitcherJA，FreedmanNJ，LefkowitzRJ.G-protein-coupledreceptorkinases[J]AnnuRevBiochem，1998，67:653-692)。脱敏作用允许细胞降低对持续信号刺激的敏感性(LynneES，AllanCS.TheDrosophilaG-protein-co叩ledreceptorkinasehomologueGprk2isrequiredforeggmorphogenesis[J].Development,1997，124:2591-2602)，在生物的生理中起着重要的作用。Synucleins是G蛋白连接的受体激酶的成员之一。Synuclein最初是作为一种突触前末梢蛋白于1988年由Maroteaux等从电鲟鱼的带电器官中首先分离出来的(MaroteauxL，CampanelliJT，Scheller肌Sy匿lein:aneuron-specificproteinlocalizedtothenucleusandpresynapticnerveterminalJNe罰sci,1988，8:2804-2815)。Synuclein在神经组织中广泛表达，以新皮质、海马、嗅球、纹状体和丘脑含量较高，它包括a-，!3-和Y-synuclein3种类型。在人，鸡等哺乳动物中均发现了以上种类的Synucleins(AnnaA，Tiunova，KonstantinV.Chickensynucleins:cloningandexpressioninthedevelopingembryo[J"].MechDev，2000，99:195-198)。a-，fi-和Y-synuclein的氨基酸序列高度保守，多分布于神经元突触及细胞核核膜，仅y-synuclein广泛分布于整个神经细胞内，尤其是胞质空间，是一组与神经退行性病变有关的蛋白。(DavidFC，uliaM.G.Thesynucleins:afamilyofproteinsinvolvedinsynapticfunction,plasticity,neurodegenerationanddisease[J].TrendsNeurosci，1998,21:249-254)。最近发现a-synuclein基因的突变(A53T，A30P)与家族性帕金森病(Parkinsondisease,PD)相关(KrugerRW，KuhnW，MullerT，etal.Ala30Promutationinthegeneencodinga-synucleininParkinson'sdisease[J].NatureGenet,1998,18:106-108)，并发现它是多种神经变性疾病的路易小体的主要成分。其中NAC的前体蛋白(non-amyloid-{3-componentprecursor,NACP)是a-synuclein的人类同系物，是从人类阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)淀粉样斑块中提取的前体蛋白，由140个氨基酸组成。(SpillantiniMG,SchmidtML,LeeVM，etal.Alpha-synucleininLewybodies[J"].Nature,1997，88:839-840)，而synuclein家族的另两个成员13-，Y-synuclein在PD和路易小体痴呆的轴突损害病理机制中也起重要作用(ClaytonDF，GeorgeJM.Thesynucleins:afamilyofproteinsinvolvedinsynapticfunction,plasticity,neurodegenerationanddisease[J].TrendsNeurosci，1998，21:249-254)。乳腺癌特异性基因1(breastcancer-specificgene1，BCSGl)是y-synuclein的人类同系物，近年来研究发现其表达蛋白广泛分布在神经系统的神经元突触前末稍，除神经系统外，正常乳腺组织或良性病变中BCSGl几乎不表达，而多数浸润性乳腺癌、卵巢癌等肿瘤组织中特异性高表达。(JiH'LiuYE，JiaT，etal.Identificationofabreastcancer-specificgene，BCSGl，bydirectdifferentialcDNAsequencing[J].CancerRes，1997，57:759-764)。BCSGl与乳腺癌和卵巢癌密切相关，因此在乳腺癌和卵巢癌的预后判断及抗肿瘤药物筛选中有重要作用。Hsu等用RNA酶保护分析法、Westernblot和免疫组化等方法分析了胚胎、幼稚和成年小鼠脑组织的synuclein的水平，发现胚胎15d以后均有显著增加，其中synuclein增加的时间明显偏早，提示这种蛋白对突触发生及中枢神经系统的发展是重要的(HsuL丄MalloryM，XiaY，etal.Expressionpatternofsynucleins(non-abetacomponentofAlzheimer'sdiseaseamyloidprecursorprotein/alpha-synuclein)duringmurinebraindevelopment[J].Neurochem，1998，71:338-344)，但Synucleins在脊椎动物发育过程中的生理作用目前尚不明确。尽管synuclein系列有巨大的研究和开发价值，但尚未关于提取到完整的Xsynuclein的cDNA克隆的报道，其在发育过程中的时空表达也鲜为人知，这种新基因的提取方法、其编码的多肽、RT-PCR引物设计、RT-PCR方法和整体原位杂交技术都是全新的领域。
发明内容本发明的目的在于提供一个非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein,分析它在非洲爪蟾胚胎发育过程中的时空表达，以便于利用非洲爪蟾这种很好的脊椎动物模型来探索其对于胚胎的中枢神经系统形成和参与神经元的变性过程的密切关系，进而研制开发神经变性疾病、乳腺癌和卵巢癌的治疗药物。本发明的另外的目的在于提供这种新基因的提取方法、其编码的多肽、两个RT-PCR引物以及RT-PCR和整体原位杂交技术。本发明的目的还在于提供非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein及其编码的多肽在治疗神经变性疾病、乳腺癌和卵巢癌等疾病的应用。为了研究非洲爪蟾胚胎发育过程中神经系统基因表达调控，从而揭示脊椎动物神经系统形态发生的分子机理，我们用activin处理非洲爪蟾第8期胚胎动物帽中的外胚层细胞构建噬菌体cDNA文库，用切除法将噬菌体cDNA文库转换成质粒cDNA文库，用整体原位杂交技术，进行四轮筛选上述文库，得到XsynucleincDNA碱基序列(SEQIDNO:1所示)。该新基因1040bp的全长c腿序列(SEQIDNO:1所示)已被提交到DDBJ/EMBL/GenBank，并已被美国国立生物技术信息中心(TheNationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)iH式接受该基因为GenBank的新成员，获得的编号为AY055119，命名为Xsynuclein。本发明提供了这种非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein编码的多肽(SEQIDNO:2所示)。本发明提供了这种非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein的RT-PCR正向引物和反向引物，分别为5'-AAGTCTTGCAGAAAGCAAAC-3'(SEQIDNO:3)和5，-GATTTACTCCAGAAACCACG-3'(SEQIDNO:4)。本发明提供了这种非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein的RT-PCR方法，其特征在于，包括(1)设计引物--Xsynuclein的正向引物和反向引物分别为5，-AAGTCTTGCAGAAAGCAAAC-3'(SEQIDNO:3)和(SEQIDNO:4);以Xen叩usubiquitous()DC为标准对照，其正向引物和反向引物分别为5'GGGCAAAGGAGCTTAATGTG-3'(SEQIDNO:5)，反向引物为5'CATTGGCAGCATCTTCTTCA-3，(SEQIDNO:6)，(2)提取RNA——用RNA-cleanTM试剂提取非洲爪蟾的0-41期胚胎的总RNA，(3)RT反应一一取l)Lig的总RNA用于cDNA第一链的合成，所用的引物为六聚体随机弓l物(Hexamerrandomprimer)p(dN)6。(4)PCR反应--以VI的cDNA做PCR的模板，取lOxPCRbuffer2.5(Lil，12.5,ol/L前述正向引物和反向引物各0.5pi,4xdNTP(2mmol/L)2.5pd，IOU厶lITaqDNA聚合酶0.2pl，反应条件为94°C，lmin;55°C,lmin;72°C2min，Xsynuclein32个循环，标准对照31个循环，得PCR产物。本发明还利用RNA聚合酶和DIGRNA标记试剂盒，以这种非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein合成了一种新型的地高辛探针。本发明还提供了一种整体原位杂交方法，包括Harland方法、Hollemann方法和组织切片技术，其特征在于，还包括(1)将权利要求1所述非洲爪蟾GRK家族新基因XsynucleinBamH酶切成链状作为模板，在一个有地高辛探针标记的11JJTP的体外转录系统中以T3RNA聚合酶(Promega)催化合成反义RNA;(2)将权利要求1所述非洲爪蟾GRK家族新基因XsynucleinHind酶切后，以SP6RNA聚合酶催化合成正义RNA，用该正义RNA作为对照，以检査原位杂交系统的可靠性，每一个20pl的转录体系中含有以下成分1吗模板DNA，2pl地高辛探针标记混合物，20URNA酶抑制剂，20UT扁A聚合酶或SP6RNA聚合酶和1^1转录缓冲液，反应在37'C下进行2h，正义RNA和反义RNA经乙醇沉淀，溶于2(Vl的DEPC水后存放于-2(TC冰箱中；(3)整体原位杂交——电泳检测探针合成结果后，按照Harland和Hollemann方法分别与各期的非洲爪蟾胚胎进行整体原位杂交，同时作阴性对照组，阴性对照组以无菌水取代地高辛探针；(4)组织切片一一运用传统的组织切片技术将经过整体原位杂交之后的非洲爪蟾0-41期胚胎做厚度为12pm的切片，并用曙红负染。本发明有下述优点提供了一个非洲爪蟾新基因Xsynuclein基因的全长cDNA序列，并描述了其编码的蛋白产物与已知几种模式动物同源基因的同源性，证明了该基因是GRK家族的成员之一。该基因以及该基因编码的蛋白产物在神经中枢中有高水平的特异性表达，对该基因的研究有助于神经变性疾病、乳腺癌和卵巢癌的基因治疗药物的开发研制。该基因编码的蛋白产物在胚胎发育期的神经中枢位置可检测到强表达水平，说明该基因在发育早期起很重要作用，可能参与胚胎中枢神经系统的形成。图1是通过对非洲爪蟾的各个时期的胚胎用synuclein的RNA探针进行整体原位杂交的图片，其中E，FandJ是22期，26期和33期的横向组织切片图。图2为运用RT-PCR检测非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein在胚胎各个时期的时间表达模式。具体实施例方式下面结合附图来具体说明本发明实施方式的技术内容一个非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein克隆、测序及表达1、基因克隆我们用activin处理的分散的非洲爪蟾的第8期胚胎的动物帽中的外胚层细胞构建噬菌体cDNA文库(NieuwkoopPD，FaberJ.NormaltableofXenopuslaevis.NorthHolland:Amsterdam1975;CaoY，ZhaoH，HollemannT，ChenY，GrunzH.Tissue-specificexpressionofan0DCparalogue，X0DC2，inXenopuslaevis[J].MechDev，2001，102:243-246)，然后通过切除法将噬菌体cDNA文库转换成质粒cDNA文库(Stratagene，USA)。并运用大规模整体原位杂交技术来筛选这一文库。我们把筛选到的新克隆拿去测序,并在美国国立生物技术信息中心(TheNationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)的网上基因库中进行序列分析，发现它不属于任何已知基因。该新基因1040bp的全长cDNA序列已被提交到DDBJ/EMBL/GenBank，获得的GenBank的接受号为AY055119,命名为Xsynuclein。2、基因测序及同源性比较我们把筛选到的新克隆拿去测序，并在NBCI的网上基因库中进行序列分析，分析结果见下表l:表l:XsynucleinMDVFKKGFSMAKEGVV/WAEKTKQGVTEAAEKTKEGVMYVGAKTKEGVVYSVNTVAEKTK60Csynuclein----------1------A-A----------------------T----------TS------60Hsynuclein---------1------G-V----------------------A----------TS------60XsynucleinEQANVVGGAVVSGVNQVSSKTVEGTENVVSSTGLVKKEDLHPDQPEEPAAEEPAVEATES120Csynuclein——V-GE—--AS--T-AN——GA-TIVATT-V-K—D-APQQ-..AAEG-A-IPG..S116Hsynuclein——A-SE---SS--T-AT——EV-NIAVTS-V-H--A-KQPV-..SQED-A-KAEEQV118XsynucleinIEQVGDGEN...129CsynucleinT-GGGE-ENEGN128HsynucleinA-ETKS-GD...127上述表1是非洲l爪蟾的Synuclein(Xsynuclein)与鸡的Y-Synuclein(Csynuclein)以及人的Y-synuclein(Hsynuclein)的氨基酸序列的比较。相同的氨基酸用连字号表示。Xsynuclein的DDBJ/EMBL/Genbank编号是AY055H9。由表1可以看出此基因编码的蛋白质序列与人的Y-synuclein(基因库编号为BC014098)有88%的同源性；与鸡的Y-synuclein(基因库编号为AF253513)有84%的同源性。在这三种蛋白质中，它们的氨基酸差别仅集中在C-末端，这表明这三种蛋白质的氨基酸序列具有高度的保守性。3、RT-PCR1)引物设计及合成Xsynuclein正向引物(PI):5'—AAGTCTTGCAGAAAGCAAAC—3'(SEQIDNO:3)反向引物(P2):5'-GATTTACTCCAGAAACCACG-3'(SEQIDNO:4)标准对照为Xenopusubiquitous0DC:正向引物(PI):5'-GGGCAAAGGAGCTTAATGTG-3'(SEQIDNO:5)反向引物(P2):5，-CATTGGCAGCATCTTCTTCA-3'(SEQIDNO:6)(CaoY，ZhaoH，HollemannT，ChenY，GrunzH.Tissue-specificexpressionofanODCparalogue,X0DC2inXen叩uslaevis[J].MechDev，2001，102:243-246)2)RNA提取依照使用说明书，用RNA-cleanTM试剂(AGSGmbH,Heidelberg,Germany)提取非洲爪蟾的0-41期胚胎的总RNA;3)逆转录(RT)反应用l吗的总RNA用于cDNA第一链的合成，所用的引物为六聚体随机引物(Hexamerrandomprimer)p(dN)6;4)PCR反应的cDNA用做PCR的模板，取10xPCRbuffer2.5pl，12.5pimol/L正向引物和反向引物各0.5pl，4xdNTP(2画l/L)2.5)nl，lOU/plTaqDNA聚合酶0.2|Ltl,反应条件为94°C，lmin;55°C，lmin;72°C2min，Xsynuclein32个循环；0DC31个循环。取PCR产物5ul经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在紫外灯下观察电泳结果并拍照。4、整体原位杂交1)地高辛探针的合成所用的Digoxigenin-UTP-labelledRNA探针是通过腿聚合酶和DIGRNA标记i式剂盒(Roche,Mannheim)，以非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein的cDNA合成的。含Xsynuclein全长cDNA的质粒经BamH酶切成链状作为模板，在一个有地高辛标记的11—UTP的体外转录系统中以T3RNA聚合酶(Promega)催化合成反义RNA。该质粒经Hind酶切后，SP6RNA聚合酶(Promega)可催化合成正义RNA，用该正义RNA作为对照，以检查原位杂交系统的可靠性。每一个20W的转录体系中含有以下成分l(Lig模板DNA，2^地高辛薩标记混合物(Boehringermannheim，BM)，20URNA酶抑制剂(Promega)，20UT3RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶和1^1转录缓冲液。反应在37摄氏度进行2h。正义RNA和反义RNA经乙醇沉淀，溶于20nl的DEPC水后存放于-20摄氏度冰箱中；2)原位杂交电泳检测探针合成结果后，按照Harland和Hoilemann(Harland,1991,Hollemannet1998)的方法分别与各期的非洲爪蟾胚胎进行整体原位杂交，实验过程中同时作阴性对照平行组，阴性对照组以无菌水取代探针；3)组织切片运用传统的组织切片技术对经过整体原位杂交之后的非洲爪蟾0-41期胚胎在进行切片(切片厚度为12nm)，并用曙红负染。图1是通过对非洲爪蟾的各个时期的胚胎用synuclein的RNA探针进行整体原位杂交的图片，我们发现在尾芽胚(tailbud)期之前的胚胎探测不到杂交信号(A、B、CandD)。在tailbud早期胚胎的神经中枢中开始探测到微弱的杂交信号(E，G)。从tailbud晚期胚胎和一直到蝌蚪(tadpole)期杂交信号不断增强，并一直维持较强的水平(H,I,K)。E，FandJ是22期，26期和33期的横向组织切片。图2是运用RT-PCR检测Xsynuclein在胚胎各个时期的时间表达模式。0DC为标准对照。我们发现在非洲爪蟾的胚胎发育的各个时期，均可探测到编码Xsynuclein的mRNA，并且在神经胚/尾芽胚(neurulation/tailbud)时期，mRNA的含量略微有所上升，并一直维持到41期。从尾芽胚晚期一直到蝌蚪期，其转录产物的表达不断增强，并一直维持较强的水平。在胚胎时期，Xsynuclein仅在神经中枢中有高水平的特异性表达。SEQUENCELISTING〈110〉山东大学〈120〉非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein〈130〉非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein〈160〉6<170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈211〉1040〈212〉DNA〈213>Xenopuslaevis〈400〉1tgagtggatccaaatattcggtcgagccggtgctcttctcaagagtgacacacac犯agt60tgaggacccccaagtcttgc已gaaagcaaacasccatggatgtgtttaagaaaggttt.tt120ctatggctaaagaaggcgtggttgctgcagcagagaaaaccaagcagggtgtgacagaag180ctgcagaaeiaaaccaaggagggggtcatgtatgtaggagcgaaaactaaagagggtgttg240tatacagtgtgaatacagttgcggagaaaaccaaagaacaggccaatgtggttggtgg已g300ccgtggtttctggagtaaatc犯gtatcttcaaELgactgtag^ggcscagagaatgttg360taagctctactggtttagtaaaaaaggaagatctacatccagatcagccagaagaacct.g420ctgcagaagaacccgcagtggaggccacagaaagcattgagcaggtcggtgatggagaga480attaatatttcaccctgtgtgctgctgggaatct"ttg33333Ctagct33ggsicatsgaa540sagaagtaattcataccacaagaataccacaggctgaaagccaatcaacgcgtgaaattt600tcctcttgaattatcaagtccgtcagtgtatgcattcatgttataattgtgaatgtacag660ctttgtaacccaaccgatataccaccagtcacacatccttcacatcttcatgtgatttat720tatacacaactttgtttgaccctgagctctggttttactaacagtctatttttaccccta780tcaatcttcatttgtatgtgtttttatttgacgcacctactaatgatccagtgctctgca840ttact.ccatctatgaatagctctcctactcaagtaccctattgtatcaactccttttttt900cttgttagtttttgcttgggtcaccattcagcatcatctttatattcacattggctatat%0tgtcccttcttaaagctatttttttttcagccataca犯taa肌ctttatttgagt.aaaa1020〈210〉2〈211〉129<212〉PRT〈213〉Xenopuslaevis〈400〉2MetAspValPheLysLysGlyPheSerMetAlaLysGluGlyValVal151015AlaAlaAlaGluLysThrLysGinGlyValThrGluAlaAlaGluLys202530ThrLysGluGlyValMetTyrValGlyAlaLysThrLysGluGlyVal354045ValTyrSerValAsnThrValAlaGluLysThrLysGluGinAlaAsn505560ValValGlyGlyAlaValValSerGlyValAsnGinValSerSerLys65707580ThrValGluGlyThrGluAsnValValSerSerThrGlyLeuValLys8590951040LysGluAspLeuHisProAspGinProGluGluProAlaAlaGluGlu100105110ProAlaValGluAlaThrGluSerlieGluGinValGlyAspGlyGlu115120125Asn<210〉3〈211〉20<212>DNA<213>Artificial<220><223>人工合成<400〉3aagtcttgcagaaagcsaac〈210〉4<211>20<212〉DNA〈213〉Artificial<220〉〈223>人工合成<400〉4gatttactccagaaaccacg〈210〉5<211>20〈212〉DNA<213>Artificial<220><223>人工合成〈400〉5gggcaaaggagcttaatgtg〈210〉6〈211〉20〈212〉DNA<213〉Artificial<220>〈223〉人工合成<400〉6cattggcagcatcttcttca权利要求1、非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein，其特征在于，具有SEQIDNO1所示的碱基序列。2、权利要求i所述非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein的提取方法，其特征在于，包括如下步骤(1)用activin处理非洲爪蟾第8期胚胎动物帽中的外胚层细胞构建噬菌体cDNA文库；(2)切除法将噬菌体cDNA文库转换成质粒cDNA文库；(3)用整体原位杂交技术筛选上述文库，得到所述Xsynuc]cincDM碱基序列。3、权利要求2所述非洲爪蟾GRK家族新基因Xsyrmclein的提取方法，其特征在于，歩骤(3)为经四轮筛选得到所述XsynucleincDNA碱基序列。4、权利要求1所述非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein编码的多肽，其特征在于，具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。5、权利要求1所述非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein的RT-PCR引物，其特征在于，具有SEQIDNO:3所示的碱基序列。6、权利要求1所述非洲爪蟾GRK家族新基因Xsy脆lein的RT-PCR引物，其特征在于，具有SEQIDNO:4所示的碱基序列。7、权利要求1所述非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein的RT-PCR方法，其特征在于，包括(1)设计引物——设计的Xsynuclein的正向引物和反向引物分别为5'-AAGTCTTGCAGAAAGCAAAC-3'(SEQIDNO:3)和5'-GATTTACTCCAGAAACCACG-3'(SEQIDNO:4);以Xenopusubiquitous()DC为标准对照，其正向引物和反向引物分别为5'GGGCAAAGGAGCTTAATGTG-3，(SEQIDNO:5)，反向引物为5，CATTGGCAGCATCTTCTTCA-3'(SEQIDNO:6);(2)提取RNA——用RNA-cleanTM试剂提取非洲爪蟾的0-41期胚胎的总RNA;(3)RT反应一一取l吗的总RNA用于cDNA第-一链的合成，所用引物为六聚体随机引物(Hexamerrandomprimer)p(dN)6;(4)PCR反应——以lpl的cDNA做PCR的模板，取lOxPCRbuffer2.5pl，12.5nmol/L前述正向引物和反向引物各0.5口1，4xdNTP(2咖ol/L)2.5^1,1()U/M1TaqDNA聚合酶0.2pl，反应条件为94°C,lmin;55°C,lmin;72°C2min,Xsynuclein32个循环，标准对照31个循环，得PCR产物。8、一种地高辛探针，其特征在于，它是利用RNA聚合酶和DIGRNA标记试剂盒，以权利要求1所述非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein合成的。9、一种整体原位杂交方法，包括Harland方法、Hollemann方法和组织切片技术，其特征在于，还包括(1)将权利要求1所述非洲爪蟾GRK家族新基因XsynucleinBamH酶切成链状作为模板，在一个有地高辛探针标记的11—UTP的体外转录系统中以T3RNA聚合酶(Promega)催化合成反义脂A，(2)将权利要求1所述非洲爪蟾GRK家族新基因XsynucleinHind酶切后，以SP6RNA聚合酶催化合成正义RNA，用该正义腦A作为对照，以检查原位杂交系统的可靠性，每一个2(V1的转录体系中含有以下成分1叫模板DNA，2pl地高辛探针标记混合物，20URNA酶抑制剂，20UT3RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶和1^1转录缓冲液，反应在37'C下进行2h，正义RNA和反义RNA经乙醇沉淀，溶于20pl的DEPC水后存放于-20'C冰箱中，(3)整体原位杂交——电泳检测探针合成结果后，按照Harland和Hollemann方法分别与各期的非洲爪蟾胚胎进行整体原位杂交，同时作阴性对照组，阴性对照组以无菌水取代地高辛探针，(4)组织切片一一运用传统的组织切片技术将经过整体原位杂交之后的非洲爪蟾0-41期胚胎做厚度为12(xm的切片，并用曙红负染。10、权利要求1所述非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein或权利要求4所述非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein编码的多肽在制备治疗神经变性疾病、乳腺癌和卵巢癌的药物中的应用。全文摘要本发明公开了非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein的cDNA全长克隆，它的cDNA全长1040bp，含有一个完整的开放阅读框，可以编码含129个氨基酸的蛋白质。也公开了这种基因的两个RT-PCR引物、RT-PCR方法和整体原位杂交技术。非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein在成蛙和胚胎时期的中枢神经系统中有高水平的表达，能参与胚胎前脑的形成，并与神经变性疾病、乳腺癌和卵巢癌等疾病密切相关。这种非洲爪蟾GRK家族新基因Xsynuclein及其编码的蛋白质有望在治疗神经变性疾病、乳腺癌和卵巢癌等疾病方面取得突破。文档编号C12N15/54GK101186921SQ20071011525公开日2008年5月28日申请日期2007年12月12日优先权日2007年12月12日发明者瑶刘,屈庆春申请人:山东大学