专利名称：一种检测血清对氧磷酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及对氧磷酶活性的检测方法。 技术背景
对氧磷酶(paraoxonases， PONs)是一个蛋白家族，由P0N1， P0N2， P0N3共三个成员 组成。其编码基因位于7号染色体的长臂。P0N1和P0N3在肝脏中合成后分泌到血液中， 并与高密度脂蛋白(HDL)结合形成复合体。P0N2在人体肝，脑，肾及睾丸等组织中广泛表 达，但不存在于血液中。
P0N1基因产物，也叫血清对氧磷酶，是这个多基因家族中发现最早，研究最多的成 员。最初研究P0N1时，发现它能水解有机磷杀虫剂 一对氧磷，对氧磷酶(E.C.3.1.8. 1) 的名字由此而来。随后，人们又发现了它有水解芳香酯酶的活性，但对氧磷酶的名称一直 沿用至今。人血清P0N1基因全长为33kb，由9个外显子和8个内含子构成，其cDNA共 1065nt。 P0N1由355个氨基酸组成，纯化的人血清P0N1是一个约43kD的糖蛋白，等电 点为5.1。目前发现在P0N1基因存在多态性现象。其中包括启动子区的4个多态性位点 (-107C〉T,-162A〉G,-824G〉A,-907G〉C)，能影响基因的表达和血清中该酶的活性。同时在 基因的编码区也存在多态现象。分别是位于其编码产物的第55位(55L/M)和第192位 (192Q/R)氨基酸。55L/M可能影响P0N1和HDL结合过程，192Q/R对P0N1的底物特异性 和水解活力产生影响。在正常人群中，血清P0N1的活力相差可达10-40倍，在单个基因 型中，P0N1蛋白水平的差异也可高达13倍。由于血清中P0N3的对氧磷酶活力较低，目 前所称得血清对氧磷酶一般指的是P0N1.
P0N1是一种广谱的非专一性酯酶。同时具有有机磷酯酶、芳香酯酶和内酯酶活性。 可以水解异丙嘧磷、毒死蜱、对氧磷等有机磷杀虫剂，甚至能分解某些神经毒剂如沙林、 梭曼。研究表明，P0N1的在血清中的活性不仅可以提示个体抵抗有机磷毒剂能力的强弱， 而且其活力还与动脉粥样硬化、冠心病2型糖尿病、高血压、肝炎、阿尔茨海默病等的发 展有一定的相关性，因此，建立对氧磷酶活性的测定方法不仅有利于这些疾病的监测，也 有利于疾病发病机制的深入研究。
目前国内外对对氧磷酶的活性检测主要是检测其对氧磷酶和芳香酯酶的活性，最常用 的底物是对氧磷和乙酸苯酯。但两种方法各有利弊，以乙酸苯酯为底物，反应的检测波长 在270nm，在该波段干扰物质较多，不利于检测的自动化。以对氧磷为底物进行检测虽然能 够在自动生化分析仪上进行，但对氧磷为剧毒物质，购买和储存都比较困难。而且工作者 在相关的检测中必须做好防护以预防中毒。BryanF等人曾经用对硝基苯乙酸乙酯为底物 测定肝细胞中P0N1的活性。该方法测定的原理是以对硝基苯乙酸乙酯为底物，在P0N1 芳香酯酶的作用下水解生成对硝基苯酚和乙酸。通过在405nm条件下测定对硝基苯酚的含 量来确定P0N1活力的大小。该方法可以在可见光波长范围检测结果，而对硝基苯乙酸乙 酯本身又无毒性，可以克服以上两种测定方法制缺点，但由于其测定过程干扰物质依然比 较多，且测定的灵敏度要比以乙酸苯酯为底物差，所以其应用受到很大限制。
发明内容
针对以上筛选方案存在的弊端，本发明提供了一种操作简单，反应直观，不依赖于仪 器，所用底物对人体无毒的快速测定血清对氧磷酶活性的新方法。 技术原理
该方法是在BryanF等的测定方法基础上改进而来的。对硝基苯乙酸乙酯在对氧磷酶 的作用下生成硝基苯酚和乙酸，通过添加一种基于PH值变化的颜色指示剂溴百里香酚兰 (其指示范围为6—8，当PH-6时呈黄色，W^8时呈蓝色，当PH值在两者之间时，显示不同的颜色变化，可以指示乙酸生成量的多少，从而间接指示对氧磷酶的活性)。而且指示剂 的添加使该检测底物复合物的有效波长扩大到620nm,减少了检测过程的干扰。
对硝基苯乙酸乙酯 - 对硝基酚+乙酸(反应原理)
对氧磷酶
检测方法
反应体系中加入一定量的血清，对硝基苯乙酸乙酯(5mM),氯化钙(20Min), tris-Hcl(O. lM,ra为7.7),37。C反应一定时间后用0. 1M EDTA中止反应。最后在该反映体 系中上添加O. 01%的溴百里香酚兰，在620mn的可见光条件下测定光吸收值。 应用举例
1、 定量测定血清对氧磷酶的活性 人体内血清对氧磷酶的活性在有10-40倍的个体差异，血清对氧磷酶的活性不同，个体
对有机磷毒剂的耐受能力也有很大差异，而且研究表明，其活性的高低与动脉粥样硬化、 冠心病、糖尿病等的发病几率都有一定的相关性。我们实验证明，以对硝基苯乙酸乙酯为 底物的的测定方法虽然没有乙酸苯酯灵敏度高，但人个体之间的血清对氧磷酶活性的差异 用该方法可以准确测定。(可以检测100倍差别的血清对氧磷酶活性)该方法在普通的可 见分光光度计即可测定。
2、 定性评价人血清对氧磷酶高低 溴百里香酚兰是一种对PH值非常敏感的颜色指示剂。通过反应颜色的变化可以粗略的
观察个体的血清对氧磷酶含量是否偏高。(对氧磷酶活性较低时，显示为深蓝色；对氧磷 酶活性偏高时，显示为浅黄色；当活性处于中间时，呈现一系列深浅不同的颜色变化)
3、 用于对氧磷酶的高通量筛选 在筛选高产对氧磷酶基因工程菌时，该颜色反应可以做为高通量筛选的耙点。
技术优点
该方法操作简便，在可见光分光光度计下即可完成，节约成本，而且该底物对人体无 害，容易获得，在620nm条件下干扰物质较少。灵敏的颜色反应不仅可以在科研方面进行 高活力对氧磷酶的高通量筛选，而且更方便临床上血清对氧磷酶的测定。更重要的是，我 们可以利用该原理进行血清对氧磷酶快速检验试纸条的研制，有望使病人可以不依赖仪器 可以进行的粗略自检，便于病人在治疗过程中更方便的了解自身病情的进展情况。
权利要求
1.一种新型的检测血清对氧磷酶的方法，本发明的特征在于反应体系中加入一定量的血清，对硝基苯乙酸乙酯(5mM)，氯化钙(20Mm)，tris-Hcl(0.1M，PH为7.7)，37℃反应一定时间后用0.1M EDTA中止反应。最后在该反应体系中上添加0.01％的溴百里香酚兰，在620nm的可见光条件下测定光吸收值。
2. 按照权利要求1中所述的新型的检测血清对氧磷酶的方法。其关键特征在于在检测体系中添加了颜色指示剂溴百里香酚兰，其浓度范围在0%— 30%之间。
3. 按照权利要求1中所述的新型的检测血清对氧磷酶的方法。本检测方法中所用的缓冲液不限于Tris-Hcl缓冲液，可以是任何种类的PH值在6—8之间的缓冲液。
4. 按照权利要求1中所述的新型的检测血清对氧磷酶的方法的应用。可用于编码不同活性的血清对氧磷酶基因的高通量筛选。
5. 按照权利要求1中所述的新型的检测血清对氧磷酶的方法的应用。可用于定量检测血清对氧磷酶的活性。
6. 按照权利要求l中所述的新型的检测血清对氧磷酶的方法的应用。可用于血清对氧磷酶活性的临床快速检测
7. 按照权利要求1中所述的新型的检测血清对氧磷酶的方法的应用。利用该原理进行血清对氧磷酶快速检验试纸条或快速检测试剂盒的研制和应用。
全文摘要
本发明涉及血清对氧磷酶活性的检测方法。具体内容是通过在测定血清对氧磷酶活性的反应体系中添加一种特殊的颜色指示剂，反应产物与颜色指示剂结合形成复合物之后使测定的吸光值范围由405nm提高到620nm，降低了测定过程中其他物质的干扰，而且该反应有明显的颜色变化谱，可以通过颜色变化来快速反映血清中对氧磷酶含量的高低。该方法简便，灵敏，底物对人体无害，容易获得，还可用于不同活性对氧磷酶的高通量筛选。
文档编号G01N21/77GK101650312SQ20081023087
公开日2010年2月17日 申请日期2008年11月13日 优先权日2008年11月13日
发明者张建云, 谷立坤 申请人:河南工程学院