一种土壤过氧化物酶活性测定试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生命科学领域，设及一种试剂盒，具体设及一种±壤过氧化物酶活性 测定试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002] 过氧化物酶(S-P0D)主要来源于±壤微生物，能够氧化±壤有机物质产生过氧化 物，在腐殖质的形成过程中具有重要作用。
[0003] 目前测定过氧化物酶活性最权威的方法是愈创木酪法。但该方法只能适用于测定 动物、植物和培养细胞中过氧化物酶活性，不能适用于±壤样本。目前市面上还没有一种有 效的±壤过氧化物活性的测定方法及其试剂盒。
【发明内容】
[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明旨在提供一种±壤过氧化物酶活性测定试剂盒 及其方法，可快速准确的对±壤过氧化物酶活性进行测定。
[0005] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过W下技术方案实现： 一种±壤过氧化物酶活性测定试剂盒，包括W下试剂： 试剂一，粉剂X 1瓶，4°c保存，由一定量的邻苯立酪组成，置于lOmL试剂瓶中； 试剂二，液体XI瓶，4°C保存，由一定量的过氧化氨与蒸馈水混匀而成，置于2mL试剂瓶 中； 试剂Ξ，液体X 1瓶，4°C保存，由巧樣酸-憐酸缓冲液组成，置于5mL试剂瓶中； 试剂四，液体X 1瓶，4°C保存，由乙酸组成，置于100血试剂瓶中。
[0006] 进一步的，所述试剂一中的邻苯Ξ酪的质量为0.125g; 进一步的，所述试剂二中的过氧化氨的体积为50uL，蒸馈水的体积为1.95mL; 进一步的，所述试剂Ξ中的巧樣酸-憐酸缓冲液的抑=4.5,所述的巧樣酸-憐酸缓冲液 是由57.4mg-水合巧樣酸、162.6mg十二水合憐酸氨二钢和5m蒸馈水混匀而成； 进一步的，所述试剂四中的乙酸的体积为lOOmL。
[0007] ±壤过氧化物酶(S-P0D)催化有机物质氧化成紫色没食子素，后者在430nm有特征 光吸收。
[000引一种采用上述试剂盒且基于分光光度法的±壤过氧化物酶活性测定方法，包括W 下步骤： 步骤1仪器和用品的准备； 可见分光光度计或酶标仪、台式离屯、机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿或96 孔板、50mL乙酸、研鉢、冰和蒸馈水； 步骤2试剂的配制； 所述试剂一在临用前加 lOmL蒸馈水充分溶解，制成试剂一水溶液； 步骤3分光光度计或酶标仪的预热； 分光光度计或酶标仪预热30min W上，调节波长至430nm，蒸馈水调零； 步骤4 ±壤过氧化物酶活性的测定操作； 取一支1.5mLEP管，作为测定管，在其中加入0.0?风干±样、100化所述试剂一水溶液、 20化所述试剂二，振荡混匀，30°C恒溫培养1 h;再加入50化所述试剂Ξ和43化L所述试剂 四，振荡数次，室溫静置30min，取20化L上层液，于430nm处测定吸光值A; 步骤5 ±壤过氧化物酶活性的计算； 1) 用微量石英比色皿测定，其计算公式如下： 标准条件下测定吸光值A的回归方程为y = 8.97x - 0.003; 其中，X为标准品浓度(mg/mL)，y为吸光值A; 单位的定义:每天每肖±样中产生Img紫色没食子素定义为一个酶活力单位； ±壤过氧化物酶活性化/g±样)=(A+0.003)今8.97XV反旨今W今T = 80X(A+0.003); 其中，T=lh=l/24d，表示反应时间； V反宮=0.6mL，表示反应体系总体积； W=0.02g，表示样本质量； 2) 用96孔板测定，其计算公式如下： 标准条件下测定吸光值A的回归方程为y = 4.485X - 0.003; 其中，X为标准品浓度(mg/mL)，y为吸光值A; 单位的定义:每天每肖±样中产生Img紫色没食子素定义为一个酶活力单位； ±壤过氧化物酶活性化/邑±样)=(4+0.003)今4.485 X V反旨今W今Τ=160 X (A+0.003); 其中，T=lh=l/24d，表示反应时间； V反宮=0.6mL，表示反应体系总体积； W=0.02g，表示样本质量。
[0009] 本发明的有益效果是： 1、本发明的试剂盒是目前市面上唯一的检测±壤过氧化物的试剂盒，具有独创性。
[0010] 2、本发明的试剂盒检测灵敏度极高，最低检测限达到0.抓/肖±样。
[0011] 3、本发明的方法操作步骤简便，快速，可W-次性测定96个样本。
[0012] 4、本发明的方法所用的试剂均为常见试剂，成本极低，对设备和用品的要求也相 对较低。
[0013] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予W实施，W下W本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实 施方式由W下实施例详细给出。
【具体实施方式】
[0014] 下面将结合实施例，来详细说明本发明。
[0015] -种±壤过氧化物酶活性测定试剂盒，包括W下试剂： 试剂一，粉剂X 1瓶，4°C保存，由0.125g的邻苯立酪组成，置于10血试剂瓶中； 试剂二，液体X 1瓶，4°C保存，由50uL过氧化氨与1.95血蒸馈水混匀而成，置于2mL试剂 瓶中； 试剂立，液体X 1瓶，4°C保存，由pH=4.5的巧樣酸-憐酸缓冲液组成，置于5mL试剂瓶中； 所述的巧樣酸-憐酸缓冲液是由57.4mg-水合巧樣酸、162.6mg十二水合憐酸氨二钢和5m蒸 馈水混匀而成； 试剂四，液体X 1瓶，4°C保存，由100血乙酸组成，置于100血试剂瓶中。
[0016] ±壤过氧化物酶(S-P0D)催化有机物质氧化成紫色没食子素，后者在430nm有特征 光吸收。
[0017] -种采用上述试剂盒且基于分光光度法的±壤过氧化物酶活性测定方法，包括W 下步骤： 步骤1仪器和用品的准备； 可见分光光度计或酶标仪、台式离屯、机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿或96 孔板、50mL乙酸、研鉢、冰和蒸馈水； 步骤2试剂的配制； 所述试剂一在临用前加 lOmL蒸馈水充分溶解，制成试剂一水溶液； 步骤3分光光度计或酶标仪的预热； 分光光度计或酶标仪预热30min W上，调节波长至430nm，蒸馈水调零； 步骤4 ±壤过氧化物酶活性的测定操作；
参见上表所示，取一支1.5mLEP管，作为测定管，在其中加入0.0?风干±样、lOOiiL所述 试剂一水溶液、2化L所述试剂二，振荡混匀，30°C恒溫培养1 h;再加入50化所述试剂Ξ和 43化L所述试剂四，振荡数次，室溫静置30min，取20化L上层液，于430nm处测定吸光值A; 步骤5 ±壤过氧化物酶活性的计算； 1) 用微量石英比色皿测定，其计算公式如下： 标准条件下测定吸光值A的回归方程为y = 8.97x - 0.003; 其中，X为标准品浓度(mg/mL)，y为吸光值A; 单位的定义:每天每肖±样中产生Img紫色没食子素定义为一个酶活力单位； ±壤过氧化物酶活性化/g±样)=(A+0.003)今8.97XV反旨今W今T = 80X(A+0.003); 其中，T=lh=l/24d，表示反应时间； V反宮=0.6mL，表示反应体系总体积； W=0.02g，表示样本质量； 2) 用96孔板测定，其计算公式如下： 标准条件下测定吸光值A的回归方程为y = 4.485X - 0.003; 其中，X为标准品浓度(mg/mL)，y为吸光值A; 单位的定义:每天每肖±样中产生Img紫色没食子素定义为一个酶活力单位； ±壤过氧化物酶活性化/邑±样)=(4+0.003)今4.485 X V反旨今W今Τ=160 X (A+0.003); 其中，T=lh=l/24d，表示反应时间； V反宮=0.6mL，表示反应体系总体积； W=0.02g，表示样本质量。
[0018]上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的 普通技术人员能够了解本发明的内容并据W实施，并不能W此限制本发明的保护范围。凡 是根据本
【发明内容】
的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种土壤过氧化物酶活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂： 试剂一，粉剂X 1瓶，4°c保存，由一定量的邻苯三酚组成，置于10mL试剂瓶中； 试剂二，液体X 1瓶，4°C保存，由一定量的过氧化氢与蒸馏水混匀而成，置于2mL试剂瓶 中； 试剂三，液体X 1瓶，4°C保存，由柠檬酸-磷酸缓冲液组成，置于5mL试剂瓶中； 试剂四，液体X 1瓶，4°C保存，由乙醚组成，置于100mL试剂瓶中。2. 根据权利要求1所述的土壤过氧化物酶活性测定试剂盒，其特征在于： 所述试剂一中的邻苯三酚的质量为〇.125g; 所述试剂二中的过氧化氢的体积为50uL，蒸馏水的体积为1.95mL; 所述试剂三中的柠檬酸-磷酸缓冲液的pH=4.5，所述的柠檬酸-磷酸缓冲液是由57.4mg 一水合梓檬酸、162.6mg十二水合磷酸氢二钠和5m蒸馏水混勾而成； 所述试剂四中的乙醚的体积为l〇〇mL。3. -种采用如权利要求2所述的试剂盒的土壤过氧化物酶活性测定方法，其特征在于， 基于分光光度法，包括以下步骤： 步骤1仪器和用品的准备； 可见分光光度计或酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿或96 孔板、50mL乙醚、研钵、冰和蒸馏水； 步骤2试剂的配制； 所述试剂一在临用前加10mL蒸馏水充分溶解，制成试剂一水溶液； 步骤3分光光度计或酶标仪的预热； 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至430nm，蒸馏水调零； 步骤4 土壤过氧化物酶活性的测定操作； 取一支1.5mLEP管，作为测定管，在其中加入0.02g风干土样、10(^所述试剂一水溶液、 20yL所述试剂二，振荡混匀，30°C恒温培养1 h;再加入50yL所述试剂三和430Λ所述试剂 四，振荡数次，室温静置30min，取200yL上层液，于430nm处测定吸光值A; 步骤5 土壤过氧化物酶活性的计算； 1) 用微量石英比色皿测定，其计算公式如下： 土壤过氧化物酶活性(U/g 土样)=(A+0.003) + 8.97XV願+W+T = 80Χ(Α+0·003); 其中，T=lh=l/24d，表示反应时间； Vm^=0.6mL，表示反应体系总体积； W=0.02g，表示样本质量； 2) 用96孔板测定，其计算公式如下： 土壤过氧化物酶活性(U/g 土样)=(A+0.003) + 4.485XV^+W+T=160X(A+0.003); 其中，T=lh=l/24d，表示反应时间； Vm^=0.6mL，表示反应体系总体积； W=0.02g，表示样本质量。
【专利摘要】本发明公开了一种土壤过氧化物酶活性测定试剂盒及其方法，该试剂盒包括：由邻苯三酚组成的试剂一，由过氧化氢与蒸馏水混匀而成的试剂二，由一水合柠檬酸、十二水合磷酸氢二钠和蒸馏水混匀而成的试剂三，由乙醚组成的试剂四。本发明的试剂盒是目前市面上唯一的检测土壤过氧化物的试剂盒，具有独创性，灵敏度极高，最低检测限达到0.5U/g土样。本发明的方法操作步骤简便，快速，可以一次性测定96个样本，且所用的试剂均为常见试剂，成本极低，对设备和用品的要求也相对较低。
【IPC分类】C12Q1/28
【公开号】CN105543331
【申请号】CN201610039406
【发明人】赵林川
【申请人】苏州科铭生物技术有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月21日