一种抗菌肽活性检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种琼脂溶液，它包括琼脂与强碱，其中，琼脂的浓度为2～3%（w/v），强碱的浓度不低于0.8mol/L。本发明还提供了包含前述琼脂溶液的检测试剂盒，以及该试剂盒的检测方法。采用本发明试剂盒检测抗菌肽活性，检测结果准确可靠，对实验条件的要求低，操作简便，普通人即可使用，实用性强。
【专利说明】一种抗菌肽活性检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗菌肽活性检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]抗菌肽的活性检测通常采用管碟法，管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和待检品两者对指示菌的抑菌圈大小来测定待检品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置牛津杯，杯内放入标准品和待检品的溶液，经16~18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。抑菌圈直径大小与抗生素效价相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。[0003]使用管碟法进行检测时，需要制备新鲜的琼脂溶液，即将琼脂粉加热至95°C以上制成琼脂溶液，灭菌后，降低温度，在适当温度下加入指示菌进行检测。然而，对于试验条件比较差或者完全没有实验操作能力的人员来说，难以有效灭菌，同时，因凝胶溶液降温至400C以下时形成凝胶，而大部分细菌生长繁殖的适宜温度通常为20~40°C，若在40°C以下加入指示菌，则指示菌与凝胶状的琼脂不能有效混匀，导致指示菌分布不均，致使检测结果不准确，若在40°C以上加入指示菌，将导致指示菌难以有效生长，降低检测效率或者导致检测失败。
【发明内容】
[0004]为了解决上述问题，本发明提供了一种新的琼脂溶液，以及包含该琼脂溶液的抗菌肽活性检测试剂盒。
[0005]本发明琼脂溶液，它包括琼脂与强碱，其中，琼脂的浓度为2~3%(w/v)，强碱的浓度不低于0.8mol/L。
[0006]w/v,即 g/ml。
[0007]强碱，溶于水能发生完全电离的碱，如，氢氧化钠、氢氧化钾、。
[0008]其中，所述琼脂的浓度为3% (w/v)。
[0009]其中，所述强碱为氢氧化钠，浓度不低于1.0mol/Lo
[0010]其中，所述强碱为氢氧化钾，浓度为0.8~1.0mol/Lo
[0011]本发明还提供了一种制备前述琼脂溶液的方法，步骤如下:按照前述配比取原料，混匀，灭菌，即可。
[0012]本发明抗菌活性检测试剂盒，可用于检测品(如，抗菌肽)的抗菌活性，它包括如下组分:
[0013]指示菌；
[0014]营养液:指示菌的液体培养基；
[0015]基质液:前述琼脂溶液；
[0016]稀释液:强酸溶液。[0017]强酸，溶于水能发生完全电离的酸，如，磷酸、盐酸或者硝酸、硫酸。
[0018]其中，所述指示菌中，活菌数为IO7~IO8个/g。
[0019]其中，所述指示菌为大肠杆菌时，营养液是LB液体培养基。
[0020]LB液体培养基，大肠杆菌常用的培养基，其制备方法:取胰蛋白胨(Tryptone) 10g、酵母提取物(Yeast extract) 5g、氯化钠(NaCl) IOg,定容至 1L,调 ρΗ7.0,121°C灭菌15分钟，即得。
[0021]优选地，所述强酸溶液是磷酸溶液、盐酸溶液或者硝酸溶液。
[0022]优选地，所述强酸溶液的浓度为0.3~0.4mol/L。
[0023]本发明使用前述试剂盒检测样品(如，抗菌肽)的抗菌活性的方法，包括如下步骤:
[0024]( I)取待检样品，制成样品溶液；
[0025](2)取指示菌，加入营养液，制成菌悬液；
[0026](3)在温度大于等于20°C的条件下，往基质液中加入稀释液至溶液pH为5-7，再加入步骤(2)的菌悬液，混匀，倒入培养皿中；
[0027](4)待培养皿中的溶液凝固后，倒置培养，放入牛津杯，在牛津杯中加入步骤(1)制备的样品溶液，培养，观察抑菌圈大小，即可。
[0028]本发明琼脂溶液pH值高，不易染菌，可以长时间放置，用于抗菌肽检测时，无需灭菌，对实验条件和实验者操作技巧的要求低，同时，其在温度为20°C时，即呈液态，在较低温度(20°C )下加入指示菌也可以充分混匀，能够在保证指示菌与琼脂溶液混匀的同时维持指示菌的正常生长。采用本发明试剂盒检测抗菌肽活性，无需配制新鲜琼脂溶液，对实验条件的要求低，操作简便，普通人即可使用，实用性强，检测结果准确可靠，具有良好的应用前
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[0029]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0030]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
图1本发明检测方法可靠性的结果图【具体实施方式】
[0031]实施例1本发明琼脂溶液的制备
[0032]取琼脂粉，制成浓度为2% (g/ml)的琼脂溶液，加入氢氧化钾至浓度为0.8mol/L,混匀，灭菌，即可。
[0033]实施例2本发明琼脂溶液的制备
[0034]取琼脂粉，制成浓度为2% (g/ml)的琼脂溶液，加入氢氧化钠至浓度为lmol/L，混匀，灭菌，即可。
[0035]实施例3本发明琼脂溶液的制备
[0036]取琼脂粉，制成浓度为3% (g/ml)的琼脂溶液，加入氢氧化钾、氢氧化钠至浓度分别为0.8mol/L和lmol/L,混匀，灭菌，即可。[0037]实施例4本发明抗菌肽检测试剂盒的组成及检测方法
[0038]1、检测试剂盒的组成
[0039]指示菌:活菌数为IO7~IO8个/g大肠杆菌制剂。
[0040]营养液:指示菌的液体培养基，如，LB液体培养基，制备方法:将胰蛋白胨(Tryptone) 10g、酵母提取物(Yeast extract) 5g、氯化钠(NaCl) IOg,定容至 1L,调 ρΗ7.0,121°C灭菌15分钟。
[0041]基质液:实施例1的琼脂溶液；
[0042]稀释液:硝酸溶液，浓度为0.4mol/L。
[0043]2、检测方法
[0044]( I)取待检抗菌肽，制成抗菌肽溶液；
[0045](2)取菌制剂，加入营养液，制成菌悬液；
[0046](3)在温度大于等于20°C的条件下，往基质液中加入稀释液至溶液pH为5-7，再加入步骤(2)的菌悬液，混匀，倒入培养皿中；
[0047](4)待培养皿中的溶液凝固后，倒置培养，放入牛津杯，在牛津杯中加入步骤(1)制备的抗菌肽溶液，培养，观察抑菌圈大小，即可。
[0048]实施例5本发明抗菌肽检测试剂盒的组成及检测方法
[0049]1、检测试剂盒的组成
[0050]指示菌:活菌数为IO7~IO8个/g大肠杆菌制剂。
[0051]营养液:指不菌的液体培养基，如，牛肉膏蛋白胨培养基，制备方法:取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，定容至1L，调ρΗ7.4~7.6，121°C灭菌15分钟。
[0052]基质液:实施例2的琼脂溶液； [0053]稀释液:磷酸溶液，浓度为0.3mol/L。
[0054]2、检测方法
[0055]( I)取待检抗菌肽，制成抗菌肽溶液；
[0056](2)取菌制剂，加入营养液，制成菌悬液；
[0057](3)在温度大于等于20°C的条件下，往基质液中加入稀释液至溶液pH为5-7，再加入步骤(2)的菌悬液，混匀，倒入培养皿中；
[0058](4)待培养皿中的溶液凝固后，倒置培养，放入牛津杯，在牛津杯中加入步骤(1)制备的抗菌肽溶液，培养，观察抑菌圈大小，即可。
[0059]实施例6本发明抗菌肽检测试剂盒的组成及检测方法
[0060]1、检测试剂盒的组成
[0061]指示菌:活菌数为107~108个/g大肠杆菌制剂。
[0062]营养液:指不菌的液体培养基，如，牛肉膏蛋白胨培养基，制备方法:取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，定容至1L，调ρΗ7.4~7.6，121°C灭菌15分钟。
[0063]基质液:实施例3的琼脂溶液；
[0064]稀释液:盐酸溶液，浓度为0.4mol/L。
[0065]2、检测方法
[0066]( I)取待检抗菌肽，制成抗菌肽溶液；
[0067](2)取菌制剂，加入营养液，制成菌悬液；[0068](3)在温度大于等于20°C的条件下，往基质液中加入稀释液至溶液pH为5-7，再加入步骤(2)的菌悬液，混匀，倒入培养皿中；
[0069]( 4 )待培养皿中的溶液凝固后，倒置培养，放入牛津杯，在牛津杯中加入步骤(1)制备的抗菌肽溶液，培养，观察抑菌圈大小，即可。
[0070]实施例7本发明试剂盒中的基质液(琼脂溶液)的组成筛选试验
[0071]一、强碱的种类和用量选择
[0072]1、试验方法
[0073]将2%浓度的琼脂溶液中加入不同浓度梯度的NaOH或KOH溶液，混合均匀后，待冷却至15°C或20°C下时观察琼脂的凝固状态，然后将处理后的琼脂再放入90°C的水中水浴加，观察琼脂熔化状态。
[0074]2、试验结果
[0075]实验结果如表1所示:
[0076]表1不同浓度的强碱处理后的琼脂凝固状态
[0077]
【权利要求】
1.一种琼脂溶液，其特征在于:它包括琼脂与强碱，其中，琼脂的浓度为2~3%(w/v)，强碱的浓度不低于0.8mol/Lo
2.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于:所述琼脂的浓度为3%(w/v)0
3.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于:所述强碱为氢氧化钠，浓度不低于 1.0mol/Lo
4.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于:所述强碱为氢氧化钾，浓度为0.8~ 1.0mol/Lo
5.一种制备权利要求1~4任意一项所述琼脂溶液的方法，其特征在于:步骤如下:按照权利要求1~4任意一项所述配比取原料，混匀，灭菌，即可。
6.一种检测抗菌活性的试剂盒，其特征在于:它包括如下组分: 指示菌； 营养液:指示菌的液体培养基； 基质液:权利要求1~4任意一项所述的琼脂溶液； 稀释液:强酸溶液。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于:所述指示菌中，活菌数为IO7~IO8个/g ; 所述指示菌为大肠杆菌时，营养液是LB液体培养基。
8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于:所述强酸溶液是磷酸溶液、盐酸溶液或者硝酸溶液。
9.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于:所述强酸溶液的浓度为0.3~0.4mol/L。
10.一种使用权利要求6~9任意一项所述试剂盒检测抗菌活性的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)取待检样品，制成样品溶液； (2)取指示菌，加入营养液，制成菌悬液； (3)在温度大于等于20°C的条件下，往基质液中加入稀释液至溶液pH为5-7，再加入步骤(2)的菌悬液，混匀，倒入培养皿中； (4)待培养皿中的溶液凝固后,倒直培养，放入牛津杯，在牛津杯中加入步骤(1)制备的样品溶液，培养，观察抑菌圈大小，即可。
【文档编号】C12Q1/18GK103911423SQ201410103880
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】李钢, 邹辉琴, 温静 申请人:四川华德生物工程有限公司