制备有生物活性的α-β肽的方法

专利名称：制备有生物活性的α-β肽的方法
技术领域：
本发明涉及制备包含α -氨基酸残基和β -氨基酸残基的多肽化合物的方法，由此制备的化合物以及所述化合物作为药学活性剂在治疗包括人在内的动物的疾病中的用途。背景许多天然存在的生物活性化合物是基于α -氨基酸的蛋白或肽(即其中一个氨基酸的α-羧基通过酰胺键与邻接氨基酸的α-氨基连接的α-氨基酸序列)。近年来，发现新的药学活性药物的途径已转向合成肽文库并继而针对该文库中具有所需活性(例如所需结合活性)的化合物进行测定。然而，α-氨基酸肽对于药物应用并非完全令人满意，尤其是因为它们往往吸收差并且在体内受到蛋白水解降解。关于β-氨基酸和由β-氨基酸合成的肽的许多工作已在科学文献和专利文献中报道。参见例如，由当前共同发明人Samuel H. Gellman带领的小组进行的工作， 包括,Application of Microwave Irradiation to the Synthesis of 14-helical Beta-P印tides (微波辐射在14-螺旋β -肽的合成中的应用)”，Murray和Gellman， "Organic Letters (2005) 7 (8) , 1517-1520 ；"Synthesis of 2,2-Disubstituted Pyrrol idine-4-carboxylic Acid Derivatives and Their Incorporation into Beta-Peptide Oligomers 0，2- 二取代的吡咯烷_4_甲酸衍生物的合成及其掺入 β -肽寡聚物)” · Huck 和 Gellman，J. Org. Chem. (2005) 70 (9)，3353-62 ；"Effects of Conformational Stability and Geometry of Guanidinium Display on Cell Entry by Beta-Peptides (β肽对细胞进入的胍盐展示的构象稳定性和几何学的影响)” Potocky、 Menon 禾口 Gellman, Journal of the American Chemical Society (2005) 127(11) 3686-7 ； " Residue requirements for helical folding in short alpha/ beta-peptides :crystallographic characterization of the 11一helix in an optimized sequence (对于短α/β肽中的螺旋折叠的残基需求优化序列中11_螺旋的晶体学表征)“，Schmitt、Choi、Guzei 禾P Gellman, Journal of the American ChemicalSociety(2005)，127(38)，13130-1 禾口 ‘‘ Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation (用微波福身寸对 β-月太组合文库的有效合成)，，，Murray、Farooqi、Sadowsky、Scalf、Freund、Smith、Chen 禾口 Gellman, Journal of the American Chemical Society (2005)，127 (38)，13271-80。由瑞士苏黎世的 Dieter kebach带领的另一小组也已在β-多肽领域广泛发表文章。参见例如jeekich等(1996) Helv. Chim. Acta. 79 :913-941 和 Seebach 等(1996) Helv. Chim. Acta. 79 :2043_2066。在这两篇文章的第一篇中kebach等描述了名为(H-β-HVal-β-HAla-β-HLeu) 2-0H的β-六肽的合成和表征。引人关注的是，该文章特别指出关于肽结构的现有技术报道已自相矛盾并且“部分具有争议的”。在第二篇文章中，Seekich等探索了以上提及的β-六肽的二级结构以及残基变化对二级结构的影响。Dado 和 Gel Iman (1994) J.Am. Chem. Soc. 116 :1054-1062 描述了 β 丙氨酸和 Y 氨基丁酸的衍生物中的分子内氢键合。该文章假定若多聚体骨架上的最邻近酰胺基之间的分子内氢键合是非偏爱的，则β肽将以类似于α-氨基酸多聚体的方式折叠。Suhara 等(Igge)iTetrahedron Lett. 37(10) 1575-1578 报道了 β 肽的多糖类似物，其中D-葡基胺衍生物彼此经由C-I β -羧酸基团和C-2 α -氨基连接。此类化合物已有惯用名“碳类肽(carbop印toid) ”。关于产生组合文库的方法，可得到数篇综述。参见例如Ellman(1996)Acc. Chem. Res. 29 :132-143 和 Lam 等(1997)Chem. Rev. 97 :411_448。在近来关于β-多肽的专利文献中，参见例如美国已发表的专利申请 2008/0166388，标题为“Beta-P 印 tides with Antifungal Activity (具抗真菌活性的 β _ 肽)“；2008/0058548，标题为 Concise Beta2_Amino Acid Synthesis via Organocatalytic Aminomethylation(经由有机催化氨甲基化的简明β2_氨基酸合
) “ ；2007/0154882, feH ^ “ Beta-polypeptides that inhibit cytomegalovirus infection(抑制巨细胞病毒感染的β-多肽)“；2007/0123709，标题为"Beta-amino acids(0-氨基酸)〃以及 2007/0087404，标题为〃 Poly-beta-p印tides from functionalized beta-lactam monomers and antibacterial compositions containing same (来自官能化β _内酰胺单体的β _多肽和含有所述β _多肽的抗菌组合物)“。还参见美国已公布的专利申请2003/0212250，标题为〃 P印tides(肽)"。发明简述本发明涉及一种制备有生物活性的、抵抗蛋白水解的非天然多肽的方法。所述方法包括选择具有基本由α-氨基酸残基组成的氨基酸序列的生物活性多肽或药理活性多肽或其生物活性片段(“靶标”)。然后，制备具有与靶标α-氨基酸序列对应的氨基酸序列的合成多肽。然而在所述合成多肽中，靶标中存在的约14%-约50%的α-氨基酸残基被β-氨基酸残基置换。更优选靶标中存在的约20%-约50%的α-氨基酸残基被β-氨基酸残基置换。将氨基酸残基置于所述合成多肽中，使得在整个所述合成多肽的氨基酸序列中氨基酸残基和α-氨基酸残基以重复模式分布。所得非天然多肽的长度优选为约10-约100个残基、更优选为约20-约50个残基。优选至少两个残基为β -氨基酸残基ο在本发明的一个方案中，靶标中的至少一个α-氨基酸残基被至少一个β-氨基酸残基置换，所述β-氨基酸残基经由包含其β2和β 3碳原子的环而环状约束。在本发明的另一方案中，大部分或全部被插入的氨基酸残基经由包含其β2和β3碳原子的环而环状约束。在本发明的另一方案中，至少一个氨基酸残基在其β2和β3碳原子处不被取代。或者，所有的氨基酸残基可在其β2和β 3碳原子处被取代(用直链、支链或环状取代基取代)。在本发明的另一方案中，靶标中存在的约14% -约50%的α-氨基酸残基被 β -氨基酸残基置换，其中各个β -氨基酸残基具有至少一条与其所置换的α -氨基酸残基相同的侧链。因此在该方案中，所述方法包括选择待模拟的靶标，接着制备具有与所述靶标序列对应的氨基酸序列的合成多肽，但其中靶标中存在的约20% -约50%的α -氨基酸残基被类似的氨基酸残基置换。在本发明的该方案中，各个类似的氨基酸残基具有至少一条与其置换的α-氨基酸残基相同的侧链。此外，β-氨基酸残基和α-氨基酸残基在所述合成多肽的氨基酸序列中以重复模式分布。还包括在本发明中的是，包含如SEQ. ID. NO :4_11、16-22和25-30中所示的一级氨基酸序列的分离的非天然多肽。这些非天然多肽可用于抑制人免疫缺陷病毒与人细胞的融合的方法中。该方法包括将人细胞与包含如SEQ. ID. NO :4-11、16-22和25-30中所示的一级氨基酸序列的分离的非天然多肽接触，从而使所述细胞抵抗HIV通过其细胞膜的进入。本发明的另一个方案涉及抑制人免疫缺陷病毒(HIV)与人细胞的融合的方法。所述方法包括首先选择具有包含α -氨基酸残基且对HIV体内融合所必需的氨基酸序列的天然生物活性多肽或其生物活性片段。然后制备具有与所述生物活性多肽或其片段的序列对应的氨基酸序列的合成多肽。在该合成多肽中，所述生物活性多肽或生物活性片段中存在的约14%-约50%的α-氨基酸残基被β-氨基酸残基置换。再进一步地，在所述合成多肽中氨基酸残基和α-氨基酸残基以重复模式分布。然后将人细胞与所述合成多肽接触。在本发明的所有实施方案中，通常优选(尽管并不必需)所述重复模式使氨基酸残基在采用螺旋构象的非天然多肽中的螺旋一侧排布。换言之，在多肽采用的折叠结构中，当所述非天然多肽采用螺旋构象时，α-残基和残基的重复模式使氨基酸残基沿折叠分子结构的一侧排布。氨基酸残基和α-氨基酸残基的重复模式可为长度在 2-7 个残基的模式,例如(ααααααβ)、(αααααβ)、(ααααβ)、(αααβ)、 (ααβ)、(ααβαααβ)、(ααβαβαβ)禾口(αβ)。长度在 2-7 个残基的 α -氨基酸残基和β-氨基酸残基的所有独特模式明确在本发明的范围内。所述方法可用于通过现已知或将来开发的多肽合成的任何方法来制备多肽化合物。使用肽合成的现有方法，依照本方法制备的多肽通常长度小于约100个残基、更优选总约10个残基-总约50个残基、还更优选总约20个残基-约50个残基。高于和低于这些所示范围的范围在本发明的范围之内。很多商业服务公司，例如Abgent (San Diego, California, USA)提供了多至约100个残基的肽合成服务。沿寡聚体的侧链序列优选基于具有针对疾病状态的所需生物活性的原型α -肽 (靶标)。侧链序列还可在翻译至α / β -肽骨架上后经修饰以使化合物的所需性质最优化。被引入非天然α/β-肽骨架的各个β-残基可在两个骨架碳之一(β3或β2)或这两个骨架碳处携带侧链。所述侧链还可经由连接所述两个骨架碳的环而环状约束。
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本发明中尤其值得注意的是将原型靶序列中的α -残基用载有侧链的β -残基取代使得在不破坏沿寡聚体的侧链序列的情况下修饰骨架。环状残基使骨架刚化并促成螺旋结构。优选残基沿着全长序列平均间隔以便使因骨架修饰赋予寡聚体的蛋白酶抗性最大化。有规律的重复骨架模式的实例包括但不限于(α α α α α α β), (αααααβ)、(ααααβ)、(αααβ)、(ααβ)、(ααβαααβ)、 (ααβαβαβ)禾口(αβ)。终化合物的所需性质包括调节在一般疾病状态的发生或进程中和特别是HIV进入人细胞中涉及的蛋白-蛋白相互作用的能力，和相对于靶α-肽序列改善了的药代动力学性质和药效性质(例如更好的体内半衰期、生物分布等)。很多终化合物在溶液中呈螺旋结构，但并不必需是螺旋结构。无论是否具体公开，本文所用的数字范围旨在包含每个数字以及该范围内所含数字的子集。此外，这些数字范围应理解为针对涉及该范围内的任何数字或数字子集的权利要求提供支持。例如，公开1-10应理解为支持2-8、3-7、5、6、1-9、3. 6-4. 6、3. 5-9. 9等范围。除非另外指出或其中作出引用的上下文明确暗示相反，否则本发明对单数特征或限制的所有引用应包括相应的复数个特征或限制，并且反之亦然。除非另外指出或其中进行引用组合的上下文明确暗示相反，否则本文所用方法或过程步骤的所有组合可以任何顺序进行。本发明的方法、化合物和组合物可包含、由或基本由以下组成本文所述的本发明必需元素和限制，以及本文所述或另外可用于合成有机化学的任何另外的或任选的成分、 组分或限制。附图简述图IA描述了 α -肽1-3和α / β -肽4_11的序列。粗体残基表示与其α -氨基酸对应物对应的β3_残基粗体且带下划线的残基为环状约束的β-氨基酸残基ACPC (X) 和APC(Y)。图IB描述了 α-氨基酸、相应的β3_氨基酸类似物以及环状β-残基ACPC (X) 和APC (Z)的结构。图2Α描述了由三个NHR区段和两个CHR区段组成的gp41_5蛋白。图2B描述了荧光CHR肽，其用作竞争性FP测定中的示踪物(Flu = 5-羧基荧光素)。图2C是Flu-CHR 肽和由gp41_5形成的5-螺旋束之间的相互作用的示意图。图 3A、3B、3C 和 3D 描述了 NHR 肽 1 与 CHR 类似物 3 (图 3A)、4(图 3B)、5(图 3C) 和9(图3D)之间形成的复合体的圆二色性(CD)谱。实线为在25°C下于PBS中对总浓度为 20 μ M的所示寡聚体的1 1混合物观察到的光谱。虚线为根据单独组分的⑶对1 1非相互作用的混合物计算的光谱。图4Α和4Β是在α -肽1和3之间的新表征复合体(图4Α)和α -肽1和2之间的先前表征复合体(图 4Β) (Chan、Fass、Berger 和 Kim，Cell 1997，89，263-273)的晶体结构中观察到的6-螺旋束的比较。两种结构之间Ca原子的RMSD为0.7人。图4C描述了 1+3 复合体的晶体结构。图4D描述了解析至2.8 A分辨率的1+10复合体的晶体结构。图4E 描述了解析至2.8 A分辨率的1+8复合体的晶体结构。图4F和4G描述了 1+3形成的所有 a -肽螺旋束与1+10(图4F)和1+8(图4G)形成的所有a -肽螺旋束的叠加。
图5A、5B和5C描述了圆二色性(CD)谱。图5A描述了在25°C下于PBS中，在20 μ M 浓度时，NHR肽1与CHR肽3、4、5、8和10的叠加⑶数据。图5Β描述了在25°C下于PBS中总浓度为20 μ M的所示1 1混合物的CD谱(实线)，以及根据对单独组分的CD测量对 1 1非相互作用混合物计算的光谱(虚线)。图5C描述了在PBS中，在浓度为20 μ M时， 所示复合体在222nm处的温度依赖性摩尔椭圆率。图6的图描述了在PBS中，以20 μ M总肽的1+3、1+4、1+5和1+9的1 1混合物在222nm处的温度依赖性摩尔椭圆率。图7A描述了 Puma BH3肽(1)和α / β -肽类似物2-8的一级序列(灰色的环和粗体字母表示β 3残基)。图7Β描述了 1的螺旋轮图。图7Α和图7Β的加框残基表示基于序列同源性对结合最重要的疏水位置。图7C呈现了以与如图7Β中相同方向画出的1-8 的示意图；白环和灰环表示分别由α-残基和β3-残基占据的7个位置。图7D表示一般 α-氨基酸和一般β 3_氨基酸的结构；“R”取代基常规被称为“侧链”。图8是描述结合于Bel-、或Mcl-I的荧光标记Bak ΒΗ3肽被化合物1_8置换的抑制常数的柱状图。打断的条表示比测定中可识别的更紧密结合的化合物。对于两种蛋白而言8的值弱于100 μ Μ。图9Α、9Β和9C分别描述了 3、4和10的蛋白水解稳定性，其结构在图9D中示出。 将含20 μ M肽的TBS溶液在室温下与10 μ g/mL的蛋白酶K温育。图9A、9B和9C描述了时间依赖性降解数据和由拟合至简单指数式衰减所得的曲线。图9D描述了化合物3、4和10 的结构并且还描述了在所示时间点通过质谱观察到的蛋白水解产物。垂直线表示与所示残基之间的骨架酰胺键的水解一致的一种或两种产物通过MALDI-MS的观察结果。

图10A、10BU0C和IOD的图描述了所示病毒株对TZM_bl细胞的感染的抑制情况， 作为gp41衍生的融合阻断肽的浓度的函数。各数据点为三次独立实验的平均值士S. E. M0 图IOA描述了 NL4-3感染的抑制情况。图IOB描述了 CC1/85感染的抑制情况。图IOC描述了 HC4感染的抑制情况。图IOD描述了 DJ258感染的抑制情况。发明详述以下缩写用于整个说明书中Ac2O =醋酸酐、氧化乙酰、乙酰乙酸酯。ACPC =反式-2-氨基环戊烷甲酸。APC =反式-3-氨基吡咯烷-4-甲酸。Boc =叔丁氧羰基。BOP =六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)磷锵。β-Gal = β半乳糖苷酶。CD=圆二色性。CHR = C端七残基重复序列。DIEA = N, N- 二异丙基乙胺。DMF= 二甲基甲酰胺。DMSO = 二甲基亚砜。EDTA=乙二胺四乙酸。FKBP = FK506 结合蛋白。
Fmoc = 9-芴甲基甲酰基。FP =荧光偏振。Halogen = F、Cl、Br 禾口 I。HBTU = 2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲铵六氟-磷酸盐。HIV =人免疫缺陷病毒。HOBT = N-羟基苯并三唑。HPLC =高效液相色谱。iPr2EtN = N, N- 二异丙基乙胺。IPTG =异丙基β -D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷。MALDI-T0F-MS =基质辅助激光解吸飞行时间质谱。MeOH =甲醇。NHR = N端七残基重复序列。NMP = 1-甲基-2-吡咯烷酮。PTHlR和PTH2R =甲状旁腺激素受体1和甲状旁腺激素受体2。RMSD =均方根差。RTK =受体酪氨酸激酶。TNF=肿瘤坏死因子。PBS =磷酸盐缓冲盐水。TBS = tris-缓冲盐水。Tris =三(羟甲基)氨基甲烷。TFA =三氟乙酸。TNBS = 2,4,6-三硝基苯-磺酸。在本描述中，除非另外指出，否则术语例如“本发明的化合物”包括盐形式和游离碱形式的化合物并且还包括在化合物与固相连接时。当存在碱性取代基例如胺取代基时， 盐形式可为酸加成盐，例如二盐酸盐。盐包括但不限于得自无机酸和有机酸的那些，明确地包括氢商化物例如盐酸盐和氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、氨基磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、草酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、亚甲基双_b-羟基萘甲酸盐、龙胆酸盐、羟乙基磺酸盐、二对甲苯酰基酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基磺酸盐、奎尼酸盐等。碱加成盐包括来自碱金属碱或碱土金属碱或常规有机碱的那些，例如三乙胺、吡啶、哌啶、吗啉、N甲基吗啉等。 其它的适合盐参见例如 Handbook of Pharmaceutical Salts，P. H. Mahl 和 C. G. Wermuch 编辑， 2002，Verlag Helvitica Chemica Acta (Zurich, Switzerland)禾口 S. Μ· Berge 等，“Pharmaceutical Salts, “ J. Pharm. Sci.，66 :第 1-19 页(1977 年 1 月)，其两者通过引用结合到本文中。本发明肽的β-氨基酸残基为特征性β-氨基正丙酸衍生物，通常在骨架中2位的碳原子(β2碳)和/或3位的碳原子(β3碳)被进一步取代，并可在例如N端的氨基氮原子进一步被取代。β2、β 3和氨基取代基可包括含1-43个碳原子、任选含有羰基(即-C(O)-)基团和任选进一步被多至6个选自以下的取代基取代的取代基卤素、 NO2、-OH、C1^4 烷基、-SH、-SO3、-NH2、C1^4-酰基、C1^4-酰氧基、C1^4-烷基氨基、C1^4- 二烷基氨
9基、三卤代甲基、-CN、C1^4-烷硫基、CV4-烷基亚硫酰基或CV4-烷基磺酰基；所述1-43个碳原子任选被多至4个杂原子(选自0、N或S)打断。β-氨基酸残基的β2和/或β 3碳原子上的取代基可选自天然α-氨基酸的 α -碳原子上存在的取代基，例如-H、-CH3, -CH (CH3) 2、-CH2-CH (CH3) 2、-CH (CH3) CH2CH3^-CH2-苯基、CH2-pOH-苯基、-CH2-吲哚、-CH2-SH、-CH2-CH2-S-CH3、-CH20H、-CH0H-CH3、 -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-CH2-NH-C (NH) NH2、-CH2-咪唑、-CH-C00H、-CH2_CH2-C00H、-CH 2-C0NH2、-CH2-CH2-CONH2,或与邻接的NH基团一起限定吡咯烷环的取代基，如蛋白质生成的 α -氨基酸脯氨酸中所存在的。本发明中已发现本发明的化合物具有所需性质。例如，具有约7个或更多个残基 (其中三个以上是环状约束的)的本文所述化合物，能够在溶液中形成稳定的螺旋结构。此外本文描述的化合物比其相应的α-肽对肽酶例如胃蛋白酶的作用具有大得多的稳定性。 因此，预期本文所述的化合物表现出比相应的α-肽相对更长的体内半衰期，例如血清半衰期。本发明包括纯异构体形式的本发明化合物(例如由至少90%、优选至少95%的单一异构形式组成)，以及这些形式的混合物。本发明的化合物还可呈单独对映体形式或可呈外消旋体或非对映异构体混合物或可能异构体的任何其它混合物的形式。本发明的化合物可通过本文所述的合成化学方法以及与可用于制备α-氨基酸肽的那些方法相似的其它方法来制备。这样的方法包括液相方法和固相方法两者，例如利用Boc和Fmoc方法学两者的方法。因此本文所述化合物可通过连续的酰胺键形成方法来制备，其中酰胺键在第一 β-氨基酸残基或其前体的β-氨基与第二 β-氨基酸残基或α-氨基酸残基或其前体的α-羧基之间形成。酰胺键形成步骤可反复多次，并用对得到所需α/ β-多肽所需的特定α-氨基酸残基和/或β-氨基酸残基和/或其前体。此外包含两个、 三个或更多个氨基酸残基(α或β)的肽可连接在一起以产生更大的α肽。环状化合物可通过在之前合成的线性多肽的N末端和C末端之间形成肽键来制备。β 3_氨基酸可从相应的α -氨基酸对映选择性地制备；例如，通过N保护的α -氨基酸的Arndt-Eisert同系化。适宜地这样的同系化可后接用β _氨基酸残基对Wolff重排的活性重氮酮中间体的偶联。本文所述方法可用于建立离散化合物的集合或化合物文库，用于针对具有所需活性、特别是表现特定药物用途的生物活性的化合物进行筛选。因此本发明还包括含有多种本文所述化合物的离散化合物集合(典型地包含 2-约1000种化合物)和化合物文库(典型地包含20-100种化合物直至数千种化合物，例如100，000种化合物或更多)。具有所需生物活性的化合物可利用以下所述的合适筛选测定法来鉴定。HIV蛋白gp41是涉及包膜病毒与哺乳动物细胞融合的一类蛋白的典型实例。在病毒-细胞融合期间，gp41的N端插入宿主细胞膜内，并且三聚体蛋白经历了急剧的结构重排，涉及形成由三拷贝的N端七残基重复序列(NHR)结构域和三拷贝的C端七残基重复序列(CHR)结构域组成的六-螺旋束。gp41六-螺旋束的形成是病毒-细胞融合的必需步骤，因而是用合理设计的抗病毒剂靶向中断的具有吸引力的过程。为了证明本发明的效用和功能性，制备了与gp41类似但由α-残基和残基的混合物组成的非天然多肽(α/CN 102245625 A
说明书
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β -肽)，并表明其充当HIV-细胞融合的抑制剂。很多基于gp41 NHR或CHR序列的α -肽，例如化合物1和化合物2 (分别为SEQ. 10.而1和2，参见图1幻已被研究作为融合抑制剂。最突出的实例为36个残基的α-肽药物恩夫韦肽(由Hoffmarm-La Roche, Inc.以注册商标"FUZEON“出售)，其源自CHR结构域。几个小组已试图用短的α-螺旋模拟物抑制gp41六-螺旋束的形成，所述模拟物包括小分子、环状肽、三联苯类和肽，其旨在以α-螺旋样方式展示三个关键的CHR疏水侧链；然而，这些分子在基于细胞的测定中仅表现出适度的抗HIV活性(IC5Q> ΙμΜ对比恩夫韦肽为约InM)。用相对短的α-肽发现相似的结果，该α-肽已针对α-螺旋性通过内部交联化学预处理。本发明人已发现，模拟原型α -肽序列的关键结构性质和功能性质的系统开发的 α/β-肽折叠体(foldamer，产生对蛋白水解降解比类似的α -多肽更稳定的生物活性非天然多肽。在本文被称作“基于序列的设计”的方法一般涉及在整个靶序列中将α-残基用氨基酸残基系统地取代，并优选用载有所置换的α-残基的侧链的β 3_氨基残基取代。参见图1Β。α — β修饰改变了肽骨架化学组成但保留了母体α-肽的侧链序列。基于序列的设计的系统使用得到了以下α/β-肽，其表现出复合体行为例如蛋白样四元组装物(quaternary assembly)的形成和涉及凋亡的蛋白螺旋的模拟。将gp41介导的HIV 细胞融合选作模型系统以证明基于序列的骨架修饰的效用和功能性，因为该靶标具有极大的生物医学重要性。简而言之，使用可重复用于其它治疗上重要靶标的合理且系统的方法设计的、抑制gp41介导的HIV细胞融合的药理活性剂是非常有用的。该方法提供了以合理的直接模式在更短时间内、用更少试验和误差的情况下设计药理活性剂的途径。基于天然gp41的CHR序列的α -肽，例如化合物2已被广泛研究，并且几个小组已公布了通过合理的诱变提高CHR α-肽的结合亲和力和生物稳定性的成果。为了证明本发明的效用和功能性，将近来报导的gp41 CHR类似物α -肽3(SEQ. ID. NO :3，参见图1A)选择作为α — β修饰的起点。α-肽3包含许多预期通过工程改造的螺旋内盐桥和Xxx —Ala 取代来提高螺旋倾向性的侧链突变。在之前的研究中，3显示出相对于基于野生型CHR序列的肽在细胞培养中提高的抗病毒功效和增大的半衰期。尽管3中的突变并不预想改变其与gp41 NHR结构域的结合相互作用的结构性质，但寻找到另外的实验证据六螺旋束结构未改变。α -肽1和α -肽3的共晶体通过悬滴蒸汽扩散得到，将结构解析至2.0 A分辨率 (参见表1和图4Α)。所得六螺旋束与天然NHR+CHR肽复合体形成的基本相同。将图4Α(1+3 共晶体)和图4Β(1+2共晶体)进行比较。表1 晶体数据收集和精修统计*
权利要求
1.一种制备有生物活性的非天然多肽的方法，所述方法包括(a)选择具有含α-氨基酸残基的氨基酸序列的生物活性多肽或其生物活性片段；和(b)制备具有与步骤(a)的生物活性多肽或生物活性片段序列对应的氨基酸序列的合成多肽，其中(i)在所述合成多肽中，步骤(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的约 14%-约50%的α-氨基酸残基被β-氨基酸残基置换；( )在所述合成多肽中，氨基酸残基和α-氨基酸残基以重复模式分布；和 (iii)所述合成多肽具有约10个残基-约100个残基的长度并且包含至少两个β-氨基酸残基。
2.权利要求1的方法，其中步骤(b)(i)包括用至少一个氨基酸残基置换所述 α-氨基酸残基中的至少一个，所述β-氨基酸残基经由包含其β2和β3碳原子的环而环状约束。
3.权利要求1的方法，其中步骤(b)(i)包括将步骤(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的约14%-约50%的α-氨基酸残基用β-氨基酸残基置换，所述β-氨基酸残基经由包含其β2和β 3碳原子的环而环状约束。
4.权利要求1的方法，其中步骤(b)(i)包括用氨基酸残基置换步骤(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的约14%-约50%的α-氨基酸残基，其中所述β-氨基酸残基中的至少一个在其β2和β 3碳原子处不被取代。
5.权利要求1的方法，其中步骤(b)(i)包括将步骤(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的约14%-约50%的α-氨基酸残基用β-氨基酸残基置换，其中所有的所述 β-氨基酸残基在其β 2和β 3碳原子处被取代。
6.权利要求1的方法，其中步骤(b)(i)包括将步骤(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的约14%-约50%的α-氨基酸残基用β-氨基酸残基置换，其中各个β-氨基酸残基具有至少一条与其所置换的α-氨基酸残基相同的侧链。
7.一种制备有生物活性的、抵抗蛋白水解的非天然多肽的方法，所述方法包括(a)选择具有含α-氨基酸残基的氨基酸序列的生物活性多肽或其生物活性片段；和(b)制备具有与步骤(a)的生物活性多肽或生物活性片段的序列对应的氨基酸序列的合成多肽，其中(i)在所述合成多肽中，步骤(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的约 14% -约50%的α -氨基酸残基被相似的β -氨基酸残基置换；( )相似的氨基酸残基各自具有至少一条与其所置换的α-氨基酸残基相同的侧链；(iii)在所述合成多肽中，氨基酸残基和α-氨基酸残基以重复的模式分布；并且(iv)所述合成多肽具有约10个残基-约100个残基的长度并且包含至少两个β-氨基酸残基。
8.权利要求1-7中任一项的制备有生物活性的非天然多肽的方法，其中在所述多肽所采用的折叠结构中，当所述非天然多肽采用螺旋构象时，所述重复模式使氨基酸残基沿着折叠分子结构的一侧排布。
9.权利要求1-7中任一项的制备有生物活性的非天然多肽的方法，其中β-氨基酸残基和α-氨基酸残基的重复模式选自(ααααααβ)、(αααααβ)、(ααααβ)、(αααβ)、(ααβ)、(ααβαααβ)、(ααβαβαβ)禾口(αβ)0
10.权利要求1-7中任一项的制备有生物活性的非天然多肽的方法，其中步骤(b)包括制备具有约20个残基-约50个残基的合成多肽。
11.一种分离的非天然多肽，所述多肽包含SEQ. ID. NO 4-11和25-30中所示的一级氨基酸序列。
12.—种抑制人免疫缺陷病毒与人细胞融合的方法，所述方法包括将人细胞与含SEQ. ID. NO 4-11和25-30中所示的一级氨基酸序列的分离非天然多肽接触。
13.—种抑制人免疫缺陷病毒(HIV)与人细胞融合的方法，所述方法包括(a)选择天然的有生物活性的多肽或其生物活性片段，其具有含α-氨基酸残基并且对HIV体内融合所必需的氨基酸序列；(b)制备具有与步骤(a)的生物活性多肽或生物活性片段的序列对应的氨基酸序列的合成多肽，其中(i)在所述合成多肽中，步骤(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的约 14%-约50%的α-氨基酸残基被β-氨基酸残基置换；( )在所述合成多肽中，氨基酸残基和α-氨基酸残基以重复模式分布；和 (iii)所述合成多肽具有约10个残基-约100个残基的长度，并且包含至少两个β -氨基酸残基；然后(c)将人细胞与步骤(b)的合成多肽接触。
全文摘要
本发明描述了一种制备有生物活性的非天然多肽的方法。所述方法包括以下步骤选择具有包含α-氨基酸残基的氨基酸序列的生物活性多肽或其生物活性片段，和制备具有以下氨基酸序列的合成多肽，所述氨基酸序列与所述生物活性多肽的序列对应，但其中将步骤(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的约14％-约50％的α-氨基酸残基用β-氨基酸残基置换，并且所述α-氨基酸残基以重复模式分布。
文档编号C07K14/00GK102245625SQ200980151598
公开日2011年11月16日 申请日期2009年10月14日 优先权日2008年10月17日
发明者L·M·约翰逊, S·H·格尔曼, W·S·霍恩 申请人:威斯康星旧生研究基金会