专利名称：一种端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于端粒酶活性检测技术领域，涉及一种端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
端粒酶(Telomerase)是一种核蛋白逆转录酶，由RNA模板和蛋白催化亚基组成。通过反转录作用，它可以延伸染色体端粒的3'末端的重复序列(TTAGGG) n，从而实现稳定端粒长度，抑制细胞分裂的作用。在正常人体组织和细胞中，端粒酶的活性被抑制，而在超过85%的已知肿瘤细胞中，端粒酶往往具有较高的活性,被认为与肿瘤细胞的激活,转化增殖等过程密切相关。在临床诊断领域，端粒酶是一种重要的恶性肿瘤标志物。此外，许多癌症治疗方法和药物也以抑制肿瘤细胞中端粒酶活性为目标，因此，建立高灵敏度、选择性强、操作简便的端粒酶活性检测方法，对于癌症的早期诊断及治疗具有十分重要的意义。目前，对于肿瘤细胞中的端粒酶检测主要是通过在kim等建立的端粒酶重复序列扩增法(Telomeric repeat amplification protocol, TRAP)基础上建立起来的一系列改良方法，包括TRAP结合EB染色法，TRAP结合银染色法，实时荧光TRAP法等。该类方法的核心在于利用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增被端粒酶延长的底物(Telomerase Substrate,TS),实现检测信号的放大，通过PCR产物来表征端粒酶的逆转录活性。虽然TRAP类方法具有较高的灵敏度，但操作复杂，反应步骤多，耗时长，需要配备价格昂贵的热循环设备；此外，PCR技术中Taq聚合酶的活性容易受到复杂体系的抑制，产生假阴性结果，而引物二聚体又容易引起假阳性信号，对端粒酶的检测形成严重的干扰。因此TRAP类方法不适用于临床肿瘤细胞端粒酶的实时、快速检测。近年来，为了避免TRAP类方法的缺陷，国内外的研究者们相继建立了许多新型端粒酶检测技术，包括化学发光法，比色法，电化学方法，荧光法等。这些方法虽然更加简便，快速，但却难以获得令人满意的灵敏度与检测范围，同时一些价格按昂贵或不易合成的材料也限制了该类方法在实际中的应用。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，通过基于DNA分子机器的等温级联核酸扩增方法替代传统的基于PCR扩增技术的TRAP法对端粒酶活性进行检测，并结合特殊的DNA结构来抑制非特异性扩增。该方法不仅具有与TRAP法相媲美的灵敏度，同时操作简便，成本较低。本发明是通过以下技术方案来实现一种端粒酶活性检测试剂盒，包括端粒酶底物，与端粒酶结合后，利用端粒酶的逆转录活性延长端粒酶底物；端粒酶逆转录缓冲液，用于延长端粒酶底物的反应；DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；
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触发DNA分子机器工具的探针,包括3WJ模板、3WJ引物、primerl和primer2 ；端粒酶底物3WJ模板3WJ引物的摩尔比为1:0. 5 I. 5:0. 5 I. 5 ;3WJ模板由3'端开始包括三部分第一部分与端粒酶底物的5'端12 16bp的序列相互补，第二部分与3WJ引物3'端5 Sbp的碱基互补，第三部分是用于一级扩增的模板，包含一个核酸切口酶的识别位点；3WJ引物由3'端开始包括三部分，第一部分与3WJ模板的第二部分相互补的序列，第二部分与端粒酶底物3'端2 6bp的序列相互补，第三部分与端粒酶底物的延长部分的序列相互补；端粒酶底物primer I primer 2的摩尔比为I :5 10:5 10 ;primer I包括两部分,3'端第一部分与primer 2的3’端互补,其长度为5 8个bp ;第二部分是与一级扩增产物相互补的序列；primer 2包括两部分,3'端第一部分与primer I的第一部分互补；第二部分是用于二级扩增的模板，其长度为15 21bp ；分子信标探针包括一个茎环结构，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，其环状部分序列与二级扩增产物的序列相互补，分子信标探针的摩尔浓度为primer 2的3 6倍;DNA 分子机器扩增反应缓冲液10mM Tris-HCl, 50mM NaCl，IOmM MgCl2 和 ImMDDT，pH=7. 9。所述所述的DNA分子机器工具由KF聚合酶和Nt. BbVCI核酸切口酶组成，端粒酶底物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；3WJ引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；3WJ模板的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示；primer I的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示；primer 2 核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 5 所不；分子信标探针的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示，其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。所述的3WJ模板的Y端还被磷酸化。一种端粒酶活性检测方法，包括以下步骤I)将待测细胞裂解后离心，分离得到含有端粒酶的上清液；2)将含有端粒酶的上清液与端粒酶底物混合，在端粒酶逆转录缓冲液中利用端粒酶的逆转录活性延长端粒酶底物，生成端粒酶延长产物；3)端粒酶底物延长反应完成后，加入触发DNA分子机器工具的探针、DNA分子机器工具、作为底物的dNTPs，以及信号转化分子，在DNA聚合酶与核酸切口酶所要求的温度下进行扩增反应，最终形成的二级扩增产物与信号转化分子作用产生放大的荧光检测信号；
所述的DNA分子机器工具包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；所述的探针包括3WJ模板、3WJ引物、primerl和primer2 ;所述的信号转化分子为分子信标探针；其中，端粒酶底物3WJ模板3WJ引物的摩尔比为1:0. 5 I. 5:0. 5 I. 5 ;3WJ模板由3'端开始包括三部分第一部分与端粒酶底物的5'端12 16bp的序列相互补，第二部分与3WJ引物3'端5 Sbp的碱基互补，第三部分是用于一级扩增的模板，包含一个核酸切口酶的识别位点；3WJ引物由3'端开始包括三部分，第一部分与3WJ模板的第二部分相互补的序列，第二部分与端粒酶底物3'端2 6bp的序列相互补，第三部分与端粒酶底物的延长部分的序列相互补；端粒酶延长产物、3WJ模板和3WJ引物混合形成便于DNA聚合酶扩增的三元连接结构；三元连接结构在DNA聚合酶、核酸切口酶，dNTPs的存在下启动DNA分子机器扩增反应，产生一级放大产物；primerl和primer2是针对一级放大产物设计的两个探针,端粒酶底物primerl primer2的摩尔比为I :5 10:5 10 ;primerl包括两部分,3'端第一部分与primer2的3’端互补,其长度为5 8个bp ;第二部分是与一级扩增产物相互补的序列；primer2包括两部分,3'端第一部分与primerl的第一部分互补；第二部分是用于二级扩增的模板，其长度为15 21bp ；一级放大产物与primerl和primer2形成碱基堆积结构，在DNA聚合酶、核酸切口酶，dNTPs作用下触发DNA分子机器，产生二级放大产物；分子信标探针包括一个茎环结构，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，其环状部分序列与二级扩增产物的序列相互补，分子信标探针的摩尔浓度为primer2的3 6倍;生成的二级放大产物与分子信标杂交形成双链，破坏其稳定的茎环结构，导致荧光基团与猝灭基团分开，产生荧光信号；4)待反应完成后，利用荧光仪检测荧光信号的强度，根据荧光信号的检测结果与细胞数量来绘制标准曲线，其中，横坐标为细胞数量的对数，纵坐标为相对突光增强倍数(F-F0) AVF为荧光检测强度，Ftl为细胞数量为零时的背景荧光强度，根据标准曲线反映的线性关系来判断待测细胞中端粒酶的活性。所述的标准曲线表示为Y=AlogX+B, Y表示相对突光增强倍数(F-Fci) /Fc^X表示细胞数量，A与B由标准曲线来确定。所述的端粒酶逆转录缓冲液包括20mM Tris-HCUl. 5mM MgCl2、ImMEGTA、63mMKCl、O. 2mM dNTPs 和体积分数为 O. 05% 的 Tween20, ρΗ=7· 9 ；利用端粒酶的逆转录活性延长端粒酶底物时，端粒酶底物浓度为150ηΜ，反应温度为30 °C，反应时间为60min。所述的端粒酶延长产物、3WJ模板和3WJ引物形成的三元连接结构后，首先在DNA聚合酶作用下由3WJ引物的3'端进行扩增，与3WJ模板的第三部分的序列形成含有核酸切口酶识别的双链序列；核酸切口酶识别并切割单链后形成可再次被DNA聚合酶作用的缺口，从而引发扩增-置换-切割循环的DNA分子机器，产生一级放大产物；—级放大产物与primerl和primer2形成的碱基堆积结构,在DNA聚合酶作用下，primerl和primer2的3'端均进行扩增；primerl扩增后与primer2的第二部分形成含有核酸切口酶识别的双链序列；核酸切口酶识别并切割单链后可再次形成被DNA聚合酶作用的缺口，从而引发扩增-置换-切割循环的DNA分子机器，形成二级放大产物；primer2扩增后导致一级放大产物被置换下来,与其他的primerl和primer2形成的新的碱基堆积结构，从而触发多个扩增-切割循环的DNA分子机器，进一步放大检测信号。所述的DNA分子机器为由KF聚合酶和Nt. BbVCI核酸切口酶组成的DNA分子机器，其反应温度为37度，要求的反应体系包括IOmM Tris-HCl, 50mM NaCl, IOmM MgCl2, ImMDDT，10nM3WJ引物，10nM3WJ模板，50nM primerl, 50nM primer2，IOOnM分子信标探针，0. IU/μ L KF 聚合酶，O. 2U/ μ LNt. BbvCI 和 O. 2mM dNTPs, ρΗ=7· 9 ;反应时间为 90 120min。所述的3WJ模板的第二部分的A-T比例大于75%。所述的3WJ模板的Y端还被磷酸化。所述的分子信标探针其5'与3'端分别标记有荧光基团FAM和猝灭基团DABCYL。所述的端粒酶底物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；3WJ引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；3WJ模板的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示；primerl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示；primer2 核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 5 所不；分子信标探针的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果I、本发明提供的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，是一种基于等温核酸扩增技术的端粒酶检测方法，通过等温级联核酸扩增放大端粒酶逆转录产物，然后将其转化为方便检测的荧光信号，从而具有很高的灵敏度与检测范围。2、本发明提供的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，采用的等温核酸扩增放大技术是基于链置换扩增(Strand displacement amplification, SDA)的DNA分子机器(DNA-machine),利用具有链置换活性的DNA聚合酶的延伸反应与核酸切口酶(nickingenzyme)识别并切割特定双链中单链的性质,在等温条件下可以对寡核苷酸单链迅速扩增。该反应其不仅具有较高的扩增效率，同时不需要精确的热循环设备；此外具有链置换活性的DNA聚合酶,如KF聚合酶(Klenow Fragment polymerase)等相对于Taq DNA聚合酶受复杂体系影响较小。3、本发明提供的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，为了克服基于核酸扩增放大信号检测体系中非特异性扩增(Nonspecific amplification)对于目标物检测的干扰，采用了两对探针分别形成三元连接(Three-way junction, 3WJ)结构，以及碱基堆积杂交(Base-stacking hybridization)结构,从而达到抑制非特异性扩增,提高检测灵敏度的目的I) 3WJ探针上5-8个bp的互补区域，3WJ引物与端粒酶底物3’端2_6个bp的互补区域，以及primerl和primer2的3’端5_8个bp的互补区域在DNA分子机器的反应温度下难以形成稳定的杂交结构，确保了它们各自之间不会相互作用产生非特异性扩增；2)当不存在端粒酶时，端粒酶底物与3WJ模板的杂交有效地覆盖了 3WJ模板的大部分上游序列，大大降低了由单碱基引发的非特异性扩增的概率。确保了等温级联核酸扩增检测端粒酶活性的方法具有较低的背景信号。
3)在3WJ模板的3’端修饰磷酸基团抑制3WJ模板自身的非特异性扩增。4、本发明提供的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，将三元连接结构触发的DNA分子机器与碱基堆积杂交触发的DNA分子机器通过一级扩大反应产物进行串联，构建了一种新型的等温级联核酸扩增信号放大系统，具有很高的放大效率。5、本发明提供的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，与基于PCR技术的TRAP类商品化方法操作相比，操作更加简便，步骤少，且不需要昂贵的热循环设备；由于本发明利用的基于DNA分子机器的等温核酸扩增技术不容易受到复杂体系的干扰，减少了 TRAP类商品化方法中经常出现的假阴性信号。6、本发明提供端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，对肿瘤细胞具有较好的选择性，可以显著反应肿瘤细胞与正常体细胞端粒酶的活性的差异；对各种肿瘤细胞中端粒酶活性的检测具有广泛适用性。7、本发明提供端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，不仅可用于肿瘤细胞中端粒酶活性的检测，还可用于检测化学药物对端粒酶活性产生的抑制作用。为癌症临床药物治疗提供了一种监测手段。
图I是本发明的等温级联核酸扩增信号放大过程的示意图；图2-1 2-2是Hela细胞提取物中端粒酶活性的定量检测结果，其中图2_1为不同数量Hela细胞端粒酶提取物对应的荧光发射光谱，图2-2为518nm处荧光增强倍数与Hela细胞数量的关系；图3是不同细胞中端粒酶提取物的检测结果；图4是3’ -叠氮-3’ -脱氧胸苷(AZT)对Hela细胞中端粒酶活性抑制的检测结
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具体实施例方式下面结合具体的附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。参见图1，基于三元连接结构和碱基堆积介导等温级联信号放大检测端粒酶活性的示意图，其中a)为端粒酶延长底物的反应过程，b)和c)为基于DNA分子机器的等温级联信号放大过程。具体使用了 6种寡核苷酸探针，包括端粒酶底物、3WJ模板、3WJ引物、primerl、primer2,以及分子信标探针；分别对其功能陈述如下端粒酶底物，能够被端粒酶识别并进行延长反应；其与端粒酶结合后，利用端粒酶的逆转录活性延长端粒酶底物；端粒酶底物3WJ模板3WJ引物的摩尔比为1:0. 5-1. 5:0. 5-1. 5 ；3WJ模板由3'端开始包括三部分第一部分与端粒酶底物的5'端12 16bp的序列相互补，第二部分与3WJ引物3'端5 Sbp的碱基互补，第三部分是用于一级扩增的模板，包含一个核酸切口酶的识别位点；3WJ引物由3'端开始包括三部分，第一部分与3WJ模板的第二部分相互补的序列，第二部分与端粒酶底物3'端2 6bp的序列相互补，第三部分与端粒酶底物的延长部分的序列相互补；端粒酶底物primerl primer2的摩尔比为I :5 10:5 10 ;primerl包括两部分,3'端第一部分与primer2的3’端互补,其长度为5 8个bp ;第二部分是与一级扩增产物相互补的序列；primer2包括两部分,3'端第一部分与primerl的第一部分互补；第二部分是用于二级扩增的模板，其长度为15 21bp ；分子信标探针包括一个茎环结构，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，其环状部分序列与二级扩增产物的序列相互补，分子信标探针的摩尔浓度为primer2的3 6倍;能够符合上述要求的寡核苷酸探针即可用于等温级联扩增检测端粒酶活性，下面给出一种具体的序列设计(5’-3’)端粒酶底物AATCCGTCGAGCAGAGTT；3WJ 引物TAACCCTAACCCTAACCCTAAAAGAAAAAG ；3WJ 模板GGAAGAGACGAGCGGCTGAGGTTCTTTTTCCTCTGCTCGACGGATT ；primerl:GGAAGAGACGAGCGG CTGAAGCGA ；primer2:AAAGGTGCAGGATGGAGCTGAGGCCCTCGCT ；分子信标FAM-CCTAGCGAAAGGTGCAGGATGGAGCTGAGGCTAGG-DABCYL;参见图1，3WJ模板上的区域I被设计成与端粒酶底物的5’端序列互补(红色部分);3WJ-探针上的区域II (橙色部分)与primerl和primer2上的区域VII (棕色部分)分别只有7个bp与5个bp的互补序列；3WJ引物上区域IV的两个碱基与端粒酶底物3’端的两个碱基互补(黄色部分);3WJ引物的区域V含有3个TCCCAA重复序列，可与端粒酶逆转录合成的，Btt连端粒酶底物3’端的3个AGGGTT序列杂交(绿色部分)；3WJ模板上的区域III(蓝色部分)与引物2上的区域VIII (粉色部分)为DNA分子机器的模板序列，含有Nt. BbvCI识别双列序列中，不被切割的单列序列3’ -GGAGTCG-5’。3WJ引物的3’端修饰磷酸基团。上述方法对Hela细胞中端粒酶活性进行检测，具体操作为I) Hela细胞中端粒酶的提取将含有IX IO6个指数生长阶段的Hela细胞的培养液转移到I. 5mL离心管中，用磷酸缓冲液(pH=7. 4)洗涤两次(4° C，2000rpm，离心lOmin)。细胞沉积物重悬浮于200 μ L预冷的I X CHAPS细胞裂解缓冲液中(含有200U/mL)的RNA酶抑制剂，冰浴30min后于4° C，12000rpm离心20分钟，收集180 μ L的上清液，于-80° C温度下储存。2)端粒酶逆转录延长底物反应利用I X CHAPS细胞裂解缓冲液稀释Hela细胞端粒酶提取物，将2 μ L稀释的Hela细胞端粒酶提取物加入到含有150ηΜ端粒酶底物(端粒酶引物)和O. 2mM dNTPs的10 μ L端粒酶逆转录缓冲液中(20mM Tris-HCl, I. 5mMMgCl2, ImM EGTA, 63mM KCl, 0. 05%Tween20,pH=7. 9)在30度下反应60min。3)等温级联核酸扩增放大荧光检测信号将10 μ L上述反应液转移到含有10nM3WJ引物，10nM3WJ模板，50nMprimerl, 50nMprimer2, IOOnM 分子信标探针，O. IU/ μ L Klenow fragment 聚合酶，0. 2U/ μ L Nt. BbvCI核酸切口酶，以及 O. 2mM dNTPs 的 IXNEB buffer2 (IOmM Tris-HCl, 50mM NaCl, IOmMMgC12, ImM dithiothreitol, pH=7. 9)中，总体积为 100 μ L,于 37 度下反应，IOOmin 后进行
荧光检测。具体检测结果如图2所示,其中图2-1为不同数量Hela细胞端粒酶提取物对应的荧光发射光谱，随着细胞数量的增加，荧光强度也相应的增加；利用荧光仪检测荧光信号的强度，根据荧光信号的检测结果与细胞数量来绘制标准曲线，其中，横坐标为细胞数量的对数，纵坐标为相对荧光增强倍数(F-Ftl)/Ftl, F为荧光检测强度，F0为细胞数量为零时的背景荧光强度；图2-2为518nm处荧光增强倍数与Hela细胞数量的关系及标准曲线；可以看到，518nm处荧光增强倍数随Hela细胞数量增加而增加，利用该方法可以检测3 5000数量范围内的Hela细胞端粒酶活性,其线性范围内的标准曲线为Y=A logX+B,具体为Y=2. 45Χ-1. 52 (Y表示相对荧光增强倍数，X表示细胞数量)。标准曲线中Y表示相对荧光增强倍数，由检测结果而获得，X表示细胞数量在检测前可知，而所生成的Α、B与待测细胞相关；对于同种细胞来说，可以设定肿瘤或非肿瘤的细胞来对照，端粒酶活性高则Y值高，标准曲线斜率较大；也可以采用标准定量方法，比如以Hela细胞作为基准，根据Hela细胞和待测细胞各自的标准曲线，以选定的荧光强度为基准，从而将待测细胞的端粒酶的活性定量为Hela细胞端粒酶的活性的某个系数，从而达到对其进行定量。方法的重复性考证对检测范围内78个和625个Hela细胞端粒酶提取物分别进行三次重复测量，其测量结果的标准偏差分别为4. 76%与3. 15%，说明该方法具有较好的重现性。方法的选择性与普遍适用性利用该方法分别对六种相同细胞个数的不同细胞系(两个体细胞H9C2, 293Α,四个肿瘤细胞Hela，PC3, LINCaP, H印G2)的端粒酶提取物(2500个细胞)进行检测，结果如图3所示，其中纵坐标为检测荧光强度。可以看出，四个肿瘤细胞的端粒酶提取物均引起显著的荧光增强，而两个体细胞的端粒酶提取物仅产生微弱的荧光增强。说明该方法能够选择性地区分肿瘤细胞与体细胞端粒酶的活性，并对各种瘤细胞端粒酶活性的检测具有普遍适用性。基于等温级联核酸扩增放大荧光信号的肿瘤细胞中端粒酶活性检测方法，对AZT抑制Hela细胞端粒酶活性进行检测，具体操作为I) Hela细胞中端粒酶的提取将含有IX IO6个指数生长阶段的Hela细胞的培养液转移到I. 5mL离心管中，用磷酸缓冲液(pH=7. 4)洗涤两次(4° C，2000rpm，离心lOmin)。细胞沉积物重悬浮于200 μ L预冷的I X CHAPS细胞裂解缓冲液中(含有200U/mL的RNA酶抑制剂)，冰浴30min后于4° C，12000rpm离心20分钟，收集180 μ L的上清液，于-80° C温度下储存。2) AZT抑制端粒酶活性利用I XCHAPS细胞裂解缓冲液稀释Hela细胞端粒酶提取物，将2 μ L含有2500个Hela细胞端粒酶提取物加入到含有150ηΜ端粒酶底物和O. 2mM dNTPs的10 μ L端粒酶逆转录缓冲液中(20mM Tris-HCl, I. 5mM MgCl2, ImM EGTA, 63mM KCl, 0. 05%Tween20,pH=7. 9)，在30度下反应120min。同时,在反应的第Omin, 60min,和90min向体系中分别加入2mM, IOmM,以及50mM浓度的AZT (每个时间点对应三个浓度，共9组)，对照组不加AZT。3)等温级联核酸扩增放大荧光检测信号将上述10组反应液分别转移到含有10nM3WJ引物，10nM3WJ模板，50nM弓丨物 1，50nM 引物 2，IOOnM 分子信标探针，O. IU/ μ L Klenow fragment 聚合酶，O. 2U/μ L Nt. BbvCI 核酸切口酶，以及 0.2mM dNTPs 的 IXNEB buffer2 (IOmM Tris-HCl, 50mMNaCl, IOmM MgC12, ImM dithiothreitol, pH=7. 9)中，总体积为 100 μ L,于 37 度下反应，IOOmin后进行突光检测。具体检测结果如图4所示，可以看到，2500个Hela细胞端粒酶提取物诱导产生的荧光信号强度随AZT浓度的上升与作用时间的增加均呈下降趋势，与端粒酶活性的变化相一致，说明了该方法可用于抗肿瘤药物抑制端粒酶活性的检测。
权利要求
1.一种端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括端粒酶底物，能够被端粒酶识别并进行延长反应；端粒酶逆转录缓冲液，用于延长端粒酶底物的反应；DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；触发DNA分子机器工具的探针，包括3WJ模板、3WJ引物、primer I和primer 2 ；端粒酶底物3WJ模板3WJ引物的摩尔比为1:0. 5 I. 5:0. 5 I. 5 ;3WJ模板由3'端开始包括三部分第一部分与端粒酶底物的5'端12 16bp的序列相互补，第二部分与3WJ引物3'端5 Sbp的碱基互补，第三部分是用于一级扩增的模板， 包含一个核酸切口酶的识别位点；3WJ引物由3'端开始包括三部分，第一部分与3WJ模板的第二部分相互补的序列，第二部分与端粒酶底物3'端2 6bp的序列相互补，第三部分与端粒酶底物的延长部分的序列相互补；端粒酶底物primer I primer 2的摩尔比为I :5 10:5 10 ; primer I包括两部分,3'端第一部分与primer 2的3’端互补,其长度为5 8个bp ; 第二部分是与一级扩增产物相互补的序列；primer 2包括两部分,3'端第一部分与primer I的第一部分互补；第二部分是用于二级扩增的模板，其长度为15 21bp ；分子信标探针包括一个茎环结构，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，其环状部分序列与二级扩增产物的序列相互补，分子信标探针的摩尔浓度为primer 2的3 6倍； DNA 分子机器扩增反应缓冲液10mM Tris-HCl, 50mM NaCl，IOmMMgCl2 和 ImM DDT, pH=7. 9。
2.如权利要求I所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述的DNA分子机器工具由KF聚合酶和Nt. BbVCI核酸切口酶组成，端粒酶底物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；3WJ引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；3WJ模板的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示； primer I的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示； primer 2核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示；分子信标探针的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示，其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。
3.如权利要求I所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述的3WJ模板的3'端还被磷酸化。
4.一种端粒酶活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤1)将待测细胞裂解后离心，分离得到含有端粒酶的上清液；2)将含有端粒酶的上清液与端粒酶底物混合，在端粒酶逆转录缓冲液中利用端粒酶的逆转录活性延长端粒酶底物，生成端粒酶延长产物；3)端粒酶底物延长反应完成后，加入触发DNA分子机器工具的探针、DNA分子机器工具、作为底物的dNTPs，以及信号转化分子，在DNA聚合酶与核酸切口酶所要求的温度下进行扩增反应，最终形成的二级扩增产物与信号转化分子作用产生放大的荧光检测信号；所述的DNA分子机器工具包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；所述的探针包括3WJ模板、3WJ引物、primer I和primer 2 ;所述的信号转化分子为分子信标探针；其中，端粒酶底物3WJ模板3WJ引物的摩尔比为1:0. 5 1.5:0. 5 1.5 ;3WJ模板由3'端开始包括三部分第一部分与端粒酶底物的5'端12 16bp的序列相互补，第二部分与3WJ引物3'端5 Sbp的碱基互补，第三部分是用于一级扩增的模板， 包含一个核酸切口酶的识别位点；3WJ引物由3'端开始包括三部分，第一部分与3WJ模板的第二部分相互补的序列，第二部分与端粒酶底物3'端2 6bp的序列相互补，第三部分与端粒酶底物的延长部分的序列相互补；端粒酶延长产物、3WJ模板和3WJ引物混合形成便于DNA聚合酶扩增的三元连接结构； 三元连接结构在DNA聚合酶、核酸切口酶，dNTPs的存在下启动DNA分子机器扩增反应，产生一级放大产物；primerl和primer2是针对一级放大产物设计的两个探针，端粒酶底物primerl primer2的摩尔比为I :5 10:5 10 ;primerl包括两部分,3'端第一部分与primer2的3’端互补,其长度为5 8个bp ; 第二部分是与一级扩增产物相互补的序列；primer2包括两部分,3'端第一部分与primerl的第一部分互补；第二部分是用于二级扩增的模板，其长度为15 21bp ；一级放大产物与primerl和primer2形成碱基堆积结构,在DNA聚合酶、核酸切口酶， dNTPs作用下触发DNA分子机器，产生二级放大产物；分子信标探针包括一个茎环结构，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，其环状部分序列与二级扩增产物的序列相互补，分子信标探针的摩尔浓度为primer2的3 6倍； 生成的二级放大产物与分子信标杂交形成双链，破坏其稳定的茎环结构，导致荧光基团与猝灭基团分开，产生荧光信号；4)待反应完成后，利用荧光仪检测荧光信号的强度，根据荧光信号的检测结果与细胞数量来绘制标准曲线，其中，横坐标为细胞数量的对数，纵坐标为相对突光增强倍数 (F-F0) AVF为荧光检测强度，Ftl为细胞数量为零时的背景荧光强度，根据标准曲线反映的线性关系来判断待测细胞中端粒酶的活性。
5.如权利要求4所述的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述的标准曲线表示为Y=A logX+B, Y表示相对荧光增强倍数(F-Ftl) /F0, X表示细胞数量，A与B由标准曲线来确定。
6.如权利要求4所述的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述的端粒酶逆转录缓冲液包括20mM Tris-HCUl. 5mM MgCl2UmM EGTA、63mMKCl、0. 2mM dNTPs 和体积分数为O.05% 的 Tween20, pH=7. 9 ；利用端粒酶的逆转录活性延长端粒酶底物时，端粒酶底物浓度为150nM，反应温度为 30oC，反应时间为60min。
7.如权利要求4所述的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述的端粒酶延长产物、 3WJ模板和3WJ引物形成的三元连接结构后，首先在DNA聚合酶作用下由3WJ引物的3'端进行扩增，与3WJ模板的第三部分的序列形成含有核酸切口酶识别的双链序列；核酸切口酶识别并切割单链后形成可再次被DNA聚合酶作用的缺口，从而引发扩增_置换_切割循环的DNA分子机器，产生一级放大产物；一级放大产物与primerl和primer2形成的碱基堆积结构，在DNA聚合酶作用下， primerl和primer2的3'端均进行扩增；primerl扩增后与primer2的第二部分形成含有核酸切口酶识别的双链序列；核酸切口酶识别并切割单链后可再次形成被DNA聚合酶作用的缺口，从而引发扩增_置换_切割循环的DNA分子机器，形成二级放大产物；primer2扩增后导致一级放大产物被置换下来,与其他的primerl和primer2形成的新的碱基堆积结构，从而触发多个扩增_切割循环的DNA分子机器，进一步放大检测信号。
8.如权利要求4所述的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述的DNA分子机器为由 KF聚合酶和Nt. BbVCI核酸切口酶组成的DNA分子机器，其反应温度为37度，要求的反应体系包括 IOmM Tris-HCl, 50mM NaCl, IOmMMgCl2, ImM DDT，10nM3WJ 引物，10nM3WJ 模板，50nM primerl, 50nM primer2，IOOnM 分子信标探针，0· I U/μ L KF 聚合酶，O. 2U/μ LNt. BbvCI 和O.2mM dNTPs, pH=7. 9 ;反应时间为 90 120min。
9.如权利要求4所述的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述的3WJ模板的第二部分的A-T比例大于75% ；所述的3WJ模板的3 ^端还被磷酸化；所述的分子信标探针其5'与3'端分别标记有荧光基团FAM和猝灭基团DABCYL。
10.如权利要求4所述的端粒酶活性检测试方法，其特征在于，所述的端粒酶底物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；3WJ引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；3WJ模板的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示； primerl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示； primer2核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示；分子信标探针的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示。
全文摘要
本发明公开了一种端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，通过三元连接结构探针识别端粒酶产物，并结合三元连接结构触发的DNA分子机器与碱基堆积触发的DNA分子机器实现等温级联核酸扩增，将肿瘤细胞提取物中端粒酶的逆转录事件转化为显著放大的荧光检测信号，从而精确测定痕量肿瘤细胞中端粒酶的活性，并实现对化学药物抑制肿瘤细胞端粒酶活性的检测。
文档编号C12Q1/48GK102925546SQ20121024741
公开日2013年2月13日 申请日期2012年7月17日 优先权日2012年7月17日
发明者赵永席, 齐林, 陈锋, 赵越, 张青 申请人:西安交通大学