专利名称：一种检测端粒酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测端粒酶的活性的方法，尤其是通过检测人类端粒酶逆转录酶(简称hTERT，即human Telomerase Reverse Transcriptase)中某段结构域，来确定端粒酶的活性的方法，从而为端粒酶的活性检测提供一个精确、简便的方法，对临床肿瘤诊断和预后评估，以及对细胞系的基础研究，具有重要的意义。
人类端粒酶是一种特殊的逆转录酶，自身带有模板，是一种核酸蛋白复合体，主要由RNA亚单位hTR(human Telomerase，人类端粒酶)和催化亚单位hTERT组成，其作用是hTERT以其自身的hTR为模板，合成端粒的重复序列，通过延长端粒来保持染色体的稳定[The telomerasereverse transcriptasecomponents and regulation GENES &DEVELOPMENT，121073-1085(1998)]。端粒酶活性同细胞的增殖相关，而同细胞的表型(正常或者肿瘤，良性或者恶性)无关，所以目前认为端粒酶活性是增殖细胞的标志物。
除造血干细胞、子宫内膜细胞等外，人的正常体细胞是不具有端粒酶活性的，但85～95％的肿瘤细胞、人类胚胎干细胞和增殖中的成体干细胞具有端粒酶活性[Specific association of human telomerase activity withimmortal cells and cancer，Science 2662011-2015(1994)；Telomerase activityin human germline and embryonic tissues and cells.Dev-Genet.18173-179(1996)；Asurvey oftelomerase activity in human cancer.Eur J Cancer，33787-791(1997)；Telomerase activity，cell proliferation，and cancer Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9590-92(1998)]，因而端粒酶活性已经成为判断增殖细胞存在的一种标志物，例如肿瘤细胞和干细胞。所以端粒酶活性检测在肿瘤的诊断、治疗和预后的评估等方面显示出极大的应用价值。随着干细胞研究的深入，人们越来越希望通过转染得到永生化的干细胞系。无论在建立相应细胞系还是检测干细胞，同端粒酶的联系越来越紧密了。因而如何对端粒酶活性的准确判断也越来越重要了。
只有hTR和hTERT共同存在时，细胞才具有端粒酶的活性。在进一步的研究中，人们发现，hTR并不是端粒酶阳性细胞所特有的，而是广泛存在于各种类型的细胞中，而hTERT只存在于端粒酶阳性的细胞中。研究证明，hTERT是端粒酶活性的限定性部分，即只有hTERT的表达，细胞才能具有端粒酶的活性[Catalytic subunit of telomerase expression isrelated to RNA component expression.FEBS Letters，460285-288(1999)]。所以，近年来的研究主要是集中于对hTERT的研究。
在对hTERT的研究中，确认细胞具有端粒酶的活性是研究的首要工作。因为只有确认有端粒酶的活性，才能确定有hTERT的存在。目前检测端粒酶活性的方法，主要有三种TRF、RT-PCR和TRAP。1、TRF(Terminal restriction fragment length-measurement，即染色体末端内切酶片段长度测量法)[参见Clonal Heterogeneity in Telomerase Activity and TelomereLength in Tumor-Derived Cell Lines，Proceedings of the Society forExperimental Biology and Medicine 223379-388(2000)]原理通过测量端粒重复序列的长度，间接测定端粒酶的活性。
方法1)提取DNA；2)酶切(HinfI等)；3)0.8％琼脂糖电泳；4)TTAGGG探针杂交；5)计算机程序处理。
缺点过程复杂，成本高，不准确，需要连续的观察。不适用于临床检测。目前这种方法仅局限在实验室使用，而且已经很少应用了。2、RT-PCR(逆转录PCR方法)是一种半定量方法。(参见文献同上)方法1)提取总RNA；2)逆转录成cDNA；3)利用特定引物对hTR和hTERT的cDNA进行PCR，并设立内参对照；4)PAGE电泳，EB染色。
缺点PCR尽管比较灵敏，但是反应条件不易控制，重复性差，容易出现假阴性和假阳性结果。并且涉及到要提取RNA，实验条件要求严格。3、TRAP(Telomeric repeat amplification protocol，即端粒重复序列扩增法)，是1994年Kim等基于PCR原理建立的。目前国内外检测端粒酶所采用的主要手段，是对端粒酶活性的直接检测。[参见Kim-NW等，Specific association of human telomerase activitywith immortal cells and cancer，Science，1994 Dec 23；266(5193)2011-5]原理端粒酶在体外可以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用PAGE凝胶电泳可显示6个碱基的差异梯带。
TRAP方法的进展(1)同位素法采用放射性核素(如P)标记的dGTP/dCTP掺入；(Kim)(2)染色法电泳后，用EB染色，在紫外透射仪下观察；(3)荧光法将荧光素标记到引物上，扩增后，PAGE电泳，利用计算机软件进行分析；(4)ELISA法引物TS 5’端标记生物素，PCR后，利用地高辛标记的探针杂交扩增产物，显色后，利用酶标仪进行测定。
TRAP的不足(1)利用细胞提取液，不能进行组织定位，不利于临床病理检测，也不适用于对成体干细胞的研究；(2)由于采用PCR为实验的基础，易出现假阴性和假阳性率；(3)对于大量样品来说，其重复性差，成本高。
原位杂交是经典的实验方法。原来主要是应用于基因的染色体定位，现在越来越多的应用在对细胞内的mRNA表达的检测，从而判断其编码的目的蛋白是否在该细胞或组织中表达。这种方法能更快、更准确的检测出所要研究的目的蛋白的表达情况，而且实验周期短(从发现其mRNA到制作出探针)。但是，这种方法仅限于对mRNA的检测，目前还没有人利用该方法检测hTERT mRNA表达来判断端粒酶活性，同时也未见到有人选择motif-T相对应的cDNA做探针，用其来检测端粒酶活性及其拼接变异的相关报道。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是，从已知具有端粒酶活性的人类细胞中提取总RNA，用反转录酶试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用PCR技术，用合成的特异性PCR引物，特异的扩增含motif-T编码序列的cDNA片段，经纯化后，重组到T-easy质粒中，转化、筛选、酶切鉴定、测序确认为是目的序列后，(测序部分结果见附
图1)，纯化质粒。
用内切酶从质粒上切下片段作为模板，标记序列，合成双链的cDNA探针。鉴定、纯化和测定滴度。
探针与已知的端粒酶阳性和阴性细胞或组织进行原位杂交呈色，在荧光显微镜下观察，检测是否有hTERT mRNA的转录，从而通过确定是否具有端粒酶的活性，来检验该探针的有效性。
在此基础上，使用该探针对其他大量的临床肿瘤样品和实验室的永生化细胞系进行检测，评价其是否存在端粒酶的活性。
由于对motif-T的检测是结构性检测，测量结果的灵敏度和特异性强，从而为细胞的端粒酶的活性检测提供一个精确、简便的方法，因而本发明在肿瘤的诊断、治疗和预后的评估等方面，以及对细胞系的基础研究，都具有十分重要的应用价值。
上述技术方案中，PCR引物的设计是保证探针制备的关键，其PCR产物motif-T片断是探针的主体。也可通过其它分子生物学技术获得。
含motif-T的重组T-easy质粒可通过转化大肠杆菌，经氨卞青霉素筛选、酶切鉴定和测序确认为是目的序列后(测序结果见附图1)，使用试剂盒提取并纯化质粒，成批制备探针。
motif-T探针的标记，可以采用缺口平移、同位素标记、末端标记等分子生物学技术进行。本发明选用缺口平移的方法制备。
本发明中的已知具有端粒酶活性的细胞可以是人类细胞，本发明优选人类胚胎肾细胞293细胞(human embryonic kidney cell line 293，HEK-293)。因为293细胞为端粒酶阳性的细胞系，而且hTERT mRNA的丰度很高(即表达量很高)，并且没有报导在转录水平上有拼接变异的报道(目前认为只有在肿瘤细胞中检测到了拼接变异，文献参考说明书中相应的部分)，因而模板mRNA正常且稳定，可保证扩增出来的片段序列正确。
本发明中可以使用M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒，Moloney murineleukemin virus)反转录酶试剂盒，将总RNA反转录成cDNA。
本发明标记序列时，可以将带有地高辛的核苷酸(DIG-11-dUTP)标记到序列中。并且在检测时，通过标有荧光素的抗地高辛抗体(Anti-Digoxigenin-Fluorescein Fab Fragments，来自于羊)来显色。
本发明的原理在于hTERT是端粒酶活性的限定部分，与酶的活性呈线形相关，[Catalytic subunit of telomerase expression is related to RNAcomponent expression.FEBS Letters，460285-288(1999)]，通过对hTERT基因转录的mRNA的检测，确定细胞或组织是否具有端粒酶的活性。
hTERT是一种逆转录酶，其蛋白一级结构含有8个结构域，即motif-1、2、A、B’、C、D、E和T，其中motif-T为端粒酶所特有的，其他的为逆转录酶所共有的motif数目。motif-A、B’、和C中的一部分组成了端粒酶的活性中心(三联天冬氨酸)，而motif-T的作用是连接RNA亚单位[The telomerase reverse transcriptasecomponents and regulationGENES&DEVELOPMENT，121073-1085(1998)；Telomerases.CurrentOpinion in Structural Biology，956-65(1999)]。
对hTERT转录水平进行研究时发现，在具有端粒酶活性的肿瘤细胞中，其转录子中存在着大量的拼接变异，主分为两类，即插入和缺失，并且主要集中于mRNA的3’端，而5’端，即motif-T及相临区域对应的mRNA稳定。这些变异将导致翻译出来的蛋白无酶活性，是端粒酶活性调节的一个重要方面。但是，这种拼接变异只存在于hTERT表达的肿瘤细胞或者组织中[Isolation of a candidate human telomerase catalyticsubunit gene，which reveals complex splicing pattems in different cell types.Human Molecular Genetics，62011-2019(1997)；Telomerase activity inhuman development is regulated by human telomerase reverse transcriptase(hTERT)transcription and by alternate splicing of hTERT transcripts.CancerRes.，584168-4172(1998)；Genomic organization and promotercharacterization of the gene encoding the human telomerase reversetranscriptase(hTERT)Gene，23297-106(1999)]。
hTERT中motif-T为端粒酶所特有的结构域，是与RNA亚单位相结合的位点，与motif-A、B’、C同样为端粒酶活性表达的重要位点，选择motif-T相对应的cDNA做探针，可以充分反映端粒酶的活性。
采用本发明提供的方法检测端粒酶活性的优点在于1、本发明中所选取的motif-T序列，在研究中没有发现缺失或者插入等变异现象，motif-T相对应的cDNA做成的探针，结构上稳定，所得到的信号会比其他结构域的探针要稳定，而现有实验中经常采用的检测序列，检测结果并不十分稳定，所以本发明在端粒酶活性判断上具有较高的准确性。
2、检测方法操作简便，稳定性好，并且可以对大量样品同时进行可重复性的操作。
3、采用本发明方法测量的结果，灵敏度和特异性强，不易出现假阴性和假阳性结果，克服了现有检测方法的缺点。
4、由于对motif-T的检测是结构性检测，因而可以在样品中进行定位，明确哪些结构和细胞中存在hTERT的转录，即具有端粒酶活性，具有一定的精确性，十分方便于临床检测和干细胞研究。
5、本发明选用荧光素检测，可节约时间，操作简便，便于临床对肿瘤的筛查、治疗效果的检测和基础研究中的应用。
具体实施例方式在本实验中所使用的，取总RNA利用Trizol试剂(Promega公司)，M-MLV逆转录酶试剂盒(GiBco公司)，PCR产物及探针纯化试剂盒ConcertTMRepid PCR Purification System(Bochinger Mannheim公司)，T-easy质粒(Promega公司)，质粒的纯化试剂盒为High Pure PlasmidIsolation Kit For mini preparations(GiBco公司)，所用的内切酶均来自于Promega公司，酶切片段的回收试剂盒(CONCERTTMGel ExtractionSystems)(GiBco公司)，缺口平移标记试剂盒(DIG-Nick TranslationMix)，和标有荧光素的抗地高辛抗体(Anti-Digoxigenin-Fluorescein FabFragments来自于羊)等均为Roch公司产品。实施例1motif-T探针的制备制备过程(1)从人类胚胎肾细胞293细胞(human embryonic kidney cell line 293，HEK-293)中提取总RNA，用M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒，Moloney murine leukemin virus)反转录酶试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用PCR技术，用合成的特异性引物，特异的扩增含motif-T编码序列的151bp的cDNA片段，经纯化后，重组到T-easyvector中，转化JM109大肠杆菌，经氨卞青霉素筛选、酶切鉴定和测序确认为是目的序列后，使用试剂盒提取并纯化质粒。(2)用PvuII内切酶从质粒上切下约600bp的片段作为模板，利用缺口平移方法将带有地高辛的UTP(DIG-11-dUTP)标记到序列中，合成双链的cDNA探针。(3)在进一步的电泳鉴定、探针纯化和滴度测定后，对已知的端粒酶阳性和阴性细胞或者组织进行原位杂交，通过标有荧光素的抗地高辛抗体(Anti-Digoxigenin-Fluorescein Fab Fragments，来自于羊)显色。(4)在荧光显微镜下观察(激发波长为494nm，发射波长为523nm)，细胞核为蓝色，胞浆中含有大量的绿色荧光颗粒，且荧光强度高。
实验结论说明使用已知具有端粒酶活性的HEK293细胞所制备的探针具有端粒酶活性，并且活性较高。可以用来检测其他未知细胞是否具有端粒酶活性。实施例2HEK293细胞的端粒酶活性检测实验细胞HEK293细胞一、细胞准备、固定和通透(注意所有的溶液应该用Rnase抑制因子处理)1、用37℃的PBS细胞，在室温下，固定细胞；其中固定液的组成4％多聚甲醛、5％醋酸、0.9％NaCl2.在室温下用PBS洗细胞30分钟；3.在杂交前按如下的方法处理细胞(1)脱水70％、90％和100％乙醇；(2)脱脂100％二甲苯(3)水化100％、90％、70％(4)用PBS冲洗；4.增加通透性37℃使用通透液，处理增加通透性；其中通透液的组成0.1％胃蛋白酶、0.1NHCl5.后固定(1)用PBS洗涤5分钟；(2)使用1％多聚甲醛后固定10分钟；(3)再用PBS洗涤。二、原位杂交1.在80℃将实施例1中的探针变性，后将探针加入到杂交液中，终浓度为5ng/ul；杂交液组成60％去离子甲酰胺、300mMNaCl、30mM柠檬酸钠、10mMEDTA、25mMNaH2PO4(pH＝7.4)、5％硫酸葡聚糖、250ng/ul鲑鱼精子DNA)2.向固定细胞样品上加10ul带有探针的杂交液，覆盖18*18mm盖玻片。3.37℃在湿盒中进行杂交16小时。三、洗涤1.杂交后，除去盖玻片，在室温下将载玻片放到溶液中摇床上摇；洗涤溶液组成60％甲酰胺、300mM NaCl、30mM柠檬酸钠2.重复步骤1在室温下洗三次；在37℃洗一次。3.最后，PBS洗5分钟。四、免疫荧光显色1.封闭向每一张载玻片上加100ul阻止液，并盖上盖玻片；并放在湿盒中。
封闭液组成100Mm Tris-HCl(pH＝7.5)、150mM NaCl、0.5％(w/v)封闭剂2.去除盖玻片，简单用溶液洗涤；3.加上含有抗体的阻止液，放到湿盒中，45分钟；4.洗涤；溶液组成100Mm Tris-HCl(pH＝7.5)、150mM NaCl、0.05％Tween205.脱水脱水70％、90％和100％乙醇；每个浓度5分钟；6.空气干燥；7.用带有抗褪色剂溶液包埋样片；比例为甘油∶抗褪色剂＝1∶9抗褪色溶液1M Tris-HCl(pH＝7.5)、2％DABCO、DAPI(75ng/ul)8.在荧光显微镜下面观察(激发波长为494nm，发射波长为523nm)，细胞核为蓝色，胞浆中含有大量的绿色荧光颗粒，且荧光强度高。实验结论说明HEK293细胞具有端粒酶活性，并且活性较高。实施例3神经干细胞的端粒酶活性检测实验细胞神经干细胞G3一、细胞准备、固定和通透(注意所有的溶液应该用Rnase抑制因子处理)1.用37℃的PBS细胞，在室温下，固定细胞；固定液的组成4％多聚甲醛、5％醋酸、0.9％NaCl2.在室温下用PBS洗细胞30分钟；3.在杂交前按如下的方法处理细胞1)脱水70％、90％和100％乙醇；2)脱脂100％二甲苯3)水化100％、90％、70％4)用PBS冲洗；4.增加通透性37℃使用通透液，处理增加通透性；通透液的组成0.1％胃蛋白酶、0.1N HCl5.后固定4)用PBS洗涤5分钟；5)使用1％多聚甲醛后固定10分钟；6)再用PBS洗涤。二、原位杂交。1.在80℃将实施例1中的探针变性，后将探针加入到杂交液中，终浓度为5ng/ul；杂交液组成60％去离子甲酰胺、300mM NaCl、30mM柠檬酸钠、10mM EDTA、25mM NaH2PO4(pH＝7.4)、5％硫酸葡聚糖，250ng/ul鲑鱼精子DNA)2.向固定细胞样品上加10ul带有探针的杂交液，覆盖18*18mm盖玻片。3.37℃在湿盒中进行杂交16小时。三、洗涤1.杂交后，除去盖玻片，在室温下将载玻片放到溶液中摇床上摇；2.重复步骤1在室温下洗三次；在37℃洗一次。3.最后，PBS洗5分钟。四、免疫荧光显色1.封闭向每一张载玻片上加100ul阻止液，并盖上盖玻片；并放在湿盒中。
封闭液组成100mM Tris-HCl(pH＝7.5)、150mM NaCl、0.5％(w/v)封闭剂2.去除盖玻片，简单用溶液洗涤；3.加上含有抗体的阻止液，放到湿盒中，45分钟；4.洗涤；5.脱水70％、90％和100％乙醇；每个浓度脱水5分钟；6.空气干燥。7.用带有抗褪色剂溶液包埋样片；比例为甘油∶抗褪色剂＝1∶99.在荧光显微镜下面观察(激发波长为494nm，发射波长为523nm)，细胞核为蓝色，胞浆中含有绿色荧光颗粒，且荧光强度高。结论说明神经干细胞具有端粒酶活性，并且活性较高。实施例4子宫颈癌组织的端粒酶活性检测实验组织子宫颈癌组织(北京大学肿瘤所提供)(方法一)冰冻切片(方法二)石蜡切片杂交过程同上。结果在肿瘤组织部位的细胞中，胞浆中有弥漫的绿色荧光颗粒，荧光强度较高；而周围的癌旁组织中没有绿色荧光。结论子宫颈癌组织细胞具有端粒酶活性，而癌旁的正常组织细胞不具有端粒酶的活性。实施例5阴性对照实验实验细胞人类成纤维细胞实验过程同上。结果细胞中没有检测到绿色荧光。结论该细胞中不具有端粒酶的活性。
权利要求
1.一种检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤(1)从已知具有端粒酶活性的人类细胞中提取总RNA，用反转录酶试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用PCR技术，用合成的特异性PCR引物，特异的扩增含motif-T编码序列的cDNA片段，经纯化后，重组到质粒中，转化、筛选、鉴定、测序，确认为是目的序列后，纯化质粒；然后(2)用内切酶从质粒上切下片段作为模板，标记序列，合成双链的cDNA探针，鉴定、纯化和测定探针滴度；然后(3)探针与已知的端粒酶阳性和阴性细胞或组织进行原位杂交呈色，在荧光显微镜下观察，检测是否有hTERT mRNA的转录，从而通过确定是否具有端粒酶的活性，来检验该探针的有效性；然后(4)使用该探针对其他大量的临床肿瘤样品和实验室的永生化细胞系进行检测，评价其是否存在端粒酶的活性。
2.权利要求1所述的一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于所述的PCR引物所生成的PCR产物motif-T片断是探针的主体，也可通过其它分子生物学技术获得。
3.权利要求1所述的一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于所述的含motif-T的重组质粒可通过转化大肠杆菌，经氨卞青霉素筛选、酶切鉴定和测序确认为是目的序列后，使用试剂盒提取并纯化质粒，成批制备探针。
4.权利要求1所述的一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于所述的标记序列，可以采用缺口平移、同位素标记、末端标记等分子生物学技术进行。
5.权利要求1所述的一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于所述的标记序列，可以将带有地高辛的核苷酸标记到序列中。
6.权利要求1所述的一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于所述的检测是否有hTERT mRNA的转录时，可以通过标有荧光素的抗地高辛抗体显色。
7.权利要求1所述的一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于所述的人类细胞为人类胚胎肾细胞293细胞。
8.权利要求1所述的一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于所述的反转录酶试剂盒为M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)反转录酶试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种检测端粒酶活性的方法，通过提取细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，克隆含有motif－T的cDNA序列的目的片段，合成特异探针，进行原位杂交，然后检测是否有hTERT mRNA的转录，从而确定是否具有端粒酶的活性。由于对motif－T的检测是结构性检测，测量结果的灵敏度和特异性强，从而为端粒酶的活性检测提供一个精确、简便的方法，因而本发明在肿瘤的诊断、治疗和预后的评估等方面，以及对细胞系的基础研究，都具有十分重要的应用价值。
文档编号C12Q1/25GK1450170SQ0211646
公开日2003年10月22日 申请日期2002年4月5日 优先权日2002年4月5日
发明者王亚军, 沈丽 申请人:北京科宇联合干细胞生物技术有限公司