专利名称：发卡形探针基因芯片及其制备方法和检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基因芯片，以及它的制备方法，和利用该基因芯片进行基因检测的方法。
背景技术：
与基因有关的研究是现代生命科学研究中的一个重要领域。人类基因组计划和其他基因测序计划的完成，为与生命、医学相关的研究，如基因工程、疾病的诊断和治疗、新药的开发，奠定了基础。为了这些后续的工作，同时需要发展新的生物技术，基因芯片就是其中的一个例子。
基因芯片的一种类型是将已知序列的寡聚核酸(以下称作探针)固化在表面上，通过杂交实验，检测被测样品中的寡聚核酸(基因片段)的碱基序列(定性分析)或检测某些寡聚核酸碱基序列的含量(定量分析)。
检测的方法包括荧光、电化学、交流阻抗、石英晶体微天平、同位素标记、表面等离子体共振、质谱、酶标法等。其中应用最多的是荧光检测方法。
所有检测方法可以划分为两类一类需要对探针或样品进行标记，如荧光、同位素标记、酶标法，称为有标记法；另一类不需要对探针或样品进行标记，如交流阻抗、石英晶体微天平、表面等离子体共振、质谱法，称为无标记法。有些检测方法可以分别设计成有标记法和无标记法，如电化学方法。
1996年，Tyagi和Kramer[见文献S.Tyagi，and F.R.Kramer，NatureBiotechnology，14303(1996)]提出将具有发卡形结构、同时作了荧光和淬灭基团标记的探针(称为分子信标)作为DNA杂交的检测工具。这一新颖的设计，立即引起世人的注目，在生物技术(如PCR)中得到迅速的推广和应用。
在将分子信标固化到表面以应用于DNA传感器的研究方面，有人进行了有益的尝试[见文献J.Li，et al.，Ana.Sci.171149(2001)；X.J.Liu，and W.H.Tan，Ana.Chem.71.5054(1999)；W.H.Tan，et al.，Chemistry-a European Journal，61107(2000)；X.H.Fang，and W.H.Tan，Ana.Chem.713101(1999)；X.H.Fang，et al.，J.Am.Chem.Soc.1212921(1999)]。但是，分子信标不仅不能克服以前荧光标记方法价格昂贵的缺点，而且使制作成本更为增加。
1995年，Linford和Chidsey等人[见文献M.R.Linford，et al.，J.Am.Chem.Soc.1173145(1995)]发现可以通过加热引发单晶硅表面的Si-H键与有机长链端点的C＝C双键的加成反应，在硅表面形成稳定、致密的有机膜，并且后来发现[见文献P.Wagner，et al.J.Struct.Biol.119189(1997)，T.Strother，et.al.Nuclear AcidsResearch，283535(2000)；T.Strother，et al.，J.Am.Chem.Soc.1221205(2000)]紫外光照同样可以用来制备有机膜，进而可以将寡聚核酸连接到硅表面的有机膜上。此后，有许多关于硅表面有机膜性质的研究，包括本第一发明人参与和从事的一些研究[本第一发明人参与的工作见文献T.Strother，et al.，J.Am.Chem.Soc.1221205(2000)；吴瑞阁等，物理化学学报17931(2001)]。
还有在表面寡聚核酸杂交的无标记法检测技术中的交流阻抗测量方法[见文献E.Souteyrand，et al.，J.Phys.Chem.B 1012980(1997)；H.Bemey，et al.，Sensorsand Actuators B 68100(2000)；C.Berggren，et al.，Electroanalysis 11156(1999)]。这一方法测量的是寡聚核酸杂交前后表面介电性质的改变，测量过程简单、条件温和，测量成本低，不会损伤芯片，而且不需要对寡聚核酸进行任何标记。
虽然目前已经有公司生产商品化的基因芯片，但是这些产品都存在着明显的缺点成本昂贵、重复性差、稳定性差。
特别是，目前所有基因芯片技术的一个共同的根本性的问题在于特异性差如何在检测中将只在一个位点上的碱基有差别的两个寡聚核酸序列(即所谓完全匹配与单点错配的两个寡聚核酸序列)区别开，是一个技术难题。
本发明的目的在于提供一种能够实现寡聚核酸序列中单点突变的识别、成本低、稳定性好、可以重复使用的基因芯片。
本发明的另一目的还在于提供一种制备上述基因芯片的制备方法。
本发明的目的还在于提供一种利用上述基因芯片进行基因检测的方法。
本发明的发卡形探针基因芯片包括芯片基底和固化在其上的寡聚核酸探针，至少有一个寡聚核酸探针包括探测区，存在一段或若干段由被检测样品的基因序列决定的寡聚核酸序列；茎杆区，存在一段或若干段寡聚核酸序列以及与该序列相匹配的寡聚核酸序列，茎杆区中的寡聚核酸序列和与其匹配的寡聚核酸序列形成发卡形双链结构。茎杆区的核酸的匹配方式和碱基数目满足下述条件发卡形寡聚核酸探针的解链温度，即在发卡形寡聚核酸探针不与任何寡聚核酸序列杂交而单独存在的状态的解链温度在发卡形寡聚核酸探针的探测区和单点错配样品所处的杂交状态，即单点错配杂交状态的解链温度-5℃，到发卡形寡聚核酸探针的探测区和完全匹配样品所处杂交状态，即完全匹配杂交状态的解链温度+5℃的范围之间。
本发明的基因芯片的发卡形寡聚核酸探针为无标记探针。芯片基底表面覆盖一到若干分子层的电绝缘和电化学惰性的材料膜。发卡形寡聚核酸探针化学键合于芯片基底表面。
本发明的制备上述发卡形探针基因芯片的方法，其步骤包括1、设计、合成寡聚核酸探针，设计合成后的寡聚核酸探针具有如下结构存在一段或若干段由被检测样品的基因序列决定的寡聚核酸序列，称为探测区；存在一段或若干段寡聚核酸序列以及与该序列相匹配的寡聚核酸序列，称为茎杆区；茎杆区中的寡聚核酸序列和与其匹配的寡聚核酸序列形成发卡形双链结构；根据杂交实验中样品寡聚核酸序列按照下述要求设计发卡形探针的茎杆区的核酸的匹配方式和碱基数目发卡形寡聚核酸探针的解链温度，在单点错配杂交状态的解链温度-5℃到完全匹配杂交状态的解链温度+5℃的范围之间。
2、将至少一个发卡形寡聚核酸探针固化在芯片基底表面上。
所述的寡聚核酸探针为无标记寡聚核酸探针。芯片基底表面覆盖一到若干分子层的电绝缘和电化学惰性的材料膜。本发明将至少一个发卡形寡聚核酸探针化学键合于芯片基底表面上。
本发明的利用上述基因芯片进行基因检测的方法，芯片基底采用导电基底，其步骤包括1、对基底施加电位控制；2、调节基底的表面电位，监测不同电位下的探针与被探测样品的杂交过程；3、根据监测结果确定该基因芯片对该类被探测样品的最佳杂交条件；4、在最佳条件下检测该类被探测样品，实现该基因芯片对该类被探测样品完全匹配与单点错配的寡聚核酸序列的识别。
本发明的优点和积极效果A)利用化学反应将无标记发卡形探针固化到电极，无标记发卡形探针在电极表面上的分布均匀，不同批次制备的芯片重复性能良好，同一芯片可以反复使用。这样可以大大减少平均每一次检测的成本。传统芯片技术中存在的成本昂贵、重复性差、稳定性差的问题得到改善。本发明的无标记发卡形探针和样品都无须进行任何标记，加之芯片可以重复使用的特点，制作和使用成本都会大大降低。
B)利用本发明获得对完全匹配和单点错配的寡聚核酸序列的识别图1分别显示接有无标记发卡形探针的芯片表面与完全匹配的寡聚核酸序列样品杂交(正方形数据点)、接有无标记发卡形探针的芯片表面与单点错配的寡聚核酸序列样品杂交(三角形数据点)、没有键合任何寡聚核酸序列链的电极表面(菱形数据点)、以及键合了无标记发卡形探针的芯片表面但没有进行任何寡聚核酸杂交(圆形数据点)四种情况下的Mott-Schottky测量结果。结果显示，接有无标记发卡形探针的芯片表面与完全匹配的寡聚核酸序列杂交时具有与接有无标记发卡形探针的芯片表面与单点错配的寡聚核酸序列杂交、没有键合任何寡聚核酸序列链的电极表面、键合了无标记发卡形探针但没有进行任何寡聚核酸杂交的另外三种情况表现出完全不同的性质。特别注意，后三种情况的结果完全重合在一起，表明本发明具有识别完全匹配和单点错配的寡聚核酸序列的能力。本发明实现识别的原理在于在满足本发明设计要求的情况下，有关分子的自由能(前述三种解链温度与这些自由能有关)的数值适当，使得探针与完全匹配的寡聚核酸序列的结合状态是稳定的(因此能形成杂交双链)，而与单点错配的寡聚核酸序列的结合状态是不稳定的(因此不能形成杂交双链)。
C)利用本发明，可以在上述B)的基础上，通过表面电位进一步对芯片表面性质进行调节，获得对完全匹配和单点错配的寡聚核酸序列识别的最佳条件。因为当电位施加到电极之后，表面的各种形态的寡聚核酸分子的自由能会随电位的不同而改变，由此造成相应的解链温度的改变。不同形态的寡聚核酸自由能随电位变化的变化率不同，因此解链温度的改变不同。这样经电位控制而调节到发卡形寡聚核酸探针的解链温度，在单点错配杂交状态的解链温度和完全匹配杂交状态的解链温度之间的最佳值，从而获得对完全匹配和单点错配的寡聚核酸序列的最佳识别。
图2显示实时检测杂交过程的结果。结果显示，通过对无标记发卡形探针的设计，再选择适当的表面电位(图中为-0.7V)，就可以达到在相同杂交条件下芯片对寡聚核酸序列的完全匹配和单点错配的杂交过程的识别，即芯片对完全匹配的寡聚核酸序列的样品有响应，而对单点错配的样品没有可观测到的响应。图2同时显示芯片可以重复使用。
图1 不同芯片表面的Mott-Schottky作图的性质对比图菱形数据点来自于在硅基底上接了一层12碳羧酸膜的芯片表面(I)，圆形数据点来自于在上述表面(I)上接了无标记发卡形探针的芯片表面(II)，正方形数据点来自于为上述表面(II)与完全匹配的寡聚核酸序列杂交后的芯片表面(III)，三角形数据点来自于上述表面(II)与单点错配的寡聚核酸序列杂交后的芯片表面(IV)。本图显示完全匹配的芯片表面(III)具有与其它表面[(I)、(II)、(IV)]不同的性质。表面(I)、(II)、(IV)的结果重合，表面(III)的结果与其它表面截然不同。
图2 同一个接有无标记发卡形探针的基因芯片在不同电位下反复进行杂交实验的实时观察示意图在400秒时加入单点错配的寡聚核酸序列样品，在700秒时加入完全匹配的寡聚核酸序列样品。当电位选择适当时，芯片只对加入完全匹配的寡聚核酸序列样品有响应。该图同时显示芯片可以重复使用。
图3 交流阻抗测量池示意图1--工作电极2--金属 3--氮气通道4--芯片5--参比电极6--对电极7--聚四氟乙烯电化学池其中接了无标记发卡形探针的芯片构成工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂做为对电极。
图4发卡形探针基因芯片结构示意图11--导体或半导体基底 12--电绝缘层 13--茎杆区 14--探测区实施例按照现有方法[见物理化学学报17931(2001)“硅表面上构筑具有化学特性的图形的新方法”，吴瑞阁等]制备得到以羧基终止的单层有机膜覆盖的p-硅表面。选择人体癌症抑制基因p53的一段寡聚核酸序列为被测样品。研究表明，在p53中有多个位点都可能因发生单点突变而引发癌症。这里选择的被检测的一段正常基因序列为(用219表示)5′-GGC ATG AAC CGG AGG-3′，单点突变的致癌序列为(用220表示)5′-GGC ATG AAC TGG AGG-3′，其中黑体并斜体有下划线的碱基为发生突变位置的碱基。设计的无标记发卡型探针的碱基序列为5′-GCGAGC CCT CCG GTT CAT GCC GCTCGC-(CH2)6-NH2-3′，其中下划线的碱基为茎杆区，探测区的碱基序列与正常基因序列完全匹配。计算得到的解链温度为Tm(单点错配杂交)＝58℃，Tm(无标记发卡形探针)＝67℃，Tm(完全匹配杂交)＝66℃。利用无标记发卡形探针的-NH2基团与有机膜的羧基之间的缩合反应形成的肽键将无标记发卡形探针固化到硅表面有机膜上[10 mM EDAC/10mM NHS(MES buffer，pH＝6.5)活化，固定反应4℃ 4小时]，制得接有无标记发卡形探针的芯片。可以用两种方式来识别完全匹配和单点错配的基因片段第一种，在不同电极电位下测量Mott-Schottky作图的性质。首先被测样品与芯片杂交[被测样品的20mM Tris-HCl+100mM MgCl2，pH＝8.1缓冲溶液滴加在芯片表面，37℃下反应6小时]。芯片清洗[2×SSPE，37℃，然后超纯水]后，以20mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH＝8.1溶液为支持电解质，利用如图3所示的阻抗检测池，除氧情况下，利用电化学工作站(商品，CHI660A，上海)在15kHz到45kHz之间5mV交流电压下进行不同电极电位(V)下表面电容(Cs)的测量，将(Cs)-2对V作图，得Mott-Schottky图。同时做一芯片液单纯杂交缓冲溶液的对比实验。识别结果如图1所示。完全匹配样品的Mott-Schottky图与对比实验的不同，单点错配样品的Mott-Schottky图与对比实验的重合。
第二种，在某一最佳电极电位下实时观察杂交过程。利用图3所示的阻抗检测池，利用电化学工作站(商品，CHI660A，上海)，除氧情况下，在20mMTris-HCl+100mM MgCl2，pH＝8.1缓冲溶液下滴加被测样品，直接观察杂交过程。为此首先用的已知的完全匹配和单点错配标准溶液的实验找到识别的最佳电极电位。在本实施例中为-0.7V。在25kHz 5mV交流电压和最佳电极电位(-0.7V)下，随着被测样品的加入，检测表面电容(Cs)。当加入单点错配的样品时，电容没有跃变，当加入完全匹配的样品时，电容发生跃变。结果如图2中第一幅图(-0.7V)所示。
权利要求
1.一种发卡形探针基因芯片，包括芯片基底和固化在其上的寡聚核酸探针，至少有一个寡聚核酸探针包括探测区，存在一段或若干段由被检测样品的基因序列决定的寡聚核酸序列，其特征在于该寡聚核酸探针还包括茎杆区，存在一段或若干段寡聚核酸序列以及与该序列相匹配的寡聚核酸序列，茎杆区中的寡聚核酸序列和与其匹配的寡聚核酸序列具有发卡形双链结构；茎杆区的核酸的匹配方式和碱基数目满足下述条件发卡形寡聚核酸探针的解链温度，在单点错配杂交状态的解链温度-5℃，到完全匹配杂交状态的解链温度+5℃的范围之间。
2.如权利要求1所述的发卡形探针基因芯片，其特征在于所述发卡形寡聚核酸探针为无标记探针。
3.如权利要求1所述的发卡形探针基因芯片，其特征在于芯片基底表面覆盖一到若干分子层的电绝缘和电化学惰性的材料膜。
4.如权利要求1所述的发卡形探针基因芯片，其特征在于发卡形寡聚核酸探针化学键合于芯片基底表面。
5.一种制备如权利要求1所述的发卡形探针基因芯片的方法，其步骤包括1)设计、合成寡聚核酸探针，设计合成后的寡聚核酸探针至少有一个具有如下结构存在一段或若干段由被检测样品的基因序列决定的寡聚核酸序列，称为探测区；存在一段或若干段寡聚核酸序列以及与该序列相匹配的寡聚核酸序列，称为茎杆区；茎杆区中的寡聚核酸序列和与其匹配的寡聚核酸序列形成发卡形双链结构；根据被检测样品寡聚核酸序列，按照下述要求设计发卡形探针的茎杆区的核酸的匹配方式和碱基数目发卡形寡聚核酸探针的解链温度，在单点错配杂交状态的解链温度-5℃到完全匹配杂交状态的解链温度+5℃的范围之间；2)将至少一个发卡形寡聚核酸探针固化在芯片基底表面上。
6.如权利要求5所述的制备发卡形探针基因芯片的方法，其特征在于所述的寡聚核酸探针为无标记寡聚核酸探针。
7.如权利要求5所述的制备发卡形探针基因芯片的方法，其特征在于在芯片基底表面覆盖一到若干分子层的电绝缘和电化学惰性的材料膜。
8.如权利要求5所述的制备发卡形探针基因芯片的方法，其特征在于将至少一个发卡形寡聚核酸探针化学键合于芯片基底表面上。
9.一种利用权利要求1所述发卡形探针基因芯片进行基因检测的方法，芯片基底采用导电基底，其步骤包括1)对芯片基底施加电位控制；2)调节芯片基底的表面电位，监测不同电位下的寡聚核酸探针与被探测样品的杂交过程；3)根据监测结果确定该基因芯片对该类被探测样品的最佳杂交条件；4)在最佳条件下检测该类被探测样品，实现该基因芯片对该类被探测样品完全匹配与单点错配的寡聚核酸序列的识别。
全文摘要
本发明涉及一种基因芯片,包括芯片基底和固化在其上的寡聚核酸探针,探针包括探测区和茎杆区;茎杆区中的寡聚核酸序列和与其匹配的寡聚核酸序列形成发卡形双链结构,其核酸的匹配方式和碱基数目满足下列条件:发卡形寡聚核酸探针的解链温度,在单点错配杂交状态的解链温度－5℃到完全匹配杂交状态的解链温度+5℃的范围之间。本发明可通过对该基因芯片进行电位控制进一步优化杂交条件。本发明基因芯片和样品都无须作任何标记,芯片可以重复使用,制作和使用成本大大降低,且具有识别完全匹配和单点错配的寡聚核酸序列的能力。可广泛应用于生物技术领域。
文档编号C12Q1/68GK1373228SQ0211630
公开日2002年10月9日 申请日期2002年3月22日 优先权日2002年3月22日
发明者赵新生, 魏芳, 孙豳 申请人:北京大学