专利名称：抗肿瘤抗生素力达霉素高产菌株c－1027－20的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤抗生素的产生菌，特别是涉及一种经选育培养、发酵可得到高单位的菌株。
本发明的目的在于通过菌种选育、发酵条件的研究等手段，找到优于现有技术的高产菌株，以期产生高单位的目的产物力达霉素，为临床前研究和临床治疗提供可靠的保证。发明要点1、 本发明涉及抗肿瘤抗生素力达霉素高产菌株一球孢链霉菌C-1027-20(Streptomyces globisporus C-1027-20)。所用的出发菌株球孢链霉菌C-1027能产生具有抗肿瘤活性的新化合物力达霉素，发酵液对八叠球菌抑菌圈仅为19mm，提取得到精品极少。通过菌种选育包括自然选育，化学，物理诱变，原生质体形成，原生质体融合，菌落抗生素活性检测等手段，可以提高菌种的单位.C-1027菌株经原生质体融合结合紫外光照射处理，获得4株比原株效价高的变株No11，13，19，20。其中C-1027-20菌株对八叠球菌的抑菌圈为28mm。该菌株于2002年1月30日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CGMCCNO.0704。2、 发酵研究将平皿上生长出单菌落挑在含有琼脂的发酵培养基小钢管表面.28℃培养7天，3℃过夜，次日将此对照效价高及无活性之菌株传到Gauze斜面上，28℃培养10天后进行发酵，培养基经多次试验，确定以下配方为种子及发酵培养基(g％)玉米粉1.5，淀粉1.0，葡萄糖0.5，蛋胨0.5，玉米浆0.5，MgSO40.02，KI 0.06，CaCO30.4自来水配制，其中血胨，玉米浆及葡萄糖对维持高效价较重要。此配方不仅在摇瓶而且40L罐发酵也得到满意结果.经过摇瓶发酵、立瓶发酵、发酵罐发酵的研究，对装量、接种量、空气流量、培养温度、培养时间、罐压、搅拌等等都进行了研究。从2000年1月3日至2000年3月27日，用经过选育的菌株进行200立升发酵罐装量100立升发酵液进行发酵，结果如下
以上结果表明，经过选育后发酵获得的力达霉素的精品接近20克。3、链霉菌菌学考察形态特征C-1027-20菌株的孢子丝直或波曲，孢子呈柱形，表面光滑(
图1)。培养特征C-1027-20菌株在各种合成的或有机的培养基上形成浅灰白，奶油白色气生菌丝。基内菌丝一般为浅黄，浅黄褐，微黄。在所有的实验培养基上不产生可溶性色素。C-1027-20培养特性见表1；C-1027-20的生理生化反应见表2；C-1027-20的碳源利用谱见表3。
培养特征、生理生化反应及碳源利用的实验结果表明，经过选育后的C-1027-20与原株C-1027比较有以下不同点如C-1027-20在含有蛋白等有机氮的培养基中，生长不好，而在含有淀粉的合成培养斜面上生长良好；又如黑色素，硫化氢，明胶等生化反应也有差异；碳源利用如半乳糖，甘露醇也有不尽一致。C-1027-20产生菌所使用的培养基，以含有该菌可利用的营养物的培养基为好。培养基组成的碳源有葡萄糖、果糖、甘油、糊精淀粉、玉米浆、玉米粉；氮源有蛋白胨、酵母膏、鱼粉、豆粉、硫酸铵。它们可以单独或组合使用，还可加适当的镁盐、钠盐、磷酸盐(葡萄糖，玉米浆，血胨对产生力达霉素影响大)。培养过程中产生泡沫。只加泡敌不能止住泡沫，而只加豆油则能止住泡沫。但是不能同时加入泡敌和豆油，否则发酵液会出现混浊。
表1培养特征28℃二周
表2生理生化反应
表3碳源利用含糖1g/100ml 28℃2周培养
发明的积极效果所说的高产菌C-1027-20经培养发酵，制备了足够量的力达霉素，完成了新药临床前研究，包括制备工艺，理化性质，纯度，检验方法，剂型，稳定性等质量标准，药学，药效，药理，毒理，药代及分子机制等研究，现正进入申报临床阶段。
(2)细菌检测Sarcinalutea及Bacillus subtilis ATCC6633作为检定菌，试验了不同培养基，pH及水源对抑菌圈边缘清晰度的影响。由于C-1027-20菌种发酵液对细菌的作用较弱，菌浓度也较低，故平皿仅用10ml培养基单层检测。实验结果，酵母膏，pH8.0是抑菌圈边缘清晰的主导因素，确定八叠球菌检定培养基为(％)蛋白胨0.5，酵母膏0.5，牛肉膏0.5，葡萄糖0.2，琼脂1.6，pH8，蒸馏水配制。
(3)发酵条件观察了一级二级发酵的不同时间，通气量，pH值，培养基对效价的作用，并用40L罐发酵，27-28℃，气流0-24hrs 1∶0.5，24-48hrs 1∶0.8，pH7.0.自来水250rpm转速。
(4)菌种选育所用诱变剂NTG(亚硝基胍)，用0.05mol/l磷酸钾缓冲溶液配成2.5mg/ml，5.0mg/ml，10.0mg/ml，处理孢子条件为水浴32-35℃，1h；EMS(甲基磺酸乙酯(乙基磺酸甲烷)用水配成6.0，10.0，20.0ul/ml，室温下浸泡孢子1.5h；紫外光照射条件是用30w灯管，灯距23cm，将内有10ml孢子悬液的平皿分别照射10，20，及30min。将上述三种处理过的孢子悬液稀释成不同浓度后涂在Gauze平板上，28℃培养10天。将生长好的单菌落挑选转种在内有固体培养基的小钢管上部，内有小钢管的平皿放入干燥器中，再放入一小瓶水以保湿，整个容器盖严后置28℃培养一周，放钢管至八叠球菌平板上，37℃培养过夜，挑出高活性及无活性变株。
(5)菌培养将上述平皿上生长出的单菌落挑在含有琼脂的发酵培养基的钢管表面，28℃培养7天，移钢管至八叠球菌平板上，37℃过夜。次日将此对照效价高及无活性的菌株传至Gauze斜面上，28℃培养10天后进行发酵。培养基经多次试验确定以下配方为种子及发酵培养基(g/％)玉米粉1.5，淀粉1.0，葡萄糖0.5，血胨0.5，玉米浆0.5，MgSO40.02，KI 0.06，CaCO30.4，PH7.0自来水配制，其中血胨、玉米浆及葡萄糖对维持高效价较重要。
(6)原生质体形成将无活性变株斜面接种到种子瓶中，培养48h后取10％转种于含0.5％甘氨酸的发酵培养基中，培养18h取出离心收集菌丝并用水洗，菌丝悬液含2mg/ml溶菌酶及0.05M EDTA的高渗缓冲液，35℃水浴保温30-60min，用显微镜40倍物镜进行原生质体观察，悬液通过脱脂棉层过滤，2500rpm离心10min收集原生质体，经高渗液洗一次，离心后再混悬于少量高渗液中。
(7)原生质体融合将等体积107/ml两种菌株的原生质体混合，加入等体积PEG(1/21000+1/2 6000)，32℃水浴15min，用高渗液稀释后离心并再洗一次，沉淀稀释不同浓度，涂布于RMYE再生培养基平皿上，28℃培养5-7天。
(8)菌落抗生素活性检测原生质体再生后，挑选接种于有培养基的钢管上，培养后移到八叠球菌平板上检测。
(9)突变菌株的复试从有抑菌圈的菌株转种在斜面培养基中，10天后二级发酵，测48，72及96h发酵液的抗八叠球菌活性及抗精原细胞活性。斜面再经两次传化，每次均经二级发酵和检测。
CaCO30.2水50ml迹量盐溶液 0.1ml合并I和II，调pH7.0-7.4 琼脂2 15磅消毒ISP-5 L-天门冬素 0.1 K2HPO4(无水) 0.1 甘油 1 迹量盐溶液 1ml pH7.2琼脂2 15磅消毒ISP-7 甘油1.5 L-天门冬素0.1 MgSO4·7H2O 0.05 迹量盐溶液1mlpH 7.2 琼脂2 15磅消毒 (FeSO47H2O 0.001 L-酪氨酸 0.05K2HPO40.05 (无水)NaCl 0.05)培养特征在恒温室28℃培养2周。2.生理生化反应所用培养基(g％)(1)明胶蛋白胨0.1 明胶4 葡萄糖0.4(先将水煮沸慢慢投入明胶，不断摇至全部溶化，然后调pH，分装小管 15磅消毒)(2)牛奶脱脂牛奶 分装小管 巴氏消毒(3)淀粉水解可溶性淀粉1 MgCO30.1 KNO30.1 K2HPO40.03 NaCl0.05 琼脂2 pH7.2 15磅消毒(4)黑色素反应胰酶解胨0.5 酵母膏0.3 琼脂2 pH 7.2 15磅消毒(5)H2SL-酪氨酸 0.1 NaCl 0.85 酵母膏 0.5 琼脂 2 pH 7.0 15磅消毒(6)硝酸盐还原MgSO40.05 K2HPO40.05 蔗糖 2 KNO30.1 NaCl 0.0515磅消毒溶液I 氨基苯磺酸0.5(醋酸80％+2倍水)150ml溶液II 苯胺0.1ml(α-萘胺)水20ml(7)纤维素分解MgSO40.05 K2HPO40.05 NaCl 0.05 KNO30.1 pH7.0(纸条0.8×5cm) 15磅消毒28℃恒温培养，不同时间观察。3.碳源利用培养基(g％)1)基础培养基(NH4)2SO42.64，K2HPO45.65，CuSO4.5H2O 0.0064，MnSO4.7H2O0.0079，KH2PO42.38，MgSO4.7H2O 1，FeSO4.7H2O 0.001％，1000ml蒸馏水，琼脂2，pH7，15磅消毒以上基础液分装中管每管5ml，分别加入1的糖(阿拉伯糖，木糖，葡萄糖，果糖，蔗糖，肌醇，鼠李糖，棉籽糖，甘露醇，半乳糖，水杨苷，可溶性淀粉，糊精，甘油，对照)，28℃恒温培养1-2周观察。
权利要求
1.一种抗肿瘤抗生素力达霉素的高产菌株球孢链霉菌C-1027-20(streptomyces globisporus C-1027-20)CGMCC No.0704.
2.球孢链霉菌C-1027-20在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种抗肿瘤抗生素力达霉素高产菌株球孢链霉菌C－1027－20(streptomyces globisporus C－1027－20),它是通过对出发菌株C－1027进行自然选育,化学物理诱变,原生质体形成,原生质体融合等手段,并从原生质体融合结合紫外光照射处理后的菌株中筛选出一株高效价的菌株,经长期培养观察测试,其性能稳定,且发酵,提取产物明显高于出发菌株,为进一步临床前研究和今后的临床治疗提供了可靠保证。
文档编号C12P21/02GK1373209SQ0211620
公开日2002年10月9日 申请日期2002年3月19日 优先权日2002年3月19日
发明者李电东, 甄永苏, 胡继兰, 姚恩泰 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所, 深圳市盛康达生物技术有限公司