专利名称：表达人类血管紧张素ii受体i反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物材料领域。具体地说是一种将人类血管紧张素II受体I反义基因(AT1-AS)与重组腺相关病毒载体重组构建，并获得可以满足治疗要求的滴度。
背景技术：
高血压是一种多因素影响，多基因起源的慢性疾病。应用传统药物能够有效控制，但也存在一些缺点。首先，高血压病人在就诊时许多已有靶器官损害，临床上所用的有些药物不能逆转高血压的合并症。其次，由于药物的副作用，病人长期服药的依从性受到很大的影响，而且轻至中度的高血压病人多无症状，病人往往认为服药是非必须的，很不方便，影响疾病的治疗。由于该病是病人每天需用药1-3次，而且可能是联合使用多种药物，并且终身服用才能达到效果，更影响病人依从性，而且药物价格昂贵使许多病人难以坚持治疗。而从基因水平上对高血压的致病基因进行校正，将为最终治愈高血压带来希望。由于人类RAS在高血压发病中的作用比较明确，在人体中分布广泛，而且临床上作用于RAS的药物能从多种水平发挥抗高血压的作用，因此反义抑制RAS能产生降血压的效应，这已在动物实验中得到证实。以病毒为载体介导的血管紧张素II受体I反义基因注入自发性高血压大鼠体内，能够长期使血压下降，同时能够逆转高血压引起的病理生理改变。在幼年自发性高血压大鼠应用血管紧张素II受体I反义基因后，还能阻止高血压的进展。应用于其它动物模型，也充分证明血管紧张素II受体I反义基因治疗的可靠性，有效性。同时基因治疗也具有药物所不具备的优越性。但以往的病毒载体，由于存在免疫源性，与基因组的非特异性整合，转基因范围窄等原因，限制了基因治疗的应用。
发明内容
本发明所使用的重组腺相关病毒载体它可以携带基因转染分裂期和非分裂期细胞(即具有广泛的转基因范围)、无副作用(无免疫源性)、感染效率高、能驱动基因在体内长期表达，而且成功地解决了无腺病毒污染的体外大量复制问题。为了能使高血压的基因治疗真正实现，发明人将人类血管紧张素II受体I反义基因(AT1-AS)与重组腺相关病毒载体重组构建，利用有效的包装系统进行包装成为含AT1-AS基因的重组腺相关病毒，并获得可以满足治疗要求的滴度，以满足临床治疗的需要。
实现本发明的具体技术方法是该表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒(rAAV)，其该载体系统该载体系统包括包装质粒pXX2，辅助质粒pXX6，真核表达载体pXXUF1，并在真核表达载体pXXUF1内插入了人类血管紧张素II受体I反义基因编码序列。该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成。其中pXX2为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列，并在上游和下游各插入一个p5启动子。pXX6为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因，它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激rAAV基因的转录和翻译。pXXUF1真核表达载体，所用的是CMV启动子，其含有一多克隆位点(pXXUF1为NotI位点)，可以连接不同的目的基因。该重组腺相关病毒是表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒rAAV-AT1-AS。发明人提出的人类血管紧张素II受体I反义基因由PCR法从人体白细胞基因组中克隆而得。它包括有效量的表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒和药学上所接受的载体或赋形剂。再则，该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒和腺病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成。该重组腺相关病毒是表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒rAAV-AT1-AS。制备表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒(a)、提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列——pXX2质粒，和刺激腺相关病毒复制和转录所必需的腺病毒E1A、E2A和VAIRNA基因——pXX6质粒。(b)、提供含腺相关病毒基因组的真核表达载体pXXUF1，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并插入人类血管紧张素II受体I反义基因，形成重组质粒pXXUF1-AT1-AS。(c)、将步骤α中的pXX2、pXX6和pXXUF1-AT1步骤(b)共转染293细胞，适时回收，并纯化、检测其病毒滴度。将步骤(c)中回收纯化的病毒经尾静脉注射入自发性高血压大鼠体内，检测其生物学活性。在步骤(c)共转染的方法是钙磷DNA共沉淀转染法。真核载体pXXUF1所含启动子为CMV启动子。纯化是用SSCP法，而检测滴度是用斑点杂交法。在步骤4中预计检测的结果将说明该种表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒(rAAV-AT1-AS)在生物体内可长期高效表达，发挥其降低血压、改善肾脏功能、防止心脏及血管重构等生理和病理生理作用，以期用于临床，从而实现高血压、心力衰竭，冠心病，脑血管疾病，肾脏疾病及其他相关疾病的基因治疗。
图1 本发明腺相关病毒的序列及具体分区图2 本发明腺相关病毒的基因级构造3 ITR的序列及二级结构4 腺相关病毒的转录和翻译中有增殖性和潜优性的两种表达方式图5 在AAV的增殖性表达中可转录生成6种mRNA的表达方式图6 PXXZZ、PXX6质粒构成图7 PXXUF1质粒构成图8 人类血管紧张素II受体I基因片段的序列图9 PXXUF1-AT1-AS的质粒构成下面进一步描述本发明重组腺相关病毒的各部组成特点及其制备方法一、天然腺相关病毒(AAV)及重组腺相关病毒(rAAV)载体的特征腺相关病毒是一种动物单链DNA病毒，它属于细小病毒科，细小病毒亚科，依赖病毒属，自然缺陷、无包被和无致病原性。
1、AAV基因组是一个线性、单链(ssDNA)分子，含4680个核苷酸(序列如图1)，其特征在于1)其基因组由4个开放阅读宽读框(ORF)组成，分称rep区、lip区、inf区和cap区(见图1、图2)。位于基因组DNA左端的一个大ORF由于移码突变或缺失会阻止DNA复制，因而被称为rep区。右端的一个大ORF(cap)编码合成3种外壳蛋白。另有两个小ORF位于基因组DNA的中央区，即inf区和lip区。
2)在分子单链每个末端含有一个145个碱基末端重复序列(ITR)(见图1)。ITR序列折叠成发卡结构作为DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的唯一已知顺式作用元件(见图3)。 3)腺相关病毒的复制和转录调节相当复杂，按有无辅助病毒的共转染分，有增殖性和潜伏性两种表达方式(如图4)。
在AAV的增殖性表达中，可转录生成6种mRNA，分别由启动子P5、P19、P40启动合成(如图5)。在腺病毒(Ad)的共转染的情况下，Ad的E1A基因负责AAV基因表达的反式激活；Ad E2A基因编码单链DNA结合蛋白，可刺激AAV启动子所启动的转录，还可促进AAV转录本从胞核向胞质转运；另外Ad VA1 RNA可能也有利于AAV蛋白合成的起始。而AAV也能够正调节和负调节自身基因和辅助病毒基因表达。AAV的rep基因能够正调节和负调节P5、P19、P40启动子所启动的转录，在有Ad的情况下，rep基因产物行使正调节功能，这是AAV基因大量合成所必须的；而在无辅助病毒共转染的情况下，rep基因产物则起负调节作用。
在无辅助病毒或者的情况下，AAV DNA以双链形式整合到宿主细胞基因组中，在那里以潜伏状态持续存在，形成AAV的潜伏感染。AAV整合的特异位点是在人染色体的19q13.3-19q ter上。Rep基因产物除了负调节作用外，还可识别和结合特异的整合位点，即GGTC序列，并介导了ITR与整合位点的重组。而腺病毒的感染可使其进入增殖感染状态。
2、AAV作为基因克隆的载体。
AAV是目前已知的唯一能够在宿主基因组特异染色体位点整合的真核细胞病毒。这个发现产生了基因治疗的新希望，AAV基因治疗载体不仅仅能够和非整合载体(如腺病毒为基础的载体)相比更持续稳定地表达转基因，而且能够减少理论上的由于转基因的随机整合导致的插入突变几率。我们使用的这一套载体系统是将天然腺相关病毒和腺病毒用分子生物学方法经一系列剪切和修饰而成，它们保留了腺相关病毒复制和转录所必需的部分，也保留了腺病毒的晚期基因辅助成份，其他多余的部分均已删除，既能实现病毒长期稳定的潜伏感染，又能避免腺病毒的致病危险，而且腺病毒晚期基因的表达可以保证被克隆基因的表达效率。这一载体系统的构成如下pXX2(如图6)保留了AAV的cap基因和rep基因(此时得到pACG-2)，并在下游区域又插入了一个p5启动子(在原来区域用XbaI和PstI切下，再连接到pACG-2的适当位置)。另外我们对照组所使用的报告基因(lacZ)也连在pXX2的下游。方法是先在pXX2下游造一个ClaI的切口，再在其切口上加一个Sse8387I的接头(5’-CGCCTGCAGG-3’)，把两端为Pst I切口的lacZ片段连接于其上。
PXX6(如图6)在腺病毒改造质粒pBH10(已切掉了E1、E3基因和包装信号)上用PmeI和SgfI切下一个8kb的片段(得到pXX5)，而pXX6则是由pXX5上用ClaI和SalI切下一段克隆入pBS中得到的，仅仅留下E2A、E4和VA编码区。
pXXUF1(如图7)rAAV包装所用的质粒pXXUF1含有CMV启动子(箭头)所驱动的人gfp基因，它是将腺相关病毒的编码基因全部删除后再由Not I位点导入的。为了便于基因克隆和表达，又将其加工成环状。
二、人类血管紧张素II受体I基因(human angiotension II type Ireceptor gene，AT1)的基本特点及其与rAAV的重组构建。
1、人类血管紧张素II受体I(AT1受体)及其基因的基本特点1)人类血管紧张素II受体I(AT1受体)属于G蛋白偶联受体，与血管紧张素II结合后，使细胞发生一系列变化，主要是细胞内的若干因子如磷脂酶C，磷脂酶D，磷脂酶A2，腺苷酸环化酶，酪氨酸激酶等的转录后修饰，以及引起细胞内第二信使和一些离子的累积，另外促进与基因转录调控相关的早期基因，生长因子以及其他激素的表达。在生理状态下主要发挥调节血压，血容量的作用。在病理状态下，参与高血压，充血性心力衰竭，动脉粥样硬化，心血管重构等病理过程。AT1基因为单一基因，位于3号染色体q22，长约60Kb，有个4外显子，全部编码区位于外显子4上，长约1Kb，编码359个氨基酸。其3′-非编码区5′端的A1166C具有多态性，与高血压相关联。反义AT1受体基因片段是指与真核表达载体反向连接的AT1受体基因片段，能够与AT1受体的mRNA互补结合，激活RNA酶H，使AT1受体的mRNA水解，拷贝数降低，而反义AT1受体基因片段释出后，仍能继续结合mRNA，使mRNA进一步减少。因此，在病理状态下，反义AT1受体基因片段从基因水平阻断AT1受体基因的表达，从而封闭AT1受体，达到治疗疾病的目的。
2)人类血管紧张素II受体I基因cDNA片段的序列(图8)AT1-cDNA 5’CACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCAAAATGATTCTCAACTCTTCTACTGAAGATGGTATTAAAAGAATCCAAGATGATTGTCCCAAAGCTGGAAGGCATAATTACATATTTGTCATGATTCCTACTTTATACAGTATCATCTTTGTGGTGGGAATATTTGGAAACAGCTTGGTGGTGATAGTCATTTACTTTTATATGAAGCTGAAGACTGTGGCCAGTGTTTTTCTTTTGAATTTAGCACTGGCTGACTTATGCTTTTTACTGACTTTGCCACTATGGGCTGTCTACACAGCTATGGAATACCGCTGGCCCTTTGGCAATTACCTATGTAAGATTGCTTCAGCCAGCGTCAGTTTCAACCTGTACGCTAGTGTGTTTCTACTCACGTGTCTCAGCATTGATCGATACCTGGCTATTGTTCACCCAATGAAGTCCCGCCTTCGACGCACAATGCTTGTAGCCAAAGTCACCTGCATCATCATTTGGCTGCTGGCAGGCTTGGCCAGTTTGC CAGCTATAATCCATCGAAATGTATTTTTCATTGAGAACACCAATATTACAGTTTGTGCTTTCCATTATGAGTCCCAAAATTCAACCCTTCCGATAGGGCTGGGCCTGACCAAAAATATACTGGGTTTCCTGTTTCCTTTTCTGATCATTCTTACAA2、人类血管紧张素II受体I基因(AT1)cDNA片段的克隆及其与rAAV的重组和构建。
1)人类血管紧张素II受体I基因(AT1)cDNA片段的克隆设计引物P1，5’-GCCCGGAATTCAAAATGATTCTCAAC-3’；P2，5’-GGCGCACAAGCTTTCAAATAAGAGTATAAC-3′。由武汉生物合成公司合成。用酚-氯仿抽提的方法从人白细胞中提取基因组DNA并以其为模板进行PCR(试剂盒购自日本TAKARA公司)。PCR仪购自英国TECONE公司。并将产物与pXXUF3反向相连。质粒图如图9。
将AT1cDNA测序，所得结果与从GeneBank中的结果相同。
具体实施例方式
本发明表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒的制备方法1、rAAV-AT1-AS与rAAV-LacZ重组病毒的包装与回收pXX2、pXX6、pXXUF1-AT1-AS、pdx-LacZ的质粒的大量提取，所用大提试剂盒购自Promega公司。方法依说明书所述。
将293细胞(人肾母胚胎肿瘤细胞系)传入数个150mm培养板中，传代培养需要0.25％胰蛋白酶、高糖DMEM培养基、新生小牛血清(购自Gibco公司)。待细胞生长到60％到70％聚集度时，按摩尔比1∶1∶1将pXX2、pXX6、pXXUF1-AT1(pdx-lacZ)用钙磷转染法转入293细胞。转染后48-72小时吸弃所有培养基，加入少量PBS缓冲液，刮取盘中293细胞，后-80℃冻存。
2、rAAV-AT1-AS与rAAV-LacZ回收病毒的纯化为祛除细胞中的异型蛋白，病毒的纯化应用SSCP法[13](纯化装置购自MILLIPORE公司)。具体如下将所转染的293细胞按每15cm盘应用2.5mL的DMEM的比例进行重悬。冻融2次后用各0.1mg的Dnase I和RnaseA 37℃温育30min。然后4℃，3000rpm离心15min。取上清与脱氧胆酸(终浓度0.5％)37℃温育30min。先后应用5μm孔滤器和0.8μm孔滤器过滤。将过滤物应用肝素柱纯化(肝素柱的制备方法详见说明书)。肝素柱用25mL的PBS(PH7.4)+0.1M NacL洗2次。再以15mL的PBS(PH7.4)+0.4M NacL洗脱，洗脱液在NMWL过滤装置中离心浓缩至1mL。收集浓缩液后再灌注PBS(PH7.4)浓缩至1mL，移去含病毒的溶液后再用100μL的PBS溶液洗3次，将洗脱液加入总的病毒纯化液中。取病毒纯化液用斑点杂交法测定滴度。
3、rAAV-AT1-AS与rAAV-LacZ滴度的测定—斑点杂交a)AT1cDNA探针的标记和纯化同位素标记的核苷酸α-P32购自北京雅辉公司。用HindIII切下UF3-AT1-AS中的AT1片段做为已知序列的探针。随机引物法标记AT1片段并纯化(试剂盒购自QIAGEN公司，方法如说明书)。
b)回收物的和定量标准的准备回收物经适量DnaseI和RNAse消化，消化细胞基因组的DNA、RNA。反应终止后再加ProteinseK，消化病毒的蛋白质外壳(以上试剂均购自日本TAKARA公司)。酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，祛除沉淀，上清中为病毒中的DNA。将上清按体积比对倍稀释。标准物采用目的基因片段，即AT1 cDNA片段，测定浓度后按分子数对倍稀释(具体计算方法略)。并作加热和碱变性处理。
c)杂交与放射自显影配好斑点杂交装置，并按装置大小安置一块0.45μm的尼龙膜，将待测病毒样品和标准样品按体积梯度和分子梯度分别上样，上样后将膜80℃干烤2小时，后42℃预杂交1小时(预杂交液购自INTERGEN公司)。再加加热处理的标记探针，45℃杂交12-16小时。洗膜后-80℃放射自显影2-3天。结果显示我们制备的rAAV具备足够的滴度(1-2×1011p.f.u.)，可以用于动物实验和临床治疗。
在多种动物模型及临床应用中显示，AT1受体阻滞剂具有降低血压，改善心功能，逆转心脏和血管重构，肾脏保护，预防PTCA术后再狭窄与动脉粥样硬化，预防脑中风等作用。反义AT1受体基因从基因水平上阻断AT1受体基因的转录与翻译，使AT1受体表达减少，较AT1受体阻滞剂的作用更为彻底，作用更强。重组腺相关病毒载体这一优异的基因治疗载体的开发成功，使人类基因治疗具备了可能性和可行性。表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒(rAAV-AT1-AS)的构建成功，为基因治疗走向临床迈出了可喜的一步。相信，表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒(rAAV-AT1-AS)用于临床后，必将在高血压，心力衰竭，冠心病，糖尿病，肾功能衰竭，中风等严重危害人类健康的疾病的治疗中，发挥极其主要的作用。
权利要求
1.一种表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒(rAAV)，它适用于高血压、肾脏疾病及其他相关疾病的基因治疗，其特征在于该载体系统包括包装质粒pXX2，辅助质粒pXX6，真核表达载体pXXUF1，并在真核表达载体pXXUF1内插入了人类血管紧张素II受体I反义基因编码序列。
2.如权利要求1所述的一种重组腺相关病毒，其特征在于该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成。
3.如权利要求1所述的一种重组腺相关病毒，其特征在于(a)、pXX2为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列，并在上游和下游各插入一个p5启动子。(b)、pXX6为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因，它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激rAAV基因的转录和翻译。(c)、pXXUF1真核表达载体，所用的是CMV启动子，其含有一多克隆位点(pXXUF1为NotI位点)，可以连接不同的目的基因。
4.如权利要求3所述的一种重组腺相关病毒，其特征在于该重组腺相关病毒是表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒rAAV-AT1-AS。
5.如权利要求1所述的一种人类血管紧张素II受体I基因的重组腺相关病毒(rAAV)，其特征在于紧张素II受体I反义基因由PCR法从人体白细胞基因组(genomic DNA)中克隆而得。
6.该发明为一种药物组合物，其特征在于，它包括有效量的如权利要求(1)所述的表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒和药学上所接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求(6)所述的药物组合物，其特征在于，该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒和腺病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工而成。
8.如权利要求(6)所述的药物组合物，其特征在于该重组腺相关病毒是表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒rAAV-AT1-AS。
9.一种制备表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒的方法；其特征在于a)、提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列——pXX2质粒，和刺激腺相关病毒复制和转录所必需的腺病毒E1A、E2A和VAI RNA基因——pXX6质粒。b)、提供含腺相关病毒基因组的真核表达载体pXXUF1，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并插入人类血管紧张素II受体I反义基因，形成重组质粒pXXUF1-AT1-AS。c)、将步骤α中的pXX2、pXX6和pXXUF1-AT1步骤2)共转染293细胞，适时回收，并纯化、检测其病毒滴度。d)、将步骤c中回收纯化的病毒经尾静脉注射入自发性高血压大鼠体内，检测其生物学活性。
10.根据权利要求书9所述的一种制备方法，其特征在于，在步骤(c)中共转染的方法是钙磷DNA共沉淀转染法。真核载体pXXUF1所含启动子为CMV启动子。纯化是用SSCP法，而检测滴度是用斑点杂交法。
11.根据权利要求书9所述的一种制备方法，其特征在于，在步骤(d)中预计检测的结果将说明该种表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒(rAAV-AT1-AS)在生物体内可长期高效表达，发挥其降低血压，改善肾脏功能，防止心脏，血管重构等生理和病理生理作用。
全文摘要
一种表达人类血管紧张素II受体I反义基因的重组腺相关病毒(rAAV),它适用于高血压、心力衰竭、肾脏疾病及其他相关疾病的基因治疗,该载体系统包括包装质粒pXX
文档编号C12N7/01GK1422950SQ0211577
公开日2003年6月11日 申请日期2002年4月28日 优先权日2002年4月28日
发明者汪道文, 肖啸, 孔强, 王涛 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院