专利名称：一种限制性扩增方法
技术领域：
本发明涉及一种新的基因片段分离方法，特别是涉及一种限制性扩增方法，可用于制备DNA微集芯片(DNA microchip)上固化的靶基因片段。
为了达到上述目的，本发明以限制性核酸内切酶消化基因组DNA或信使核糖核酸(mRNA)体外逆转录的双链互补的脱氧核糖核酸(cDNA)，产生许多大小合适的限制性基因片段，进一步与互补的接头连接。根据接头及内切酶识别位点的DNA序列设计标准的PCR通用引物，然后在通用引物的3′末端延伸一个或多个碱基来设计选择性引物。通过选择性引物间两两地排列组合，将PCR反应分成若干亚组，扩增限制性基因片段，最后通过电泳分离、回收基因片段，进行二次PCR，制备限制性扩增的基因片段探针。本发明依次包括以下步骤(1)限制性核酸内切酶消化DNA或cDNA；
(2)设计接头，与上述限制性酶切片段连接；(3)根据限制性内切酶位点与接头序列设计通用引物，并针对目标核苷酸序列在通用引物的3′末端延伸一个或一个以上的碱基设计选择性引物进行PCR分组扩增；(4)分离纯化步骤(3)扩增的基因片段作模板，进行二次PCR，纯化产物，重悬于溶液中。
上述步骤的流程示意图如
图1所示，图中的N1N2N3…代表延伸的碱基，U代表通用引物。
在所述的步骤(3)中，设计通用引物后针对目标核苷酸序列再设计若干个选择性引物，通过少数PCR反应进行分组扩增(a)对于已知序列基因或基因组，且其长度小于200kb，根据该基因或基因组限制性酶切位点及该位点后第1～3位碱基的序列，分析这些限制性酶切片段的分组分布情况，①若分组较集中，则合成通用引物3′末端延伸1个碱基的选择性引物，其数量共4个，通过这4个引物之间的两两组合，进行10组(或更少组)PCR。②若酶切片段较少，则可设计若干个延伸2个碱基的引物，必要时可设计延伸3个碱基的引物，进行PCR扩增，即一个反应扩增一个(最理想情况)或少数几个(如2～3个)片段。
(b)对于已知序列基因或基因组，且其长度大于200kb分析该基因或基因组限制性酶切位点及限制性片段的分组分布情况，①若基因组在200kb～3.5Mb，可合成16个(或更少)延伸2个碱基的选择性引物，进行136组(或更少组)PCR反应扩增靶基因片段。②若基因组在3.5Mb～50Mb，可合成64个(或更少)延伸3个碱基的选择性引物，进行2080组(或更少组)PCR反应。③若基因组大于50Mb，可延伸4个以上碱基进行若干组PCR反应。
(c)对于未知序列基因或基因组，根据其长度确定延伸的碱基数目，可合成延伸1个碱基的选择性引物，分10组PCR反应；也可合成16个延伸2个碱基或合成64个延伸3个碱基的选择性引物，进行136组或2080组PCR反应，依次类推，甚至可延伸3个以上碱基进行更多组PCR反应。
所述的步骤(4)中可采用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(或测序胶电泳)，或以毛细管电泳分离扩增的基因片段，切胶回收作模板；或者直接纯化单一扩增产物作模板；或将扩增产物克隆到载体上转化细菌，以菌液或提取的质粒作模板，进行二次PCR，纯化产物，重悬于溶液中。
本发明与现有技术相比具有以下优点①可以利用未知的DNA片段，直接开始DNA微集芯片的研制，将大大节省时间与资金。如仅需运用4个或16～64个选择性引物，即可扩增出近万个不同的限制性基因片段，经纯化和索引后可直接作为制作DNA微集芯片的靶基因探针。②本发明制备的限制性扩增基因片段的长度范围较窄，主要集中在100～1000bp(碱基对)之间，这种长度相对较均一，杂交动力学的条件容易控制。③可从同一个基因中扩增得到多个大小相近的基因片段作探针来检测同一个分子，显著提高信噪比，降低假阳性率。④采用本发明扩增基因片段探针制备的芯片，可设计出一种新颖的标记、杂交与检测方式，将大大加速DNA微集芯片技术的研究及产业化进程。⑤本发明可以高效地分离到多个基因的片段，将这些得到的基因片段分别进行分析和验证，将需要大量的人力和物力，而将这些分离的限制性扩增基因片段制成相应的基因芯片，一方面可与多种标记的样品核酸进行分子杂交，从中筛选出适合杂交的特异探针；另一方面，不仅可以快速验证分离基因在不同生物学系统中表达的情况，得到基因表达的量化指标，而且可以整体综合地分析基因表达信息，为基因功能机制的揭示提供一条新的研究途径。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图2是本发明的实施例1中延伸一个碱基的部分RD-PCR图谱。
(2)以Oligo 6.0软件设计两条寡核苷酸链S2P(5′-GAT CCC CCC CCCCCC CCC CCA-3′)与S2R(5′-GGG GGG GGG GGG GG-3′)，合成后溶于双蒸水中。在微量管中将两者等量(等摩尔数)混合，加热至90℃，5分钟。然后，在30分钟内，使其温度逐渐降低至室温，具体方法为在PCR仪上，90℃ 3分钟36秒，80℃ 3分钟36秒，70℃ 3分钟36秒，60℃ 3分钟36秒，50℃ 3分钟36秒，40℃ 3分钟36秒，30℃ 3分钟36秒，20℃ 3分钟36秒，4℃保持，形成的接头(S2P/S2R)如下GATCCCCCCCCCCCCCCCCCA|||||||||||||||GGGGGGGCGGGGGGG以T4 DNA连接酶将上述限制性片段与接头连接。连接反应可参考以下方法在微量管中加入22μl去离子水，10×连接酶缓冲液3μl，形成的接头2μl，酶切产物2μl，T4 DNA连接酶1μl，16℃反应2～3小时，作为PCR反应的模板。
(3)设计通用引物及选择性引物，进行PCR反应引物的设计引物1 GGGGGGGGGGGGGGGATCN1N2N3…GGGGGGGGGGGGGG＿＿＿＿＿GATCCCCCCCCCCCCCCCCA||||||||||||||||||||||||||||ACCCCCCCCCCCCCCCCTAG＿＿＿＿＿＿＿GGGGGGGGGGGGGG…N2N1CTAGGGGGGGGGGGGGGG 引物2其中，横线部分代表限制性酶切片段；两端部分为接头；其上方和下方的序列为设计的引物，N1N2N3…为延伸的碱基。若无N1N2N3…则为通用引物(U)。若只有N1，则为延伸一个碱基的选择性引物，以UN1表示；若有N1N2，则为延伸两个碱基的选择性引物，以UN1N2表示，其中N1、N2为碱基A、T、C、G中的一种。
在本实施例中，分析HIV1U26942 DNA经Sau3A I酶切后产生的限制性片段两端GATC后第一个碱基，其序列示意如下GATCAA＿＿＿＿GGTT＿＿＿＿CCCTAG由此可知，该片段两端GATC后第一个碱基分别为A和C，所以该片段可用延伸一个碱基的选择性引物UA和UC进行扩增，也就是说该片段在进行PCR扩增时，分布于含有引物UA和UC的反应中(在此把这两个引物扩增的反应称为AC组)。同理，分析其它片段，可知上述19个限制性片段的PCR反应分组情况如表1所示，每个片段以组名+大小表示，如AA组的那个片段为AA172。
表1 限制性片段的PCR反应分组分组片段(bp)AA 172AT 1081 475 466 195AC 583 456 441 105TT 1610 580 553 424 375 161TC 367 321 259 104将通用引物的3′末端延伸一个碱基，得到4个选择性引物UA、UT、UC、UG，通过它们之间的组合，只需进行5组PCR反应，即含有引物UA、UA的AA组，含有引物UA、UT的AT组，含有引物UA、UC的AC组，含有引物UT、UT的TT组，含有引物UT、UC的TC组。PCR扩增可参考以下方法在PCR反应管中加入10×PCR缓冲液5μl，dNTP混合液(各2.5mmol/L)4μl，两种分组引物(65μmol/L)各0.5μl，1μl模板，0.5μlTaq酶(5U/μl)，加ddH2O至50μl，轻轻混匀。PCR条件为95℃ 2分钟，(95℃ 30秒钟，68℃ 30秒钟，72℃ 1分钟)×30循环，72℃ 5分钟，4℃保持。
(4)各组PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，切下目的条带，或者纯化PCR产物(若该反应中只扩增一个片段)，取少量直接作模板，进行二次PCR，其反应条件同上，大量扩增限制性基因片段，纯化后溶于50％二甲基亚砜溶液(浓度为300ng/μl)等，用于DNA微集芯片的打印。
上述延伸一个碱基的部分RD-PCR图谱如图2所示，预期的基因片段大部分已扩增出来，测序结果表明，它们被限制酶切割成了多个小片段。另外，TC组中由于含有引物UT，所以也扩增了几个引物UT组合即TT组的片段。
实施例2本实施例与实施例1的区别是在步骤(3)中，分析HIV1U26942 DNA经Sau3A I酶切后产生的限制性片段的两端GATC后前两个碱基，如实施例1中所示，该片段采用延伸两个碱基的引物UAA与UCC进行PCR反应扩增该片段。因此，上述19个片段可用13个延伸两个碱基的引物进行16个PCR反应扩增出来，其中13个反应扩增的都是单一条带，另外3个PCR反应扩增的是双带(TT1610和TT580，TT553和TT424，AC456和AC441)。反应条件同上。
权利要求
1.一种限制性扩增方法，依次包括以下步骤(1)限制性核酸内切酶消化DNA或cDNA；(2)设计接头，与上述限制性酶切片段连接；(3)根据限制性内切酶位点与接头序列设计通用引物，并针对目标核苷酸序列在通用引物的3′末端延伸一个或一个以上的碱基设计选择性引物进行PCR分组扩增；(4)分离纯化步骤(3)扩增的基因片段作模板，进行二次PCR，纯化产物，重悬于溶液中。
2.根据权利要求1所述的限制性扩增方法，其特征是在所述的步骤(3)中，通用引物3′末端延伸1个碱基设计选择性引物，其数量共4个，通过这4个引物之间的两两组合，进行10组PCR。
3.根据权利要求1所述的限制性扩增方法，其特征是在所述的步骤(3)中，通用引物3′末端延伸2个碱基设计选择性引物。
4.根据权利要求1所述的限制性扩增方法，其特征是在所述的步骤(3)中，通用引物3′末端延伸3个碱基设计选择性引物。
5.根据权利要求1所述的限制性扩增方法，其特征是在所述的步骤(4)中，采用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳，或以毛细管电泳分离扩增的基因片段，切胶回收作模板；或者直接纯化单一扩增产物作模板；或将扩增产物克隆到载体上转化细菌，以菌液或提取的质粒作模板，进行二次PCR。
全文摘要
本发明公开了一种限制性扩增方法，该方法依次包括以下步骤(1)限制性核酸内切酶消化DNA或cDNA；(2)设计接头，与上述限制性酶切片段连接；(3)根据限制性内切酶位点与接头序列设计通用引物，并针对目标核苷酸序列在通用引物的3′末端延伸一个或一个以上的碱基设计选择性引物进行PCR分组扩增；(4)分离纯化步骤(3)扩增的基因片段作模板，进行二次PCR，纯化产物，重悬于溶液中。本发明可快速、经济、自动化获取大量序列已知、甚至未知的基因片段，用于制备DNA微集芯片(DNAmicrochip)上固化的靶基因片段。
文档编号C12Q1/68GK1461809SQ0211532
公开日2003年12月17日 申请日期2002年5月31日 优先权日2002年5月31日
发明者马文丽, 郑文岭, 李凌 申请人:中国人民解放军基因工程研究所