Dna甲基化转化效率的判断方法及其试剂盒和应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种DNA经过亚硫酸盐处理后判断未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的 转化率的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化(DNA methylation)是最早发现的修饰途径之一，它主要发生在富含双 核苷酸CpG岛的区域，在人类基因组中有近5万个CpG岛。正常情况下C pG岛是以非甲基化形 式(活跃形式)存在的。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及 DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
[0003] 检测甲基化的方法包括：甲基化敏感的限制性内切酶(161：117131：；[011-86118；[1：；^6 restriction Endonuclease，MS_RE)法，甲基化特异性PCR法（Methy 1 ati on-specific PCR，MSP)，甲基化敏感性解链曲线分析法(MS-High Resolution M elting Curve，MS_ HRM)，亚硫酸氢盐基因测序法（bisulfite sequencing PCR，BSP)，以及荧光法 (Methylight)等。
[0004] 焚光法(Methylight)先用甲基化处理试剂盒对样本DNA进行亚硫酸盐处理转化， 即将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，再用普通PCR探针的方法检测经过处理后的转化液， 从而判断基因是否甲基化。虽然检测方法快速便捷，但是，如果样本DNA的亚硫酸盐处理转 化过度，会造成检测转化液无法获得实验结果；如果样本DNA的亚硫酸盐处理转化率过低， 会造成检测结果假阳性。因此，对于本领域的技术人员来说如何获得样本DNA的亚硫酸盐处 理转化率是亟待解决的技术难题。
[0005] 中文文献《DNA甲基化分析中重亚硫酸盐处理DNA转化效率的评估方法》发表于《遗 传》杂志第2015年9月刊，939页至944页，其中公开了一种评估重亚硫酸盐处理DNA样本后胞 嘧啶转化效率的有效方法，需要通过不同梯度浓度DNA模板建立标准曲线，再进行转化效率 的计算，较为繁琐。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种可以快速判断样本DNA的亚硫酸盐处理转化 率过高或过低的DNA甲基化转化效率的判断方法及其试剂盒，以及该方法在制备检测产品 方面的应用。
[0007] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种DNA甲基化转化效率的 判断方法，设置转化效率的目标值为η% ;制备合格的DNA样本，所述DNA样本经甲基化转化 试剂盒处理后得到转化液，制备对照液，所述对照液由阳性甲基化质粒和DNA样本按照质量 比为η%: i-η%配制而成；
[0008] 所述引物探针组X针对管家基因的序列设计且用于检测未转化DNA，所述引物探针 组Υ针对基因甲基化区域的目标序列设计且用于检测已转化的DNA;
[0009] 采用引物探针组X对所述转化液进行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CIVm，采用 引物探针组X对所述对照液进行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CTx-D;采用引物探针组Y对 所述转化液进行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CIVm，采用引物探针组Υ对所述对照液进 行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CTy-d ;
[0010] Δ Δ CT = CTx-m-CTy-m+CTy-d-CTx-D;当 Δ Δ CT 2 0时，DNA甲基化转化效率 2 η% ;当 A Δ CT<0时，DNA甲基化转化效率<n%。
[0011] 其中η的取值范围是：97<n<100。
[0012] 优选的是：?!取97、98或99。
[0013] 优选的管家基因是ACTB或GAPDH。
[00M] 上述引物探针组Υ针对MGMT启动子甲基化区域的目标序列设计；
[0015] 所述引物探针组X包括正向引物a、反向引物a和探针a;所述引物探针组Υ包括正向 弓丨物b、反向引物b和探针b;
[0016]所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示;所述反向引物a的核苷酸序列 如SEQ ID No.2所示;所述探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0017]所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述反向引物b的核苷酸序列 如SEQ ID No.5所示;所述探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0018]所述探针a和探针b的5'端设有报告荧光基团，所述探针a和探针b的3'端设有淬灭 荧光基团。
[0019]上述探针a和探针b的5'端设有相互区别的报告荧光基团。
[0020] 上述相互区别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或 Cy3，第三种是Cy5或R0X;所述淬灭荧光基团是BHQ1。
[0021 ] 采用引物探针组X或Y对进行PCR检测时，所配制的PCR反应体系的组分中包括DNA 模板〇. 5体积，十倍浓度的PCR缓冲液1体积，2mM的dNTPs试剂1体积，15mM的MgCl2溶液1体 积，4μΜ的正向引物1体积，4μΜ的反向引物1体积，4μΜ的探针0.5体积，5U/yl的热启动Taq聚 合酶0.2体积，其余为纯水;所述PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl和500mM的KC1;所述dNTPs 试剂包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP; PCR反应体系中，各引物应用于PCR反应中的终浓度为0.4 μΜ;各探针应用于PCR反应中的终浓度为0.2μΜ;所述DNA模板的使用浓度为10~50ng/yl。
[0022] 本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是:一种采用上述的DNA甲基 化转化效率的判断方法的检测试剂盒。
[0023] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是:一种上述的DNA甲基化转 化效率的判断方法在制备甲基化检测产品的应用。
[0024] 本发明具有积极的效果:本发明的DNA甲基化转化效率的判断方法，引物探针组X 针对未经亚硫酸盐处理的模板进行针对管家基因的引物和探针设计；引物探针组Y针对目 标甲基化检测区域上下游约200bp范围内进行设计，且针对的模板为经过亚硫酸盐处理的 模板。根据CT值的大小关系，列出判定公式，可以判断转化效率是否高于ri，如果等于或高于 η说明转化效率可以接受，可进行后续检测，如果低于η说明则应该重新转化或者更换新的 临床样本基因组DNA，重新开始检测。本发明的DNA甲基化转化效率的判断方法巧妙的设立 由阳性甲基化质粒和DNA样本按照质量比为τι% : 1-ri%配制而成的对照液，利用简单的PCR 反应判断甲基化转化效率，从而保证后续检测的进行。利用本发明的DNA甲基化转化效率的 判断方法进行判断后，一般在大于97%的转化率前提下，进行后续如甲基化特异性PCR法或 荧光探针法等进行甲基化判定，可极大提高反应准确性及减少假阳性率。
【附图说明】
[0025] 图1是采用反应体系X检测样本A1及其转化液Ml的扩增图；
[0026] 图2是采用反应体系Z检测阴性对照C、阳性对照E和样本A1的转化液Ml的扩增图； [0027]图3是采用反应体系X检测阳性对照D、样本A2及其转化液M2的扩增图；
[0028]图4是采用反应体系Y检测阳性对照D、样本A2的转化液M2的扩增图；
[0029]图5是采用反应体系Z检测阴性对照C、阳性对照E和样本A2的转化液M2的扩增图。
【具体实施方式】
[0030]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实 验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所 有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或 均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0031 ] 实施例1
[0032] 一、试剂盒的组成。
[0033]本实施例的甲基化检测试剂盒包括混合液X、混合液Y、混合液Z和热启动酶(Taq Hot star)。混合液X、混合液Y、混合液Z和热启动酶(Taq Hot star)分别置于不同的试管中， 如表1至表3所;^:。
[0034] 表1混合液X的组分表
[0035]
[0036] 表2混合液Y的组分表
[0037]
[0038] 表3混合液Z的组分表
[0039]
[0040] 引物和探针的核苷酸序列如表4所示。
[0041 ]表4引物和探针的核苷酸序列表 [0042]
[0043]~混合液X中包括引物探针组X，混合液Y中包括引物探针组Y，混合液Z中包括引物探_ 针组Z。引物探针组X针对管家基因 GAPDH的序列设计且用于检测未转化DNA。引物探针组Y针 对MGM