T启动子甲基化区域的目标序列设计且用于检测已转化的DNA。
[0044] 其中，正向引物a、反向引物a和探针a是针对人类GAPDH基因设计。探针a的5'端设 有R0X修饰(报告荧光基团），探针a的3 '端设有BHQ1修饰(淬灭荧光基团）。探针b的5 '端设有 Hex修饰(报告荧光基团），探针b的3'端设有BHQ1修饰(淬灭荧光基团）。探针c的5'端设有 FAM修饰(报告荧光基团），探针c的3 '端设有BHQ1修饰(淬灭荧光基团）。探针d的5 '端没有设 报告荧光基团，探针d的3 '端设有BHQ1修饰(淬灭荧光基团）。
[0045] PCR缓冲液（PCR 8叶€6〇、(1町？8、1^(：12和热启动酶来自了&1^^公司（货号： R007A)〇
[0046] 二、试剂盒的使用方法。
[0047] 本实施例的甲基化检测试剂盒的具体检测步骤如下：
[0048] 1、DNA 提取。
[0049] 米用试剂盒（Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep c_kit)提取样本DNA， 具体的操作参见试剂盒产品说明书。
[0050] 2、样本DNA质量检测。
[00511 获得样本DNA后，使用微量分光光度计测量浓度，通过测定浓度和0D260/0 D280的 比值控制样本质量，最终加入反应体系中的样本浓度为lOOng/μΙ，1.9 2 A260/280 2 1.8， A260/230 2 1.0。合格的样本DNA液即为样本A，-20°C保存。
[0052] 3、甲基化处理。
[0053] 采用甲基化处理试剂盒（EZ DNA methylation-Gold Kit，ZYM0 RESEARCH，美国， 产品编号：5005)对样本进行亚硫酸盐处理转化，具体步骤参照甲基化试剂盒说明书，得到 转化液M。
[0054] 4、准备样本及对照品。
[0055] 各样本及对照品具体成分如表5所示。
[0056]表5样本及对照品说明
[0057]
[0058] ~B:阳性甲基化质粒。采用常规构建质粒方法构建。从随机样本里提取人类基因组, DNA液经亚硫酸盐处理，采用引物正向引物b(按照常规在5'端加酶切点的碱基序列）和反向 引物b(按照常规在5'端加酶切点的碱基序列)进行PC R扩增(扩增程序如表9所示），产物测 序验证，将MGMT基因启动子没有被转化的产物作为构建阳性质粒的PCR产物1，即其MGMT基 因启动子为甲基化形式。将PCR产物1与Puc57质粒(生工A9196,编号：150311R5876-1)相应 酶切后的片段1连接，转化至DH_5a感受态细菌，LB平板培养，蓝白斑筛选出阳性克隆，测序 验证，扩大再培养，提取质粒DNA，经测序验证后，-20°C保存，保存浓度为1 OOng/μΙ。
[0059] C:阴性甲基化质粒。采用常规构建质粒方法构建。从随机样本里提取人类基因组 DNA液经亚硫酸盐处理，采用引物正向引物b(按照常规在5'端加酶切点的碱基序列）和反向 引物b(按照常规在5'端加酶切点的碱基序列)进行PC R扩增(扩增程序如表9所示），产物测 序验证，将MGMT基因启动子被完全转化的产物作为构建阴性质粒的PCR产物2,即其MGMT基 因启动子为非甲基化形式;将PCR产物2与Puc57质粒(生工A9126,编号：150311R5876-1)相 应酶切后的片段2连接，转化至DH_5a感受态细菌，LB平板培养，蓝白斑筛选出阳性克隆，测 序验证，扩大再培养，提取质粒DNA，经测序验证后，-20°C保存，保存浓度为1 OOng/μΙ。
[0060] D:98%样本B+2%样本A。其配制方法如下：以体积比B( lOOng/μΙ): A(100ngAil)= 98:2配制即得。
[0061] E: 1.5625 %样本B。其配制采用如下方法，以下均为体积比：
[0062] 1)以B(100ng/μl):C(100ng/μl) = l:l配制，得El，为50%B;
[0063] 2)以 El:C(100ng/μl) = l:l配制，得E2，为25%B;
[0064] 3)以 E2:C(100ng/μl) = l:l配制，得E3，为12·5%B;
[0065] 4)以 E3: C( lOOng/μΙ) = 1:1配制，得 E4，为6 · 25 %B;
[0066] 5)以 E4:C(100ng/μl) = l:l配制，得E5，为3·125%B;
[0067] 6)以 E5: C( lOOng/μΙ) = 1:1配制，得 E6，SP 为1 · 5625%B。
[0068] Μ:样本A经甲基化转化试剂盒处理后的对应转化液。保存浓度为20~50ngAU。
[0069] 5、采用混合液X配制成反应体系X进行基因组DNA质量的检测。
[0070] 配制反应体系X，利用荧光PCR定量仪(Agilent 3100)对基因组DNA的质量进行检 测分析。反应体系X的组分如表6所示，反应体系X的PCR反应程序如表7所示。
[0071] 表6反应体系X的组分表
[0072]
[0073] 表7反应体系X的PCR反应程序
[0074]
[0075] 在延伸阶段收集R0X荧光信号。
[0076] 采用反应体系X检测样本A，可获得典型S型扩增曲线，可确认反应体系X正常。
[0077] 6、采用混合液Y配制成反应体系Y进行转化液质量分析。
[0078] 配制反应体系Y，利用荧光PCR定量仪(Agilent 3100)对转化液质量进行检测分 析。反应体系Y的组分如表8所示，反应体系Y的PCR反应程序如表9所示。
[0079] 表8反应体系Y的组分表
[0080]
[0081 ] 表9反应体系Y的PCR反应程序
[0082]
[0083] 在延伸阶段收集HEX荧光信号。
[0084] 采用反应体系Y检测样本B或样本C，若可获得正常S型扩增曲线，可确认反应体系Y 正常。
[0085] 7、采用混合液Z配制成反应体系Z进行甲基化检测分析。
[0086] 配制反应体系Z，利用荧光PCR定量仪(Agilent 3100)，进行甲基化检测分析。反应 体系Z的组分如表10所示，反应体系Z的PCR反应程序如表11所示。
[0087] 表10反应体系Z的组分表
[0088]
[0089]
[0090] 表11反应体系Z的PCR反应程序
[0091]
[0092] 在传统三步PCR反应的基础上，增加在较低退火温度收集FAM荧光信号这一步骤。
[0093] 采用反应体系Z检测样本B和样本D，若均能获得正常S型扩增曲线，则确认反应体 系Z工作正常。反应体系Z可检测MGMT启动子区的低至1.5625%的甲基化状态。
[0094] 三、结果判断。
[0095]以下反应体系X、Y、Z进行检测时，均以不加 DNA模板(补足水)的PCR液为空白对照， 按以下步骤进行。
[0096] 1、采用反应体系X检测样本A。
[0097] i.反应体系X检测样本A，若不能获得正常S型扩增曲线，表明样本A的质量不合格， 需重新制备后再进行检测；
[0098] ii.反应体系X检测样本A，若获得正常S型扩增曲线，则进行步骤2的检测。
[0099] 2、反应体系X检测样本Μ。
[0100] i.反应体系X检测样本M，若不能获得典型S型扩增曲线，表明临床样本基因组DNA (样本A)的转化液(样本Μ)无人类基因组残留，转化率100%。可直接进行步骤6的反应体系Z 的检测。
[0101] ii.反应体系X检测样本Μ，若能获得典型S型扩增曲线，扩增曲线CT值为CTx-m，则有 两个可能：
[0102] A.样本A的GAPDH启动区可能为完全甲基化样本;但因反应体系X所采用的引物是 针对GATOH这个管家基因的，管家基因是一类始终保持着低水平的甲基化从而一直处于活 性转录状态，样本A的GAPDH启动区不可能完全甲基化，故排除这种可能性。
[0103] B.样本A的转化未进行完全，必须进行转化率的判定，进行步骤3~5。
[0104] 3、采用反应体系X检测样本D。
[0105] 采用反应体系X检测样本D，可获得正常S型扩增曲线，扩增曲线CT值命名为CTx-D。
[0106] 4、采用反应体系Y检测样本D。
[0107]采用反应体系Y检测样本D，可获得正常S型扩增曲线，扩增曲线CT值为C Ty-d。
[0108] 5、采用反应体系Y检测样本Μ。
[0109] 采用反应体系Υ检测样本Μ，可获得正常S型扩增曲线，扩增曲线CT值为C Τγ-Μ，需进 行样本Α的转化率是否大于98%转化率的判定：
[0110] Δ Ctl=CTY-D-CTx-D; Δ Ct2 = CTY-M-CTx-M。
[0111] Δ ACT = _(实验组 ACT 值-对照组 ACT 值）=-( ACt2_ACtl)。
[0112] 若Δ ACT>0,说明临床样