嵌合RSV-F多肽、和慢病毒或α-反转录病毒GAG基VLP的制作方法

专利名称：嵌合RSV-F多肽、和慢病毒或α-反转录病毒GAG基VLP的制作方法
技术领域：
本发明涉及嵌合病毒样颗粒(VLP)技术领域，其包括呼吸道合胞病毒(RSV)F多肽、和慢病毒或者a-反转录病毒Gag多肽。在优选的实施例中，所述技术领域包括嵌合VLP和制备嵌合VLP的方法。在某些实施方案中，所述嵌合VLP包含禽白血病病毒(ALV)、劳氏肉瘤病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、或者人类免疫缺陷病毒(HIV)Gag多肽和呼吸道合胞病毒F多肽。
背景技术：
呼吸道合胞病毒(RSV)是细支气管炎和肺炎(在婴儿和I岁以下的儿童中)的主要原因(CDC国家传染病中心(2004)呼吸道合胞病毒)。在免疫系统受损或减弱的成人和老人中，RSV也是重要的呼吸道病原体。个体可以被RSV多次感染，如同天然感染，不引起 保护性免疫。RSV是反链、单股RNA病毒，其属于副黏液病毒科(Paramyxoviridae)的肺炎病毒属(Pneumovirus)。所述RSV基因组被螺旋状的核壳体包围，并编码至少10种蛋白3种跨膜结构蛋白(F、G和SH)，两种基质蛋白(M和M2)，3种核壳体蛋白(N、P和L)、2种非结构蛋白(NSl 和 NS2) (Collins 等(1996)Respiratory syncytial viru, pp. 1313-1351, InB. N. Fields (ed. ), Fields virology. Raven Press, New York, NY)。中和性的抗体似乎只被所述F和G蛋白引出。基于所述G蛋白，RSV被分成亚群A和B，其中F在两个亚群之间关系更加紧密。抗F蛋白的单克隆抗体表现出在体外具有中和性影响和体外预防性影响。(例如Anderson 等 1988. J. Virol. 62 :4232-4238 ；Anderson 等 1986. J. Clin. Micro. 23 :475-480 ；Beeler 和 Coelingh 1989. J. Virol. 63 :2941-50 ；Garcia-Barreno 等 1989.J. Virol. 63 925-32 ；Taylor 等 1984. Immunology 52 :137-142 ;和美国专利 No. 6，818，216)。尽管经过数十年的研究，仍然不存在安全和有效的RSV疫苗。在婴儿和儿童中测试的福尔马林灭活病毒疫苗不能保护其免遭感染，并且与由野生型RSV病毒并发感染期的几种症状的风险升高有关(Kapikian 等,1969, Am. J. Epidemiol. 89 :405-21 ;Chin 等,1969，Am. J. Epidemiol. 89 :449-63)。由于无法确定候选病毒适宜的减毒水平和一些候选者的遗传稳定性，之后集中于发展减毒的温度敏感突变体的尝试也失败了。(Hodes等(1974)Proc. Soc. Exp. Biol. Med.，145,1158-1164 ;Kim等(1973) Pediatrics, 52, 56-63 ；Wright等(1976)J.Pediatrics,88,931-936)。病毒样颗粒(VLP)提供了相对于传统疫苗技术的多种优势。VLP对疫苗发展的重要优势是它们在三位结构和促进中和性抗体应答(对初级和构象表位)的能力方面模仿天然病毒，因此表现比其它疫苗制剂具有更多的免疫原性。与病毒载体途径不同，VLP和预存免疫性没有问题，因此允许周期性使用。含有RSV抗原的VLP已经在昆虫细胞中通过RSV F蛋白和RSV基质(M)蛋白或者异种的M蛋白共表达形成(US 2008/0233150)。尽管如此，US 2008/02331050没有教导RSV-F蛋白与慢病毒或者a -反转录病毒GAG蛋白的实际表达。另外，美国序列号61/115，780的申请人教导了在缺乏包膜病毒核心形成多肽的情况下，RSV-F蛋白的表达。尽管如此，所述申请人发现所述鼠白血病病毒(MLV-Y-反转录病毒)GAG蛋白当与所述RSV-F蛋白共表达时，不能有效地形成VLP。因此，需要VLP，将其用于在结构多肽形成的核心上表达RSV F蛋白，而不是所述天然RSV M蛋白。发明概述本公开的多个方面迎合了这种需求，通过提供多种方法和组合物，如本文公开的形成嵌合VLP的方法和包含VLP的组合物。在优选的实施方案中，所述嵌合VLP将包含慢病毒或者a -反转录病毒Gag多肽、和呼吸道合胞病毒F多肽。本公开的组合物一方面包括嵌合病毒样颗粒，其包含慢病毒或者a -反转录病毒Gag多肽、和呼吸道合胞病毒F多肽，其相对于呼吸道合胞病毒F多肽氨基酸序列(在本文实施例中公开的)中的任何一条,具有至少80%序列同源性，至少85%序列同源性，至少90%序列同源性，至少95%序列同源性，至少97%序列同源性，或者至少99%序列同源性。 在某一些实施方案中，所述Gag多肽来自于人类免疫缺陷病毒，其相对于人类免疫缺陷病毒Gag多肽氨基酸序列(在本文实施例中公开的)中的任何一条，可能具有至少80%序列同源性，至少85%序列同源性，至少90%序列同源性，至少95%序列同源性，至少97%序列同源性，或者至少99%序列同源性；或者来自于猿猴免疫缺陷病毒，其相对于猿猴免疫缺陷病毒Gag多肽氨基酸序列(在本文实施例中公开的)中的任何一条，可能具有至少80%序列同源性，至少85%序列同源性，至少90%序列同源性，至少95%序列同源性，至少97%序列同源性，或者至少99%序列同源性。在其它实施方案中，所述Gag多肽来自于禽白血病病毒，其相对于禽白血病病毒Gag多肽氨基酸序列(在本文实施例中公开的)中的任何一条，具有至少80 %序列同源性，至少85 %序列同源性，至少90 %序列同源性，至少95 %序列同源性，至少97%序列同源性，或者至少99%序列同源性。在又一实施方案中，所述病毒样颗粒进一步包含哺乳动物糖基化。在又一实施方案中，其可能与任何在前的实施方案或方面结合，所述药剂也包括与所述病毒样颗粒混合的佐剂。在又一实施方案中，其可能与任何在前的实施方案或方面结合，其包括佐剂，所述佐剂可能被定位在所述病毒样颗粒的外部或者可能被定位在所述病毒样颗粒的内部。在又一实施方案中，其可能与任何在前的实施方案或方面结合，其包括佐剂，所述佐剂可能被共价连接到所述呼吸道合胞病毒F多肽形成共价键。在又一实施方案中，其可能与任何在前的实施方案或方面结合，中和性的抗-RSV-F抗体可以与所述呼吸道合胞病毒F多肽(证明所述RSV F多肽大体上是天然构象)结合。在某些实施方案中，其可能与任何在前的实施方案或方面结合，其包括的这种中和性的抗体，所述中和性的抗-RSV-F抗体可以是帕利珠单抗。在又一实施方案中其可能与任何在前的实施方案或方面结合，所述嵌合病毒样颗粒进一步包含附加的VLP-缔合抗原、或者与第二抗原连接的VLP-辅助多肽。另一方面，包括制备嵌合病毒样颗粒的方法，包括(a)提供一种或多种表达载体，其表达慢病毒或者a -反转录病毒Gag多肽和呼吸道合胞病毒F多肽，其相对于所述呼吸道合胞病毒F多肽核酸序列(本文实施例中公开的)中的任何一条，可能具有至少80%序列同源性，至少85%序列同源性，至少90%序列同源性，至少95%序列同源性，至少97%序列同源性，或者至少99%序列同源性；(b)在介质中引进一种或多种表达载体到真核细胞中；和(c)表达反转录病毒Gag多肽和所述呼吸道合胞病毒F多肽以制备嵌合病毒样颗粒。在某些实施方案中，所述真核细胞是酵母细胞或者哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在某一些实施方案中，所述Gag多肽来自于人类免疫缺陷病毒，其相对于人类免疫缺陷病毒Gag多肽核酸序列(在本文实施例中公开的)中的任何一条，可能具有至少80%序列同源性，至少85%序列同源性，至少90%序列同源性，至少95%序列同源性，至少97%序列同源性，或者至少99%序列同源性；或者来自于猿猴免疫缺陷病毒，其相对于猿猴免疫缺陷病毒Gag多肽氨基酸序列(在本文实施例中公开的)中的任何一条,其可能具有至少80%序列同源性，至少85%序列同源性，至少90%序列同源性，至少95%序列同源性，至少97%序列同源性，或者至少99%序列同源性。在其它实施方案中，所述Gag多肽来自于禽白血病 病毒，其相对于禽白血病病毒Gag多肽核酸序列(在本文实施例中公开的)，可能具有至少80 %序列同源性，至少85 %序列同源性，至少90 %序列同源性，至少95%序列同源性，至少97%序列同源性，或者至少99%序列同源性。在又一实施方案中，所述病毒样颗粒进一步包含哺乳动物糖基化。在又一实施方案中，其可以与在前的方面结合，所述方法进一步包括从介质中回收所述病毒样颗粒的步骤，所述真核细胞在所述介质中培养。在又一实施方案中，其可以与在前的实施方案或方面结合,所述表达载体可以是病毒载体。在又一实施方案中，其可以与在前的实施方案或方面结合，所述病毒载体可以选自腺病毒、疱疫病毒、痘病毒和反转录病毒。在又一实施方案中，其可以与在前的实施方案和方面结合，其包括病毒载体，所述病毒载体进一步包含转录调节因子，所述转录调节因子当所述病毒载体在助细胞中繁殖时下调所述呼吸道合胞病毒F多肽的表达；或者上调所述呼吸道合胞病毒F多肽在真核细胞中的表达。在某些实施方案中，所述转录调节因子可以是tet抑制子或者金属硫蛋白诱导的增强子。在又一实施方案中，其可以与在前的实施方案和方面结合，所述真核细胞可以选自=BHK细胞、VERO细胞、HT1080细胞、MRC-5细胞、WI38细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、293细胞、293T细胞、RD细胞、C0S-7细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、HUT细胞、SUPT细胞、C8166细胞、M0LT4/克隆8细胞、MT-2细胞、MT-4细胞、H9细胞、PMl细胞、CEM细胞、骨髓癌细胞、SB20细胞、LtK细胞、HeLa细胞、WI-38细胞、L2细胞、CMT-93、和 CEMX174 细胞。在又一实施方案中，其可以与在前的实施方案和方面结合，中和性的抗-RSV-F抗体可以与表达的呼吸道合胞病毒F多肽(证明所述呼吸道合胞病毒F多肽大体上是天然折叠的)结合。在又一实施方案中，其可以与在前的实施方案和方面结合，包括中和性的抗体，所述中和性的抗-RSV-F抗体是帕利珠单抗。另一方面包括治疗或者预防呼吸道合胞病毒感染的方法，其包括对受试者施用免疫原性量的所述药剂(通过任何在前那些方面的实施方案中得到的)、或者所述总体(通过任何在前的那些方面的实施方案的方法制备的)。又一个实施方案，其可以与任何在前的方面的实施方案结合，所述施用在所述受试者中引起保护性的免疫应答。又一个实施方案，其可以与任何在前的方面的实施方案结合，所述施用可以选自以下途径皮下给药、经皮给药、皮内给药、真皮下给药、肌内给药、经口给药、口服给药、鼻内给药、口腔给药、舌下给药、腹膜内给药、阴道内给药、直肠给药和颅内给药。另一方面包括药物组合物，其包含免疫原性量的所述药剂(通过任何在前那些方面的实施方案中得到的)、或者所述总体(通过任何在前的那些方面的实施方案的方法制备的)。又一个实施方案，其可以与任何在前的方面的实施方案结合，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的载体。另一方面包括提供保护免遭呼吸道合胞病毒感染的方法，其包括对受试者施用免疫原性量的所述药剂(通过任何在前那些方面的实施方案中得到的)、或者所述总体(通过任何在前的那些方面的实施方案的方法制备的)。又一个实施方案，其可以与任何在前的方面的实施方案结合，所述施用可以选自以下的途径皮下给药、经皮给药、皮内给药、真皮下给药、肌内给药、经□给药、□服给药、鼻内给药、□腔给药、舌下给药、腹膜内给药、阴道内给药、直肠给药和颅内给药。
前面所述的方面和关于其的实施方案可以进一步与本说明书中公开的任何实施方案结合。在整个详述的说明书中可以找到本文公开的所述组合物和方法的附加的方面，其可以被包含在任何前述的实施方案和/或附加的实施方案(在说明书中公开的)内。附图简述图I示出了 p3. 1-shFvl的质粒图谱。图2示出了 p3. l-shFv2的质粒图谱。图3示出了 p3. I-Gag的质粒图谱。图4示出了 RSV F和Gag表达载体转染的细胞上RSV表面表达的细胞计数分析。非-转染细胞和p3. I-Gag单独转染细胞表现出背景荧光水平。RSV F表达载体转染的细胞(有和没有p3. 1-Gag)，表现出显著的荧光水平，作为9C5单克隆抗体和荧光二级抗体检测F的结果。图5示出了在100，OOOxg沉淀中RSV F抗原活性的检测，其来自于RSV F基因转染的细胞介质(有和没有用Gag基因共转染)。图6示出了 p3. 1-bruGag的质粒图谱。图7示出了 p3. I-F-GPI的质粒图谱。图8 示出了 VLP(来自于 p3. 1-bruGag加 p3. I-F-GPI 转染)的 HIV-1 Gag 蛋白质印迹。“G”是指只表达bruGag。“F”是指只表达F-GPI。“I 1，”“3 1，”和“9 I”是指bruGag和F-GPI的比例。图9示出了 VLP (来自于p3. 1-bruGag加p3. I-F-GPI转染)的RSV F蛋白质印迹。“G”是指只表达bruGag。“F”是指只表达F-GPI。“I 1，”“3 1，”和“9 I”是指bruGag和F-GPI的比例。

图10示出了 SDS-PAGE和蛋白质印迹，其显示了在VLP (转染的293F细胞释放出的)中的bruGag和F-GPI产物。左边的平板示出了银染SDS-PAGE凝胶。右边的平板示出了蛋白质印迹。图11示出了 VLP (从编码bruGag和F-GPI的质粒转染后的293F细胞中释放出来)中的F抗原的ELISA检测。黑色圆圈是指bruGag+F-GPI VLP。暗灰色圆圈是指阴性对照。三角形是指RSV病毒阳性对照。图12示出了 p3. I-RSVFT的质粒图谱。图13示出了 SDS-PAGE和蛋白质印迹，其显示了在VLP (转染的293F细胞释放出的)中的bruGag和RSVFT产物。左边的平板示出了银染SDS-PAGE凝胶。右边的平板示出了蛋白质印迹。
图14示出了 VLP(从编码bruGag和RSVFT的质粒转染后的293F细胞中释放出来)中的F抗原的ELISA检测。黑色圆圈是指bruGag+F-GPIVLP。暗灰色圆圈是指阴性对照。三角形是指RSV病毒阳性对照。图15显示了电子显微镜负染的，VLP的蔗糖-结合型VLP(其来自质粒P3. 1-bruGag 和 P3. I-RSVFT 转染的 293F 细胞)。图16显示了空斑减数试验，其表明了在VLP接种的小鼠中，RSV-中和性抗体的应答。1-2列显示，通过分别使用对照Synagis和山羊抗RSV抗体，RSV的中和状态。3_4列显示,在天然小鼠血清中缺乏中和。5-10列显示，在VLP免疫的小鼠血清中可检测到中和活性。11-12列显示，没有抗体的对照和缺乏中和。图17 示出了 p3. 1-alvGag-dPR 的质粒图谱。图18 显示了通过 P3. 1-alvGag-DPR 和 P3. I-RSVFT 转染 293F 细胞后，ELISA 检测alvGagVLP上的F抗原假型。 图19显示酶联免疫吸附检测分别通过以p3. 1-alvGag-dPR和P3. I-RSVFT以及p3. 1-bruGag 和 p3. I-RSVFT 共转染 293F 细胞后，alvGagVLP 和 HIVGag VLP 上的 F 抗原假型。黑色圆圈是指RSV病毒阳性对照。暗灰色圆圈是指alvGag-dPR+FT(3 I)。下指三角形是指 alvGag-dPR+FT(3 I)，上指三角形是指 HIVGag+FT (3 I)。图20显示ELISA法检测通过P3. I-RSVFT和编码各种Gag产物的载体共转染来所产生的RSV F-假型F-VLP。黑色圆圈是指MPMV-Gag+FT。暗灰色圆圈是指BLV-Gag+FT。下指三角形是指EIAV-Gag+FT。上指三角形是指alvGag-dPR+FT。 图21显不编码完整al vGag多蛋白，具有完整反转录病毒蛋白酶活性的P3. 1-alvGag质粒图谱。图22显示细胞培养物中RSV F抗原活性的检测，其用p3. I-RSVFT,或者组合(p3. I-RSVFL与p3. 1-alvGag-dPR和/或p3. 1-alvGag)转染的细胞。通过超高速离心，从培养基中收集VLP，然后被固定在在过滤器底部ELISA平板。黑色圆圈是指Gag-dPR+FL(3 I)。暗灰色圆圈是指 Gag-dPR+FT (3 I)。下指三角形是指 Gag+FL (3 I)。上指三角形是指Gag+FT(3 I)。黑色正方形是指Gag-dPR+Gag+FL(10 : I : 3)。灰色正方形是指 Gag-dPR+Gag+FT(10 : I : 3)。灰色菱形是指 Gag-dPR+Gag+FL (3 I 1.3)。浅灰色菱形是指 Gag-dPR+Gag+FT (3 I 1.3)。图23示出了银染PAGE，其显示了在质粒p3. 1-alvGag-dPR和/或者p3. 1-alvGag转染之后，ALV Gag在沉淀VLP中的蛋白水解过程。所述泳道如下泳道
IalvGag-dPR+FL(3 I);泳道 2 :alvGag_dPR+FT (3 I);泳道 3 :alvGag+FL (3 I);泳道 4 alvGag+FT(3 I);泳道 5 alvGag-dPR+alvGag+FT (10 I 3);泳道 6 :alvGag-dPR+alvGag+FL (10 I 3);泳道 7 :alvGag_dPR+alvGag+FL (3 I I. 3);以及泳道 8 :alvGag_dPR+alvGag+FT(3 I 1.3)。图24示出了显示了电子显微镜负染的、VLP的蔗糖-结合型VLP(其来自质粒p3. 1-alvGag-dPR、p3. 1-alvGag 和 p3. I-RSVFT 以比例 10 I 3 转染的 293F 细胞)。图25示出了在对多个品种的小鼠用ALV Gag VLP假型(具有RSV“FT”和RSV“FL”)免疫时的(平板A) ELISA效价和(平板B)空斑减少效价。平板A :对固定在ELISA平板上的RSV病毒特异性的抗体效价。平板B :空斑减少中和性的效价。
图26示出了 p3. I-HSVgD的质粒图谱。图27示出了所述直接ELISA，其来自HSVgD-和alvGAG-dPR-转染HEK 293F培养物上层清液。图28示出了 HSVgD-和alvGAG_dPR-转染HEK 293F超高速离心(UC)沉淀的物质的免疫印迹。平板(A)和(B)都从左到右标准(分子量在左边显示)；A (转染#314-85，参见表I)，B (转染#314-85，参见表I)，C (转染#314-85，参见表I);标准；D (转染#314-91，参见表1)，E (转染#314-91，参见表1)，F (转染#314-91，参见表I)，以及G (转染#314-91，参见表I)。平板(A)显示了使用抗-HSVgD单克隆抗体的蛋白质印迹，以及(B)显示了使用的抗-P27alvGAG多克隆抗体蛋白质印迹。图29示出了样品C的两张电子显微照片p3. 1-alvGAG-dPR单独转染的HEK 293F超高速离心(UC)沉淀的物质。两张电子显微照片都具有500nm基准尺。 图30示出了样品D的5张电子显微照片p3. I-HSVgD单独转染的HEK 293F超高速离心(UC)沉淀的物质。所有电子显微照片都具有IOOOnm基准尺。所述实线箭头指大三角形或者折叠的颗粒 150-200nm。所述虚线箭头指较小的卵形到圆形的颗粒 90_120nm。图31示出了样品F的5张电子显微照片p3. I-HSVgD和p3. l-alvGAG-dPR(2. 3 I)转染的HEK 293F超高速离心(UC)沉淀的物质。上方的两张显微照片具有1000基准尺。图32 示出了 p3. I-SIVagmGag 的图谱。图33示出了从293F细胞释放出的VLP中F抗原的ELISA检测，其用编码SIVagmGag和RSVFT的质粒转染。图34 不出了 pShuttle-CMV-TO 的质粒图谱。图35 不出了 pShutt I e-ALV-Gag-dPR 的质粒图谱。图36不出了 pShuttle-TO-FL的质粒图谱。图37 不出了 pShuttle-dPR-TO-FL-rev 的质粒图谱。图38示出了(a) RSV F-假型VLP的可见带，其在所述30%和60%之间的蔗糖步骤梯度收集；以及(b)纯化的RSV F-假型VLP的SDS-PAGE分析，其由腺病毒载体转导的Veix)细胞制备。图39示出了 VLP的蛋白质印迹，其显示了 F抗原的存在。图40示出了 RSV F-假型VLP在最终VLP药剂中电子显微照片，其来自腺病毒载体转导的Vero细胞。图41示出了 RSV VLP免疫的棉鼠中的RSV中和性效价。图42示出了在免疫和攻击的棉鼠的肺中的病毒效价。图43示出了在免疫和攻击的棉鼠中，肺病理学范围(肺泡炎和间质性肺炎)。优选实施方案的详述本文公开的组合物和方法的多个方面包括(但不限制)1)嵌合VLP，其包括至少RSV-F多肽、和慢病毒或者a -反转录病毒Gag多肽；2)表达或者形成这种嵌合VLP (其可以在哺乳动物细胞表达系统中)的方法；3)进一步将这种VLP加工处理成疫苗组合物的方法，以及使用这种疫苗组合物的方法。在某些实施方案中，本文公开的嵌合VLP包含慢病毒或者a -反转录病毒Gag多肽、和呼吸道合胞病毒F多肽。本文公开的所述嵌合VLP的某些方面和实施方案,是基于意外的发现RSV_F多肽和许多反转录病毒的Gag蛋白共表达的导致VLP的量显著减少，其表明了 RSV-F多肽以某种方式干扰MLV Gag蛋白的出芽功能；所述反转录病毒的Gag蛋白包括鼠白血病病毒(murine leukemia virus)Gag 蛋白、梅森-菲舍猴病毒(Mason-Phizer monkey virus)Gag蛋白、牛白血病病毒(Bovine leukemia virus)Gag蛋白、和马传染性贫血病毒(Equineinfectious anemia virus)Gag蛋白。这种结果不取决于所述RSV-F多肽的胞质尾区和MLVgag之间的干扰，因为构建的所述RSV-F多肽的细胞外部通过受VLP形成干扰的GPI-锚固型标签被锚定到VLP。与此相反，如本文实施例所证明的，所述RSV-F多肽意外地不会干扰VLP (由劳氏肉瘤病毒Gag蛋白、禽白血病病毒Gag蛋白、猿猴免疫缺陷病毒Gag蛋白、或者人类免疫缺陷病毒Gag蛋白)的形成。在真核细胞中表达形成所述嵌合VLP的示例性方法，其具体的实施方案可以是酵、母、昆虫或者哺乳动物细胞，并且其可以包括附加的多肽抗原的共表达。公开的方法和协议的实施可以采用，除非另有说明，传统的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫技术，其均在本领域普通技术人员的能力范围以内。这些技术可以在文献中找到解释。参见，例如，J. Sambrook, E. F. Fritsch,和T. Maniatis, 1989,Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition，Books 1—3，Cold SpringHarbor Laboratory Press ；Ausubel, F. M.等.(1995 and periodic supplements ；Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N. Y.) ；B. Roe, J. Crabtree，和 A. Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing Essential Techniques， John Wiley&Sons ；J.M.Polak 和 James 0 丨 D.McGee，1990，In Situ Hybridization !Principles and Practice ；0xford University Press ；M. J. Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis A Practical Approach，IrlPress ;and，D.M.J. Lilley and J.E. Dahlberg，1992，Methods of Enzymology DNAStructure Part A !Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press.定义本文使用的“嵌合的VLP”是指使用慢病毒或者a -反转录病毒Gag多肽形成的病毒样颗粒，所述慢病毒或者a -反转录病毒Gag多肽可以和呼吸道合胞病毒F多肽同时表达。例如包括(但不限于)，VLP包含呼吸道合胞病毒F多肽(实质上缺少呼吸道合胞病毒F多肽的细胞质部分)或者呼吸道合胞病毒F多肽(实质上缺少呼吸道合胞病毒F多肽的跨膜区域和细胞质部分)，并且其和GPI锚连接。“哺乳动物糖基化”是指哺乳动物细胞表达系统形成的糖基化模式。这种糖基化模式不包括昆虫细胞制造的糖基化模式，其被修饰，包括哺乳动物糖基化酶，只要这些昆虫细胞仅仅制造“类哺乳动物的”糖基化，而不是糖基化模式(其将通过哺乳动物或者哺乳动物细胞天然制造，基于表达系统)。哺乳动物糖基化模式的非限定实施例包括在人类(例如，HEK 293，HeLa)、中国仓鼠卵巢(CHO)、狗(例如MDCK)、小鼠(mouse)(例如H9)、大鼠(rat)(例如IE)和非人灵长类(例如NCTC)细胞中表达的糖基化。本文使用的“Gag多肽”包括任何反转录病毒的Gag多肽，其来自于慢病毒(但是不包括EIAV)或者a -反转录病毒。本文描述的所述嵌合VLP的某些实施方案是由ALV或者HIV Gag多肽形成。反转录病毒基因组编码二种主要基因广物所述gag基因编码结构蛋白；所述pol基因编码反转录酶和相关的蛋白水解多肽、核酸酶和相关功能的整合酶；包膜蛋白基因(env)编码糖蛋白膜蛋白，其可以在转染细胞的表面上和在成熟释放的病毒颗粒的表面上检测到。所有反转录病毒的gag基因具有总体的结构相似性，在每组反转录病毒的之间的氨基酸水平是保守的。所述gag基因导致产生除了反转录酶以外的核心蛋白。对于MLV所述Gag前体多蛋白是Pr65Gag，并且其被分裂成4个蛋白，所述前体的顺序是NH2-pl5-ppl2-p30-pl0-C00H。所述分裂通过病毒蛋白酶调节，并且在病毒释放之前或之后发生(取决于所述病毒)。所述MLV Gag蛋白以糖基化的或者非糖基化的形式存在。所述糖基化形式是从gPrSO^剪切而来的，其是从定位在上游不同的框内起始密码子合成的，对于非糖基化的PreSeag是从AUG密码子合成的。MLV的缺失突变体(其不合成糖基化的Gag)仍然具有传染性，并且非糖基化的Gag仍然能形成病毒样颗粒，因此提高了糖 基化事件的重要性。病毒编码蛋白酶对pr55Gag的HIV-IGag前体的翻译后剪切产生N-十四烧基化(N-myristoylated)和内源性磷酸化pl7基质蛋白(pl7MA)、磷酸化p24衣壳蛋白(P24CA)和核壳体蛋白pl5 (pl5NC)(其被进一步剪切成p9和p6)。结构上地，所述原型Gag多蛋白被分成三种主要蛋白，其在反转录病毒gag基因中总是发生在相同的顺序发生基质蛋白(MA)(不与流感基质蛋白Ml混淆，它虽然具有相同的名称“基质”，但是其和MA是不同的蛋白)，衣壳蛋白(CA)、和核壳体蛋白(NC)。多蛋白加工成成熟蛋白，是由反转录病毒编码蛋白酶催化，它的发生如同新出芽病毒颗粒的成熟。功能上地，所述Gag多蛋白被分成三种主要蛋白膜结合蛋白，其将Gag多蛋白锚定在细胞膜上；相互作用区，其促进Gag聚合作用；和Iate结构域(late domain),其促进新生病毒从宿主细胞的释放。调节组装的Gag蛋白的形式是所述多蛋白。因此，所述组装区不需要整齐地设置在任何之后形成的剪切产物内部。关于这些重要的功能因子，目前的技术水平是非常先进的。参见，例如，Hansen 等 J. Virol 64，5306-5316，1990 ;Will 等，AIDS 5,639-654,1991 ；ffang 等 J. Virol. 72, 7950-7959,1998 ；McDonnell 等，J. Mol. Biol. 279，921-928，1998 ；Schultz 和 Rein, J. Virol. 63，2370-2372，1989 ；Accola 等，J. Virol. 72，2072-2078，1998 ；Borsetti 等，J. Virol. , 72,9313-9317,1998 ；Bowzard 等，J. Virol. 72，9034-9044，1998 ；Krishna 等，J. Virol. 72,564-577,1998 ；ffills 等，J. Virol. 68,6605-6618,1994 ；Xiang 等，J. Virol. 70，5695-5700，1996 ；Garnier 等，J. Virol. 73，2309-2320,1999。多肽的反转录病毒的来源的实施例包括a-反转录病毒(例如禽白血病病毒或者劳氏肉瘤病毒)，或者慢病毒(人类免疫缺陷病毒I型、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒和山羊关节炎脑炎病毒(但是不包括马传染性贫血病毒(Equine infectiousanemia virus))。a -反转录病毒(例如禽白血病病毒)含有它们的蛋白酶结构域作为Gag多蛋白(而不是所述Pol多蛋白)的组成部分，大多数其它反转录病毒通常也是这样。在本文中描述的组合物和方法中使用的Gag多肽实质上缺失C-末端蛋白酶结构域。本文使用的“脂後”是指细胞膜微结构域(cell membrane microdomain),在其中所述Gag多肽可以在病毒组装加工过程中集中，因此其可以作为整合附加的抗原(其与脂筏天然相关或者与脂筏相关多肽连接)的途径。本文使用的“VLP-相关多肽”是指任何多肽，其直接或者间接地和VLP相关，不包括任何包膜病毒核心形成多肽(其将干扰所述慢病毒或者a -反转录病毒Gag多肽)。本文公开的组合物和方法使用的特定VLP-相关多肽将取决于所述VLP的期望用途和所述VLP-相关多肽的作用(例如，将一种或多种附加抗原或者佐剂与所述VLP连接)。所述VLP-相关多肽可以是完整 的膜蛋白或者脂筏-相关部分，通过蛋白质修饰(例如脂修饰，其导致和膜相关)和所述VLP直接相关的蛋白或者部分，或者其通过脂筏-相关多肽与VLP间接相关的多肽。许多具有脂锚钩的脂蛋白与脂筏相关。通常这种蛋白的短片段对于脂肪连接是足够的，使得这些片段适合脂筏连接，因为这些片段(它们可能不会自身与脂筏天然连接)可以容易地与其它蛋白和多肽连接。将多肽和脂筏连接的脂锚钩包括GPI锚、豆蘧酰化、棕榈酰化和二乙酰化。许多不同类型的多肽和脂筏相关。脂筏在包括信号转导、膜运输、病毒进入、病毒组装和组装颗粒的出芽的生物活性过程中发挥平台功能，因此脂筏与多种在这些加工过程中关联的多肽相关。多种类型的与信号级联放大相关的多肽作为信号平台的与脂筏相关。一种脂筏类型，其作用是作为信号平台，被称为胞膜窖(caveolae)。它是质膜瓶形的内陷，其包含来自于窖蛋白家族(例如，窖蛋白和/或者阀蛋白)的多肽。膜运输多肽与作为膜运输平台的脂筏相关。实施例包括胞吞作用和胞吐作用相关的蛋白，例如突触融合蛋白-I (syntaxin-1)、突触融合蛋白-4 (syntaxin_4)、突触蛋白I (synapsin I)、内收蛋白(Adducin)、VAMP2、VAMP/小突触泡蛋白、小突触泡蛋白
II(synaptobrevin II)、SNARE 蛋白、SNAP-25、SNAP-23、突触接合蛋白 I (synaptotagminI)、突触接合蛋白II (synaptotagmin II)和类似的等等。病毒受体、受体-辅助受体复合物、以及其它有助于调节进入过程的成分都与脂筏相关，其作用是作为病毒进入的特定膜运输平台。脂筏-相关的病毒受体的实施例包括1)衰变加速因子(DAF或者CD55)，GPI-锚定的膜糖蛋白(其是许多肠病毒(Enteroviruses)的受体)；2) A组轮状病毒受体,含有多种成分的复合物,包括神经节苷脂(Ganglioside)、Hsc70蛋白、a 2-0 I和a 5-0 2整合蛋白；3)几种包膜病毒的糖蛋白，如HIV、MLV、麻疹和埃博拉病毒(埃博拉病毒)；和4)与HIV进入相关的多肽，如⑶5、CCR5和nef o 参见 Chazal 和 Gerlier, 2003, Virus Entry, Assembly, Budding 和 Membrane Rafts,Microbiol. & Mol. Bio. Rev. 67(2) :226_237。涉及病毒颗粒组装的多肽与起病毒组装平台功能的脂筏相关。只要删除利于病毒核壳体、衣壳或者核心的形成的部分，这些多肽或其部分可以作为VLP-相关多肽使用。这些多肽的实施例，包括HA和NA流感包膜糖蛋白，来自麻疹的H和成熟F1-F2融合蛋白，和来自 HIV 的 gpl60、gp41 和 Pr55gag。参见 Chazal 和 Gerlier, 2003, Virus Entry, Assembly,Budding, and Membrane Rafts, Microbiol. And Mol. Bio. Rev. 67(2) :226_237。涉及组装病毒的出芽的多肽与起病毒出芽平台功能的脂筏相。有数据表明HIV_1从宿主细胞出芽在膜後上发生。参见Chazal和Gerlier, 2003, Virus Entry, Assembly,Budding, and Membrane Rafts, Microbiol. And Mol. Bio. Rev. 67 (2) :226-237.关于多月太(涉及病毒出芽)的概括信息可以参见Fields Virology(4th ed.)2001。一些VLP-相关多肽包括病毒的多肽，例如红血球凝集素多肽、唾液酸苷酶多肽、融合蛋白多肽、糖蛋白多肽和包膜蛋白多肽。这些多肽的每一种可以是来自任何类型的病毒；尽管如此，某些实施方案包括来自于HIV-I病毒的包膜蛋白，来自于呼吸道合胞病毒或者麻疹病毒的融合蛋白，来自于呼吸道合胞病毒、单纯性疱疹病毒或者埃博拉病毒的糖蛋白，和来自于麻疫病毒的红血球凝集素蛋白。某些非-病毒的病原体VLP-相关多肽可以从s may be obtained from病原性的原生动物、寄生虫和其它真核微生物病原体；包括但不限制于疟原虫，例如恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)、三日痕原虫(Plasmodium malariae)、卵形痕原虫(Plasmodium ovale)、和间日痕原虫(Plasmodium vivax);刚地弓形虫(Toxoplasmagondii);布氏维虫(Trypanosoma brucei)、克氏维虫(Trypanosoma cruzi);埃及血吸虫(schistosoma haematobium)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum);杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani);小肠贾第虫(Giardia intestinalis);微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum);诸如此类等等。这些非-病毒的VLP-相关多肽可以在没有和抗原(其没有和脂筏天然连接)连接的情况下使用，因为所述VLP-相关多肽自身起抗原的作用。病毒的VLP-相关多肽(其可以被包括在所述嵌合VLP内)的实施例是红血球凝集素多肽。本文使用的所述“红血球凝集素多肽”来自于流感病毒蛋白，其介导病毒结合到被感染的细胞上。红血球凝集素多肽也可以来自于类似的麻疹病毒蛋白。所述蛋白是抗原糖蛋白，其通过跨膜结构域锚定到流感病毒的表面。至少16个亚型的流感红血球凝集素通过标记Hl至H16识别。H1、H2和H3在人类流感病毒中发现。发现具有H5或者H7红血球凝集素的高病原性禽流感病毒可以以较慢的速率感染人类。据报道，发现人类病人中禽病毒菌株的H5’类型红血球凝集素中的单个氨基酸存在变化，其改变了受体特异性；以允许H5红血球凝集素显著改变禽H5N1病毒的受体特异性，使它们具有与人类受体(109和110)结合的能力。这些发现解释了不能天然感染人类的H5N1病毒是如何成熟和有效感染人类细胞的。红血球凝集素是同源三聚体完整的膜多肽。所述跨膜结构域与脂筏结构域天然连接，其允许其与所述呼吸道合胞病毒F多肽连接以合并成VLP。它的形状像圆筒，并且大约135 A的长度。所述三个组成HA的相同单体形成中心卷曲螺旋(central coiled-coil)和球形头(spherical head),其含有暴露在所述VLP表面的唾液酸结合位点。HA单体作为单一的多肽前体合成，其被糖基化，并且被剪切成两个更小的多肽HA1和HA2亚单位。所述形成三聚体卷曲螺旋的HA2锚定在膜上，并且所述HAl亚单位形成球头。 如在某些本文公开的VLP中使用的作为VLP-相关多肽，所述红血球凝集素多肽至少包括所述膜锚定结构域。所述红血球凝集素多肽可以来自任何流感病毒类型、亚类型、菌种或者亚菌种，其例如可以来自所述HI、H2、H3、H5、H7和H9红血球凝集素。另外，所述红血球凝集素多肽是来自不同流感红血球凝集素的嵌合体。所述红血球凝集素多肽可以包括一种或多种附加的抗原(没有天然和脂筏相关)，其可以将一种或多种附加的多肽的编码序列剪切形成红血球凝集素多肽编码序列。附加多肽插入到所述红血球凝集素多肽的示例性位点是所述N-末端。
病毒VLP-相关多肽的又一实施例是唾液酸苷酶多肽。本文使用的所述“唾液酸苷酶多肽”来自于流感病毒蛋白，其通过分裂糖蛋白末端唾液酸残残基来调节从细胞中释放出流感病毒。所述唾液酸苷酶糖蛋白在病毒表面表达。所述唾液酸苷酶蛋白是四聚体，具有共同的结构，由球状头和￠-针轮(P-pinwheel)结构、细茎区和小疏水区(其通过单一的跨膜结构域锚定在病毒膜中的蛋白上)。唾液酸残基裂解的活性位点包括每个亚单位(由15个带电氨基酸形成)的表面的口袋，其在所有流感A病毒中使保守的。至少9个亚类型的流感唾液酸苷酶(标记NI至N9)已经被识别。 如在某些公开的VLP中使用的，所述唾液酸苷酶多肽将至少包括所述膜锚定结构域。目前相关功能区域技术的现状已经有很高的水平。参见,例如，Varghese等，Nature303，35-40，1983 ;Colman 等，Nature 303，41-44，1983 ;Lentz 等，Biochem，26，5321-5385，1987 ；ffebster等，Virol. 135，30-42，1984.所述唾液酸苷酶多肽可以来自于任何流感病毒类型、亚类型菌种或者亚菌种，其可以形成所述NI和N2唾液酸苷酶。另外，所述唾液酸苷酶多肽可以是不同流感唾液酸苷酶的嵌合体。所述唾液酸苷酶多肽可以包括一种或多种附加的抗原(不是天然和脂筏相连接)，其通过将一种或多种附加多肽的编码序列剪切成红血球凝集素多肽而形成。附加多肽插入到所述唾液酸苷酶多肽编码序列的示例性位点是所述C-末端。VLP-相关多肽的另一实施例是来自昆虫的粘附蛋白，称为成束蛋白I(FasI)。本文使用的所述“成束蛋白I多肽”来自于与胚胎发育有关的昆虫蛋白。这种非-病毒蛋白可以在昆虫细胞杆状病毒表达系统中表达，导致脂筏和FasI连接(J. Virol. 77，6265-6273，2003)。因此，随后异种抗原和成束蛋白I多肽的连接，将导致所述嵌合分子组装进VLP，当其和呼吸道合胞F多肽共表达时。如在本文公开的VLP中使用的所述成束蛋白I多肽应该至少包括膜锚定结构域。VLP-相关多肽的另一实施例是来自病毒的(来自RSV的)附着蛋白，称为G糖蛋白。本文使用的“G糖多肽”来自于RSV G糖蛋白。最新数据表明脂筏结构域对于RSV颗粒出芽是重要的，就如同它们对于流感病毒的重要性(Virol 327，175-185，2004 ；Arch.Virol. 149，199-210,2004 ；Virol. 300，244-254，2002)。所述来自 RSV 的 G 糖蛋白是 32. 5kD的完整膜蛋白，其在病毒附着蛋白中起作用，也作为RSV感染的保护性抗原。如同来自流感病毒的红血球凝集素，它的抗原性可以增强任何与它连接的非-脂筏抗原的抗原性。任何对所述G糖多肽的修饰(以非-脂筏外源抗原连接的方式)将导致嵌合VLP对外源抗原诱导产生显著的免疫应答。抗原本文公开的组合物和方法的某些方面包括与所述嵌合VLP相关的附加的抗原。这些附加抗原可以被包括在相同的组合物内，也可以进一步共价或非共价地与所述VLP连接。在某些实施方案中，所述Gag多肽对于嵌合VLP (含有呼吸道合胞病毒F多肽和/或者其它VLP-相关多肽)的形成，是容易适应的平台。这个部分描述了用于所公开的VLP的示例性抗原。抗原和VLP-相关多肽之间的连接键形成VLP (其含有与VLP非天然连接的抗原)的方式，是在所述呼吸道合胞病毒F多肽(和/或者其它VLP-相关多肽)和所述抗原之间形成连接键。所述VLP-相关多肽可以与单抗原或者多抗原连接，以增加所述VLP的免疫原性，赋予多种病原体免疫原性，或者赋予特异性病原体多种菌种的免疫原性。所述抗原和VLP-相关多肽之间的连接键可以是任何类型的连接键，足够导致所述抗原被整合进所述VLP。所述连接键可以是共价键、离子相互作用、氢键、离子键、范德华力、金属配体相互作用、或者抗体-抗原相互作用。在某些实施方案中，所述连接键是共价键，例如肽键、碳-氧键、碳-硫键、碳-氮键、碳-碳键或者二硫键。所述抗原的制备，可以是以和所述VLP-相关多肽存在连接键的状态下，即重组体的形式制备；也可以是以先以单独的物质制备，再随后通过连接键和所述VLP-相关多肽连接。抗原类型本文使用的所述抗原可以是能够产生免疫应答的任何物质，其和脂筏不是天然相关。抗原包括但不限于，蛋白、多肽(包括活性蛋白和蛋白内的单独多肽表位)、糖多肽、月旨 多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖(和其它分子)的肽或非肽类似物、小分子、脂质、糖脂类和碳水化合物。如果所述抗原没有天然地与VLP相关(直接或间接)，那么其将不会被整合进VLP内(没有与VLP-相关多肽连接)。所述抗原可以是任何暗示疾病或者失调的抗原，例如，微生物抗原(例如，病毒抗原、细菌的抗原、真菌的抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、酵母抗原等)，肿瘤抗原，过敏原等等。抗原来源本文描述的所述抗原可以化学方法或者酶方法地合成，以重组体方式产生，从天然来源或者前述的组合物分离出来。所述抗原可以被纯化的，部分纯化的，或者是天然的提取物。多肽抗原可以采用本技术领域蛋白质纯化的标准方法，从天然来源中分离出来，本技术领域蛋白质纯化的标准方法包括但不限于液相色谱法(例如，高效液相色谱法、快速蛋白液相色谱法等)，尺寸排阻色谱法，凝胶电泳(包括一维凝胶电泳、二维凝胶电泳)，亲和层析，或者其它纯化技术。在许多实施方案中，所述抗原是纯化的抗原，例如，从约50%至约75%纯度，从约75%至约85%纯度，从约85%至约90%纯度，从约90%至约95%纯度，从约95 %至约98 %纯度，从约98 %至约99 %纯度，或者高于99 %纯度。我们可以采用现有技术中已经熟知的固相多肽合成技术。参见Jones，TheChemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford) (1994) 一般来说，在这种方法中，肽的制备通过将活化的的单体单元顺序添加固相结合的生长肽链上。多肽制备可以采用已确立的DNA重组技术，在和所述脂筏相关的多肽相同的载体内，形成基因修饰的宿主细胞；在适宜的培养条件下，所述蛋白通过基因修饰的宿主细胞制备；在所述载体中，含有编码多肽的核苷酸序列的表达构建体被引入到宿主细胞(例如，在体外细胞培养物中作为单细胞实体生长的真核宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等)或者原核细胞(例如，在体外培养物中生长)中。病毒抗原合适的病毒抗原包括一种或多种下述组群相关的的(例如，合成得到的)病毒逆转录病毒科Retroviridae(例如人类免疫缺陷病毒，例如HIV_1(也称为HTLV-III、LAV或者HTLV-III/LAV、或者HIV-III);和其它分离种群，例如HIV-LP ;小核糖核酸病毒科Picomaviridae (例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)Aalciviridae(例如导致肠胃炎的菌种，包括诺沃克和相关病毒)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如登革病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；Coronoviridae (例如冠状病毒 coronaviruses) ；Rhabdoviradae (例如水抱性口 炎病毒、)狂犬病病毒)；Coronaviridae (例如冠状病毒 coronaviruses) ;Rhabdoviridae (例如水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如埃博拉病毒)；副黏液病毒科(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正黏液病毒(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(例如汉塔病毒Hantaan viruses、bunga viruses、白岭病毒phleboviruses和内罗病毒Nairo viruses);沙粒状病毒科Arena viridae (出血热病毒)；呼肠孤病毒科 Reoviridae (例如呼肠孤病毒 reoviruses、orbiviurses 和轮状病毒 rotaviruses)；Bimaviridae ;肝炎病毒科Hepadnaviridae (乙型肝炎病毒)；细小病毒科Parvovirida (细小病毒)；乳多空病毒科 Papovaviridae (papilloma viruses, polyoma viruses);腺病毒科Adenoviridae (大多数腺病毒)；抱疫病毒科Herpesviridae (单纯抱疫病毒(HSV) I和
2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒、Poxyiridae (天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪痕病毒)；和未分类病毒(例如海绵状脑病变的病原，D型肝炎的病原(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷性卫星)，非甲、非乙型肝炎(I类=内部输送；2类=非肠胃输送(即，丙型肝炎)的病因；和星状病毒。诺如病毒抗原本文公开的所述VLP可以包括多种来自诺如病毒科的抗原。诺如病毒，也称为“类诺沃克病毒”代表杯状病毒科(Caliciviridae virus family)中的四个属中的一种。在诺如病毒属内，有两个主要的基因组群，被分为小组I和小组II。小组I诺如病毒菌种包括诺沃克病毒、南安普顿病毒、沙漠风暴病毒和Chiba virus。小组II诺如病毒菌种包括Houston virus、夏威夷病毒、Lordsdale virus、Grimsby virus、Mexico virus和the SnowMountain agent (Parker, T. D ,等 J Virol. (2005) 79 (12) :7402-9 ;Hale, A. D ,等 J Clin.Micro. (2000)38(4) : 1656-1660)。诺沃克病毒(NV)是人类杯状病毒组的原型菌种，其是全世界急性病毒性肠胃炎的传染病爆发的主要原因。所述诺沃克病毒衣壳蛋白具有两个结构域外壳域(S)和突出域(P)。所述突出域P(aa 226-530，根据诺沃克菌种编号)被分成两个亚结构域，Pl和P2。所述P2域是在所述Pl域中的具有127aa的插入部分(aa 279-405)，并且被定位在所述折叠单体的最远端的表面。所述P2域是在诺如病毒菌种中最不保守的区域，并且所述P2内的高变异区被认为在受体连接和免疫活性方面起重要作用。假设所述P域定位在外表面，这是示例性的抗原或者多肽表位的来源(作为本文公开的所述VLP疫苗的抗原使用)。所述P2域是小组I或者小组II诺如病毒菌种的示例性抗原。又一个实施例是所述mAb 61. 21表位，最近被识别的，横卧在所述P2域(在诺如病毒菌种范围内保守)的范围内，如同所述 mAb 54. 6 表位一样(Lochridge, V. P.,等 J Gen. Virol. (2005)86 2799-2806)。流感抗原 本文所公开的VLP包括多种来自流感的抗原，包括但不限于红血球凝集素、唾液酸苷酶或者附加的流感抗原。附加流感抗原是所述M2多肽。所述流感病毒的M2多肽是小 的97氨基酸III类完整膜蛋白，其由RNA部分7 (基质部分)编码、在剪切事件后产生(80，81)。极少的M2存在于病毒颗粒上，但是可以发现较多的M2在被感染的细胞上。M2作为质子-选择性离子通道起作用，其对于病毒进入(82，83)是必要的。在感染或者传统的疫苗接种中具有最低限度的免疫原性，解释了它的保守性；但是当以替代的形式存在时，它更具有免疫原性和保护性(84-86)。这和对体外M2单克隆抗体的被动迁移的现象观察是一致的，其促进了病毒清理，同时产生保护(87)。当所述M2外部结构域表位连接到HBV核心颗粒(作为融合蛋白)，其在老鼠中是具有保护性的(包括通过非肠胃和鼻内注射的方式接种)；当三个串联复本被融合成所述核心蛋白的N-末端时，其具有最高的免疫原性(88-90)。这和其它半抗原载体数据时一致的，表明了表位密度增加，免疫原性也增加(91)。对于M2疫苗的鼻内给药，实现良好的保护需要佐剂，使 用LTR192G(88，90)和CTAl-DD(89)已经产生了良好的结果。所述多肽可以与载体通过化学方式连接，其在老鼠和其它动物中作为疫苗是具有保护性的(92，93)，所述载体例如KLH、或者脑膜炎双球菌的外膜蛋白复合物、或者人乳头状瘤病毒VLP。虽然M2蛋白高度保守，它不是完全没有序列差异。展示的普通菌种A/PR/8/34 (HlNl)和A/Aichi/68(H3N2)的M2胞外结构域表位可能和现代已测序菌种(除了A/Hong Kong/156/97 (H5N1) (92))，具有免疫活性反应。流感数据库序列的考察也表明，在所述其他更近的病原性的H5N1人类分离物(例如A/Vietnam/1203/04)中，具有相似的差异度。这一发现显示了，合并M2表位的H5-特异性流行疫苗将会对M2序列(其对所述病原性的禽类菌种是唯一的)有反应，而目前不是在人Hl和H3分离物中循环的M2序列。来自流感病毒(除了 HA、NA和M2)的附加蛋白，也可以被包含在所述VLP疫苗内，通过共表达，或者通过所有(或部分)附加抗原与呼吸道合胞病毒F多肽(或其它VLP-相关多肽)的连接。这些附加的抗原包括PB2、PB1、PA、核蛋白质、基质(M1)、NS1和NS2。这些后面的抗原通常不是中和性抗体的靶标，但是可以含有重要的表位(由T细胞识别)由VLP疫苗引起的对这种表位的T细胞应答可以被证明，其在促进保护性免疫反应方面是有益的。其它病原性抗原合适的细菌的抗原包括与(例如，合成的或者内生的)任何多种病原性细菌相关的抗原，包括，例如，病原性的革兰氏阳性细菌(例如病原性的PasteureIla species.Staphylococci species 和 Streptococcus species);和革兰氏阴性病原体(例如这些属Neisseria、Escherichia、Bordetella、Campylobacter、Legionella、Pseudomonas>Shigella、Vibrio、Yersinia、沙门 氏菌、Haemophilus、Brucella、Francisella 和Bacterioides)参见，例如，Schaechter, M, H. Medoff, D. Schlesinger, Mechanisms ofMicrobial Disease. Williams and Wilkins, Baltimore (1989)。与传染性病原性真菌相关的合适的抗原(例如，合成的或者内生的)包括与传染性真菌相关的抗原包括但不限于Cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum、Coccidioides immitis、 Blastomyces dermatitidis、 Candida albicans、 Candidaglabrata、Aspergillus fumigata、Aspergillus flavus和 Sporothrix schenckii。与病原性的原生动物、寄生虫和其它真核微生物病原体相关的合适抗原(例如，合成的或者内生的)，包括与原生动物、寄生虫和其它真核微生物病原体相关的抗原，包括但不限于 Plasmodium(例如 Plasmodium falciparum、Plasmodium malariae、Plasmodiumovale 和 Plasmodium vivax) ；Toxoplasma gondii ；Trypanosoma brucei、Trypanosomacruzi ；Schistosoma haematobium、Schistosoma mansoni、Schistosoma japonicum ；Leishmania donovani ；Giardia intestinalis ；Cryptosporidium parvum ;等等)。合适的抗原包括与病原性的微生物相关的抗原(例如，合成的或者内生的)，例如Helicobacter pyloris， Borelia burgdorferi， Legionella pneumophila，Mycobacteria sps (例如 M. tuberculosis、M. avium、M. intracellulare、M. kansaii、M. gordonae)，Staphylococcus aureus，Neisseria gonorrhoeae，Neisseriameningitidis， Listeria monocytogenes, Chlamydia trachomatis， Streptococcuspyogenes (Group A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Group BStreptococcus) , Streptococcus(viridans group)，Streptococcus faecalis，Streptococcus bovis, Streptococcus (需氧的菌种)，Streptococcus pneumoniae，病原性 Campylobacter sp.，Enterococcus sp.，Haemophilus inf luenzae，炭疽芽胞杆菌， Corynebacterium diphtheriae，corynebacterium sp.，Erysipelothrix rhusiopathiae，Clostridium perfringens， Clostridium tetani， Enterobacter aerogenes， Klebsiellapneumoniae， Pasturella multocida， Bacteroides sp. ， Fusobacterium nucleatum，StreptobaciIIus moniliformis，Treponema pallidium，Treponema pertenue，Leptospira, Rickettsia，和 Actinomyces israeli。病原性 E.coli 菌种的非限定性实施例是ATCC No. 31618、23505、43886、43892、35401、43896、33985、31619 和 31617。与细胞内病原相关的任意多种多肽或者其它抗原，可以被包含在所述VLP中。细胞内的病原体相关的多肽和肽表位是任何与细胞内病原体相关(例如，被编码)的多肽，其片段与MHC I类分子一起展示在感染细胞的表面，使其可以被识别，例如，被T细胞抗原受体结合在CD8+淋巴细胞的表面上。与细胞内的病原体相关的多肽和肽表位是现有技术中已知的，包括但不限于，与人类免疫缺陷病毒相关的抗原，例如HIV gpl20或者相关抗原性片段；巨细胞病毒抗原；分支杆菌抗原(例如，Mycobacterium avium、Mycobacteriumtuberculosis等等)；Pneumocystic car ini i (PCP)抗原；痕疾抗原，包括但不限于与Plasmodium falciparum或者其他任何痕疾种类相关的抗原，例如41_3、AMA-U CSP>PFEMP-1、GBP-130、MSP-1、PFS-16、SERP 等等；真菌抗原；酵母抗原(例如，Candida spp.抗原)；弓形虫抗原，包括但不限于与Toxoplasma gondii>Toxoplasma encephalitis或者任何其它弓虫属物种相关的抗原；Epstein-Barr病毒(EBV)抗原；Plasmodium抗原(例如，gpl90/MSPl，等等)；等等。又一种VLP疫苗可以指针对炭疽芽胞杆菌的。所述炭疽芽胞杆菌是需氧的或者兼氧的革兰氏阳性、不运动的杆菌(I. 0 y m宽和3. 0-5. 0 y m长)。在相反的条件下，来自高度抗内生孢子的炭疽芽胞杆菌，其可以在土壤中的某些(感染动物先前死亡的)地方找至IJ。本文公开的VLP疫苗中使用的抗原是保护性抗原(PA)，一个83kDa的蛋白质，其和哺乳动物细胞上的受体结合，对炭疽芽胞杆菌致病的能力非常重要。又一抗原是炭疽芽胞杆菌PA的C-末端140氨基酸片段，在受试者中使用可以引起对抗炭疽芽胞杆菌的保护性免疫。其它在对抗炭疽病的VLP疫苗中使用的示例性的抗原是来自所述炭疽病孢子(例如BclA)的抗原，来自生长阶段细菌的抗原(例如，细胞壁抗原，荚膜抗原(例如，多聚-Y-D-氨基戊二酸或者PGA)，分泌抗原(例如，外毒素，例如保护性抗原、致死因子或者水肿因子)。在VLP疫苗中使用的又一是含有anthrose的四糖,其对炭疽芽胞杆菌(Daubenspeck J. M.,等J. Biol. Chem. (2004)，279 :30945)是唯一的。所述四糖可以和VLP-相关多肽结合，允许所述抗原联合所述VLP疫苗。肿瘤相关抗原任意的多种已知肿瘤特异性抗原或者肿瘤相关抗原(TAA)可以被包含在所述VLP内。可以使用，但不是必须使用完整的TAA。作为替代的，TAA的部分，例如，表位可以被使用。可以在VLP中使用的肿瘤相关抗原(或者含有表位及其相关的片段)，包括但不限于MAGE-2、MAGE-3、MUC-1、MUC-2、HER-2、高分子重量黑素瘤-相关抗原MAA、⑶2、癌胚抗原(CEA)、TAG-72、卵巢-相关抗原 0V-TL3 和 M0V18、TUAN、a -胎蛋白(AFP)、OFP、CA-125、CA-50、CA-19-9、肾脏肿瘤相关抗原G250、EGP-40 (也被称为EpCAM) ,SlOO (恶性黑素瘤-相关抗原)、p53和p21ras。可以使用合成的任意TAA(或者其相关表位)的类似物，包括任意前述的。此外，一种或多种TAAs (或者其相关表位)的组合可以被包含在所述组合物中。讨敏原 在一个方面中，所述抗原(作为所述VLP疫苗的部分)可以是多种过敏原的任意一种。可以使用基于疫苗的过敏原，在受试者中引起对所述过敏原的耐受性。过敏原疫苗(包括和酪氨酸共沉淀的)的实施例可以在美国专利号3，792，159，4，070，455和6, 440, 426 中找到。多种过敏原的任意一种可以被包括在VLP中。过敏原包括但不限于环境气源性致敏原；植物花粉(例如豚草过敏/花粉过敏)；杂草花粉过敏原；草类花粉过敏原Johnsongrass ;树花粉过敏原；黑麦草；蛛形纲动物过敏原，例如粉尘螨过敏原(例如,Der p I,Derfl等)；仓储螨过敏原；柳杉花粉/花粉过敏；霉菌孢子过敏原；动物过敏原(例如狗、豚鼠、仓鼠、沙鼠、胎鼠、小鼠等等过敏原)；食物过敏原(例如甲壳类动物过敏原、坚果、例如花生、柑橘类水果)；昆虫过敏原；毒液(膜翅目昆虫，小黄蜂、蜜蜂、黄蜂、大黄蜂、火蚁)；其它来自蟑螂、跳蚤和蚊子等的环境过敏原；细菌性过敏原(例如链状球菌抗原)；寄生虫过敏原(例如蛔虫属抗原；病毒抗原)；真菌孢子；药物过敏原；抗生素；青霉素类和相关的混合物；其它抗生素；完整蛋白(例如激素(胰岛素)，酶(链激酶))；所有药物和它们的可以作为不完全抗原或者半抗原的代谢物；工业化学制品和能够作为半抗原和致敏原的代谢物(例如酸酐(例如偏苯三酸酐)和异氰酸酯(例如甲苯二异氰酸酯))；职业性过敏原(例如面粉(例如，导致面包师哮喘的过敏原))、蓖麻子、咖啡豆、和上文描述的工业化学制品；跳蚤过敏原；和在非人动物中的人类蛋白。过敏原包括但不限于细胞、细胞提取物、蛋白、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其它分子的肽和非肽类似物、小分子、脂质、糖脂类和碳水化合物。特异性的天然、动物和植物过敏原的实施例包括但不限于对以下属特异性的蛋白Canine(Canis familiaris) ；Dermatophagoides (例如 Dermatophagoidesfarinae) ；Felis(Felis domesticus) ；Ambrosia(Ambrosia artemiisfolia ；Lolium(例如 Lolium perenne 或 Lolium multiflorum) ；Cryptomeria(Cryptomeria japonica)；Altemaria(Altemaria altemata) ；Alder ；Alnus(Alnus gultinoas) ；Betula(Betulaverrucosa) ；Quercus(Quercus alba) ；01ea(Olea europa) ；Artemisia(Artemisiavulgaris) ；Plantago (例如 Plantago lanceolata) ；Parietaria(例如 Parietariaofficinalis 或者 Parietaria judaica) ；Blattella(例如 Blattella germanica)；Apis(例如 Apis multif lorum) ;Cupressus (例如 Cupressus sempervirens、Cupressusarizonica 和 Cupressus macrocarpa) ；Juniperus (例如 Juniperus sabinoides、Juniperus virginiana、Juniperus communis 和 Juniperus ashei) ；Thuya(例如Thuya orientalis) ;Chamaecyparis (例如 Chamaecyparis obtusa) ;Periplaneta (例如Periplaneta americana) ；Agropyron (例如 Agropyron repens) ；Secale(例如 Secalecereale) ;Triticum(例如 Triticum aestivum) ;Dactylis (例如 Dactylis glomerata)；Festuca(例如 Festuca elatior) ；Poa(例如 Poapratensis 或者 Poa compressa)；Avena (例如 Avena sativa) ；Holcus(例如 Holcus lanatus) ；Anthoxanthum(例如Anthoxanthum odoratum) ;Arrhenatherum(例如 Arrhenatherun elatius) ;Agrostis (例如 Agrostis alba) ；Phleum (例如 Phleum pratense) ；Phalaris (例如 Phalarisarundinacea) ;Paspalum(例如Paspalum notatum) ;Sorghum(例如Sorghum halepensis)；和 Bromus (例如 Bromus inermis)。、
从哺乳动物细胞制备嵌合VLP的示例性方法嵌合VLP可以由本领域技术人员通过任何方法制备得到。嵌合VLP包括慢病毒或者a-反转录病毒Gag多肽，其是具有所述RSV-F多肽的VLP形成的原因。另外，所述嵌合VLP可以包括一种或多种附加的多肽，例如膜-相关(包括脂筏相关)的多肽，其提供附加的抗原(除了那些作为所述一种或多种多肽的部分、天然或者人工地存在的，并成为所述VLP或者所述RSV-F多肽的形成原因)。在某些实施方案中，所述多肽可以在任意可行的蛋白表达系统中共表达，所述蛋白表达系统包括，例如基于哺乳动物细胞的系统(其包括在质膜内的脂筏结构域。VLP的多肽的重组表达包括表达载体,所述表达载体含有编码一种或多种多肽的多核苷酸。一旦获得编码一种或多种多肽的多核苷酸，所述制备多肽的载体可以通过DNA重组技术(使用本领域技术人员已知的技术)获得。因此，本文公开了通过表达多核苷酸(含有任意的所述VLP编码-多肽的核苷酸序列)，来制备蛋白的方法。在本领域技术人员中已经知道的方法可以用来构建表达载体，所述表达载体含有所述VLP多肽编码序列和转录、翻译控制信号。这些方法包括，例如，体外DNA重组技术、合成技术和体外基因重组。因此，公开的这些方法和组合物提供了可复制载体，其包含编码慢病毒或者a-反转录病毒Gag多肽的核苷酸序列、和编码呼吸道合胞病毒F多肽(和任选的一种或多种附加的VLP-相关多肽)的核苷酸序列，所有序列都可行地与一个或多个启动子连接。本文公开的用来表达序列(组装在的VLP内部)的载体的非限定性例子包括基于病毒的载体(例如反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、痘病毒和杆状病毒)，质粒载体，非病毒载体，哺乳动物载体，哺乳类人造染色体(例如脂质体、微粒载体等等)，及其相关组合。所述表达载体典型地含有编码序列和表达控制元件，其允许编码区在合适的宿主中表达。所述控制元件通常包括启动子、增强子、外显子、内含子、剪切位点翻译起始密码子、翻译和转录终止序列、以及将插入片段引入到所述载体的插入位点。翻译控制元件被M. Kozak 论述过(例如，Kozak,M. ,Mamm. Genome 7 (8) :563-574,1996 ；Kozak,M. ,Biochimie76(9) :815-821,1994；Kozak, M. ， J Cell Biol 108(2) :229-241,1989 ；Kozak, M. ， andShatkin, A. J.，Methods Enzymol 60 :360-375,1979)。例如，用于哺乳动物细胞表达的典型启动子包括SV40早期启动子，CMV启动子(例如立即启动子，CMV启动子可以包括内含子A)，RSV, HIV-LTR，小鼠乳瘤病毒LTR启动子(MMLV-LTR)，FIV-LTR，所述腺病毒主要后期启动子(Ad MLP)和单纯疱疹病毒启动子等等。其它非病毒启动子，例如来自于小鼠金属硫蛋白基因的启动子，也可以用于哺乳动物表达。典型地，也会存在转录终止和聚腺苷酸化序列，其定位在所述翻译终止密码子的3'。也存在翻译起始的优化序列，其定位在编码序列的5'。转录终止子/聚腺苷酸化信号的实施例包括来自于SV40 (如在Sambrook，等中描述的)和上文所述的牛生长激素中值序列一样。如本文所述，含有剪接供体和受体位点的内含子，也可以设计在构建体中(Chapman等，Nuc. Acids Res. (1991) 19:3979-3986)。本文也可以使用增强子元件来增加构建体的表达水平，例如在哺乳动物宿主细胞中。实施例包括SV40早期基因增强子(描述参见于Dijkema等，EMBO J. (1985)4 :761)、来自于劳氏肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子(描述参见于Gorman等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79 :6777)和来自人类 CNV 的元件(描述参见于 Boshart等，Cell (1985)41 :521,例如在所述CMV内含子A序列中包含的元件(Chapman等,Nuc.Acids Res. (1991) 19:3979-3986))。非常明显，本文描述的载体可以含有一种或多种序列。例如，单一的载体可以携带编码所有(所述VLP中的)蛋白的序列。可选择的，可以使用多种载体(例如，多种构建体，每种编码单一多肽-编码序列；或者多种构建体，每种编码一种或多种多肽-编码序列)。在实施方案中，其中单一载体包含多个多肽-编码序列，所述序列可以在相同的载体内、可行地与相同或者不同的转录控制元件(例如启动子)连接。另外，一种或多种编码非-RSV蛋白的序列可以被表达，和被组装进所述VLP，包括但不限于，包含和/或者编码免疫调节分子(例如，下文描述的佐剂)的序列，例如免疫调节的寡核苷酸(例如CpGs)、细胞因子、解毒的细菌毒素等等。 所述表达载体可以通过传统技术被转移到宿主细胞和转染细胞，然后通过传统技术培养，以制备所述VLP多肽。因此，本文公开的所述组合物和方法包括宿主细胞(含有编码一种或多种VLP多肽的多核苷酸，其可行地和异种启动子连接)。在某些形成VLP的实施方案中，编码慢病毒或者a -反转录病毒Gag多肽、所述呼吸道合胞病毒F多肽、和任选的一种附加的VLP-缔合抗原或者VLP-相关多肽(其与附加的抗原或者佐剂连接的)的载体，可以在形成VLP的宿主细胞中共表达，详细描述见下文。所述VLP可以在真核细胞中制备，例如哺乳动物细胞，之前经过转染、建立连续的细胞株(使用现有技术中已知的标准是操作流程)、和/或者被DNA分子(其携带目标RSV基因)感染。通过对真核或病毒启动子的序列优化，所述VLP形成需要的蛋白表达水平被最大化，所述启动子启动选定基因的转录。所述VLP从培养基释放，其所述VLP被纯化、然后被制备成疫苗。所述VLP是没有感染力的疫苗，因此,不需要活化疫苗。从本文描述的序列中表达慢病毒或者a-反转录病毒Gag多肽、并使其自组装进VLP(在表面上存在抗原性蛋白)的能力，使得可以(通过将预期基因共同导入)在任意的宿主细胞中制备这些VLP。在多种组合物中的所述序列(例如，在一种或多种表达载体内)可以稳定地和/或者短暂地整合进宿主细胞。
合适的宿主细胞包括但不限于细菌、哺乳动物、昆虫、酵母、植物和非洲爪蟾属细胞。例如，在现有技术中已知多种哺乳动物细胞株，其包括原代细胞、和(从美国模式培养物集存库(A. T. C. C.)获得的永久细胞株，例如但不限于，BHK、VERO, HT1080、MRC-5、WI 38、MDCK, MDBK、293、293T、RD、COS-7, CHO, Jurkat, HUT、SUPT、C8166、M0LT4/ 克隆 8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM、骨髓癌细胞(例如 SB20 细胞)、LtK、HeLa、WI-38、L2、CMT-93 和CEMX174(例如可以从A. T. C. C.获得的细胞株)。相似地,细菌宿主(例如E. coli、Bacillus subtilis 和 Streptococcus spp.)可以用于目前存在的表达构建体。本文公开的有用的酵母宿主尤其包括Saccharomyces cerevisiae、Candidaalbicans、Candida maltosa、Hansenula polymorpha> Kluyveromyces· fragilis、Kluyveromyces lactis、Pichia guiIlerimondii>Pichia pastoris>Schizosaccharomycespombe 和 Yarrowia lipolytica。 真菌宿主包括例如Aspergillus。杆状病毒表达载体使用的昆虫细胞尤其包括Aedes aegypti、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、 Spodoptera frugiperda 和 Trichoplusia ni.See。 Latham& Galarza(2001)J. Virol. 75 (13) :6154-6165 ;Galarza 等(2005)Viral. Immunol. 18(1)244-51 ;和美国专利出版物 200550186621 和 20060263804。假设本公开稳定地组装成一种或多种编码所述VLP的呼吸道合胞病毒F多肽的序列(表达载体)，那么表达上文描述的一种或多种序列的细胞株，可以很容易地形成。调节稳定完整所述呼吸道合胞病毒F多肽序列的启动子可以是组成型的或者诱导型的。嵌合VLP-生产细胞株的母本细胞株选自任意上文描述的细胞，包括例如哺乳动物的、昆虫、酵母、细菌细胞株。在某些实施方案中，所述细胞株是哺乳动物细胞株(例如293、RD、C0S-7、CH0、BHK、VER0、MRC-5、HT1080和骨髓癌细胞)。采用哺乳动物细胞的嵌合VLP制备提供了 (i)VLP形成；(ii)校对十四烷基化、糖基化和出芽；(iii)非-哺乳动物细胞污染物的缺失；和(iv)缓慢纯化。除了创建细胞株外，慢病毒或者a -反转录病毒Gag-和RSV F-编码序列可以在宿主细胞中暂时表达，伴随或不伴随附加的抗原或者佐剂。合适的重组表达宿主细胞系统包括但不限于，现有技术中已知的细菌的、哺乳动物的、杆状病毒/昆虫、牛痘、塞姆利基森林病毒(SFV)、腺病毒、甲病毒属(例如Sindbis病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE))、哺乳动物、酵母和非洲爪蟾表达系统。示例性的表达系统是哺乳动物细胞株、牛痘、Sindbis病毒、昆虫和酵母系统。许多合适的表达系统是可以通过商业方式获得的，包括，例如如下杆状病毒表达(Reilly, P. R.，等，BACUL0VIRUS EXPRES SION VECTORS A LABORATORY MANUAL(1992)；Beames,等，Biotechniques 11 :378(1991) ；Pharmingen ；Clontech, Palo Alto, Calif.),牛痘表达系统(Earl, P. L ,等，Expression of proteins in mammalian cells usingvaccinia" In Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel,等Eds. ),GreenePublishing Associates & Wiley Interscience, New York (1991) ；Moss, B.，等，美国专利号 5，135，855，在 1992 年 8 月出版)，在细菌中表达(Ausubel,F. M.，等，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Inc.，Media Pa. ;Clontech)，在酵母中表达(Rosenberg，S，and Tekamp-Olson，P.，美国专利号 RE35, 749，1998 年 3 月 17 日公布，此处通过参考方式并入；Shuster, J. R.，美国专利号5，629，203，1997年5月13日出版，此处通过参考方式并入；Gellissen,G.,等，Antonie Van Leeuwenhoek, 62 (1-2) :79-93(1992)；Romanos, M. A.,等,yeast 8(6) :423-488 (1992) ；Goeddel, D. V.，Methods in Enzymology185 (1990) ;Guthrie, C.,和 G. R. Fink,Methods in Enzymology 194 (1991)),在哺乳动物细胞中表达(Clontech ;Gibco_BRL, Ground Island, N. Y.;例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株(Haynes, J.，等，Nuc. Acid. Res. 11 :687-706(1983) ;1983，Lau，Y. F.，等，Mol. Cell. Biol. 4 1469-1475(1984) ；Kaufman,R. J. , " Selection and coamplification of heterologousgenes in mammalian cell, " in Methods in Enzymology,vol. 185,pp 537-566. AcademicPress, Inc. , San Diego Calif. (1991)),以及在植物细胞中表达(plant cloning vectors,Clontech Laboratories, Inc. , Palo—Alto, Calif. , and Pharmacia LKB Biotechnology,Inc.，Pistcataway, N.J. ；Hood, E.，等，J. Bacteriol. 168 :1291-1301 (1986) ;Nagel, R.，等，FEMS Microbiol. Lett. 67 :325(1990) ;An,等，"Binary Vectors" , and others in Plant Molecular Biology Manual A3 :1-19 (1988) ;Miki，B. L. A.，等，pp. 249-265，以及植物 DNA 致病源中的其他(Hohn, T.,等,eds.) Springer-Verlag, Wien, Austria, (1987)；Plant Molecular Biology Essential Techniques, P.G. Jones and J. M. Sutton, NewYork, J. Wiley, 1997 ；Miglani,Gurbachan Dictionary of Plant Genetics and MolecularBiology, New York, Food Products Press,1998 ；Henry, R. J. , Practical Applicationsof Plant Molecular Biology, New York, Chapman & Hall, (1997)。当含有改变基因(其编码VLP必需的蛋白)的表达载体被导入到宿主细胞中，然后以必须的水平表达时，所述VLP组装并随后从细胞表面释放到培养基中。根据所述表达系统和选定的宿主，所述VLP通过生长的宿主细胞制备，所述宿主细胞由表达载体在一定条件下转化；该条件下，所述颗粒形成多肽被表达，同时形成VLP。所述适宜的生长条件的选择是在现有技术中已知的。所述颗粒然后通过保持其完整性的方法分离(或者大体纯化)，例如密度梯度离心和标准纯化技术；所述密度梯度离心例如蔗糖梯度、PEG-沉淀、制粒等等(参见例如，Kimbauer等J. Virol. (1993)67 :6929-6936);所述标准纯化技术包括例如，离子交换和凝胶过滤层析。在VLP中的致病源的失活的示例性方法失活的示例性方法是电磁辐射，因为电磁辐射能够使致病源失活的同时，基本不减少嵌合VLP的免疫原性。所有三种示例性的电磁辐射模式(即，光活性复合物的UV辐射、单独的UV辐射和Y辐射)具有较长的使在多种样品中的致病源失活的使用历史，所述多种样品例如血液、食物、疫苗等。商业途径可以得到的电磁辐射设备有很多，应用这些设备可以在很少改动的情况下实行本文公开的方法。此外，对波长和剂量的优化是现有技术的常规方法，因此其对于本领域技术人员是容易的。光活性复合物的UV辐射电磁辐射失活的示例性方法是紫外线辐射联合使用光活性复合物；所述紫外线辐射例如UV-A辐射；所述光活性复合物例如可以在致病源中与多核苷酸反应的光活性复合物。
示例性的光活性复合物包括放射菌素、蒽环酮、氨茴霉素、苯吡喃酮类、芴、芴酮、呋喃香豆素、丝裂霉素、monostral fast blue、norphillin A、菲唆、phenazathionium 盐、吩嗪、吩噻嗪、叠氮基苯、喹啉和硫代咕吨酮。一种是呋喃香豆素，其属于两种类别中的一种。第一种类别是补骨脂素[7氢-呋喃(3，2-g)_(I)-苯并吡喃-7-酮或者6-羟基-5-苯并呋喃丙烯酸delta-内酯]，是线型的，其中连接在中心芳香部分的两个氧残基具有1，3方向，进一步的其中呋喃环部分与所述两个香豆素环系统的6位点连接。所述第二种类别是异补骨脂素[2氢-呋喃(2，3-h)_(I)-苯并吡喃-2-酮或者4-羟基-5-苯并呋喃丙烯酸S-内酯]，是角型的，其中连接在中心芳香部分的两个氧残基具有1，3方向，进一步的其中呋喃环部分与所述两个香豆素环系统的8位点连接。通过对线型呋喃香豆素，在3、4、5、8、4'或者5'位点进行取代，可以形成补骨脂素衍生物；同时通过在角型呋喃香豆素在
3、4、5、6、4'或者5位点进行取代，可以形成异补骨脂素。在吸收长波紫外线(UVA)后，补骨脂素可以添加设置在双链核苷酸的碱基对之间，形成嘧啶碱基的共价加合物。参见，例如，G. D. Cimino 等,Ann. Rev. Biochem. 54 :1151 (1985) ；Hearst 等,Quart. Rev. Biophys. 17 1(1984)。UV辐射(或者在一些例子中，是可见光)的示例性波长，在该波长下，光加合物(其依赖于光化学活性)可以形成。举例的方式例如，波长在320和380nm之间的UV辐射对许多补骨脂素是有效的，其中330至360nm具有最大的有效性。单独的UV辐射除了在光活性复合物存在时的UV辐射，致病源可以使用单独的UV辐射失活。在某些实施方案中，所述辐射是UVC辐射，其具有波长在约180和320nm之间、或者在约225和290nm之间、或者约254nm(即，多核苷酸的最大吸收峰)。可以使用UVC辐射，因为它对所述(本文公开的)嵌合VLP的组成成分在稳定性和免疫原性方面的危害均较小，例如对于形成包膜的脂质双分子层，同时保留有充足的能量使致病源失活。尽管如此，UV辐射的其它类型，例如UVA和UVB也可以使用。y 辐射可以使用Y辐射(S卩，电离辐射)，来实行本文公开的方法，以形成所述组合物。Y辐射可以通过使编码致病源基因组的多核苷酸链断裂、或者形成攻击多核苷酸的羟基自由基，从而使致病源失活。使用嵌合VLP的示例性方法制剂本文描述的嵌合VLP的示例性用途是制备疫苗药剂。典型地，这种疫苗制备成可注射的液体溶液或者悬浮液；也可以制备成固体形式(适合注射前溶解或悬浮在液体内)。这种药剂可以被乳化或者制备成干粉。所述活性免疫原性成分通常被与药学上可接受并且与所述活性成分协调的赋形剂混合。合适的赋形剂是，例如，水、盐水、葡萄糖、蔗糖、甘油、乙醇或者诸如此类，及其组合。另外，如果期望，所述疫苗可以含有辅助物质，例如加湿剂或者乳化剂、PH缓冲剂或者可以增强疫苗效果的佐剂。疫苗可以通过传统的非肠胃的方式注射施用，例如皮下给药、皮内给药、真皮下给药或者肌内给药。适合施用其它模式的其它制剂包括栓剂，在某些实施例中，以口服的、鼻内的、口腔的、舌下的、腹膜内的、阴道内的、直肠的和颅内的方式施用的制剂。对于栓剂，传统的结合者和携带者可以包括，例如聚烷撑二醇或者甘油三酯；这些栓剂可以从混合物中形成，其含有活性成分，其范围是0.5%至10%、或者甚至1-2%。在某些实施方案中，低熔点的蜡，例如首先将脂肪酸甘油酯或可可油的混合物熔化，然后使本文公开的所述嵌合VLP均匀分散，例如通过搅拌。所述熔化的均匀的混合物然后被倾倒到合适大小的模制品中，允许其冷却和凝固。适合鼻内给药的制剂包括液体(例如，作为喷雾剂或者滴鼻剂施用的水性溶液)和干粉(例如用于在鼻内通道快速沉积)。制剂包括正常采用的赋形剂，例如制药学等级的甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇和壳聚糖。可以使用Mucosadhesive试剂，例如在液体或者干粉制剂中的壳聚糖，以延迟鼻内施用制剂的黏液纤毛清除。例如甘露醇和蔗糖的糖类，可以作为液体制剂的稳定剂，在干粉制剂中作为稳定剂、膨胀剂、或者粉末流动剂和浸润剂。另外，佐剂，例如单磷酰脂A(MPL)或者CpG寡核苷酸，可以作为免疫刺激的佐剂在液体或干粉制剂中使用。适合口服给药的制剂包括液体、固体、半固体、凝胶、片剂、荚膜、锭剂等等。适合口服给药的制剂包括片剂、锭剂、荚膜、凝胶、液体、食用产品、饮料、功能食物等等。制剂包括 正常使用的赋形剂，例如制药学等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。其它嵌合VLP疫苗陈分可以采用的形式有溶液、悬浮液、药片、持续释放的制剂或者干粉，并且含有10-95%或者25-70%的活性成分。对于口服制剂，霍乱毒素是有趣的制剂组合(也是可能的缀合物组合)。所述嵌合的VLP疫苗当制备成以阴道方式施用时，可以采用的形式有阴道药栓、棉塞、霜剂、凝胶、糊状物、泡沫剂或者喷雾剂。任何前述的制剂可以含有除了嵌合VLP以外的试剂，例如现有技术已知的载体。在某一些实施方案中，所述嵌合的VLP疫苗可以制备成全身或者局部给药的制齐U。这种制剂在现有技术中是已知的。非肠胃载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、林格氏乳酸盐或者不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如这些基于林格氏葡萄糖的)等等。全身的和局部的施用途径包括，例如，皮肤内的、点滴法、静脉注射、肌肉内的等等。所述嵌合VLP可以被制备成疫苗，包括中性或者盐基制剂。药学上可接受的盐包括(与肽的游离氨基形成)和与无机酸形成的酸式盐，例如盐酸或者磷酸，或者有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等。与游离酰基形成的盐可以来自于无机碱，例如钠、钾、铵、钙或者氢氧化铁；和有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。所述疫苗可以以和制剂剂量协调的方式施用，所述剂量的量在治疗上是有效的和具有免疫原性的。被使用的量取决于被治疗的受试者，包括，例如，个体的免疫系统引起免疫应答的能力和预期保护的程度。合适的剂量范围是每次接种疫苗几百微克的数量级，示例性的范围如从约0. I ii g至2000 ii g(甚至更高的量，考虑I-IOmg范围)，例如范围从约0. 5 ii g至1000 u g，或者甚至范围从I y g至500 ii g或者在范围从约10 ii g至100 ii g。初始施用和后续疫苗注射的合适的方案是可变的，但是典型的是初始施用，随后进行接种疫苗或者其它施用。应用的方式可以有大范围的变化。任何传统的疫苗的施用方法都可以应用。这些口服应用包括以固体形式生理学可接受的碱基上或者在生理学上可接受的分散方式(非肠胃的，如通过注射或者诸如此类)。这些疫苗的剂量将根据常规的使用、或者根据被接种个体年龄、或者根据抗原制剂而改变。一些疫苗制剂作为疫苗其自身具有充分的免疫原性的，但是其余的一些需要进一步包含佐剂物质以增强免疫应答。改进黏膜黏附的递送药剂也可以使用，以改进给药和免疫原性，特别是鼻内的、或者口服的或者基于肺部的制剂给药。一种这样的复合物壳聚糖，几丁质的N-脱乙酰形式，在许多药学制剂中使用(32)。它是疫苗鼻内给药的迷人的粘膜粘着剂，因为其能够延迟黏膜纤毛清除，从而允许黏膜抗原有更多的时间吸收和处理(33，34)。另外，它可以暂时性地打开细胞紧密连接，其可以增强抗原到NALT的跨膜运输。在最近的人类实验中，，通过鼻内施用三价失活的流感疫苗(伴随壳聚糖，但是伴随没有任何附加的佐剂)，产生的血清转化和HI效价，仅仅稍微低于肌肉内接种后获得的(33)。壳聚糖可以和佐剂一起被制备成制剂，其在鼻内具有良好的功能，例如基因解毒 的E. coli不耐热的肠毒素突变体LTK63。这增加了给药后、壳聚糖赋予的免疫刺激效应和粘着效益，导致粘膜和系统应答增强(35)。最终，应当注意，可以以干粉形式制备壳聚糖制剂，其已经被表明可以提高疫苗稳定性，进一步延迟黏膜纤毛对液体制剂的清除(42)。可见，在最近的涉及鼻内干粉白喉毒素疫苗制剂联合壳聚糖的人类临床试验中，所述鼻内途径和传统肌肉内途径效果相同，都伴随有分泌型IgA应答的额外好处(43)。所述疫苗也可以有较好的耐受性。炭疽病的鼻内干粉疫苗，含有壳聚糖和MPL，在兔子中比肌肉内接种可以引起更强的应答，并且对喷雾孢子攻击具有保护性(44)。鼻内疫苗代表了示例性的制剂，因为他们可以影响上呼吸道和下呼吸道，和非肠胃施用疫苗(其对下呼吸道的效果较好)形成对比。这有助于引起对基于过敏原的疫苗的耐受性，有助于产生基于病原体疫苗的免疫性。除了对上呼吸道和下呼吸道产生保护外，鼻内疫苗避免了针接种的并发症，并通过微粒状物质和/或可溶性抗原与鼻咽相关的淋巴组织(NALT)的相互作用，提供产生粘膜和全身体液和细胞应答的途径(16-19)。所述鼻内途径历史性地效果比非肠胃接种要小，但是嵌合VLP其作为新的给药制剂、和佐剂使用改变了这一范例。事实上，含有功能性红血球凝集素多肽的嵌合VLP可以特别适合鼻内给药，因为在鼻粘膜中含有丰富的含唾液酸受体，其导致增强的HA抗原的结合潜力，减少了黏膜纤毛清除。佐剂实现佐剂对疫苗的影响的多种方法在现有技术中是已知的，并且可以结合本文所述嵌合VLP联合使用。总体的原则和方法在以下文献中详细描述"The Theoryand Practical Application of Adjuvants " ,1995, Duncan E.S.Stewart-Tull(ed.),John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6,以及"Vaccines New GenerationImmunological Adjuvants " ,1995, Gregoriadis G et al. (eds. ), Plenum Press, NewYork, ISBN 0-306-45283-9。在某一些实施方案中，嵌合的VLP疫苗包括嵌合VLP，其与至少一种佐剂混合，嵌合的VLP 佐剂，按重量比其范围为从约10 I至约101° I ;例如，从约10 I至约100 1，从约 100 I 至约 IO3 1，从约 IO3 I 至约 IO4 1，从约 IO4 I 至约 IO5 1，从约IO5 I至约IO6 1，从约IO6 I至约IO7 1，从约IO7 I至约IO8 1，从约IO8 I至约IO9 1，或者从约IO9 I至约101° I。本领域技术人员可以容易地确定合适的比例，其通过关于佐剂的信息和常规实验来测定最佳比例。佐剂示例性的实施例包括但不限于Toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰基脂质A(MPL)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因子、皂角苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡核苷酸、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳状液、在水乳状液中的油、病毒颗粒、脂质卷(cochleate)、聚乳酸-聚甘醇酸共聚合物(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒和脂质体。优选的，所述佐剂不是细菌衍生的外毒素。优选的佐剂是刺激Thl型应答的佐剂，例如3DMPL、CpG寡核苷酸或者QS21。单磷酰基脂质A(MPL)，来自沙门氏菌的脂质A的非毒性衍生物，是有效的TLR-4激动剂，其已经作为疫苗佐剂发展(Evans等2003)。在鼠科动物的临床前期研究中，鼻内的MPL已经表明可以增强分泌型的和全身性的体液应答(Baldridge等2000 ；Yang等 2002)。其在临床研究中已经被证明，作为疫苗佐剂，对多于120，000的病人是安全和有效的(Baldrick等，2002 ;2004)。MPL刺激通过TLR-4受体引入内生免疫性，因此能对大范围的感染性病原体引起非特异性的免疫应答，包括革兰氏阴性和阳性细菌、病毒和寄生虫(Baldrick等2004 ;Persing等2002)。在鼻内制剂的MPL内含物对来自病毒的攻击，(通常通过疫苗的抗原成分)应该提供快速内生应答的诱导，并引起非特异性应答。因此，在一个实施方案中，本发明提供包含单磷酰基脂质A (MPL )或者3De-0_酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL )的组合物，其增强适应性和内生性免疫。化学制备的3D-MPL 是3De-0-酰化单磷酰基脂质A和4、5或者6酰化链的混合物。3De_0-酰化单磷酰基脂质A的优选形式在欧洲专利0689454B1中公开(SmithKline Beecham Biologicals SA),其通过参考的方式并入本文。在又一实施方案中，本发明提供了含有合成脂质A、脂质A模拟物或类似物的组合物，例如BioMira’ s PET脂质A或者合成衍生物(其被设计具有类似TLR-4激动剂的功能)。佐剂示例性的实施例是多肽，其可以很容易地添加到本文描述的所述嵌合VLP，其方式通过与所述嵌合的VLP的多肽成分共表达，或者与多肽成分融合制备嵌合的多肽。细菌鞭毛，鞭毛的主要蛋白成分是佐剂，其作为佐剂蛋白受到了越来越多的关注，因为它能通过toll-样受体TLR5被内生免疫系统识别出5)。TLR5的鞭毛蛋白信号对内生性和适应性免疫都能发挥功效；通过诱导DC突变和迁移，同时激活巨噬细胞、嗜中性白血球和肠上皮细胞，产生促炎介质￠6-72)。TLR5识别在鞭毛蛋白单体内的保守结构，其对蛋白是唯一的，并且对鞭毛功能是必需的，阻止了它在面对免疫压力应答时发生突变(73)。所述受体对于IOOfM浓度敏感，但是不能识别完整的细丝。拆开成单体的鞭毛对于结合和刺激是必要的。作为佐剂，鞭毛蛋白具有有效的活性，据报道，其能诱导对非肠胃或者鼻内施用的异种抗原产生保护性应答(66，74-77)，并且佐剂对DNA疫苗也产生效果(78)。当采用鞭毛蛋白时，可以观察到Th2偏移(Th2 bias)，其对例如流感毒的呼吸道病毒是合适的，但是没有观察到在老鼠和猴子中的IgE诱导的证据。另外，据报道，对后再在鼻内或者全省施用后，没有产生局部或者全身性的炎症应答(74)。在使用鞭毛蛋白后引起的Th2特征应答，是有些奇怪的，因为已经被表面在MyD88-依赖性方式中的TLR5鞭毛蛋白信号会导致产生Thl偏移(Thl bias) (67,79) 0重要地，鞭毛蛋白预存的抗体对佐剂功效没有明显影响
(74)，使得其可以作为多用途佐剂。在最近的许多鼻内疫苗试验中，共同的主题是对佐剂的用途和/或者给药系统的研究，以改善疫苗功效。在一项研究中，含有基因解毒E.coli不耐热肠毒素佐剂(LTR192G)的流感H3疫苗,对H5攻击产生异亚定型的保护(heterosubtypic protection),但是仅仅在鼻内给药以后。保护是基于诱导交叉中和性抗体的，并且这种保护表明在新疫苗发展中的鼻内途径具有重要意义(22)。细胞因子，集落刺激因子(例如GM-CSF、CSF等等)；肿瘤坏死因子；白介素-2，-7，-12，干扰素和其他类生长因子，都可以被作为佐剂使用，因为通过与所述多肽成分混合或者融合，它们可以容易地被包括在所述嵌合的VLP疫苗中。
在某一些实施方案中，本文公开的所述嵌合的VLP疫苗组合物包括其它通过Toll-样受体起作用的佐剂，例如包含5' -TCG-3'序列的核酸TLR9配体，咪唑喹啉TLR7配体，取代的鸟嘌呤TLR7/8配体，其它TLR7配体例如罗唑利宾、7-脱氮脱氧鸟嘌呤核苷、7-硫杂-8-氧脱氧鸟嘌呤核苷、咪喹莫特(R-837)和瑞喹莫德(R-848)。某些佐剂通过APCs促进疫苗分子的吸收并且激活它们，例如树突细胞。非限定性的例子选自免疫靶向佐剂，免疫调节佐剂(例如毒素、细胞因子、分支杆菌的衍生物)，油悬剂，聚合体，胶团形式佐剂，皂角苷，免疫刺激复合物基质(ISC0M基质)，颗粒，DDA，铝佐齐U，DNA佐剂，MPL和胶囊佐剂。佐剂的其它实施例包括试剂，例如铝盐，例如氢氧化物或者磷酸盐(明矾)，所述铝盐其通常以0.05%至0. 1%溶解在缓冲盐水中使用(参见例如，Nicklas (1992) Res.Immunol. 143 :489-493);与糖多聚体合成物(例如Carbopol )，其作为0. 25%的溶液使用，在所述疫苗中的蛋白通过热处理方式聚集，热处理温度范围在70°至101°C之间，30秒至2分钟，并且也可能通过交叉连接试剂的方式聚集。可以采用胃蛋白酶处理的抗体(Fab片段)对白蛋白的重新激活的聚集作用，与细菌细胞(例如C. parvum)或者革兰氏阴性菌的内毒素或者脂多糖成分的混合物，在生理上可接受的盐载体中的乳状液(例如二缩甘露醇一油酸(Aracel A))或者作为阻滞替代物的具有20%溶液的全氟化碳(Fluosol-DA)的乳状液。可以使用与油的混合物(例如鲨烯和IFA)。不但DDA (双十八烷基二甲基溴化铵)是佐剂的有趣候选物，而且弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，和皂树皂甙一样(例如QuilA和QS21)也是有趣的候选物。进一步可能，包括脂多糖的聚对羧基苯氧基磷腈(PCPP)衍生物，例如单磷酰基脂质A(MPL )、胞壁酰二肽(MDP)和苏氨酰胞壁酰二肽(tMDP)。基于脂多糖的佐剂可以用于产生Thl-型主导的应答，包括，例如，单磷酰脂A，例如3-脱-0-酰化单磷酰脂A)和铝盐的组合。MPL 佐剂可以从 GlaxoSmithKline 获得(参见例如，美国专利号 4，436，727 ;4，877，611 ;4，866，034 和4，912，094)。已知脂质体制剂可以赋予佐剂产生影响，因此脂质体佐剂可能与所述嵌合VLP联合使用。免疫刺激复合物基质类型(ISC0M 基质)佐剂可以与所述嵌合VLP —起使用，特别是由于已经表明这种类型的佐剂能够通过APC上调MHC II类的表达。ISCOM基质由以下组成皂角苷(三萜系化合物)(其从皂皮树(任选分离的))、胆固醇和磷脂。当其与所述免疫原性蛋白混合，例如在所述VLP中，最终颗粒制剂是被称为ISCOM颗粒，其中所述皂角苷可以占60-70% w/w,胆固醇和磷脂10-15% w/w,蛋白10-15% w/w。关于组合物的详细描述和免疫刺激复合物的用途，可以在上述的处理佐剂的文本中找到例子，也可以参见Morein B 等，1995, Clin. Immunother. 3 :461-475 和 Barr I G and Mitchell G F, 1996，Immunol, and Cell Biol. 74 :8_25，其对完全免疫刺激复合物药剂提供有用的指导。所述皂角苷，不管其是否是免疫刺激复合物的形式，其可以在佐剂中联合所述公开的嵌合的VLP疫苗使用，包括来自Quillaja Saponaria Molina树皮的Quil A及其分离物，详细描述参见于美国专利号5，057，540和"Saponins as vaccine adjuvants",Kensil, C. R. , Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996,12(1-2) :1-55;和 EP 0 362279B1。Quil A的示例性部分是QS21、QS7和QS17。^ -七叶素是在所述嵌合VLP的佐剂组合物中使用的另一种溶血性皂角苷。七叶素在Merck目录(第12版条目3737)中描述为一种皂角苷的混合物，在七叶树属欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)的种子中发生。它通过色谱法和纯化技术分离，描述见于(Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4,213 (1953))，和离子交换树脂分离(Erbring 等，美国专利No. 3, 238, 190)。七叶素部分已经被纯化,并且表现出生物活性(Yoshikawa M,等(ChemPharm Bull (Tokyo) 1996 August ；44(8) :1454-1464))。￠-七叶素也称为七叶素。在所述所述嵌合VLP中使用的另一种溶血性皂角苷是洋地黄皂苷。洋地黄皂苷在Merck目录(第12版条目3204)中描述为阜角苷,其来自Digitalis purpurea的种子中，并根据 Gisvold 等，J. Am. Pharm. Assoc.，1934, 23,664 ；和 Ruhenstroth-Bauer, Physiol.Chem.，1955，301，621.中描述的程序进行纯化。它的用途被描述为胆固醇测定的临床试剂。另一种实现佐剂功效的有趣的可能性，是采用在Gosselin等，1992.中描述的技术。简而言之，将所述抗原与抗体(或者抗原结合抗体片段)(其抗在单核白血球/巨噬细胞上的Fc受体)连接，可以增强相关抗原的呈现，例如在本文公开的嵌合的VLP中的抗原。特别是在抗原和抗-FeRI之间的连接，已经被表明，其增强疫苗目标的抗原性。所述抗体可以与所述嵌合的VLP连接，在嵌合的VLP形成以后，或者作为嵌合的VLP形成的部分；其包括作为与任意一种所述嵌合的VLP多肽成分的融合体表达。其它的可能性包括靶向和免疫调节物质的用途(即细胞因子)。另外，可以使用细胞因子诱导物的合成，例如poly I:C。 合适的分支杆菌的衍生物可以选自胞壁酰二肽、弗氏完全佐剂、RIBKRibiImmunoChem Research Inc.，Hamilton, Mont.)和海藻糖二兀酸酯(例如 TDM 和 TDE)。免疫靶向佐剂的合适的实施例包括CD40配体和CD40抗体或者其特异性结合片段(与上文论述的比较)、甘露糖、Fab片段和CTLA-4。合适的聚合体佐剂的实施例包括碳水化合物(例如葡萄聚糖、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖)、塑料聚合物和乳胶(例如乳胶珠粒)。有一种调节免疫应答的有趣的方式，包括在“虚拟淋巴结”(VLN)(从ImmunoTherapy, Inc. , 360 Lexington Avenue, New York, N. Y. 10017-6501 发展而来的私有医疗装置)中的免疫原(任选地伴随佐剂或者生理学上可以接受的载体和介质)。所述VLN(薄管装置)模拟淋巴结的结构和功能。VLN在皮肤下的插入建立了无菌炎症位点(伴随细胞因子和趋化因子的爆发)。T-细胞和B-细胞，以及APC迅速对危险信号作出应答，回到发炎位点，并在所述VLN的多孔基质内的累积。已经表明，当使用所述VLN时，对抗原引起免疫应答的必要性抗原在减少，并且使用VLN的疫苗接种赋予的免疫保护超过了使用Ribi作为佐剂的传统免疫。所述技术的简介参见于Gelber C等，1998, " Elicitationof Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of ImmunogensUsing a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node" , in : " Fromthe Laboratory to the Clinic,Book of Abstracts,Oct. 12-15,1998,Seascape Resort,Aptos, Calif."。寡核苷酸可以作为佐剂和所述嵌合的VLP疫苗一起使用，其可能含有两个或更多个二核苷酸CpG基序，被至少三个或更多个、或者甚至至少六个或更多的核苷酸分离。含有CpG的寡核苷酸(在其中所述CpG 二核苷酸是未甲基化的)诱导Thl为主导的应答。这种寡核苷酸是已经熟知的，其描述见于，例如在WO 96/02555，WO 99/33488和美国专利号6，008，200 和 5，856，462 中。 这些寡核苷酸佐剂可以是脱氧核苷酸。在某些实施方案中，在所述寡核苷酸中的所述核苷酸骨架是二硫代磷酸酯或者磷硫酰键，尽管也可以使用磷酸二酯和其它核苷酸骨架(例如PNA，包括寡核苷酸和混合的骨架连接)。磷硫酰寡核苷酸或者二硫代磷酸酯的制备方法描述，参见美国专利号5，666，153，美国专利号5，278，302和W095/26204。示例性的寡核苷酸具有下述的序列。所述序列可以含有磷硫酰修饰的核苷酸骨架。(SEQ ID NO I) 0LIG0 I TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)(SEQ ID NO 2) 0LIG0 2 TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)(SEQ ID NO :3) 0LIG0 3 ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG(SEQ ID NO :4) OLIGO 4 TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)(SEQ ID NO :5)0LIG0 5 TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)可选的CpG寡核苷酸包括上述的序列(并具有对其的非重要性删除或者添加)。作为佐剂的所述CpG寡核苷酸可以通过现有技术中任何方法合成(例如EP 468520)。例如，这种寡核苷酸可以利用自动化合成仪合成。这种寡核苷酸佐剂的长度可以在10-50个碱基之间。另一种佐剂系统包括含有CpG的寡核苷酸和皂角苷衍生物的组合，特别是CpG和QS21的组合(其在WO 00/09159中公开)。许多单相或多相的乳状液系统已经被描述过了。本领域技术人员可以迅速适应将这种乳状液系统与嵌合VLP —起使用，使所述乳状液不干扰所述嵌合VLP的结构。已经表明，水乳状液佐剂中的油本身作为佐剂组合物是有效的(EP0 399 843B)，也与在水乳状液中油组合，并且其它活性试剂曾被作为疫苗佐剂描述(W0 95/17210 ；W0 98/56414 ；W099/12565 ；W0 99/11241)。已经描述的其它油乳状液佐剂，例如在油乳状液中的水(美国专利号5，422，109 ；EP 0 480 982B2)和在水乳状液中的油(美国专利号5，424，067 ；EP 0480 981B)。本文描述的与所述嵌合的VLP疫苗联合使用的油乳状液佐剂可以是天然的或者合成的，并且可以是有机的或者矿物的。矿物或者有机油的实施例对本领域技术人员是很容易得到的。为了使任何水组合物中的油适合于人类施用，所述乳状液系统的油相可以包括可代谢的油。术语“可代谢的油”在现有技术中是已知的。可代谢的可以被定义为"能够通过代谢被转化"(Dorland' s Illustrated Medical Dictionary,W. B. Sanders Company,25th edition(1974))。所述油可以是植物油、鱼油、动物油或者合成油，其对接受者是无毒的，并能够通过代谢被转化。坚果(例如花生油)、种子和谷粒是植物油的通常来源。也可以使用合成油，其能包括商业可获得的油，例如NEOBEE 和其它。可以与嵌合VLP联合使用鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-廿四碳六烯)是非饱和油，其在鲨鱼肝脏中大量的存在，在橄榄油、麦胚芽油、米糠油和酵母中存在较少的量。鲨烯是可代谢油的事实，其优点是在于它是胆固醇生物合成的中间产物。(Merck目录，IOth Edition,登陆no. 8619)。示例性的油乳状液是在水乳状液中的油，特别是在水乳状液中的鲨烯。另外，与所述嵌合VLP联合使用的所述油乳状液佐剂包括抗氧化剂，例如所述油状a -生育酚(维生素E，EP 0 382 271B1)。 WO 95/17210和WO 99/11241公开了乳状液佐剂，其基于鲨烯、a -生育酚和TWEEN80 (TM)，任选的由免疫刺激剂QS21和/或者3D-MPL配制的。WO 99/12565公开了对这些鲨烯乳状液的改进，在油相中添加固醇。此外，甘油三酯，例如三辛酸甘油酯(C27H5006)，可以被添加到油相中，以使乳状液稳定(W0 98/56414)。水乳状液中的稳定油内的油滴的大小可以小于I微米，范围可以是大体上30-600nm,直径大体上约30_500nm，或者直径大体上150_500nm，并且直径特别是约150nm (其通过光子相关光谱技术测定)。考虑到这点，80%的油滴(以计数方式)可以在这些范围内，多于90%或者多于95%的油滴(以计数方式)在所限定的范围内。存在于油乳状液中的成分的量通常在范围从2至10%油(例如鲨烯)；当存在时，从2至10% a生育酚；以及从0.3至3%表面活性剂(例如聚氧代乙烯山梨聚糖一油酸酯)。所述油a生育酚的比例可以等于或者少于1，因为这一比例提供更加稳定的乳状液。SPAN 85 (TM)也可以以约1%的水平存在。在某些例子中，更有利的情况是本文公开的所述嵌合的VLP疫苗进一步含有稳定剂。制备在水乳状液中的油的方法对于本领域技术人员是已知的。通常，所述方法包括将油相与表面活性剂混合的步骤，所述表面活性剂例如PBS/TWEEN80 溶液，接着使用均质器使其均匀，这对于本领域技术人员将是清楚的，包括使用注射针传递所述混合物两次从而使小体积的液体均匀混合。同样的，在微射流纳米分散均质设备(M110S微流体设备，最大50次,在最大输入压力6巴的2分钟时间段内(输入压力约850巴))的所述乳化过程可以被本领域技术人员适应，以制备更小或更大体积的乳状液。这种适应可以通过常规实验实现，所述常规实验包括测量最终乳状液，直到得到具有预期直径的油滴的药剂。可以使用本文公开的所述嵌合的VLP疫苗药剂，以保护或者治疗哺乳动物或者禽类(其对病毒感染敏感或者正遭受病毒感染)，疫苗施用方式包括鼻内的、肌肉内的、腹膜内的、皮肤内的、经皮肤的、静脉的或者皮下。全身施用疫苗制剂的方法可以包括常规注射器和注射针，或者固体疫苗弹道施用的(W0 99/27961)，或者无针压力液体注射设备(美国专利号 4，596，556 ;美国专利号 5，993，412)，或者皮肤药贴(W0 97/48440 ；W0 98/28037)。所述嵌合的VLP疫苗可以涂覆在皮肤上(经过皮肤的或者经皮给药WO 98/20734 ；W098/28037)。本文公开的所述嵌合的VLP疫苗因此包括全身施用的给药设备，预充装有所述嵌合的VLP疫苗或者佐剂组合物。因此，提供诱导个体免疫应答的方法，所述个体例如哺乳动物或者禽类，所述方法包括对所述个体施用疫苗(包括任意的嵌合的VLP组合物、和任选的包括佐剂和/或者载体)，其中所述疫苗通过非肠胃或者全身途径施用。可以使用所述嵌合的VLP的疫苗药剂，以保护或者治疗哺乳动物或者禽类(其对病毒感染敏感或者正遭受病毒感染)，施用所述疫苗的方式包括粘膜途径，例如所述口 /消化道或者鼻子途径。可选择的粘膜途径是阴道内的和直肠内的。所述粘膜途径的施用可以是通过鼻子途径，称为鼻内疫苗接种。鼻内疫苗接种的方法在现有技术中是已知的，包括将滴状、雾状或干粉形式的疫苗施用到被免疫个体的鼻咽内。使成雾状或雾化的疫苗制剂是本文公开的所述嵌合的VLP疫苗的潜在形式。肠制剂，例如用于口服抗胃的胶囊和颗粒，直肠或者阴道施用的栓剂，都是本文公开的嵌合的VLP疫苗制剂。本文公开的所述示例性的嵌合的VLP疫苗组合物，代表一组适合在人类中使用通过粘膜疫苗接种的的粘膜疫苗，以代替全身性疫苗接种。
所述嵌合的VLP疫苗可以通过口服途径施用。在这些例子中，所述药学上可以接受的赋形剂也可以包括碱性缓冲剂、或者肠溶胶囊剂或者微粒剂。所述嵌合的VLP疫苗可以通过阴道途径施用。在这些例子中，所述药学上可接受的赋形剂包括乳化剂，聚合体(例如CARB0P0L )，和其它已知的阴道栓剂和霜剂的稳定剂。所述嵌合的VLP疫苗也可以通过直肠途径施用。在这些例子中，所述赋形剂可以包括蜡和(现有技术中已知的可以形成栓剂的)聚合体。可选择的，所述嵌合的VLP疫苗制剂可以和疫苗载体组合，包括由壳聚糖(上文描述的)或者其它聚阳离子聚合体、聚乳酸和聚乳酸乙交酯共聚物颗粒、基于聚N-乙酰氨基葡糖糖聚合体的基质、颗粒(由多糖或者化学修饰的多糖、脂质体和基于脂质的颗粒、由甘油单脂组成的颗粒等等。所述皂角苷可以在胆固醇存在情况下制备，形成颗粒结构，例如脂质体或者ISC0M。此外，所述皂角苷可以和聚氧乙烯醚或者酯一起制备，在非颗粒溶液或者悬浮液中，或者在微粒状结构中(例如微粒状脂质体或者ISCOM中。示例性的在制药学上的佐剂和疫苗组合物(使用本文描述的所述嵌合VLP)包括SAF (Chiron, Calif.，United States), MF-59 (Chiron,参见，例如，Granoff 等(1997) Infect Immun. 65 (5) :1710-1715)，佐剂的 SBAS 系列(例如，SB-AS2 (SmithKlineBeecham 佐剂系统 #2 ;含有 MPL 和 QS21 的油水乳液);SBAS_4 (SmithKline Beecham 佐剂系统 #4 ;含有明帆和 MPL),可以从 SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium 获得，Detox(Enhanzyn ) (GlaxoSmithKline)，RC-512，RC-522，RC-527，RC-529，RC-544，和RC-560 (GlaxoSmithKline)和其它烷基氨基氨基葡糖苷4-磷酸酯化合物s (AGPs)，这些在描述参见美国专利申请序列08/853，826和09/074，720。其它佐剂实施例包括但不限于Hunter ' s TiterMax 佐剂(CytRx Corp.,Norcross, Ga.) ;Gerbu 佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, Germany);硝基纤维素(Nilsson and Larsson(1992)Res. Immunol. 143 :553-557);明帆(例如氧氧化招、憐酸铝)乳状液制剂(包括矿物油、在油乳状液中的水或者在水乳状液中的油)，例如佐剂的Seppic ISA 系歹Ij (例如 ISA-51, ISA-57，ISA-720，ISA-151 等等；Seppic, Paris, France)；PROVAX (IDEC Pharmaceuticals) ;0M_174 (脂质 A 相关的氨基葡萄糖二糖)；Leishmania延伸因子；非离子阻断共聚物(其形成微团，例如CRL 1005) JPSyntex佐剂制剂。参见例如 0' Hagan等(2001) Biomol Eng. 18 (3) :69-85;以及"Vaccine Adjuvants !PreparationMethods and Research Protocols" D. 0' Hagan,ed. (2000)Humana Press。其它示例性的佐剂包括佐剂分子，具有通式HO (CH2CH2O)n-A-R, (I)其中，n是1_50，A是键或者一C (0) —, R是烧基或者苯基烧基。一个含有疫苗直接的实施方案，包括聚氧乙烯醚或酯，其具有通式(1)，其中11在1和50之间，4-24，或者9 ;所述R成分是Cu，C4-C2tl烷基，或者C12烷基，A是键。所述聚氧乙烯醚的浓度应该在范围0. 1-20%,0. 1-10%，或者在范围0. 1-1%。示例性的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-9-十八烷基醚、聚氧乙烯-8-十八烷基醚、聚氧乙烯-4-十二烷基醚、聚氧乙烯-35-十二烷基醚和聚氧乙烯-23-十二烷基醚。聚氧乙 烯醚，例如聚氧乙烯十二烧基醚的描述见于Merck索引(12th edition :登陆7717)。这些佐剂分子在WO 99/52549中有描述。所述聚氧乙烯醚，根据上述的通式(I)，如果期望，可以和另一佐剂组合。例如，佐剂组合物可以包括上文描述的CpG。合适的药学可接受的(与本文公开的嵌合的VLP疫苗一起使用的)赋形剂所述的进一步实施例，包括水、磷酸盐缓冲盐水、等渗缓冲溶液。通过参考下文的非限定性实施例，可以更好地理解本公开的组合物和方法。如本文描述的，本发明包括嵌合VLP，其任选地包括附加的VLP-相关多肽(其与抗原或者佐剂链接)。下文的实施例描述了本发明的典型实施方案(其包括嵌合VLP)。实施例I-尝试的假病毒MLV gag+RSV F VLP这个实施例证明截短的缺失胞质尾区的RSV融合(F)糖蛋白，或者含有跨膜区和胞质尾区(来自流感红血球凝集素)的杂种F蛋白，在哺乳动物细胞中的表达，导致形成含有RSV F的披膜病毒样颗粒(VLP)。这个实施例被设计，使所述RSV F糖蛋白在哺乳动物细胞中表达，伴随或不伴随鼠白血病病毒Gag基因产物的共表达。所述RSV F将被整合进披膜Gag VLP (其从细胞出芽)是可以预期的。质粒p3. I-RSVFT编码F (RSVFT)截短的译本，其缺失了其胞质尾区，但是含有其天然的跨膜区域。p3. I-RSVFT的质粒图谱可见于图16，所述RSVFT编码序列如下atggaactgctgatcctgaaggctaacgctatcaccaccatcctgaccgctgtcaccttctgcttcgcctccggccagaacatcaccgaggaattctaccagtccacctgctccgctgtctccaagggttacctgtccgctctgcgcaccggctggtacacctccgtcatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgctaaggtcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgctgtcaccgagctgcagctgctgatgcagtccacccccgctaccaacaaccgcgctcgccgtgagctgccccgcttcatgaactacaccctgaacaacgccaagaaaaccaacgtcaccctgtccaagaagcgcaagcgccgcttcctgggtttcctgctgggtgtcggttccgctatcgcttccggtgtcgctgtctctaaggtcctgcacctggaaggcgaggtcaacaagatcaagtccgccctgctgtccaccaacaaggctgtcgtgtccctgtccaacggtgtctccgtcctgacctccaaggtgctggacctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcgtcaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagactgtcatcgagttccagcagaagaacaaccgcctgctggaaatcacccgcgagttctccgtcaacgctggtgtcaccacccctgtctccacctacatgctga
ccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccaaaagaaactgatgtccaacaacgtccagatcgtccgccagcagtcctactctatcatgagcatcatcaaggaagaggtcctggcttacgtcgtccagctgcccctgtacggtgtcatcgacaccccctgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggaaggttccaacatctgcctgacccgcaccgaccgcggctggttctgcgacaacgctg gctctgtctccttcttcccccaagctgagacttgcaaggtccagtccaaccgcgtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccctccgaggtcaacctgtgcaacgtcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgacctctaagaccgacgtgtcctcctctgtcatcacctccctgggtgctatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcttccaacaagaaccgcggtatcatcaagaccttctccaacggttgcgactacgtgtccaacaagggcgtcgacaccgtgtccgtcggcaacaccctgtactacgtgaacaagcaggaaggcaagtccctgtacgtcaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttcccctccgacgagttcgacgcttccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggctttcatccgcaagtccgacgagctgctgcacaacgtgaacgctggcaagtctaccaccaacatcatgatcaccactatcatcatcgtgatcatcgtcatcctgctgtctctgatcgctgtcggtctgctgctgtactaa(SEQID NO 6)合成所述RSVFT编码序列，其作为通常的合成DNA片段，不是从病毒克隆得到，因为所述天然的RSV F基因是来自副粘液病毒，其在细胞的细胞质中复制，将不能被期望在细胞核中合适地表达。所述RSVFT的氨基酸序列如下(带有信号肽(以大写字母表示)和跨膜区域)MELLILKANAITTILTAVTFCfasgqniteefyqstcsavskgyIsalrtgwytsvitielsnikenkcngtdakvklikqeldkyknavteIqllmqstpatnnrarrelprfmnytInnakktnvtIs kkrkrrf Igf I lgvgsaiasgvavskvlhlegevnkiksal lstnkavvslsngvsvltskvldlknyidkqllpivnkqscsisnietviefqqknnrlleitrefsvnagvttpvstymltnsellslindmpitndqkklmsnnvqivrqqsysimsiikeevlayvvqlplygvidtpcwklhtsplcttntkegsnicltrtdrgwfcdnagsvsffpqaetckvqsnrvfcdtmnsltlpsevnlcnvdifnpkydckimtsktdvsssvitslgaivscygktkctasnknrgiiktfsngcdyvsnkgvdtvsvgntlyyvnkqegkslyvkgepiinfydplvfpsdefdasisqvnekinqslafirksdeIIhnvnagksttnIMIT TIIIVIIVILLSLIAVGLLLY(SEQ ID NO :7)编码杂种蛋白的质粒p3. 1-shFvl包括RSV F的胞外结构域，其与来自流感A的H5红血球凝集素跨膜区域和胞质尾区融合。图I示出了 p3. 1-shFvl的质粒图谱，所述ShFvl的编码序列如下atggaactgctgatcctgaaggctaacgctatcaccaccatcctgaccgctgtgaccttctgcttcgcttccggccagaacatcaccgaggaattctaccagtccacctgctccgctgtgtccaagggttacctgtccgctctgcgtaccggttggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagagaacaagtgcaacggcaccgacgctaaggtcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgctgtgaccgagctgcagctgetgatgcagtccacccccgctaccaacaaccgtgetcgtcgtgagctgccccgttteatgaactacaccctgaacaacgccaagaaaaccaacgtcaccctgtccaagaagcgtaagcgtcgtttcctgggtttcctgctgggtgtgggtagcgctatcgcctccggtgtcgctgtctccaaggtgctgcacctcgagggcgaggtgaacaagatcaagtccgccctgctgtccaccaacaaggctgtggtgtccctgtccaacggtgtctccgttctgaccagcaaggtcttggacctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcgt
gaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagactgtgatcgagttccagcagaagaacaaccgtctgctcgagatcacccgtgagttctccgtgaacgctggtgtcaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcgtcagcagtcctactctatcatgagcatcatcaaagaggaagtcctggcttacgtggtgcagctgcccctgtacggtgtcatcgacaccccctgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggttccaacatctgcctgacccgtaccgatcgtggttggttctgtgacaacgctggttccgtgtccttcttcccccaagctgagacttgcaaggtgcagtccaaccgtgtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccctccgaggtgaacctgtgcaacgtggacatcttcaaccccaagtacg actgcaagatcatgacctctaagaccgacgtgtcctcctccgtcatcacctccctgggtgctatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcttccaacaagaaccgcggtatcatcaagaccttctccaacggttgcgactacgtgtccaacaagggtgtcgataccgtgtccgtcggtaacaccctgtactacgtcaacaagcaggaaggcaagtctctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttcccctccgacgagttcgacgcttccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggctttcatccgtaagtccgacgagctgctgcacaacgtcaacgctggcaagtccaccaccaacatcctgtccatctactccaccgtggcttcctccctggctctggctatcatgatggctggtctgtccctgtggatgtgctccaacggctccctgcagtgccgtatctgcatctaataa(SEQ ID NO :8)所述shFvl的氨基酸序列如下(具有信号肽编码序列和HA跨膜区和胞质尾区序列(以大写字母表示))MELLILKANAITTILTAVTFcfasgqniteefyqstcsavskgylsalrtgwytsvitielsnikenkcngtdakvkl ikqeldkyknavtelql lmqstpatnnrarrelprfmnyt lnnakktnvt lskkrkrrf Igf I Igvgsaiasgvavskvlhlegevnkiksallstnkavvslsngvsvltskvldlknyidkqllpivnkq scsisnietviefqqknnrlleitrefsvnagvttpvstymltnsel lslindmpitndqkklmsnnvqivrqqsysimsiikeevlayvvqlplygvidtpcwklhtsplcttntkegsnicltrtdrgwfcdnagsvsffpqaetckvqsnrvfcdtmnsltlpsevnlcnvdifnpkydckimtsktdvsssvitslgaivscygktkctasnknrgiiktfsngcdyvsnkgvdtvsvgntlyyvnkqegkslyvkgepiinfydplvfpsdefdasisqvnekinqslafirksdellhnvnagksttnlLSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI (SEQ IDNO 9)如同RSVFT，所述shFvl编码序列通过DNA合成形成。编码杂种蛋白的质粒p3. l-shFv2包括RSV F的胞外结构域，其和来自流感A的H5红血球凝集素的跨膜区域和胞质尾区融合。在流感HA-衍生的跨膜区和尾区中，shFv2和shFvl的差异是多4个氨基酸。图2示出了 p3. l-shFv2的质粒图谱。所述shFv2的编码序列如下atggaactgctgatcctgaaggctaacgctatcaccaccatcctgaccgctgtgaccttctgcttcgcttccggccagaacatcaccgaggaattctaccagtccacctgctccgctgtgtccaagggttacctgtccgctctgcgtaccggttggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagagaacaagtgcaacggcaccgacgctaaggtcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgctgtgaccgagetgcagctgetgatgcagtccacccccgctaccaacaaccgtgetcgtcgtgagctgccccgttteatgaactacaccctgaacaacgccaagaaaaccaacgtcaccctgtccaagaagcgtaagcgtcgtttcctgggtttcctgctgggtgtgggtagcgctatcgcctccggtgtcgctgtctccaaggtgctgcacctcga
gggcgaggtgaacaagatcaagtccgccctgctgtccaccaacaaggctgtggtgtccctgtccaacggtgtctccgttctgaccagcaaggtcttggacctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagactgtgatcgagttccagcagaagaacaaccgtctgctcgagatcacccgtgagttctccgtgaacgctggtgtcaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcgtcagcagtcctactctatcatgagcatcatcaaagaggaagtcctggcttacgtggtgcagctgcccctgtacggtgtcatcgacaccccctgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggttccaacatctgcctgacccgtaccgatcgtggttggttctgtgac·aacgctggttccgtgtccttcttcccccaagctgagacttgcaaggtgcagtccaaccgtgtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccctccgaggtgaacctgtgcaacgtggacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgacctctaagaccgacgtgtcctcctccgtcatcacctccctgggtgctatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcttccaacaagaaccgcggtatcatcaagaccttctccaacggttgcgactacgtgtccaacaagggtgtcgataccgtgtccgtcggtaacaccctgtactacgtcaacaagcaggaaggcaagtctctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttcccctccgacgagttcgacgcttccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggctttcatccgtaagtccgacgagctgctgcacaacgtcaacgctggcaagtccaccaccaacggcacctaccagatcctgtccatctactccaccgtggcttcctccctggctctggctatcatgatggctggtctgtccctgtggatgtgctccaacggctccctgcagtgccgtatctgcatctaataa(SEQ ID NO :10)所述shFv2的氨基酸序列如下(具有信号肽编码序列和HA跨膜区和胞质尾区序列(以大写字母表示))MELLILKANAITTILTAVTFcfasgqniteefyqstcsavskgylsalrtgwytsvitielsnikenkcngtdakvklikqeldkyknavtelqllmqstpatnnrarrelprfmnytlnnakktnvtIskkrkrrf Igf I lgvgsaiasgvavskvlhlegevnkiksal lstnkavvslsngvsvltskvldlkny idkql lpivnkqscsisnietviefqqknnrlleitrefsvnagvttpvstymltnsel lslindmpitndqkklmsnnvqivrqqsysimsiikeevlayvvqlplygvidtpcwklhtsplcttntkegsnicltrtdrgwfcdnagsvsffpqaetckvqsnrvfcdtmnsItlpsevnlcnvdifnpkydckimtsktdvsssvitslgaivscygktkctasnknrgiiktfsngcdyvsnkgvdtvsvgntlyyvnkqegkslyvkgepiinfydplvfpsdefdasisqvnekinqslafirksdeIIhnvnagksttnGTYQILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO :11)所述shFv2编码序列通过DNA合成方法形成。质粒p3. I-Gag编码来自鼠白血病病毒Gag基因产物。图3示出了 p3. I Gag的质粒图谱。来自质粒p3. I-Gag的所述Gag编码序列如下atgggccagactgttaccactcccttaagtttgaccttaggtcactggaaagatgtcgagcggatcgctcacaaccagtcggtagatgtcaagaagagacgttgggttaccttctgctctgcagaatggccaacctttaacgtcggatggccgcgagacggcacctttaaccgagacctcatcacccaggttaagatcaaggtcttttcacctggcccgcatggacacccagaccaggtcccctacatcgtgacctgggaagccttggcttttgacccccctccctgggtcaagccctttgtacaccctaagcctccgcctcctcttcctccatccgccccgtctctcccccttgaacctcctcgttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcactccttctctaggcgccaaacctaaacctcaagttctttctgacagtggggggccgctcatcgacctacttacagaagaccccccg
ccttatagggacccaagaccacccccttccgacagggacggaaatggtggagaagcgacccctgcgggagaggcaccggacccctccccaatggcatctcgcctacgtgggagacgggagccccctgtggccgactccactacctcgcaggcattccccctccgcgcaggaggaaacggacagcttcaatactggccgttctcctcttctgacctttacaactggaaaaataataacccttctttttctgaagatccaggtaaactgacagctctgatcgagtctgttctcatcacccatcagcccacctgggacgactgtcagcagctgttggggactctgctgaccggagaagaaaaacaacgggtgctcttagaggctagaaaggcggtgcggggcgatgatgggcgccccactcaactgcccaatgaagtcgatgccgcttttcccctcgagcgcccagactgggattacaccacccaggcaggtaggaaccacctagtccactatcgccagttgctcctagcgggtctccaaaacgcgggc
agaagccccaccaatttggccaaggtaaaaggaataacacaagggcccaatgagtctccctcggccttcctagagagacttaaggaagcctatcgcaggtacactccttatgaccctgaggacccagggcaagaaactaatgtgtctatgtctttcatttggcagtctgccccagacattgggagaaagttagagaggttagaagatttaaaaaacaagacgcttggagatttggttagagaggcagaaaagatctttaataaacgagaaaccccggaagaaagagaggaacgtatcaggagagaaacagaggaaaaagaagaacgccgtaggacagaggatgagcagaaagagaaagaaagagatcgtaggagacatagagagatgagcaagctattggccactgtcgttagtggacagaaacaggatagacagggaggagaacgaaggaggtcccaactcgatcgcgaccagtgtgcctactgcaaagaaaaggggcactgggctaaagattgtcccaagaaaccacgaggacctcggggaccaagaccccagacctccctcctgaccctagatgactagtag(SEQ ID NO :12)所述MLV Gag氨基酸序列如下MgqtvttplsltlghwkdveriahnqsvdvkkrrwvtfcsaewptfnvgwprdgtfnrdlitqvkikvfspgphghpdqvpyivtwealafdpppwvkpfvhpkpppplppsapsIplepprstpprssIypaltpslgakpkpqvlsdsggpIidlltedpppyrdprpppsdrdgnggeatpageapdpspmasrlrgrreppvadsttsqafplraggngqlqywpfsssdlynwknnnpsfsedpgkltaliesvlithqptwddcqqlIgtlltgeekqrvllearkavrgddgrptqlpnevdaafplerpdwdyttqagrnhlvhyrqlllaglqnagrsptnlakvkgitqgpnespsafIerlkeayrrytpydpedpgqetnvsmsfiwqsapdigrklerledlknkt lgdlvreaekifnkretpeereerirreteekeerrrtedeqkekerdrrrhremskllatvvsgqkqdrqggerrrsqldrdqcayckekghwakdcpkkprgprgprpqtslltldd(SEQ ID NO :13)所述Gag基因表示了在质粒pAMS (ATCC)中的MLV基因组的天然克隆。8 个 IOcm2 细胞培养皿上接种 293-F 细胞，其在 Dulbecco’ s Modif iedEagle’ s 培养基中培养，并且培养基中添加10%胎牛血清。当这些细胞达到约95%汇合(单层培养)后，每个都使用4u g的质粒DNA的量转染，按如下1.没有 DNA2. 4u g p3. I-Gag3. 4u g p3. I-RSVFT4. 4 U g p3. 1-shFvl5. 4 U g p3. l-shFv26. 2 U g p3. l-RSVFT+2 U g p3. I-Gag7. 2 U g p3. l-shFvl+2 U g p3. I-Gag8. 2 U g p3. l_shFv2+2 U g p3. I-Gag
质粒DNA的转染使用LIPOFECTAMINE (TM) 2000 (Invitrogen)，步骤根据生产商的建议。转然后8小时，所述转染培养基用CD293无血清培养基替换后，继续培养。在转染后48小时，所有含有细胞转染的培养皿(具有任意的RSV F表达载体)，表现出显著的合胞体(融合细胞)水平，其与正确折叠F的表面表达一致。在48小时，通过移液分离转染后细胞，收集细胞和培养基。在细胞表面上的RSV F抗原活性的表达进一步通过流式细胞仪证明，在对具有小鼠单克隆抗体(9C5)的细胞染色之后，所述小鼠单克隆抗体(9C5)在膜完整的状态下识别正确折叠F抗原。细胞进一步和山羊-抗-小鼠二级抗体反应，其连接有藻红蛋白以进行F-阳性细胞的荧光检测。图4显示了流式细胞仪运行得到的柱状图，表明任意F表达载体(有和没有所述Gag载体)转染的细胞上F的表面表达水平显著。这些数据与转染细胞群中合胞体的存在一致，表面了正确折叠F抗原在细胞表面上存在。从转染细胞中收集生长培养基，将其在2000rpm离心5分钟以除去合胞体和任何细胞残骸，此步骤的上清液，在tris-缓冲盐水中30%蔗糖垫，100, OOOxg离心I小时，以收集Gag和/或者F基因表达后的任何被释放到培养基中的VLP。来自此步骤的100，OOOxg小球在tris-缓冲盐水中重悬，作其它分析。 来自所述超高速离心步骤的重悬小球进行蛋白质印迹分析，以检测所述Gag产物(其指示了 VLP形成)的存在。出乎意料地，在所述p3. I-Gag载体单独转染的细胞中，检测到Gag产物具有显著的量，但是在3. I-Gag联合任意F基因载体转染的细胞小球中，Gag产物的量明显减少。所述结果与F基因产物以某种方式干扰Gag产物的出芽功能一致。在重悬超高速离心小球中的F抗原的存在接着通过如下的ELISA检测每个重悬的超高速离心小球样品定位在单一的孔中(其在Nunc MAXISORP (TM)平底96孔ELISA平板的A排)，平板的下方每列的每个样品被系列稀释两倍。在4°C覆盖过夜后，所述平板用含有 0. 05 % TffEEN 20 (TM) (PBS-T)的 PBS 洗涤 3 次，然后用封闭缓冲液 STARTING BLOCK (TM)(PBS) (Pierce, Biotechnology)封闭。在封闭之后，在 STARTING BLOCK T20 (TM) (Pierce)中的IOOiU的I : 1000稀释的单克隆抗体9C5被定位在每个孔中，所述平板在室温孵育3小时。所述平板被再次洗涤，100 ill在STARTING BLOCK T20 (TM)中的小鼠HRP连接抗体(Southern Biotech)被添加到每个孔中，在室温孵育I. 5小时。接着后期用PBS-T洗涤(3x)，所述平板通过添加100 u I ABTS试剂(Pierce)，在室温孵育45分钟显影。图5示出了这种ELISA的结果，从其中可以观察在100，OOOxg小球(来自单独F基因、和F基因+Gag基因共转染)中，检测到RSV F抗原的显著水平。重要地和出乎意料地，来自RSV F基因单独转染的细胞的小球，观察到RSV F抗原活性的量更大。这些数据表明F基因单独表达(在缺失Gag表达的情况下)，最终形成携带F抗原的VLP。这也和上述观察一致，F和Gag共表达导致Gag出芽的抑制，可能是由于F干扰Gag出芽。实施例2-假型 HIV-I Gag+RSV F VLP这个实施例表明了具有RSV F糖蛋白GPI-锚定译本的假型HIV-1 Gag VLP的制备。材料和方法质粒p3. 1-bruGag含有编码(来自HIV-1菌种的)HIV-Gag产物的合成序列的。这种质粒采用CMV即刻早期启动子,适合瞬时转染表达研究。图6显示了 p3. 1-bruGag的质粒图谱。所述bruGag的编码序列如下
atgggagccagagccagcgtgctgtctggcggcgagctggacagatgggagaagatccggctgcggccaggcggcaagaagaagtacaagctgaagcacatcgtgtgggctagccgggagctggaaagattcgccgtgaaccccggactgctggaaaccagcgagggctgcagacagatcctgggccagctgcagccatctctgcagaccggcagcgaggaactgcggagcctgtacaacaccgtggccaccctgtactgcgtgcaccagcggatcgagatcaaggacaccaaagaggccctggacaagatcgaggaagaacagaacaagtccaagaagaaggcccagcaggccgctgccgataccggccacagcagccaggtgtcccagaactaccccatcgtgcagaacatccagggccagatggtgcaccaggccatctctcccagaaccctgaacgcctgggtgaaagtggtggaggaaaaggccttcagccccgaagtgatccccatgttcagcgccctgagcga aggcgccaccccccaggacctgaacaccatgctgaacaccgtgggaggacaccaggccgccatgcagatgctgaaagagacaatcaacgaagaggccgccgagtgggacagagtgcaccctgtgcacgccggacctatcgcccctggccagatgagagagcccagaggcagcgatatcgccggcaccacaagcaccctgcaggaacagatcggctggatgacaaacaacccccccatccccgtgggcgagatctacaagcggtggatcatcctgggcctgaacaagatcgtgcggatgtacagccccacctccatcctggacatccggcagggccccaaagagcccttccgggactacgtggaccggttctacaagaccctgcgggccgagcaggccagccaggaagtgaagaactggatgaccgagacactgctggtgcagaacgccaaccccgactgcaagaccatcctgaaggccctgggaccagccgccaccctggaagagatgatgaccgcctgtcagggcgtgggcggacctggacacaaagccagagtgctggccgaggccatgagccaggtgaccaacagcgccaccatcatgatgcagcggggcaacttccggaaccagcggaagatcgtgaagtgcttcaactgcggcaaggaaggccacattgcccggaactgcagagcccccagaaagaaaggctgctggaagtgcgggaaagaggggcaccagatgaaggactgcaccgagcggcaggccaacttcctcggcaaaatctggcccagctacaagggcagacccggcaacttcctgcagagcagacccgagcctaccgcccctcccttcctgcagtccaggcctgaacctaccgctccccccgaggaaagcttcagatccggcgtggagacaaccacccctagccagaagcaggaacccatcgacaaagagctgtaccccctgaccagcctgagaagcctgttcggcaacgaccccagcagccagtga (SEQ ID NO :14)p3. 1-bruGag编码的氨基酸序列如下mgarasvlsggeldrwekirlrpggkkkyklkhivwasrelerfavnpglletsegcrqilgqlqpsIqtgseelrslyntvatlycvhqrieikdtkealdkieeeqnkskkkaqqaaadtghssqvsqnypivqniqgqmvhqaisprtlnawvkvveekafspevipmfsalsegatpqdlntmlntvgghqaamqmlketineeaaewdrvhpvhagpiapgqmreprgsdiagttstlqeqigwmtnnppipvgeiykrwiilglnkivrmysptsildirqgpkepfrdyvdrfyktlraeqasqevknwmtetllvqnanpdcktilkalgpaatleemmtacqgvggpghkarvlaeamsqvtnsatimmqrgnfrnqrkivkcfncgkeghiarncraprkkgcwkcgkeghqmkdcterqanflgkiwpsykgrpgnflqsrpeptappfIqsrpeptappeesfrsgvetttpsqkqepidkelypltslrslfgndpssq*(SEQ ID NO :15)质粒p3. I-F-GPI含有编码(来自RSV菌种A2)RSV F糖蛋白GPI-锚定译本的合成序列。该质粒的构建通过删除编码跨膜区和胞质尾区的F基因序列，用编码GPI锚信号(来自人类羧肽酶M)的序列替换它们。图7示出了 p3. I-F-GPI的图谱。所述F-GPI编码序列如下atggagctgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgcttcgcctccggccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgetccgccgtgtccaagggctacctgtcc
gccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagaacgccgtgaccgagctgcagctgetgatgcagtccacccctgccaccaacaaccgggccaggcgggagctgcctcggttcatgaactacaccctgaacaacgccaagaaaaccaacgtcaccctgtccaagaagcggaagcggcggttcctgggcttcctgctgggcgtgggctccgctatcgcctctggcgtggccgtgtctaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagtctgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctg
ctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacaagagagttctccgtcaacgctggtgtgaccactcctgtctctacttatatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctactctatcatgagcatcatcaaggaggaggtcctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggttctgcgacaacgccggctccgtgtccttctttccacaggccgagacatgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgataccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctctaagaccgacgtgtcctcctctgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagtctctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggcctteatccggaagtccgacgagctgctgcacaacgtgaacgctggcaagtctaccaccaaccccgaccactccgccgccaccaagccctccctgttcctgttcctggtgtccctgctgcacatcttcttcaagtgataa (SEQ ID NO :16)p3. I-F-GPI编码的所述氨基酸序列如下melIilkanaittiltavtfcfasgqniteefyqstcsavskgylsalrtgwytsvitielsnikenkcngtdakvklikqeldkyknavtelqllmqstpatnnrarrelprfmnytlnnakktnvtlskkrkrrflgflIgvgsaiasgvavskvlhlegevnkiksallstnkavvslsngvsvltskvldlknyidkqllpivnkqscsisnietviefqqknnrlleitrefsvnagvttpvstymltnsellslindmpitndqkklmsnnvqivrqqsysimsiikeevlayvvqlplygvidtpcwklhtsplcttntkegsnicltrtdrgwfcdnagsvsffpqaetckvqsnrvfcdtmnsltlpsevnlcnvdifnpkydckimtsktdvsssvitslgaivscygktkctasnknrgiiktfsngcdyvsnkgvdtvsvgntlyyvnkqegkslyvkgepiinfydpIvfpsdefdasisqvnekinqslafirksdellhnvnagksttnpdhsaatkpslflflvsllhiffk氺(SEQID NO 17)将质粒p3. 1-bruGag和p3. I-F-GPI (以单独的方式或者彼此组合的方式)转染到293F细胞中，组合比例有多种(Gag和F的比例为I : 1、3 I和9 I)。每次转染釆用T75培养瓶，使293F细胞单层培养。根据生产商的描述，釆用LIPOFECTAMINE (TM) 2000进行转染。转染后约6小时，用无血清CD293培养基替换所述DMEM+10%FBS生长培养基。在转染后48小时，收集所述生长培养基，低速离心净化残骸；在其后，通过在tris-缓冲盐水(TBS)中的20%蔗糖垫、100，OOOx离心以收集培养基。得到的小球材料在TBS中重悬，使用对HIV-IGag和RSV抗原特异性的抗体，进行蛋白质印迹分析。结果图8示出了所述Gag蛋白质印迹，图9示出了所述RSV蛋白质印迹。所述Gag蛋白质印迹(图8)表明无论所述Gag载体单独转染，还是和所述F载体联合转染，在培养基中都存在充分量的Gag产物。在I : I比例培养物中，所述Gag基因产物的产量有些减少；但是HIV Gag基因表达和VLP出芽没有被RSV F表达关闭，对MLV Gag通常就是这样。如图9所示，在球状样品中检测到所述RSV F抗原；在HIV-IGag和RSV F共同表达的培养物中，在这些样品中所述F抗原的量明显增加。这种存在Gag共表达时高分子量F抗原释放的增加，表明了在HIV-IGag VLP上的假型F抗原。应该注意，在所述RSV蛋白质印迹中，所述Gag产物作为背景带出现，并且这很可能是由于第二共轭抗体对Gag产物展示的某些低水平的交叉活性。 实施例3-规模放大的假型HIV-lGag+RSV F (GPI) VLP 这个实施例描述了具有RSV F糖蛋白GPI-锚定译本的假型HIV-IGag VLP的大规模制备。材料和方法用p3. 1-bruGag 和 p3. I-F-GPI,按比例 3 I (Gag 与 F 的比例)，使用LIPOFECTAMINE (TM) 2000，转染6个T175瓶的293F细胞。转染后约8小时，所述转染培养基(DMEM+10% FBS)用CD293培养基替换。转染后48小时，收集所述生长培养基，净化残骸，通过20%蔗糖垫，在10°C、100，OOOxg离心I小时使VLP沉淀。所述VLP小球在TBS中重悬，分层到20-60%蔗糖步骤梯度，在10°C、100，OOOx离心I小时。梯度分离物通过SDS-PAGE分析，以鉴定含Gag的部分。合并含Gag部分的峰，蔗糖通过TBS稀释3倍，所述VLP通过再次离心(100，000战，1小时，10°0收集。然后在TBS中重悬样品，通过SDS-PAGE、蛋白质印迹和ELISA进行分析。结果图10示出了银染SDS-PAGE凝胶(左边的平板)，其显示了明显的bruGag带( 57Kd)和较浅的与GPI-锚定的F( 61Kd) —致的带。所述F带的鉴定，通过蛋白质印迹确定(图10，右边的平板I)。F抗原存在的进一步证据通过ELISA获得，其中VLP的样品在ELISA平板上系列稀释。与Synagis RSV F-特异中和性的单克隆抗体(MedImmune)反应。在图11中显示的ELISA数据，其中蔗糖-结合型VLP引起与肝脏RSV病毒相似的信号(在它们对Synagis抗体的活性方面)。实施例4-规模放大的假型HIV-lGag+RSV F (截短的)VLP这个实施例描述了具有截去胞质尾区的RSV F糖蛋白的假型HIV-IGag VLP的大规模制备。材料和方法将p3. 1-bruGag 和 p3. I-RSVFT 按比例 3 : I (Gag 和 F 的比值)，使用LIPOFECTAMINE (TM) 2000，转染8个T175瓶的293F细胞。质粒p3. 1_FT含有的合成片段，其截截掉了编码RSV F糖蛋白细胞质尾区的译本。图12示出了 p3. I-RSVFT的图谱。所述F编码序列如下atggaactgctgatcctgaaggctaacgctatcaccaccatcctgaccgctgtcaccttctgcttcgcctc
cggccagaacatcaccgaggaattctaccagtccacctgetccgctgtctccaagggttacctgtccgctctgcgcaccggctggtacacctccgtcatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgctaaggtcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgctgtcaccgagctgcagctgctgatgcagtccacccccgctaccaacaaccgcgctcgccgtgagctgccccgcttcatgaactacaccctgaacaacgccaagaaaaccaacgtcaccctgtccaagaagcgcaagcgccgcttcctgggtttcctgctgggtgtcggttccgctatcgcttccggtgtcgctgtctctaaggtcctgcacctggaaggcgaggtcaacaagatcaagtccgccctgctgtccaccaacaaggctgtcgtgtccctgtccaac
ggtgtctccgtcctgacctccaaggtgctggacctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcgtcaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagactgtcatcgagttccagcagaagaacaaccgcctgctggaaatcacccgcgagttctccgtcaacgctggtgtcaccacccctgtctccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccaaaagaaactgatgtccaacaacgtccagatcgtccgccagcagtcctactctatcatgagcatcatcaaggaagaggtcctggcttacgtcgtccagctgcccctgtacggtgtcatcgacaccccctgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggaaggttccaacatctgcctgacccgcaccgaccgcggctggttctgcgacaacgctggctctgtctccttcttcccccaagctgagacttgcaaggtccagtccaaccgcgtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccctccgaggtcaacctgtgcaacgtcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgacctctaagaccgacgtgtcctcctctgtcatcacctccctgggtgctatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcttccaacaagaaccgcggtatcatcaagaccttctccaacggttgcgactacgtgtccaacaagggcgtcgacaccgtgtccgtcggcaacaccctgtactacgtgaacaagcaggaaggcaagtccctgtacgtcaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttcccctccgacgagttcgacgcttccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggctttcatccgcaagtccgacgagctgctgcacaacgtgaacgctggcaagtctaccaccaacatcatgatcaccactatcatcatcgtgatcatcgtcatcctgctgtctctgatcgctgtcggtctgctgctgtactaa(SEQID NO 18)所述编码的F氨基酸序列如下，所述N-末端信号肽和所述C-末端跨膜区域用下划线表示mel Ii lkanaitti ItavtfcfasRqniteefyqstcsavskRy IsalrtRwytsvitielsnikenkcnRtdakvklikqeldkyknavtelqlImqstpatnnrarrelprfmnytlnnakktnvtlskkrkrrflgflIgvgsaiasgvavskvlhlegevnkiksallstnkavvslsngvsvltskvldlknyidkqllpivnkqscsisnietviefqqknnrlleitrefsvnagvttpvstymltnsellslindmpitndqkklmsnnvqivrqqsysimsiikeevlayvvqlplygvidtpcwklhtsplcttntkegsnicltrtdrgwfcdnagsvsffpqaetckvqsnrvfcdtmnsltlpsevnlcnvdifnpkydckimtsktdvsssvitslgaivscygktkctasnknrgiiktfsngcdyvsnkgvdtvsvgntlyyvnkqegkslyvkgepiinfydpIvfpsdefdasisqvnekinqslafirksdel IhnvnaRksttnimittiiiviivi I Isl iavRl I Iy^ (SEQID NO 19)转染后约8小时，所述转染培养基(DMEM+10% FBS)被CD293培养基替换。转然后48小时，收集所述生长培养基，净化残骸，通过20%蔗糖垫以100，OOOx g、在10°C离心I小时，以沉淀VLP。所述VLP沉淀小球在TBS中重悬，分层到20-60%蔗糖步骤梯度中，在100，OOOx g、10°C离心I小时。梯度分离物通过SDS-PAGE分析，以识别含Gag的分离部分。合并含Gag-峰的部分，蔗糖用TBS稀释3倍，VLP通过再次离心(100，OOOx, 10°C, I小时)收集。所述样品然后在TBS中重悬，通过SDS-PAGE、蛋白质印迹和ELISA分析。结果图13示出了银染SDS-PAGE凝胶(左边的平板)，其显示了明显的bruGag带( 57Kd)和较浅的与截短的F—致的带( 61Kd)。F带的鉴定通过蛋白质印迹确认(图13，右边的平板)。存在F抗原的进ー步证据通过ELISA获得，在其中，VLP样品在ELISA平板上系列稀释，与Synagis RSV F-特异中和性的单克隆抗体(MedImmune)反应。在图14中显示的ELISA数据，其中蔗糖-结合型VLP引起与肝脏RSV病毒相似的信号(在它们对Synagis抗体的活性方面)。蔗糖-结合型VLP的样品也进行电子显微镜负染。如图15所述典型显微照相，表明统ー的披膜颗粒的存在，其含有不成熟(未加工的)Gag核心，如同可以预期利用HIV-IGag多蛋白前体作为VLP出芽的引擎。 实施例5-假型HIV-lGag+RSV F VLP的免疫原性这个实施例表明在小鼠中，通过RSV F-假型HIV Gag VLP诱导中和性的抗体应答。材料和方法RSV F-GPI假型HIV-lGag VLP按照实施例3制备，并且被用来免疫小鼠。小鼠接受两次免疫，每次间隔4周，其中每次免疫包括在TBS中的VLP，其含有约O. 5 μ g的所述F抗原。两周后收集第二次免疫血清样品，用于RSV空斑減数实验分析(中和性病毒)。肝脏RSV等分试样，其平均含有125噬菌斑形成単位(pfu)的病毒，用系列稀释的RSV中和性的对照抗体或者血清(来自免疫小鼠或对照小鼠)处理。所述抗体处理的病毒接种液然后被添加到Vero细胞96孔平板的孔中，所述平板在37°C孵育48小时以允许非中和性病毒感染细胞。在48小时后，RSV生长的噬菌斑被鉴定，通过将细胞固定，允许它们与山羊多克隆RSV-特异性反应。结果这个实验的数据如图16所示，其中列I和列2分别显示Synagis和山羊抗-RSV对照抗体表现出的RSV中和性的活性。列3和列4代表阴性对照小鼠血清，其中可见没有中和性活性。列5-列10代表VLP-免疫的小鼠血清，其中在6/6只免疫小鼠中可见显著的中和性活性。最終，列11和列12代表未处理RSV接种液，其中没有中和性活性，也没有观察到。这些数据表明，含有RSV F抗原的假型VLP可以诱导显著的RSV-特异中和性的抗体应答。实施例6-假型ALV Gag+RSV F (截短的)VLP这个实施例表明了 RSV F-假型ALV Gag VLP的制备。除了 HIV-IGag (慢病毒)，编码禽白血病病毒(ALV，α反转录病毒)Gag产物的载体也被构建。当其被识别，HIV病毒从脂筏区出芽，HIV-IGag能够定位到脂筏，关于所述ALV Gag产物的相似数据是缺失的。材料和方法为了测定在反转录病毒颗粒(例如ALV Gag)上的所述RSV F糖蛋白是否是假型的，编码ALV Gag的载体被制备。质粒p3. 1-alvGag-dPR含有合成序列，其编码所述ALV Gag基因产物，并缺乏它的C-末端蛋白酶结构域。反转录病毒(例如ALV)含有它们的蛋白酶结构域，并将其作为所述Gag多蛋白的部分，而不是所述Pol多蛋白，其它反转录病毒通常也是这样。因为所述蛋白酶结构域对VLP出芽是不必要的，它不被包含在最终载体中。图17示出了 p3. 1-alvGag-dPR的图谱。所述核苷酸编码序列如下atggaagctgtgatcaaggtcatctcctccgcttgcaagacctactgcggcaagacctccccctccaagaaagaaatcggtgctatgctgtccctgctgcagaaagagggcctgetgatgtccccctccgacctgtactcccccggtt cctgggaccctatcaccgctgctctgtcccagcgtgctatgatcctgggcaagtccggcgaactcaagacctggggcctggtgctgggtgctctgaaggctgctcgcgaggaacaagtgacctccgagcaggctaagttctggctgggtctgggtggtggtcgtgtgtccccccctggtcccgagtgcatcgagaagcccgctaccgagcgtcgtatcgacaagggcgaggaagtgggcgagactaccgtgcagcgtgacgctaagatggctcccgaggaaaccgctacccccaagaccgtgggcacctcctgctaccactgcggcaccgctatcggttgcaactgcgctaccgcttccgctcccccccctccttacgtgggctccggcctgtacccttccctggctggtgtcggcgagcagcaaggacagggtggagacacccctcccggtgctgaacagtcccgtgccgagcctggtcacgctggtcaagctcccggtcccgctctgactgactgggctcgtgtgcgtgaggaactggcttccaccggtccccctgtggtggctatgcccgtggtcatcaagaccgagggtcccgcttggacccccctggaacccaagctgatcacccgtctggctgacaccgtgcgtaccaagggcctgcgttccccaatcaccatggctgaggtggaggctctgatgtcctcccccctgctgcctcacgacgtgaccaacctgatgcgtgtgatcctgggtcccgctccctacgctctgtggatggacgcttggggcgtgcagctgcagaccgtgatcgctgctgctacccgtgacccccgtcaccctgctaacggacagggtcgtggcgagcgtaccaacctgaaccgtctgaagggcctggctgacggcatggtcggcaaccctcagggacaggctgctctgctgcgtcctggcgagctggtcgctatcaccgccagcgctctgcaggctttccgtgaggtggcccgtttggccgaaccagctggtccctgggctgacatcatgcagggcccctccgagtccttcgtggacttcgctaaccgtctgatcaaggctgtggagggctccgacctccctccttccgctcgtgctcccgtgatcatcgactgcttccgtcagaagtcccagcccgacatccagcagctgatccgtaccgctccctccaccctgactacccctggcgagatcatcaagtacgtgctggaccgtcaaaagaccgctcccctgaccgaccaaggtatcgctgccgctatgtcctccgctatccagcccctgatcatggctgtcgtgaaccgcgagagggacggacagaccggttccggtggtcgtgetcgtggcctgtgctacacttgcggttcccccggtcactaccaggctcagtgccccaagaagcgcaagtccggaaactcccgcgagcgctgccagctctgcaacggcatgggtcacaacgccaagcagtgccgcaagcgcgacggaaaccagggccagcgtcccggaaagggactgtcctccggtccttggcctggtcctgagccccctgctgtgtcctaa(SEQ ID NO :20)所述编码的氨基酸序列如下meavikvissacktycgktspskKeigamlsilqkegllmspsdlyspgswdpitaalsqramiIgksgelktwglvlgalkaareeqvtseqakiwlglgggrvsppgpeciekpaterridkgeevgettvqrdakmapeetatpktvgtscyhcgtaigcncatasappppyvgsglypslagvgeqqgqggdtppgaeqsraepghagqapgpaltdwarvreeiastgppvvampvviktegpawtplepklitrladtvrtkglrspitmaevealmsspllphdvtnlmrvilgpapyalwmdawgvqlqtviaaatrdprhpangqgrgertnlnrlkgladgmvgnpqgqaallrpgelvaitasalqafrevarlaepagpwadimqgpsesfvdfanrlikavegsdlppsarapvndcfrqksqpdiqqlirtapst lttpgenkyvldrqktapltdqgiaaamssaiqplimavvnrerdgqtgsggrarglcytcgspghyqaqcpkkrksgnsrercqlcngmghnakqcrkrdgnqgqrpgkglssgpwpgpeppavs*(SEQ ID NO :21)将质粒p3. 1-alvGag-dPR和p3. I-RSVFT以单独的方式，或者以比例I : 1、3 : I和9 I (Gag和F的比值)组合的方式，转染进293F细胞。转然后48小时，收集培养基，净化残骸，在10°C、100，OOOxg离心I小时以沉淀VLP。使用上文描述的Synagis单克隆抗体，通过ELISA分析重悬的沉淀小球的RSV F抗原活性。结果如图18所示的数据表明，p3. 1-alvGag-dPR加p3. I-RSVFT的组合，导致较多的Synagis-活性VLP的释放，相对于p3. I-RSVFT单独表达观察到的。因此，所述RSV F抗原(当证明在其自身上具有ー些VLP出芽活性)可以是到Gag产物上的假型，包括来自慢病毒和α反转录病毒。实施例7-RSV F假型VLP的制备比较(在编码HIV-IGag和alvGag-dPR的载体之间)这个实施例比较了假型HIV-lGag+RSV F VLP的制备和alvGag-dPR+RSV F VLP的 制备。材料和方法将质粒p3. 1-alvGag-dPR与ρ3·トRSVFT —起，以I : I和3 : I的比例共转染到293F细胞。另外，质粒p3. I-bruGag与p3. I-RSVFT 一起，以3 : I的比例共转染到293F细胞。转然后72小时，收集所述培养基，净化残骸，在10°C、100，OOOxg离心I小时以沉淀VLP。使用上文描述的Synagis单克隆抗体，通过ELISA分析重悬的沉淀小球的RSV F抗原活性。结果如图19所示的数据表明,在所所有3种转染中检测到相似量的Synagis活性VLP,证明了所述alvGag-dPR表达载体与HIV Gag表达载体在制备RSV F-假型VLP方面，效果相等。实施例8-尝试的假型具有MPMV-Gag、BVL-Gag和EIAV-Gag的RSVF这个实施例测定来自其它反转录病毒的Gag蛋白对于制备RSV F-假型VLP是否有效。材料和方法使用常规的合成Gag编码序列片段,构建载体,其编码Mason Pfizer Monkey病毒(MPMV，β反转录病毒)、牛白血病病毒(BLV，delta反转录病毒)和马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus) (EIAV,慢病毒)Gag产物的载体,其通过DNA序列分析确定。所述载体与所述F-编码载体p3.トRSVFT，以3 : I (Gag与F的比值)的比例，共转染进293F细胞。转染后72小吋，收集所述培养基，净化残骸，在10°C、100，OOOxg离心I小时以沉淀VLP。使用上文描述的Synagis单克隆抗体,通过ELISA分析重悬的沉淀小球的RSV F抗原活性。结果数据如图20所示,其中证明编码三个可选择Gag产物的载体像alvGag —样,在RSV F-假型VLP的释放方面不发挥作用，其采用F-特异单克隆抗体通过ELISA分析測定。所述较弱的F ELISA信号(伴随有编码MPMV Gag、BLV Gag，和EIAV Gag的载体获得)与RSV F単独表达获得的信号相似，其中F蛋白自身出芽(Gag-独立的)活性通常被检测到。MPMV、BLV和EIVAGags不能使F颗粒释放显著增加，与MLV Gag的结果相似，其中后者的Gag产物被表明不和RSV F形成假型，因此当与F共表达时不能増加含RSV F颗粒的释放。此夕卜，数据表明在存在RSV F表达时，MLV、MPMV、BLV和EIAV Gags的表达被抑制，表明后者Gags的VLP产物和RSV F表达之间不相客。实施例9-完整蛋白酶alvGag与alvGag-dPR之间的比较除了 alvGag-dPR，具有C-末端蛋白酶活性的完整alvGag也可以于所述RSV F蛋白形成假型VLP。这在转染实验中被证明，将p3. Ι-alvGag-dPR(加FL或FT)转染、与p3. I-alvGag (加 FL 或 FT)转染、以及 p3. l-alvGag-dPR 和 p3. I-alvGag (加 FL 或 FT)的混合物转染，这三者转染后的VLP释放作比较。图21示出了质粒p3. I-alvGag的图谱，其编码完整alvGag多蛋白，具有完整反转录病毒蛋白酶活性。所述核苷酸编码序列如下atggaagccgtgatcaaagtgatcagcagcgcctgcaagacctactgcggcaagaccagccccagc
aagaaagaaattggcgccatgctgtctctgctgcagaaggaaggcctgctgatgagccccagcgacctgtacagccccggcagctgggatcctatcacagctgccctgagccagagagccatgatcctgggcaagagcggcgagctgaaaacctggggcctggtgctgggagccctgaaggccgccagagaagaacaggtcaccagcgagcaggccaagttttggctgggcctgggcggaggaagagtgtctccccctggccccgagtgtatcgagaagcccgccaccgagcggagaatcgacaagggcgaggaagtgggcgagacaaccgtgcagcgggacgccaagatggcccctgaggaaaccgccacccccaagaccgtgggcaccagctgctaccactgtggcaccgccatcggctgcaattgtgccaccgccagcgcccctccacctccttacgtgggcagcggcctctatccttcactggccggcgtgggcgaacagcagggacagggcggcgatacacctcctggcgccgagcagagcagagccgaacctggacatgccggacaggcccctggacctgctctgaccgattgggccagagtgcgggaggaactggcctctaccggaccccctgtggtggctatgcccgtggtgattaagacagagggccctgcctggacccctctggaacccaagctgatcacccggctggccgatacagtgcggaccaagggcctgagaagccccatcaccatggccgaggtggaggccctgatgagcagccccctgctgccccacgacgtgaccaacctgatgagagtgatcctgggacccgctccctacgccctgtggatggatgcctggggcgtgcagctgcagacagtgatcgccgctgccaccagagatcccagacaccccgccaatggccagggcagaggcgagagaaccaacctgaaccggctgaagggcctggccgacggcatggtcggcaatcctcagggacaggccgctctgctgaggcctggcgaactggtggccatcacagccagcgccctgcaggccttcagagaagtggctagactggccgaacctgccggcccttgggccgatatcatgcagggccccagcgagagcttcgtggacttcgccaaccggctgatcaaggccgtggagggcagcgatctgcctcctagcgccagagcccccgtgatcatcgactgcttccggcagaagtcccagcccgacatccagcagctgatcagaaccgcccccagcaccctgaccacccctggcgagatcatcaaatacgtgctggaccggcagaaaaccgcccctctgaccgatcagggcattgccgccgctatgagcagcgccatccagcccctgattatggccgtggtgaaccgggagagggatggccagacaggaagcggcggcagagctagaggactgtgctacacctgtggcagccctggccactaccaggctcagtgccccaagaagcggaagtccggcaacagccgggagagatgccagctgtgcaacggcatgggccacaacgccaagcagtgcagaaagagggacggcaatcagggccagaggcccggcaaaggcctgtctagcggaccttggcctggacctgagcctcctgccgtgagcctggccatgaccatggaacacaaggaccggcccctggtccgcgtgatcctgaccaacaccggcagccaccccgtgaagcagcggagcgtgtacatcaccgccctgctggactctggcgccgacatcaccatcatcagcgaagaggactggcccaccgactggcctgtgatggaagccgccaacccccagatccacggcatcggcggaggcatccccatgcggaagtccagagacatgatcgagctgggcgtgatcaaccgg
gacggcagcctggaaagacccctgctgctgttcccagctgtggccatggtccggggcagcatcctgggcagagactgtctgcagggactgggcctgcggctgaccaatctgtgatga(SEQ ID NO :22)所述编码的氨基酸序列如下meavikvissackt ycgktspskKeigamlsllqkegllmspsdlyspgswdpitaalsqramilgksgeIktwglvlgalkaareeqvtseqakiwlglgggrvsppgpeciekpaterridkgeevgettvqrdakmapeetatpktvgtscyhcgtaigcncatasappppyvgsglypsIagvgeqqgqggdtppgaeqsraepghagqapgpaltdwarvreeiastgppvvampvviktegpawtplepklitrladtvrtkglrspitmaevealmsspllphdvtnlmrvilgpapyalwmdawgvqlqtviaaatrdprhpangqgrgertnlnrlkgladgmvgnpqgqaailrpgelvaitasaiqafrevarlaepagpwadimqgpsesfvdfanrlikavegsdlppsarapviidcfrqksqpdiqqlirtapstlttpgenkyvldrqktapltdqgiaaamssaiqplimavvnrerdgqtgsggrarglcytcgspghyqaqcpkkrksgnsrercqlcngmghnakqcrkrdgnqgqrpgkglssgpwpgpeppavslamtmehkdrplvrviltntgshpvkqrsvyitalldsgaditiiseedwptdwpvmeaanpqihgi gggipmrksrdmielgvinrdgslerplIlfpavamvrgsilgrdclqglglrItnl*(SEQ ID NO :23)转染之后，培养基上层被净化残骸，VLP通过30%蔗糖垫沉淀。在VLP上的F抗原释放的量的定量，通过ELISA分析进行，使用O. 2微米过滤底ELISA平板，其中VLP被捕捉在过滤底上，然后与RSV-特异性抗体反应，使用与辣根过氧化物酶共轭的ニ级抗体显影。如图22显示的分析结果，表明所述质粒p3. Ι-alvGag-dPR和p3. Ι-alvGag,在与F编码质粒共转导之后，释放到培养基中的高分子量的RSV F抗原活性的量相似。而且，当p3. Ι-alvGag-dPR和p3. Ι-alvGag以10 I或3 I的比例时，释放到培养基中的RSV F抗原活性的量相似。图23表明在这三种转染的每种中，所述ALV Gag蛋白的状态相似。如所预期的，p3. Ι-alvGag-dPR转染产生明显的61kD带，其和完整Gag-dPR多蛋白的表达一致(泳道I和泳道2)。剩余的泳道代表p3. Ι-alvGag转染或者p3. l_alv_Gag和p3. Ι-alvGag-dPR的组合转染，其产生明显的27kD带，与Gag加工一致，由于反转录病毒蛋白酶活性的存在。如图24 所不，从使用 p3. 1-RSVFT 与 ρ3· l-alvGag-dPR 和 ρ3· I-alvGag (alvGag-dPR alvGag RSVFT的值为10 I 3)共转染后的细胞中，制备VLP，通过将其与在tris-缓冲盐水中的30%和60%之间的蔗糖层结合，100, OOOxg离心I小时，纯化来自这种共转染的VLP。VLP被涂敷到硝基纤维素-涂布的300目铜网格，用2%W/vこ酸铀酰负染，通过电子显微镜分析。如图24所示的显微照片表明被膜VLP的存在。实施例10-RSV F-假型ALV Gag VLP在小鼠中诱导中和性的抗体应答。含有RSV “FT”或者“FL”的 ALV Gag VLP,从 p3. l-alvGag-dPR 与 ρ3· 1-RSVFT (或者p3. 1-RSVFL) 一起转染后的HEK293细胞中制备。所述“Gag”与“F”质粒DNA的转染比例(“Gag” “F”质粒DNA)是3 : I。含有F抗原的VLP从生长培养基中沉淀，所述培养基在第三天，通过30%蔗糖垫、100，OOOx g离心收集，然后使其与20-60%不连续蔗糖梯度结合。含有少于lug F抗原的VLP的等分试样，被用来免疫多种小鼠，所述每只小鼠接受的引导和追加注射接种间隔21天。每周疫苗接种物同时含有“FT”和“FL”VLP。在所述追加注射两周后，收集免疫血清，用于测量RSV-特异性抗体应答。这些数据可以在图25中可见，其中上方的平板显示ELISA效价数据，其采用固定在ELISA平板上的RSV病毒颗粒的传统ELISA，来检测血清活性。所述底部的平板显示了使用在上述实施例5所描述的空斑減数实验测量的病毒中和性抗体的水平。
实施例11-尝试的假型HSV gD+ALV Gag
其它披膜病毒制备表面糖蛋白，其实所述RSV F蛋白的类似物；这些糖蛋白可以发挥与宿主细胞受体粘附和相互作用的功能，并且在病毒发病机理方面其重要作用。ー个来自单纯疱疹病毒(HSV)的这种实施例是糖蛋白D(gD)，其在病毒进入期间与ー种以上的宿主受体相互作用(參见 J. C. Whitbeck等。The major neutralizing antigenic site onHerpes simplex Virus glycoprotein D overlaps a receptor-binding domain. 1999.J Virol 73(12) :9879-9890)。在预防HSV感染的临床试验中，测试了 HSV gD亚单位疫H (D. I. Bernstein, et a_l. ， safety and immunogenicity of glycoprotein D-adjuvantgenital herpes vaccine. 2005. Clin Inf Disease 40:1271-1281)。为了比较在ALV基于Gag的VLP上的假型化可选择的病毒的糖蛋白，使用了所述HSV gD基因进行与p3. 1-alvGag-dPR的共表达研究。材料和方法 合成人类HSV 2型gD基因(GeneBank GeneID =1487358)，并将其克隆进pcDNA3. 1(-)载体(Invitrogen),以构建质粒p3. 1-HSVgD。所述质粒图谱见于图26。所述核酸编码序列如下atgggtagactgacttccggagtgggcaccgccgctctgctggtcgtggctgtgggcctgcgcgtcgtgtgcgccaagtacgcactggccgatccctccctgaagatggccgaccctaaccgcttccgcggcaagaacctccccgtgctggaccagctgaccgacccccctggcgtgaagcgcgtgtaccacatccagccttccctggaagatcccttccagcccccctccatccccatcaccgtgtactacgcagtgctggaacgcgcctgccgctccgtgctgctgcatgetccctccgaggcccctcagatcgtgcgcggagcctccgacgaggcccgcaagcacacctacaacctgactatcgcctggtacaggatgggcgacaactgcgccatccctatcactgtgatggaatacaccgagtgcccctacaacaagtccctgggcgtgtgccccatccgcacccagccccgctggtcctactacgactccttctccgccgtgtccgaggacaacctgggcttcctgatgcacgcccctgccttcgaaaccgccggcacctacctgaggctggtcaagatcaacgactggaccgagatcacccagttcatcctggaacaccgcgccagggcctcttgcaagtacgctctgcccctgcgcatcccccctgccgcctgcctgacctctaaggcctaccagcagggcgtgaccgtggactccatcggcatgctgcctcgcttcatccccgagaaccagcgcaccgtggccctgtacagcctgaagatcgccggctggcacggccccaagccaccctacacctccaccctgctgccccccgagctgtccgacaccaccaacgccacccagcccgagctggtgcccgaggaccctgaggactccgccctgetcgaagatcccgccggaaccgtgtcctcccagatcccccccaactggcacatcccttccatccaggacgtggccccccaccacgctccagccgcaccttccaacccaggcctgatcatcggagccctggccggctccaccctggccgtcctggtcatcggcggaatcgctttctgggtcaggagaagggcccagatggctccaaagcgcctgcgcctgccccacatccgcgacgacgacgcccctccctctcaccagcccctgttctac(SEQ ID NO :24)所述编码的氨基酸序列如下MgrltsgvgtaallvvavglrvvcakyaiadpslkmadpnrfrgknlpvldqltdppgvkrvyhiqpsIeapiqppsipItvyyavleracrsviihapseapqivrgasdearkhtynltiawyrmgdncaipItvmeytecpynksIgvcpirtqprwsyydsfsavsednlgfImhapafetagtylrlvkindwteitqfIlehrarasckyalplrippaacltskayqqgvtvdsigmlprfipenqrtvalysikiagwhgpKp
pytstIIppelsdttnatqpelvpedpedsalledpagtvssqippnwhipsiqdvaphhapaapsnpgliigalagstlavlviggiafwvrrraqmapkrlrlphirdddappshqplfy(SEQ IDNO 25)将质粒ρ3· I-HSVgD和ρ3·トalvGag-dPR，以分别单独的方式，或者以比例(HSVgD ALVGag) I 1,5.6 I和2. 3 I组合的方式，转染到293F细胞。用上述的DNA转染在T75瓶中的HEK 293F单层，使用LIPOFECTAMINE (TM) 2000，孵育8小时，再转换到新鲜无血清培养基孵育48小时。收集所述培养物上层，离心(3分钟，500xg)以沉淀细胞，制备净化的培养物上层清液。这些样品直接在ELISA中筛选，或者覆盖到30%蔗糖-TBS垫上进行超高速离心(10°C，100，OOOx g，I小吋)，以沉淀VLP和多聚体蛋白复合物。超高速离心沉淀的材料(即，UC沉淀)在无菌TBS中重悬，在4-12% SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris Gels,Invitrogen)上电泳,转移到聚偏氟こ烯薄膜进行蛋白质印迹分析。HSVgD和ALV Gag蛋白的表达用特异性抗体试剂跟踪抗-HSVgD单克隆抗体(GeneTex)和山羊抗-p27alvGAG多克隆抗体(Synbiotics)。直接ELISAELISA在覆盖的免疫II微孔板(Immunon II microtiter plate)的孔中进行,所述孔中装有测试样品或者对照样品(25-100 μ L的培养物上层清液)。在TBS中漂洗，在新鲜牛奶封闭液(在TBS中的5%w/v脱脂乳和l%w/v BSA，其含有O. 1% v/v Tween 20)中封闭室温I小时，在TBS中漂洗，在初级抗体(抗-HSVgD mAb在I μ g/mL封闭液中，抗-ALVGag Ab在以I : 1000稀释的封闭液中)中4°C孵育过夜。清洗平板(3x TBS+0. I % Tween20加3x TBS)，在合适的ニ级抗体(HRP-共轭的杭-小鼠或者杭-山羊抗体，在以I : 2000稀释的封闭液中)中室温孵育I小时，清洗，添加柠檬酸盐缓冲剂中的领苯ニ胺底物。使用10%硫酸终止颜色显影,在490nm读取平板。免疫印迹分析蛋白质印迹分析步骤如下聚偏氟こ烯(PVDF)印迹在室温新鮮牛奶封闭液(与上文所述ー样)中封闭I小时，在初级抗体(I μ g/mL抗-HSVgD mAb，以I : 2000稀释的抗-ALV Gag pAb)中4°C过夜孵育。印迹在新鲜牛奶封闭液中清洗15分钟，3次，在AP-共轭的杭-小鼠或者杭-山羊抗体(在封闭液中以I : 2000稀释)室温封闭I小吋。在Tris-NaCl-MgCl2PH 9. 5缓冲剂清洗印迹15分钟，3次，将其浸没在NBT-BCIP底物中进行颜色显影。所述反应在2mM Na2EDTApH 8. O缓冲剂中终止，在新鲜3MM过滤纸片上干燥印迹。电子显微镜
来自HSVgD加alvGag-dPR转染的HEK 293F细胞的UC沉淀物质被涂敷到硝基纤维素-涂布的300目铜网格，用2% w/vこ酸铀酰负染，进行电子显微镜分析。如图24所示的显微照片表明披膜VLP的存在。使用SISSoft-Imaging Systems软件界面，以嵌入的基准尺，捕捉颗粒图像作为8位的数据文件。结果如图27所示，为筛选HSVgD和alvGag-dPR转染的上层清液的ELISA数据。以剂量依赖方式构建的p3. I-HSVgD构建体转染的细胞形成的上层清液中，检测到HSVgD蛋白。接受p3. 1-alvGAG-dPR构建体的所有转染显示了在上层清液中ALV Gag蛋白的基本水平。虽然覆盖的微孔板直接与仅仅25 μ L的Τ75转染上层体积，甚至最低的alvGAG-dPR DNA水平(1.5 μ g/瓶)，在所述比例5. 6 l(gD GAG)转染，但是多克隆检测试剂产生强烈的信号。因为所述HSVgD检测活性是克隆的，所述ALV Gag是多克隆抗体，因此没有进行表达水平的直接比较。图28显示了在所述T75-瓶规模中的两次HEK 293F转染研究的蛋白质印迹结果。下述的表I列出了瓶标记A-G，每个T75瓶添加啊微克级别的DNA，和最終的HSVgD和alvGAG-dPR构建体比例。代表约10%的T75收集物的UC沉淀样品被装载到复本凝胶中，印迹和用所述抗-HSVgD和抗-p27alvGAG抗体试剂探针测试。所述数据显示在哺乳动物宿主细胞中，HSVgD和ALV Gag蛋白的DNA剂量依赖型表达。如上述ELISA结果所提示的，ALV Gag蛋白的表达是強烈的，甚至在低DNA水平时(样品E，I. 5 μ g的输入量)。表达的HSVgD的质量在预期的范围内，如上文所讨论的。所述ALV Gag(-dPR)电泳，产生预期的约60kDa，其是在印迹图像中较强信号带之一，如图28(平板(B))所示。较小的带可能是降解的产物；所述较大的带可能是多聚体或者复合物，其中其它蛋白在NuPAGE凝胶系统中没有完全变性或者还原，相似的Gag结合模式对其它Gag核心也存在(例如，图8HIV_Gag印迹)。所述ELISA和蛋白质印迹数据表明=HSVgD和ALV Gag在HEK 293F转染系统中共表达。表IHEK293F 转染 #314-85 =样品 A、B、和 C转染#314-91 =样品 D、E、F 和 G
权利要求
1.一种嵌合病毒样颗粒，包含慢病毒或a-反转录病毒Gag多肽、和呼吸道合胞病毒F多肽。
2.根据权利要求I所述的病毒样颗粒，其中所述Gag多肽来自于猿猴免疫缺陷病毒或者人类免疫缺陷病毒。
3.根据权利要求I所述的病毒样颗粒，其中所述Gag多肽来自于禽白血病病毒或劳氏肉瘤病毒。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的病毒样颗粒，进一步包含哺乳动物糖基化。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的病毒样颗粒，进一步包含与所述病毒样颗粒混合的佐剂。
6.根据权利要求5所述的病毒样颗粒，其中所述佐剂定位于所述病毒样颗粒的外部。
7.根据权利要求5所述的病毒样颗粒，其中所述佐剂定位于所述病毒样颗粒的内部。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述佐剂与所述呼吸道合胞病毒F多肽共价连接形成共价键。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的病毒样颗粒，其中中和性的抗-RSV-F抗体与所述呼吸道合胞病毒F多肽结合。
10.根据权利要求9所述的病毒样颗粒，其中所述中和性抗-RSV-F抗体是帕利珠单抗。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的病毒样颗粒，进一步包含附加的VLP-缔合抗原。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的病毒样颗粒，进一步包含与第二抗原连接的附加的VLP-缔合多肽。
13.—种制备嵌合病毒样颗粒的方法,包括 (a)同时提供一种或多种表达载体，其表达慢病毒或者a-反转录病毒Gag多肽、和呼吸道合胞病毒F多肽； (b)在介质中将所述一种或多种表达载体引入真核细胞中；以及 (C)表达所述Gag多肽和所述呼吸道合胞病毒F多肽，以制备嵌合病毒样颗粒。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞、哺乳动物细胞、或者昆虫细胞。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述Gag多肽来自于猿猴免疫缺陷病毒或者人类免疫缺陷病毒。
17.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述Gag多肽来自于禽白血病病毒或者劳氏肉瘤病毒。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，进一步包括从培养所述真核细胞的所述介质中回收所述病毒样颗粒的步骤。
19.根据权利要求13-18的中任一项所述的方法，其中所述表达载体是病毒载体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述病毒载体选自腺病毒、疱疹病毒、痘病毒和反转录病毒。
21.根据权利要求19或者20所述的方法，其中所述病毒载体进一步包括转录调节因子，其当所述病毒载体在助细胞中繁殖时下调所述呼吸道合胞病毒F多肽的表达；或者上调所述呼吸道合胞病毒F多肽在真核细胞中的表达。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述转录调节因子是tet抑制子或者金属硫蛋白诱导的增强子。
23.根据权利要求13-22中任一项所述的方法，其中所述真核细胞选自BHK细胞、VERO细胞、HT1080细胞、MRC-5细胞、WI 38细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、HEK293细胞、293T细胞、RD 细胞、C0S-7 细胞、CHO 细胞、PER. C6 (TM)细胞、Jurkat 细胞、HUT 细胞、SUPT 细胞、C8166细胞、M0LT4/克隆8细胞、MT-2细胞、MT-4细胞、H9细胞、PMl细胞、CEM细胞、骨髓癌细胞、SB20细胞、LtK细胞、HeLa细胞、WI-38细胞、L2细胞、CMT-93、和CEMX174细胞。
24.根据权利要求13-23中任一项所述的方法，进一步包含附加的VLP-缔合抗原。
25.根据权利要求13-23中任一项所述的方法，进一步包含与第二抗原连接的附加的VLP-缔合多肽。
26.根据权利要求13-25中任一项所述的方法，其中中和性的抗-RSV-F抗体与所述表达的呼吸道合胞病毒F多肽结合。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述中和性的抗-RSV-F抗体是帕利珠单抗。
28.一种治疗或者预防呼吸道合胞病毒感染的方法，包括对受试者施用免疫原性量的权利要求1-10中任一项所述病毒样颗粒、或者通过权利要求13-27中任一项所述的方法制备的所述病毒样颗粒。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述施用在所述受试者内引起保护性的免疫应答。
30.根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述施用选自下组的路径施用皮下给药、经皮给药、皮内给药、真皮下给药、肌内给药、经口给药、口服给药、鼻内给药、口腔给药、舌下给药、腹膜内给药、阴道内给药、直肠给药和颅内给药。
31.一种药物组合物，包含免疫原性量的权利要求1-11中任一项所述的病毒样颗粒、或者通过权利要求13-27中任一项所述的方法制备的病毒样颗粒。
32.权利要求31所述的药物组合物，进一步包含药学上可接受的载体。
33.一种预防呼吸道合胞病毒感染的方法，其包括对受试者施用免疫原性量的权利要求1-11中任一项所述的病毒样颗粒、或者权利要求13-27中任一项所述的方法制备的病毒样颗粒。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述施用选自以下的途径皮下给药、经皮给药、皮内给药、真皮下给药、肌内给药、经口给药、口服给药、鼻内给药、口腔给药、舌下给药、腹膜内给药、阴道内给药、直肠给药和颅内给药。
全文摘要
本发明涉及嵌合RSV-F多肽、和慢病毒或α-反转录病毒基于GAG的病毒样颗粒(VLP)。本发明也包括制备和使用这种嵌合VLP的方法。在某些实施方案中，所述嵌合VLP的GAG多肽包含HIV或者ALV GAG多肽。
文档编号C12N15/86GK102753582SQ201080049907
公开日2012年10月24日 申请日期2010年11月3日 优先权日2009年11月3日
发明者J·R·海恩斯 申请人:莱戈赛特医药股份有限公司