来自actinomaduranamibiensis的抗菌和抗病毒肽的制作方法

专利名称：：来自actinomaduranamibiensis的抗菌和抗病毒肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及从w"/m》/es&(DSM6313)分离的新肽，其制备方法及其用于制备下述药物的用途，所述药物用于治疗细菌感染、治疗病毒感染和治疗疼痛。
背景技术：
：文献中已知若干种高度桥连的肽，例如从芋螺(conesnail)中分离的芋螺多肽(conopeptide，综述见例如Terlau&Olivera，Physiol.Rev.2004，84，41-68)或来自革兰氏阳性菌来源的所谓的羊毛硫抗生素(Chatterjee等，Chem.Rev.2005，105，633-683)。所述肽具有多种功用。在其他功用中，羊毛硫抗生素乳链菌肽从许多年前已被用作食品防腐剂。所述芋螺多肽例如适用于治疗疼痛、糖尿病、多发性硬化和心血管疾病，并且目前正进行临床前或临床开发。芋螺多肽的实例为a-GI(序列ECCNPACGRHYSC*,*酰胺化的，连接能力(connectivity):1-3，2-4)和a-GID(序列IR/CCSNPACRVNNOHVC,连接能力l-3，2-4),其中O/Hyp是羟脯氨酸，且连接性指出涉及各特异二硫键的半胱氨酸的位置，例如在a-GID中为第一到第三，和第二到第四<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>j__-^_■^--.............-'—'S-S-~~-H2N-lle-Arg-Cys-CSer-Asn-PrcKAIa-Gys-Arg-WAS!>Mf>Hyp'His-His-Cys-OHL__——s—$——__J(ex-GID)。发明概述现在已惊人地发现，高度桥连的肽可从微生物菌林爿"/朋/mw^m/m附/6/e"^y(DSM6313)中分离，并适用于治疗细菌感染、病毒感染和/或疼痛。发明详述本发明的一个实施方案是式(I)化合物，其中Rl为H、C(OHC广C6)烷基或C(0)-0-(C广C6)烷基；R2为OH、NH2、NH-(C广C6)烷基、NH-(C广C4)亚烷基-苯基或NH-(d-C4)亚烷基-吡咬基；R3和R4彼此独立地为H或OH，或R3和R4—起为-O;且m和n7彼此独立地为0、l或2;其为任何立体化学形式，或是任何比例的任何立体化学形式的混合物，或其生理学可耐受的盐。在另一实施方案中，式(I)化合物是式(II)化合物，其中R1、R2、R3、R4、m和n如上文定义。R1优选为H。R2优选为OH。R3和R4优选为H或OH，其中如果R3为OH则R4为H，且如果R3为H则R4为OH，或R3和R4—起为=0。更优选R3和R4为H或OH，其中如果R3为OH则R4为H，且如果R3为H则R4为OH。优选m和n均为0，或m和n均为2，或m为0且n为2，或m为2且n为0。更优选m和n均为0。本发明的另一实施方案是式(I)或式(II)化合物或其生理学可耐受的盐，其中Rl为H;R2为OH;R3和R4为H或OH,其中如果R3为OH则R4为H，且如果R3为H则R4为OH;且m和n彼jt匕独立地为0、l或2，优选m和n均为0，或m和n均为2，或m为0且n为2，或m为2且n为0，尤其优选m和n均为O。最优选式(I)化合物是式(III)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>为了进一步表征本发明的化合物，从核糖体肽合成将肽残基转化回其可能的前体。残基l和10中的a、a-双取代的氨基酸在文献中没有报导。所述氨基酸可被描述为通过亚甲基桥连并在P-位置上被取代的Ala残基，:i口下文所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本发明还涉及根据本发明的式(l)、(n)和(lll)的化合物的所有明显化学等价物。这些等价物是下述化合物，其仅显示轻孩t的化学差异并具有相同的药理学作用，或其在温和条件下被转化为根据本发明的化合物。所述等价物也包括例如式(l)、(ii)和(ni)的化合物的盐、还原产物、氧化产物、部分水解过程的酯、醚、缩醛或酰胺，以及本领域技术人员能够使用标准方法制备的等价物，除此之外，还包括所有的旋光对映体和非对映异构体和所有的立体异构形式。除非另有说明，式(I)化合物中的手性中心以R构型或S构型存在。本发明涉及光学纯净的化合物和立体异构体混合物二者，例如对映异构体混合物和非对映异构体混合物。式(I)、(II)和(III)的化合物的生理学耐受的盐理解为其有机盐及其无机盐，如Remington'sPharmaceuticalSciences(笫17版，第1418页(1985))中所述。因为其生理和化学稳定性及其溶解度，对酸根尤其优选钠盐、钾盐、钩盐和铵盐；对碱基尤其优选盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐，或羧酸盐或磺酸盐，如乙酸盐、柠檬酸盐、苯曱酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐和对曱笨璜酸盐。全文中本发明的化合物被称作Labyrinthopeptin。本发明还涉及制备其中m和n彼此独立地为0、1或2的式(I)化合物的方法，所述方法包括a)在合适的条件下，在培养基中发酵菌林JdVio/mw/"niwfl附幼/emis(DSM6313),或其变体和/或突变体之一，直到培养基中产生一种或多种式(I)化合物，b)从培养基中分离式(I)化合物，和c)适当时将式(I)化合物衍生化，和/或适当时将其转化为生理学可耐受的盐。本发明优选地涉及制备式(I)化合物的方法，其中化合物(I)是式(II)化合物，更优选地本发明涉及制备式(I)或优选制备(II)的化合物的方法，其中m和n均为0，或m和n均为2，或m为0且n为2，或m为2且n为0。尤其优选的，本发明优选地涉及制备式(I)化合物的方法，其中化合物(I)是式(III)化合物。培养基是营养溶液或固体培养基，其含有至少一种惯用碳源和至少一种氮源，以及一种或多种惯用无机盐。根据本发明的方法可用于以实验室规模发酵(毫升到升的规模)，和用于以工业规模发酵(立方米的规模)。用于发酵的合适碳源是可同化的糖类和糖醇，例如葡萄糖、乳糖、蔗10糖或D-甘露糖醇，以及含糖类的天然产物，例如麦芽提取物或酵母提取物。含氮营养物的例子是氨基酸；肽和蛋白质及其降解产物，例如酪蛋白、蛋白胨或胰蛋白胨；肉提取物；酵母提取物；谷蛋白；地面种子(groundseed),例如来自玉米、小麦、豆类、大豆和棉花植物；来自生产醇的蒸馏残渣；肉粉；酵母提取物；铵盐；硝酸盐。优选该氮源是一种或多种已通过合成或生物合成获得的肽。无机盐的实例是碱金属、碱土金属、铁、锌、钴和锰的氯化物、碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐。微量元素的实例是钴和锰。特别适用于形成本发明的Labyrinthopeptin的条件如下0.05到5%，优选0.1到2.5%的酵母提取物；0.2到5.0%,优选0.1到2%的酪胨；0.02到1.0%,优选0.05到0.5%的CaCl2x2H20;0.02到1.5%,优选0.05到0.7%的MgS04x7H20和0.00001%到0.001%的氰钴铵素。给出的百分比数值在各情况下以总营养液的重量为基础。对微生物进行需氧培养，即例如浸没时在摇瓶或发酵罐中振动或搅拌，或适当时在固体培养基上时通入空气或氧气。微生物可在约18到35°C,优选地约20到32。C,尤其是27到30。C的温度范围内培养。pH范围应当在4和10之间，优选地在6.5和7.5之间。微生物通常在这些条件下培养2到10天，优选72到168小时的周期。有利地以若干步骤培养^L生物，例如最初在液体营养培养基中制备一种或多种初步培养物(preliminaryculture),然后将这些初步培养物例如以1:10到1:100的体积比接种进实际的生产培养基中，即主要培养物。如下获得初步培养物例如将营养细胞或孢子形式的菌抹接种进营养液中，并允许其生长约20到120个小时，优选48到96个小时。可例如如下获得营养细胞和/或孢子允许菌林在固体或液体营养底物例如酵母琼脂上生长约1到15天，优选地生长4到10天。可使用已知的方法并考虑天然物质的化学、物理和生物学特性，从培养基中分离和纯化Labyrinthopeptin衍生物。使用HPLC，通过将形成的物质的量与校准液便利地比较，测试培养基中或各个分离步骤中Labyrinthopeptin衍生物的浓度。ii对分离而言，任选地将培养物发酵液或培养物与固体培养基一起冻干，并使用有机溶剂，或水和有机溶剂的混合物从冻干物中提取Labyrinthopeptin衍生物，所述混合物优选地含有50-卯％的有机溶剂。有机溶剂的实例为曱醇和2-丙醇。有机溶剂相含有根据本发明的天然物质；适当时将其真空浓缩并进行进一步纯化。根据本发明的一种或多种化合物的进一步纯化在合适材料上通过层析进行，优选地例如在分子筛上、在硅胶上、在氧化铝上、在离子交换器上或在吸附树脂上或在反相(RP)上。使用该层析分离Labyrinthopeptin衍生物。使用緩冲的、碱性或酸化的水性溶液或水性和有机溶液的混合物对Labyrinthopeptin衍生物进行层析。水性或有机溶液的混合物理解为是所有易与水混合的有机溶剂，优选地为曱醇、2-丙醇或乙腈，其浓度为5到99%有4几溶剂，优选5到50%有机溶剂，或者是易与有机溶剂混合的所有緩冲的水性溶液。有待使用的緩冲液与上文所述相同。基于Labyrinthopeptin衍生物有差异的极性，借助于反相层析对其进行分离，所述层析例如在MCI(吸附树脂，Mitsubishi,日本)或AmberliteXAD(TOSOHAAS)上，或在其他疏水材料例如RP-8或RP-18相上进行。另外，分离可借助于正相层析，例如在硅胶、氧化铝等等上进行。緩冲的、碱性或酸化的水性溶液理解为是例如水、磷酸盐緩冲液、乙酸铵和柠檬酸盐緩沖液(浓度高达0.5M)，以及曱酸、乙酸、三氟乙酸、氨和三乙胺，或技术人员已知的所有可商业获得的酸和碱(优选地浓度高达1%)。在緩冲水性溶液的情况下，尤其优选0.1%乙酸铵。可使用梯度完成层析，所述梯度从100。/。水开始，以100%有机溶剂结束；优选地用5到95%乙腈的线性梯度进行层析。或者也可能进行凝胶层析或在疏水相上层析。凝胶层析可例如在聚丙烯酰胺凝胶或共聚物(copolymer)凝胶上进行。上述层析步骤的顺序可以逆转。在Labyrinthopeptin作为立体异构体存在的情况下，它们可以使用已知的方法分离，例如借助于使用手性柱的分离进行分离。OH基团到酯或醚衍生物的衍生化使用本身已知的方法进行(J.March,AdvancedOrganicChemistry,JohnWiley&Sons,第4版，1992),例如借助于与酸酐反应或通过与二烷基碳酸盐或二烷基硫酸盐反应进行衍生化。COOH基团到酯或酰胺基衍生物的衍生化使用本身已知的方法进行(J.March,AdvancedOrganicChemistry,JohnWiley&Sons,第4版，1992)，例如借助于与氨反应成相应的conh2基团，或与任选地活化的烷基化合物反应成相应的烷基酯进行衍生化。-<:112-8-(:112-基团到-ch2-s(o)-ch2-或-ch2-S(0)2-CHr基团的氧化可以在将相应的Labyrinthopeptin衍生物暴露于氧气或空气后实现。根据布达佩斯条约，在1991年1月23日将微生物菌林爿"Z"o/mw/"ra"ff附幼/e附^的分离菌在编号DSM6313下以识别参考(identificationreference)FH曙A1198保藏于DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen[德国微生物和细胞培养物保藏中性GmbH(DSMZ)，MascheroderWeg1B，38124Braunschweig,德国。孩t生物菌抹K/"o附ad"m舰附幼/msis由Wink等，在InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology2003，53，721-724中进一步描述。4戈替菌林J"iVw附flJwYi"附幼^附&(DSM6313)，还可能4吏用其突变体和/或变体，所述突变体或变体合成一种或多种根据本发明的化合物。突变体是下述微生物，其中基因组中的一个或多个基因已被修饰，使得负责该生物生产本发明化合物的能力的所述一个或多个基因维持功能并且是可遗传的。这类突变体可以用本身已知的方式，使用物理手段或化学诱变剂制备，所述物理手段例如使用紫外线或X射线辐射，所述化学诱变剂例如乙基曱磺酸酯(EMS)、2-羟基-4-甲氧基二苯曱酮(MOB)或N-甲基-N'-亚硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，或如Brock等，in"BiologyofMicroorganisms",PrenticeHall,第238-247页(1984)中所述制备变体是微生物的一种表型。微生物具有适应其环境的能力，因此显示高度发达的生理学适应性(flexibility)。微生物的所有细胞均涉及该表型适应，改变的本质不是遗传限制的(geneticallyconditioned)，并且在改变的条件下是可逆的(H.Stolp，Microbialecology:organism,habitats,activities.CambridgeUniversityPress,Cambridge,GB，第180页，1988)。如下完成合成一种或多种本发明化合物的突变体和/或变体的筛选任选地冻干发酵培养基，用如上所述的有机溶剂，或水和有机溶剂的混合物提取该冻干物或发酵液，并借助于HPLC或TLC或通过测试生物活性进行分析。发酵条件可应用于^4"/"o/waflf"m/jfl附^Ze附/s(DSM6313)及其突变体和/或变体。本发明的又一实施方案是上文所述式(I)化合物，优选式(II)或(III)的化合物用于治疗细菌感染，特别是革兰氏阳性菌引起的细菌感染，用于治疗病毒感染和/或用于治疗疼痛，特别是神经性疼痛或炎症引发的疼痛的用途。上述药物(也称作药物制剂或药物组合物)含有有效量的至少一种式(I)化合物和至少一种可药用的载体，所述式(I)化合物是如上所述的任何立体化学形式，或任何比例的任何立体化学形式的混合物，或生理学可耐受的盐或其化学等价物，所述可药用的载体优选地是一种或多种可药用的载体物质(或媒介物)和/或添加剂(或赋形剂)。药物可以经口施用，例如以丸剂、片剂、涂膜片(lacqueredtablet)、包衣片、颗粒剂、硬明胶胶嚢剂和软明胶胶嚢剂、溶液剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂或气雾剂混合物的形式。然而，也可以经直肠进行(例如以栓剂的形式)施用，或以注射溶液或输液剂、微嚢剂、植入物或棒(rod)的形式胃肠外地(例如静脉内、肌内或皮下)进行施用，或经皮或局部进行(例如以软膏剂、溶液剂或酊剂的形式)施用，或以其他形式(例如以气雾剂或鼻喷剂的形式)施用。根据本发明的药物以本身已知且本领域技术人员熟悉的方式制备，除14了式(I)化合物外还使用可药用的惰性无机和/或有机载体物质和/或添加剂，所述式(I)化合物为如上所述的任何立体化学形式，或是任何比例的任何立体化学形式的混合物，或是其生理学可耐受的盐或化学等价物。为了生产丸剂、片剂、包衣片剂和硬明胶胶嚢剂，可能使用例如乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐等。用于软明胶胶嚢剂和栓剂的载体物质为例如脂肪、蜡、半固体和固体的多羟基化合物、天然油或硬化油等。用于生产溶液剂(例如注射溶液)或乳剂或糖浆的合适的载体物质为例如水、盐水、醇、甘油、多羟基化合物、蔗糖、转化糖、葡萄糖、植物油等。用于微嚢剂、植入物或棒的合适的载体物质为例如羟乙酸和乳酸的共聚物。药物制剂通常含有按重量计约0.5到约90%的式(1)化合物和/或其生理学可接受的盐和/或其前药。药物中式(I)活性成分的量(以如上所述的任何立体化学形式，或任何比例的任何立体化学形式的混合物，或其生理学可耐受的盐或其化学等价物)通常为约0.5到约1000mg，优选约1到约500mg。除了式(I)的活性成分(以如上所述的任何立体化学形式，或任何比例的任何立体化学形式的混合物，或其生理学可耐受的盐或其化学等价物)和载体物质以外，药物制剂可含有一种或多种添加剂，例如填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、湿润剂、稳定剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂、稀释剂、緩冲物质、溶剂、增溶剂、用于达到保藏作用的试剂、用于改变渗透压的盐、包衣剂或抗氧化剂。它们也可以含有两种或更多式(I)化合物，其为任何立体化学形式，或任何比例的任何立体化学形式的混合物，或其生理学可耐受的盐或其化学等价物。一旦药物制剂含有两种或更多式(I)化合物，则个体化合物的选择可针对药物制剂的特异总体药理学谱。例如，可将具有较短作用时间的高效化合物与较低效能的长效化合物组合。式(I)化合物取代基的选择所许可的适应性允许极大控制化合物的生物特性和理化特性，因而允许选择这类期望的化合物。另外，除了至少一种式(I)化合物外，药物制剂也可含有一种或多种其他的治疗或预防活性成分。使用式(I)化合物时，剂量可在广泛的限度内变化，并且如常规和医师所知道的，有待在各个个体的案例中合适个体的条件。这取决于例如使用的特定化合物，有待治疗的疾病的本质和严重性，施用的模式和时间表，或取决于治疗的病症是急性或是慢性，或是否进行预防。可使用医学领域公知的临床途径确立适当的剂量。通常，用于在体重约75kg的成人中达到预期结果的每日剂量为约0.01到约100mg/kg，优选为约0.1到约50mg/kg，尤其是从约0.1到约10mg/kg(在各情况下以每kg体重计)。每曰剂量可^L划分为若干次(例如2、3或4次)部分施用，尤其是在施用相对大量的情况下。通常，根据个体的表现，可能需要向上或向下偏离指定的每日剂量。实施例1:制备j"/"0附fff/"rawtf附幼/e附/s(DSM6313)的低温培养物(ciyoculture)在无菌的500ml锥形瓶中用菌抹J"/wo附m/w/Yiw"附/6/e朋/s(DSM6313)接种100ml培养基(1升自来水中10g淀粉、2g酵母提取物、10g葡萄糖、10g甘油、2.5g玉米杆粉、2g蛋白胨、lgNaCl、3gCaC03，灭菌前调至pH7.2)，并在摇床上于27。C和120转/分钟下孵育72小时。随后将lml培养物与1ml无菌保藏溶液(20g甘油、10g蔗糖、70ml去离子水)混合并储存于-80'C。或者，将琼脂上的小块生长良好的培养物用1.5ml50%无菌甘油溶液转移至Cryotubes(VangardInternational)并在液氮中储存于-196。C。实施例2:制备Labyrinthopeptin用在琼月旨平板上生长的爿"/"oimw/wflwfl柳幼/ews/s(DSM6313)培养物接种含有100ml实施例1中所述培养基的无菌500ml锥形瓶，并在摇床上于27'C和120转/分钟下孵育。72小时后，各用2ml该预培养物接种以相同量含有相同培养基的其他锥形瓶，并在同样的条件下孵育168小时。或者用爿c""o附"flfwmwa附幼/ewsis(DSM6313)的培养物接种含有100ml实施例1中所述培养基的300ml锥形瓶，并在25X:和180转/分钟下赙育。72小时后，各用5ml该预培养物接种以相同量含有相同培养基的其他锥形瓶，并在同样的条件下孵育168小时。实施例3:分离Labyhnthopeptins向根据实施例2的10升培养液中添加2%HyfloSuper-cd硅藻土(HyfloSupercell;VWR，Darmstadt,德国)，并将培养物滤过压滤器，从而将培养液与菌丝体(mycd)分离。将滤出液上样在含1升AmberliteXAD-16树脂(柱直径5.5cm，柱高42cm)的柱上，并用5升去离子水和5升含20%曱醇的水。用5升含60%曱醇的水和5升含80%曱醇的水洗脱Labyrinthopeptin。通过HPLC-DAD和LC-ESI-MS鉴定含Labyrinthopeptin的级分，在旋转蒸发器上集合性浓缩直至获得水性残余物，随后将其冻干。获得300mg粗产物。实施例4:对Labyhnthopeptins进行具有二极管阵列检测的高效液相层析(HPLC-DAD)柱Nucleosil100-C18;20+125mmx4.6mm,5n(Machery-Nagel)流动相水中0.1%H3P04(洗脱液A)和乙腈(洗脱液B)在15分钟的时间段中洗脱液A中从0%到100。/。洗脱液B的线性梯度流速每分钟2ml通过210、230、260、280、310、360、435和500nm处的UV/Vis吸收检测产生的峰。式(II)的Labyrinthopeptin的滞留时间7.75分钟。实施例5:对Labyrinth叩eptin进行具有电喷射离子化质谱的高效液相层析(HPLC-ESI-MS)柱PurospherRP-18e;125mmx4mm,5(Agilent)17流动相Wasser中0.1%三氟乙酸(洗脱液A)和乙腈中0.1%三氟乙酸(洗脱液B)在10分钟的时间段中洗脱液A中从5%到100%洗脱液B的线性梯度流速每分钟1.5ml。通过T分流器将到质镨仪ES界面的流速降低至每分钟0.4ml。通过210nm处的UV吸收和其中使用离子阱作为质量分析器的ESI-MS(阳性模式)进行检测。式(III)的Labyrinthopeptin的滞留时间为5.9分4中。分子量为1922Da。实施例6:纯4匕Labyrinthopeptin将根据实施例3获得的Labyrinthopeptin粗产物(300mg)溶于二甲基亚砜、甲醇和水的混合物(1:3:6)中，并使用等度洗脱(水+0.1%曱^/甲醇35:65)以每分钟20ml的流速在Nucleosil100-ds柱(颗粒尺寸10p，柱尺寸250x16mm)上通过层析分离组分。通过HPLC(比较实施例4)分析级分。获得62mg99%纯度的式(111)的Labyrinth叩eptin。实施例7:Labyrinthopeptin(III)的一般表征式(III)化合物在暴露于氧气后被氧化为对应的亚砜。式(III)化合物在2Asp-3Trp和llrThP-12Gly之间含有2顺式-酰胺。实施例8:高分辨率ESI-FTICR-质镨法通过注射泵使式(III)的Labyrinthopeptin在甲醇中的溶液(c=0.2mg/ml)以2nl/分钟的流速进入装备了电喷射源的BrukerApexIIIFTICRMS(7T磁铁)。使用外部校准以阳性模式记录波镨。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>C85H11()N2()024S4的理论质量[M1922.6885分子式C85H110N20O24S4实施例9:氨基酸分析水解在氮气氛中用6NHCl、5。/。苯酚于110。C下将Labyrinthopeptin(III)(0.05mg)水解24小时。在氮气流中干燥水解产物。非手性GC-MS:将水解产物与双-(三曱代甲硅烷基)三氟-乙酰胺(BSTFA)/乙腈(1:1)一起在150。C加热4小时。对GC-MS实验，使用DB5-融合的-二氧化硅-毛细管(I=15mx0.25nm融合的二氧化硅，涂有二甲基-(5%-苯基曱基)-聚硅氧烷，d产0.10ftm;温度程序T=65。/3V6/280'C)。手性GC-MS:于110。C下用200jU2NHCl将水解产物在乙醇中酯化30分钟并干燥。随后，于110。C下在100nl二氯甲烷中用25plTFAA将混合物酰化10分钟并干燥。对GC-MS而言，使用融合的二氧化硅毛细管(I=22mx0.25融合的二氧化珪，涂有chirasil-S-Val(Machery-Nagel)，df=0.13nm;温度程序T=55。/3V3，2/180。C)。_<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例10:NMR光i普法在装备了5mmZ-Grad三元共振探头的AMX600MHzNMR波谱仪(Bruker,Karlsruhe,德国)和装备了5mmZ-Grad宽镨带逆转探头的DRX500NMR波镨仪(Bruker，Karlsruhe,德国)上测量2-DNMR谱(COSY，TOCSY，NOESY，HSQC，HMBC)。下表显示测量中获得的信号。DMSO-d6中式(III)的Labyrinthopeptin的NMR数据0.68:0.71;0,75;0.78;1,05;1,07;1.10;1,35;1.40;1,42;1,49;1.90;1.96;2,00;2.10;2,17;2.26;2.77;2,86;2.90;2,97;3.03;3.14;3.16;3.18;3,18;3.20;3.24;3.29;3.30;3箭'3.59;3.67;3.67;3.72;3,99;4,02;4,03;4,10;4.13;4.14;4,16;4,19;4.34;4.36;4.45;4.49;4.59;6邻；7,26;7.00;7.04;7,08;7.08;7.10:7.18:7.22;7.23;7.24;7.24;7.31:7.35;7,36;7.42;7.51;7.53;7.65;7.65;7.69;7.77;7.84;7.98;譜;8.01;8,56;濕O;10.81.19.7;21,3;21,4;22,6;23,04;23,2;23,7;26.4;26.4;27'1;33.4;35,2;35,4;36.7;38.3:40.0:40.5:40J;40.8:40,8:41.2:41.2:43.4;48.4;48.7;49.0;51.2;51.4:52.5;52.6;52.7:53,2:53,5;54.0;56.9;60.0;60.3;66.4;109.8;110.6;111,2;111,2;117,4;118,1;118.1;118,2;120.7;120.7;122.1:123.4;126,5;127.2;127.3;127.8;129.4;136.0;136,1;136.6;140.8;徹4;173众174.3;176,9.实施例11:Labyrintopeptin(III)的X射线晶体学结晶条件将蛋白质溶于0.02MTrispH8.2(浓度7mg/ml)中。晶体在室温下通过蒸汽滴扩散(vapourdropdiffusion)从该蛋白质溶液与60%乙醇、0.75%PEG6000、0.025M乙酸钠和0.05M氯化钠的1:1混合物中生长。晶体生长约l周。测量在Bruker3-环衍射仪上用旋转阳极和镜面单色CuK-a辐射(mirrormonochromatedCuK-alpharadiation)收集X-射线数据。辐射强度在SMART6000CCD区域监测器上收集。晶体数据:式NaN20C85S4048NaC85N20024S4式重量2220.291834.82结晶体系正交晶空间群(spacegroup)P21212(第18号)晶胞维度(unitcelldimension)a=41.136()Ab=12.885()A20<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>实施例12:氧化Labyrinthopeptin(III)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>在室温下4夺50mgLabyrinthopeptin(III)(0.026mmol)溶于1mlDMSO中并与11mgl-羟基-l-氧化物-l，2-苯碘酰-3(1H)-酮(l國Hydroxy-l-oxide-l，2-Benziodoxol-3(1H)-one，IBX，0.039mmol)混合。将混合物在40。C搅拌6小时，在室温下再搅拌12小时，然后在带有XTerraPr印MSC1810jim前置柱(Waters,尺寸19x10mm)的PhenomenexLunaAxia5C18(2)柱(尺寸100mmx30mm)上通过反相HPLC纯化。在30分钟内使用含5%到95%乙腈的水(含0.1%乙酸铵，pH7.0)的梯度作为洗脱液。将柱流出液(60ml/分钟)分级并通过UV检测。级分7到ll含有期望的化合物。所述级分在冻干后产生25mg(50%)。通过质^普法(BrukerDaltonicsMicroTof)表征产物。UV:222sh，278nmESI-MS:MW=1920.66518(单MW)分子式C85H108N20O24S4分子量(MW)=1922.2实施例13:Labyrinthopeptin(III)C-末端的肽合成将40mgLabyrinthopeptin(III)(0.021mmol)溶于2ml无水二曱基曱酰胺中并用10mg(0.045mmol)二-叔-丁基-重碳酸盐(Boc20)和7mg(0.054mmol)二异丙基乙胺在室温下处理1小时。然后添加6.8mg(0.063mmol)节胺和丙基磷酸酐在DMF中的50%溶液50nl(0.072mmol)。在含有XBridgeShieldC1810前置柱(Waters,尺寸19x10mm)的WatersXBridgeShield5,C18Saule(尺寸100mmx30mm)上通过反相HPLC纯化反应混合物。在30分钟内使用含5%到95%乙腈的水(含0.1%乙酸铵，pH7.0)的梯度作为洗脱液。将柱流出液(60ml/分钟)分级并通过UV检测。将级分30到31合并并产生9.6mg(22。/。)期望的化合物。通26过质谱法(BmkerDaltonicsMicroTof)表征产物。UV:222sh,276nmESI-MS:MW=2U1.7卯18(单MW)分子式C97H125N21025S4分子量(MW)=2113.5实施例14:Labyrinthopeptin(III)N-末端的肽合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>将5mg(0.028mmol)2-氯誦4,6-二甲氧基画l，3，5-三噪(triazin)(CDMT)溶于2ml无水二曱基曱酰胺中，并与8.6mg(0.085mmol)N-曱基吗啉(NMM)混合。将混合物在室温下搅拌l小时。添加3.3mg(0.028mmol)正己酸并将混合物在室温下再搅拌30分钟。随后添加40mg(0.021mmol)Labyrinthopeptin(III)，并将得到的混合物在室温下再搅拌2小时。在带有XBridgeShieldC1810前置柱(Waters,尺寸19x10mm)的WatersXbridgeShield5jimC18Saule(尺寸100mmx30mm)上通过反相HPLC纯化反应混合物。在30分钟内使用含5%到95%乙腈的水(含0.1%曱酸，pH2.0)的梯度作为洗脱液。将柱流出液(60ml/分钟)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>分级并通过UV检测。将级分38到40合并并产生11.0mg(26。/。)期望的化合物。通过质镨法(BrukerDaltonicsMicroTof)表征产物。UV:220sh,278應ESI-MS:MW=2020.75738(单MW)分子式C91H120N20O25S4分子量(MW)(MW)=2022.3实施例15:抗菌活性将生物在液体牛肉膏蛋白胨培养基(beefextractbroth)中培养后，通过用新鲜的培养基稀释，将细菌悬浮液调节至确定的密度(5-105生物/1111)。将Labyrinthopeptin(III)溶解并用水以几何稀释系列(因数2)稀释。将各个稀释步骤中1.5ml溶液与13.5ml液体琼脂(Mtiller-Hinton琼脂)在约45。C下混合。培养皿中最大的化合物浓度通常为100mg/l。使用无化合物的琼脂平板作为对照。培养基冷却并固化后，使用每个接种点递送5-104个菌落形成单位(cfu)的多点接种器(MultipointInoculator)同时用20种不同的细菌菌林接种琼脂平板，然后在有氧条件下于37。C孵育17小时。醉育后，肉眼检查平板得到细菌生长不再是可见的最低化合物浓度。忽略接种点处的单个菌落或混浊(haze)生长。抗菌作用被评价为测试化合物的最小抑制浓度(MIC:细菌生长不再是肉眼可见的最低化合物浓度)测^式生物MIC金黄色葡萄球菌(S鄉/r卢cocc"51SG51112.5mg/1金黄色葡萄球菌28512.5mg/1金黄色葡萄球菌5033.13mg/1酉良脓链3求菌(5^e/;tococcMS308A3.13mg/1酿脓链J求菌77A3.13mg/128尿链球菌(5^/;tococc附/flec/"附)D6.25mg/1实施例16:抗病毒活性病毒只能在活细胞中繁殖。因此，病毒研究在细胞培养物中进行。选择病毒是因为它们作为传染物的重要性或其典型的生物化学或形态学结构。在96-孔微量滴定板中制备Labyhnthopeptin(III)的稀释系列。根据感染性病毒添加Hela或Vero细胞，在24小时的孵育内得到汇合的单层。孵育3小时后，以下述浓度向细胞添加各病毒，所述浓度预期在2天内完全破坏细胞单层。将培养物在充气的孵育箱(空气中5%<:02)中于37。C下孵育。24小时后，通过显微镜检查评价细胞培养物中测试化合物的最大耐受剂量(MTD)。将结果与非感染的组织对照和相应的感染对照比较编号宿主生物测试生物抑制[mg/lj1Vero细胞真菌病毒(RNA/流感A/Aichi)44.442Hela细胞单纯疱瘆(DNA)，1(型)133.333Vero细胞单纯疱瘆(DNA),2(型)VR73444.444Hela细胞腺病毒(DNA)，5"133.33实施例17:神经性疼痛活性在神经性疼痛的周围神经损伤(sparednerveinjury,SNI)小鼠模型中研究Labyrinth叩eptin(III),从而证实对触觉异常性疼痛的活性。在全身麻醉下，将成年雄性C57B6小鼠(22.7g士0.26SEM)中坐骨神经的两个主要分支结扎并横切，保持腓肠神经完整。用自动的vonFrey检验测定触觉异常性疼痛使用清除穿刺针(dumpneedlestick)将后爪的跖部皮肤暴露于强度递增至5g的压力刺激。动物用缩回后爪来应答的力(以克计)用作触觉异常性疼痛的读数(read-out)。该研究在神经损伤后7天进行6个小时，并在24小时后额外测量。在神经^f黄切后两天内，触觉异常性疼痛发展完全并且在至少两周内维持稳定。作为单次应用(3mg/kg)静脉施用化合物。选29择l:1:18(乙醇Solutol:踌酸盐緩沖的盐水)的媒介物作为静脉应用的媒介物。爪缩回阈值(PWT)测量已用于计算显著的处理效应，并用于参考时间段(6小时)内的AUC计算和随后的。/。益处计算。对统计分析而言，以两种方式使用同侧后爪的PWT值第一种基于特定时间(在24小时的周期内)的PWT值进行两因素ANOVA,第二种对未转化的5AUC值IAUCl-6小时|进行单因素ANOVA。下述实验揭示了静脉应用各化合物后1到6小时，与媒介物组的高度显著的差异使用重复测量的两因素方差分析(重复因子TIME,分析变量PWT)，随后进行补偿分析(因子GROUP对因子TIME各水平的效应(Winer分析)，分析变量PWT)，随后进行因子TREATMENT对因子TIME各水平的邓奈特检验(Dunnett'stest)(双侧比较vs水平VEHICLE)。该效应在应用后24小时消失。使用S|AUCl-6小时|值的单因素ANOVA分析揭示了p<0.0001的p值。邓奈特分析对两种化合物均给出显著的处理效应。使用同侧媒介物组(0%益处)的IAUCl-6小时|值和所有三组对侧的所有IAUCl-6小时|值评价处理的益处百分比(100%益处=最大可能效应)。与这些界限相比，Labyrinthopeptin(ni)达到了97%的益处。总而言之，在神经性疼痛的SNI小鼠模型中，该化合物显著地减轻了触觉异常疼痛。实施例18:炎症引发的疼痛活性在小鼠中角叉菜胶(CAR)诱导的后爪炎症模型中研究Labyrinthopeptin(III)，从而验证对热痛觉过敏(thermalhyperalgesia)的活性，所述热痛觉过敏是炎症引发的疼痛的一种典型读数。诱导后爪炎症在轻微的全身异氟烷麻醉下，将20nl盐水中的2。/oCAR(Sigma,Deisenhofen,德国)注射进雄性C57B6小鼠两个后爪的跖面中。使用安装了小型照相机的市售设备(PlantarTestUgoBasileBiologicalResearchApparatus,Comerio,Italy)将爪暴露于确定的温度刺激下，测定爪缩回潜伏期(PWL)，所述照相机确保将红外线热准确置于目的后爪下。整个研究周期(6小时)内将小鼠保持在测试笼中。热痛觉过敏的测量如果动物摇动其受影响的后爪，则测量后爪反射红外光的持续时间的计时器由研究者开始和终止。设定16秒的断开，以防止组织损伤。在CAR注射之前进行研究，并在注射之后进行6小时。以秒计的爪缩回潜伏期用作读数，用于进一步的分析。选择l:1:18(乙醇Solutol:磷酸盐緩沖的盐水)的媒介物用作静脉应用的J某介物。爪缩回潜伏期(PWL)测量已用于计算显著的处理效应，并用于参考时间段(6小时)内的AUC计算和随后的。/。益处计算。对统计分析而言，以两种方式使用两只后爪的PWL值第一种基于特定时间(在6小时的周期内)的PWL值进行两因素变量分析(ANOVA),第二种对未转化的5AUC值IAUCl-6小时l进行单因素ANOVA。下述实验揭示了静脉应用两种剂量后1到2小时，与媒介物组的高度显著的差异使用重复测量的两因素方差分析(重复因子TIME，分析变量PWL)，随后进行补偿分析(因子GROUP对因子TIME各水平的效应(Winer分才斤)，分析变量PWL)，随后进4亍因子DOSAGE对因子TIME各水平的邓奈特检验(双侧比较vs水平0=VEHICLE)。该效应在应用后4小时消失。使用8|AUCl-6小时l值的单因素ANOVA揭示了p0.0001的p值。邓奈特分析对两种剂量均给出显著的处理效应。使用媒介物组(0%益处)的IAUCl-6小时|值和注射CAR前的所有IAUCl-6小时l值评价处理的益处百分比(6小时间的理论基线=最大可能效应=100%效应)。与这些界限相比，1mg/kg剂量组达到了37%的益处，且10mg/kg组达到了34%的益处。总而言之，该化合物在炎症引发疼痛的CAR小鼠模型中显著降低了热痛觉过敏。3权利要求1.式(I)化合物，其中R1为H、C(O)-(C1-C6)烷基或C(O)-O-(C1-C6)烷基；R2为OH、NH2、NH-(C1-C6)烷基、NH-(C1-C4)亚烷基-苯基或NH-(C1-C4)亚烷基-吡啶基；R3和R4彼此独立地为H或OH，或R3和R4一起为＝O；且m和n彼此独立地为0、1或2；所述化合物为任何立体化学形式，或是任何比例的任何立体化学形式的混合物，或其生理学可耐受的盐。2.根据权利要求l的式(I)化合物，其为式(II):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>3.根据权利要求1或2的式(I)化合物，其中Rl为H。4.根据权利要求1或3的式(I)化合物，其中R2为OH。5.根据权利要求1或4的式(I)化合物，其中R3和R4为H或OH，其中如果R3为OH则R4为H,或如果R3为H则R4为OH，或R3和R4—起为-O。6.根据权利要求1到5中任一项的式(I)化合物，其中R3为OH且R4为H，或如果R3为H则R4为OH。7.根据权利要求1到6中任一项的式(I)化合物，其中m和n均为O,或m和n均为2，或m为0且n为2，或m为2且n为0。8.根据权利要求1到7中任一项的式(I)化合物，其中m和n均为0。9.根据权利要求1到8中任一项的式(I)化合物，其中Rl为H;R2为OH;R3和R4彼此独立地为H或OH，其中如果R3为OH则R4为H,且如果R3为H则R4为OH;且m和n彼此独立地为0、1或2。10.根据权利要求1到9中任一项的式(I)化合物，其中Rl为H;R2为OH;R3和R4彼此独立地为H或OH，其中如果R3为OH则R4为H,且如果R3为H则R4为OH;且m和n均为0，或m和n均为2，或m为0且n为2，或m为2且n为0。11.根据权利要求1到10中任一项的式(I)化合物，其中Rl为H;R2为OH;R3和R4彼此独立地为H或OH，其中如果R3为OH则R4为H，且如果R3为H则R4为OH;且m和n均为0。12.根据权利要求1到11中任一项的式(I)化合物，其为式(III)化合物13.从J"i7io附"fiTwYi"fl附幼Ze附/s(DSM6313)分离的化合物，其特征在于单种同位素中性分子量为1922.6872Da，且分子式为C85H11()N2。024S4。14.根据权利要求1到13中任一项的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗细菌感染、病毒感染和/或疼痛。15.药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1到13中任一项的式(I)化合物，和至少一种可药用成分。16.用于制备根据权利要求1到13中任一项的式(I)化合物的方法，其包括a)在合适的条件下，在培养基中发酵菌林爿"/w0附flw"/w幼/ews^(DSM6313)，或其变体和/或突变体之一，直到培养基中产生一种或多种式(I)化合物，b)从培养基中分离式(I)化合物，和C)适当时将式(I)化合物衍生化，和/或适当时将其转化为生理学可耐受的盐。17.根据权利要求16的方法，其中化合物(I)为式(II)化合物。18.根据权利要求16或17中任一项的方法，其中化合物(I)为式(III)化合物。19.根据权利要求16到18中任一项的方法，其中m和n均为0，或m和n均为2，或m为0且n为2，或m为2且n为0。全文摘要本发明涉及获自Actinomaduranamibiensis(DSM6313)的式(I)化合物，其用于治疗细菌感染、病毒感染和/或疼痛的用途，和包含它的药物组合物，所述式(I)中R3和R4独立地为H或OH，且其中m和n彼此独立地为0、1或2。式(I)化合物已被定义为Labyrinthopeptin，并由18个氨基酸的高度桥连的肽结构组成，所述肽结构含有羊毛硫氨酸样残基和α二取代的氨基酸类似物。该氨基酸序列为XDWXLWEXCXTGXLFAXC，其中两个Cys残基形成二硫键，且各X独立地表示涉及桥连键的非天然氨基酸之一。文档编号C07K14/36GK101522705SQ200780037217公开日2009年9月2日申请日期2007年9月25日优先权日2006年10月6日发明者G·谢尔里克,G·赛博特,H·居林,H·霍夫曼,I·温克勒,J·温克,K·迈因德尔,L·托蒂,L·韦尔泰希,M·布伦斯特鲁普,R·聚斯穆特申请人:塞诺菲-安万特股份有限公司