抗菌肽诱导剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种可发挥人所具备的自身生物体防御机制、新型、安全、无副作用的、抗菌肽诱导剂。提供一种含乳酸菌作为有效成分的新型抗菌肽诱导剂。该乳酸菌可以以活菌的形式直接摄取其菌体，也可以以使该乳酸菌发酵后的所谓混有乳酸菌的活菌的原材料的形式摄取。通过摄取本发明的抗菌肽的体内分泌诱导剂，在体内诱导该抗菌肽，从而可以期待提高因各种感染防御而产生的免疫力、以及抗衰老、延长健康寿命等。
【专利说明】
抗菌肽诱导剂
技术领域
[0001]本发明涉及一种抗菌肽诱导剂。
【背景技术】
[0002] 以人为首的哺乳动物因被病原性细菌和真菌、病毒等感染，而导致这些菌或病毒 侵入生物体内进行增殖和固着，从而引起腹泻、胃肠疾病、发热等，当其症状严重时，有时还 会导致死亡。哺乳动物的这种感染症即使在医疗发达的现代也无法杜绝，例如是人类过上 健康生活方面的重大课题。
[0003] 与健康成人相比，倒是以感染防御功能为代表的抵抗力弱的高龄者、婴幼儿、小儿 等容易罹患这些感染症。例如，高龄者随着年龄的增加，其自身的感染防御功能下降，从而 容易感染在健康成人中不会感染的常在细菌(例如存在于鼻粘膜等处的黄色葡萄球菌等）。 例如，婴幼儿或小儿的免疫组织尚未成熟，自身的感染防御功能低，因此被认为与健康成人 相比罹患感染症的可能性大。在抵抗力如此弱的对象者集体生活的设施中，当发现个别的 感染症时，为了防止感染症的扩散，会强制采取以下等措施:对罹患了该感染症的患者进行 物理隔离，或者，封闭已发生感染症的患者滞留或访问过的设施。
[0004] 作为感染症的处理方法，通常是采取先确定感染症的病因、然后再给予具有抗菌 作用的药物(抗菌药)的疗法。然而，在对患者给予抗菌药时，该抗菌药不仅对作为感染症病 因的特定的菌或病毒产生作用，还会对不是感染症病因的原本就固着在体内的所谓无病原 性的双歧乳杆菌等肠内细菌或常在菌产生作用，因此还存在着发生腹泻或其他病原体的感 染症等副作用的可能性。另外，通过反复给予、或者长期给予相同种类的抗菌药，会提供作 为感染症病因的病原性细菌、真菌和病毒本身耐受该药物的机会，从而导致其感染症的治 疗有时会变得困难。
[0005] 本来，已知生物为了防止作为感染症病因的病原性细菌或真菌、病毒的侵入或固 着，在该生物自身的体内分泌具有抗菌作用的各种肽(抗菌肽）。抗菌肽是10~100个氨基酸 结合而成的肽，已由包括人在内的各种生物中分离。另外，由于抗菌肽来自宿主，所以没有 如给予上述抗菌药时一样的副作用，不会出现耐药菌。即，如果能够在体内促进抗菌肽的分 泌，则可以期待理想的感染防御。
[0006] 来自人的抗菌肽例如有防卫素家族(α-防卫素、β-防卫素等）、(^他61丨(^虹11〇^-37)、(^^(^虹11、1^4?-1(铁调素）、1^4?-2、乳铁蛋白、（属于)再生胰岛衍生家族的肽(1^ 8 肽)等。这些抗菌肽的分子结构或分泌的脏器不同，显示抗菌作用的靶物质也不同。
[0007] 如果可以人为地使这些抗菌肽在人体内表达或分泌，则可以期待预防感染症或减 轻症状。例如，有人提出了如下的技术：以有机酸作为有效成分的人即方卫素的分泌促进技 术(专利文献1)、以来自酵母的不溶性组分作为有效成分的抗菌肽的基因的表达诱导技术 (专利文献2)、以含有来自酵母的甘露聚糖的成分作为有效成分的抗菌肽的表达诱导技术 (专利文献3)、作为HI-CHEW(译者注：日本森永制果公司生产的一种果汁软糖)用浓缩酸乳、 甜酒提取物、烧酒糟、米糠酱浓缩物等的有效成分的抗菌肽的表达诱导技术(专利文献4)、 以来自发芽糙米和/或糙米糠的留醇糖苷作为有效成分的α-防卫素等抗菌肽的分泌诱导技 术(专利文献5)、以白藜芦醇作为有效成分的α-防卫素等抗菌性肽的分泌诱导技术(专利文 献6)等。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1:国际公开第2005/027893号；
[0011] 专利文献2:日本特开2003-000262号公报；
[0012] 专利文献3:日本特开2006-241023号公报；
[0013] 专利文献4:日本特开2005-270117号公报；
[0014] 专利文献5:日本特开2013-074821号公报；
[0015] 专利文献6:日本特开2013-237643号公报。
【发明内容】
[0016] 发明所要解决的课题
[0017] 本发明的课题在于:提供一种能够发挥人体内存在的自身生物体防御机制的、安 全、无副作用的、抗菌肽的体内分泌诱导剂。
[0018] 用于解决课题的方法
[0019] 鉴于上述课题，本发明人进行了深入研究，获得了以下的认知。即，本发明人发现 了：证实了，通过摄取乳酸菌可诱导表达防卫素的基因或Reg肽的基因表达，解决了上述课 题。另外，由于作为本发明的有效成分的乳酸菌、及其下位概念的使乳酸菌发酵后的原材料 作为发酵食品等还具有长年的食用习惯，因此本发明的抗菌肽的体内分泌诱导剂安全，副 作用的风险非常小。
[0020] 而且，通过摄取本发明的抗菌肽的体内分泌诱导剂，在体内诱导该抗菌肽，可以期 待着维持、提高因各种感染防御而产生的免疫力、或抗衰老、延长健康寿命等。其中，可以期 待预防和/或治疗由机会性致病菌(Opportunistic pathogens)引起的感染症、由病原细菌 和真菌引起的感染症、幽门螺旋杆菌感染症、细菌易位、肠粘膜炎症的持续、肠内菌群平衡 的变化(肠内菌群平衡的紊乱等）、以及由这些炎症诱导的疾病、克罗恩病、溃疡性大肠炎等 炎症性大肠炎、调节性T细胞分化所诱导的过剩的炎症或过敏症状等。另外，还可以期待降 低免疫功能尚未成熟的婴幼儿或小儿、免疫力低下的高龄者、以及患有各种疾病的患者的 感染风险，抑制炎症，预防或减轻过敏或慢性疾病等。
[0021] 如上所述，乳酸菌具有诱导防卫素或Reg肽或这两种抗菌肽的基因表达的作用。因 此，本发明提供一种抗菌肽诱导剂或其诱导用组合物或其两者，所述抗菌肽诱导剂的特征 在于：以乳酸菌或经乳酸菌发酵的原材料或其两者作为有效成分，诱导抗菌肽的基因表达。 本发明还提供:乳酸菌在制备抗菌肽诱导剂中的应用。此外，本发明还提供:乳酸菌在制备 抗菌肽诱导用组合物中的应用。
[0022] 即，本
【发明内容】
如下。
[0023] (1)-种抗菌肽诱导剂，其特征在于：以乳酸菌或经乳酸菌发酵的原材料或其两者 作为有效成分，诱导抗菌肽的基因表达。
[0024] (2) (1)所述的抗菌肽诱导剂，其特征在于:抗菌肽为防卫素或再生胰岛衍生家族 肽(Reg肽)或其两者。
[0025] (3)(1)或(2)所述的抗菌肽诱导剂，其特征在于:乳酸菌为乳杆菌属乳酸菌或链球 菌属乳酸菌或其两者。
[0026] (4)-种抗菌肽诱导用组合物，其中含有权利要求1~3中任一项所述的抗菌肽诱 导剂。
[0027] (5)(4)所述的抗菌肽诱导用组合物，其中，乳酸菌是选自乳杆菌属乳酸菌的一种 或两种或多于两种的菌株和选自链球菌属乳酸菌的一种或两种或多于两种的菌株的组合。
[0028] (6)(4)所述的抗菌肽诱导用组合物，其特征在于:诱导用组合物的每单位包装含 有1亿个以上的乳酸菌。
[0029] (7)(1)~(6)中任一项所述的抗菌肽诱导用组合物，其特征在于:上述乳酸菌为活 菌。
[0030] (8) -种具有感染预防作用的食品/药品组合物，其中，（4)~(7)所述的抗菌肽诱 导用组合物诱导抗菌肽的基因表达。
[0031] (9)(8)所述的具有感染预防作用的食品/药品组合物，其中，上述食品/药品组合 物是通过经口摄取、经肠摄取来进行诱导。
[0032] (10)作为诱导抗菌肽的基因表达的有效成分的乳酸菌或经乳酸菌发酵的原材料 或其两者在制备抗菌肽诱导剂中的应用。
[0033] (11)作为诱导抗菌肽的基因表达的有效成分的乳酸菌或经乳酸菌发酵的原材料 或其两者在制备含有抗菌肽诱导剂的抗菌肽诱导用组合物中的应用。
[0034] (12)作为诱导抗菌肽的基因表达的有效成分的乳酸菌或经乳酸菌发酵的原材料 或其两者在制备含抗菌肽诱导剂的具有感染预防作用的食品/药品组合物中的应用。
[0035] 发明效果
[0036] 本发明可以提供一种可发挥人体内存在的自身生物体防御机制的、安全、无副作 用的、抗菌肽的体内分泌诱导剂。
【具体实施方式】
[0037] 下面，详细说明本发明，但本发明并不限于各种方式。
[0038] 本发明的乳酸菌是指在分类学上被认定为乳酸菌的所有细菌的总称，或者是指双 歧乳杆菌等其全部类似细菌的总称，对菌种或菌株等没有限定。另外，根据乳酸菌的来源， 有时还会将其分为植物来源和动物来源，但本发明的乳酸菌可以使用植物来源也可以使用 动物来源。其中，选自乳杆菌属乳酸菌的一种或两种或多于两种的菌株和选自链球菌属乳 酸菌的一种或两种或多于两种的菌株的组合通过酸乳等发酵乳在饮食习惯上具有实效，因 此优选。另外，更优选乳杆菌属乳酸菌为被称作保加利亚菌或保加利亚乳杆菌的德氏乳杆 菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp .bulgaricus)、而链球菌属乳酸菌为被 称作嗜热菌（Thermophi Ius)或嗜热链球菌的唾液链球菌嗜热亚种（Streptococcus salivarius ssp·thermophiIus)〇
[0039] 本发明的乳酸菌可以使用活菌或死菌的任一种状态。另外，关于本发明的乳酸菌 的形态，即使是进行了冻结或冷冻干燥的乳酸菌也可使用。而且，本发明的乳酸菌不仅是乳 酸菌菌体的形态，还可以是在乳酸菌的菌体中包含菌体以外的成分(例如冻结保护剂或冷 冻干燥保护剂等）的形态，也可以是分散在作为药品的原材料或饮食品的原材料等具有使 用实效的淀粉或水等各种介质中的状态。
[0040] 本发明的抗菌肽诱导剂是指通过让以人为首的哺乳动物摄取而在体内诱导基因 等、并可以产生来自该基因的抗菌肽的制剂。需要说明的是，这里所说的摄取只要是进入人 体内的摄取即可，对给药途径没有限定，例如口服给药、经管给药、经肠给药等公知的所有 给药方法均可。此时，典型地可以列举经由消化道的经口摄取、经肠摄取，但优选经口摄取， 更优选通过饮食摄取。
[0041] 本发明的抗菌肽是指，将不是来自体内的外部细菌进行灭菌、杀菌、静菌而具有防 御感染的作用的肽。作为抗菌肽，可以例示：防卫素家族（α_防卫素、防卫素等）、 cathelicidin(LL_37)、dermcidin、LEAP_l(铁调素）、LEAP_2、乳铁蛋白、Reg肽等。抗菌肽可 以是相应的肽本身，也可以是将特定部位水解活化的所谓的前体形态。
[0042] 本发明的诱导是指，增加用于表达抗菌肽的基因在生物体内的表达，随之使抗菌 肽表达。对该基因没有特别限定，但作为优选的基因，可以例示RegI、R egII、RegIIIa、 RegIIIi3、RegIII γ、和表达防卫素的基因等。
[0043]作为本发明的另一方案，涉及由防卫素家族和/或Reg肽引起的各种疾病的预防 和/或治疗剂。各种疾病是指：由机会性致病菌引起的感染症、由病原细菌、真菌、病毒引起 的感染症、幽门螺旋杆菌感染症、细菌易位、肠粘膜炎症的持续、肠内菌群平衡的变化(肠内 菌群平衡的紊乱等）、以及由这些炎症诱导的疾病、克罗恩病、溃疡性大肠炎等炎症性大肠 炎、调节性T细胞分化所诱导的过剩的炎症或过敏症状等，与本发明的申请日和/或以优先 日为基准的日期的前后无关，是指由防卫素家族和/或Reg肽引起的疾病、症状、综合征、以 及暗示这些情况的所有情形。
[0044] 本发明的经乳酸菌发酵的原材料，只要是将身为药品的原材料、饮食品的原材料 等、且具有以人为首的哺乳动物摄取的习惯的原材料经乳酸菌发酵而获得的物质即可，没 有特别限定。其中，可以例示通过乳酸菌使乳、大豆、小豆、谷类、野菜类、肉类、鱼类、以及它 们的混合物发酵而获得的原材料。
[0045] 作为通过乳酸菌使乳发酵而获得的原材料之一例，可以例示:调合原料乳、乳产品 和原料水，使乳脂肪分达到3.0重量％、无脂乳固体分达到9.5重量％，再根据需要进行用于 调节乳脂肪球的均质化处理，在相当于65°C下保持30分钟的杀菌条件下进行加热杀菌，在 40~45°C下冷却后，添加作为乳杆菌属乳酸菌的德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜 热亚种的混合引子，在40~45°C下发酵2~12小时，调整成0.6~1.2重量％的乳酸酸度的原 材料。此时，对德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热亚种的菌株没有限定，可任意添 加这两个菌种以外的乳酸菌(例如乳杆菌属、双岐杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属等）、以及 其他的对发酵或健康有用的微生物或原材料或添加剂。需要说明的是，这里所说的原料乳 并不限于由牛、山羊、羊、水牛等挤出的被称为生乳或原乳的乳、以及与该生乳或原乳的组 成相同的还原乳，还可以加入(强化)乳脂肪分和/或无脂乳固体分(乳蛋白、乳糖、灰分），或 者，例如除去乳脂肪分而制成低脂肪乳或无脂肪乳，以及面向具有乳糖不耐受倾向的人而 制成脱乳糖乳或乳糖分解乳。而且，为了面向钠等矿物质的摄取受限的患者和/或为了缓和 摄取时的盐味而制成脱盐乳或推荐摄取钙等矿物质的患者，还可制成钙强化乳。
[0046] 本发明的抗菌肽诱导剂只要含有乳酸菌即可，对其菌数没有特别限定，优选每单 位包装中存在1亿个以上的乳酸菌，更优选存在5亿个以上的乳酸菌，进一步优选存在10亿 个以上的乳酸菌。乳酸菌的菌数越多，则越能期待本发明的效果，但考虑到乳酸菌的正常增 殖，上限为10兆个。另外，例如在含有乳杆菌属乳酸菌和链球菌属乳酸菌时，优选乳杆菌属 乳酸菌为0.1亿个以上、且链球菌属乳酸菌为1亿个以上，更优选乳杆菌属乳酸菌为0.5亿个 以上、且链球菌属乳酸菌为5亿个以上，进一步优选乳杆菌属乳酸菌为1亿个以上、且链球菌 属乳酸菌为10亿个以上，最优选乳杆菌属乳酸菌为5亿个以上、且链球菌属乳酸菌为50亿个 以上。乳杆菌属乳酸菌和链球菌属乳酸菌的菌数越多，则越能期待本发明的效果，但考虑到 乳酸菌的正常增殖，上限是保加利亚乳杆菌为1兆个、嗜热链球菌为10兆个。而且，例如在含 有德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热亚种时，优选德氏乳杆菌保加利亚亚种为 0.1亿个以上、且唾液链球菌嗜热亚种为1亿个以上，更优选德氏乳杆菌保加利亚亚种为0.5 亿个以上、且唾液链球菌嗜热亚种为5亿个以上，进一步优选德氏乳杆菌保加利亚亚种为1 亿个以上、且唾液链球菌嗜热亚种为10亿个以上，最优选德氏乳杆菌保加利亚亚种为5亿个 以上、且唾液链球菌嗜热亚种为50亿个以上。德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热 亚种的菌数越多，则越能期待本发明的效果，但考虑到乳酸菌的正常增殖，上限是德氏乳杆 菌保加利亚亚种为1兆个、唾液链球菌嗜热亚种为10兆个。
[0047] 本发明的抗菌肽诱导剂，对每单位包装的重量没有限定，在每Ig的抗菌肽诱导剂 中存在1亿个以上的乳酸菌时，每单位包装的重量优选为10~500g，更优选为25~250g，进 一步优选为50~200g，最优选为75~150g。另外，本发明的单位包装不仅是指每袋、每箱、每 个容器，还可以是其中所包含的每次的单位包装形态，也可以是每天的单位包装形态。可以 制成将适合多天、例如1周的摄取的数量一并包装而成的产品、或包含多个独立包装的产品 等。
[0048] 在本发明的一个方案中，为了提高抗菌肽诱导、分泌促进效果，希望持续摄取乳酸 菌和/或其培养物、以及包含这些成分的抗菌肽诱导剂达3周以上、优选5周以上、更优选8周 以上。
[0049] 由于乳酸菌和/或其培养物可以安全地进行摄取，因此对摄取期间的上限没有特 别限定，可以永久地持续摄取。从获得充分有效的抗菌肽诱导效果的角度考虑，也可以以持 续摄取达8周左右作为标准。
[0050] 本发明的乳包含乳、乳产品、乳蛋白中的至少一种以上。例如，可以列举:牛乳、羊、 山羊等的兽乳;或其加工品、灭菌乳、脱脂乳、全脂奶粉、部分脱脂乳、脱脂奶粉、全脂浓缩 乳、脱脂浓缩乳、奶油、黄油、酪乳、乳清、乳清蛋白浓缩物(WPC)、乳清蛋白分离物(WPI)、a_ 乳清蛋白（α-La)、β_乳球蛋白（β-Lg)、α-酪蛋白、β-酪蛋白、K-酪蛋白、非蛋白态氮等。
[0051] 本发明的乳酸菌还可用作药品或饮食品。含有本发明的乳酸菌的药品或饮食品在 具有抗菌肽表达促进效果方面有用，特别是，可以用作微生物感染预防或感染治疗用的药 品或饮食品。将本发明的乳酸菌用作药品或饮食品时，可以使用单独的菌株，或者可以组合 两种或多于两种的菌株进行使用。
[0052]将本发明的乳酸菌用于上述药品或饮食品时，对其状态没有限定。例如，本发明的 乳酸菌无论是活菌、死菌或处理物，均可用于上述药品或饮食品。例如，在上述药品或饮食 品中可以使用本发明的乳酸菌的培养物、其浓缩物、加工成膏状的膏化物、喷雾干燥物、冷 冻干燥物、真空干燥物、鼓干燥物、分散在介质中的液态物、经稀释剂稀释的稀释物、将干燥 物用磨粉机等破碎而获得的破碎物等。
[0053] 而且，本发明的饮食品还可用于保健功能食品或患者用食品。保健功能食品制度 是依据内外的动向、以及与一直以来的特定保健用食品制度的整合性，不仅以普通食品、还 以形成了片剂、胶囊等形状的食品为对象而设定的制度，包括特定保健用食品（个别许可 型）和营养功能食品（规格基准型)这两种类型。通过对人等动物给予本发明的乳酸菌作为 特定保健用食品等特別用途食品或营养功能食品，可以预防各种感染。
[0054] 在本发明的一个方案中，优选在本发明的抗体效价提高剂中标示其用途、效能、功 能、有效成分的种类、功能性成分的种类、摄取方法等的说明。"标示"可以是在药品、准药 品、保健功能食品、特定保健用食品、营养功能食品、普通食品、健康辅助食品、健康食品、补 品、经肠营养剂、口腔化妆品和饲料中分别适用的标示。
[0055] 在本申请说明书中，"标示"包括用于使需要者了解上述说明的所有标示，只要是 使人想起/类推上述标示内容的标示，则不管标示的目的、标示的内容、标示的对象物/介质 等如何，所有的标示均包括在内。例如可以列举:在产品的包装/容器上标示上述说明；在与 产品有关的广告、价格表或契约书类中标示上述说明以进行展示或颁布;或者，通过电磁的 (互联网等)方法提供以上述各项为内容的信息。
[0056] 作为本发明的一个方案，当采用了本发明的抗菌肽的表达增强、抗菌肽的分泌促 进、感染症的预防/减轻的方法的包装而成的产品是例如采用了抗菌肽的表达增强方法的 饮食品时，优选制成标示为用于增强抗菌肽的用途的饮食品、例如标示为"抗菌肽增强用" 的具有抗菌肽的表达增强效果的饮食品、标示为"抗菌肽增强用"的含乳酸菌的饮食品、或 者标示为"感染症预防用"的含乳酸菌的饮食品等。
[0057]需要说明的是，用于进行如上所述的标示的文字，并不限于例如"抗菌肽增强用" 或"感染症预防用"这样的文字，可以是其以外的文字，只要是表示能量代谢活化效果的文 字，则当然包括在本发明的范围内。作为这样的文字，例如还可以是基于使需要者了解抗菌 肽的增强或感染症预防效果等的各种用途的标示。
[0058] 将本发明的乳酸菌用作饮食品时，对饮食品的种类没有特别限定。例如，可以加工 成各种饮食品（牛乳、加工乳、清凉饮料、发酵乳、酸乳、奶酪、其他乳产品、面包、饼干、薄脆 饼干、比萨饼皮、配方奶粉、流食、患者用食品、婴幼儿用奶粉等食品、孕妇/产妇用奶粉等食 品、营养食品等）。在制造这样的饮食品时，可以依照将本发明的乳酸菌或其处理物直接使 用、或者与其他饮食品或食品成分混合等普通食品组合物中的制法。另外，对饮食品的形状 也没有特别限定，只要是通常使用的饮食品的形状即可。例如可以是固体状(包括粉末、颗 粒状）、膏状、液态、悬浮状等任一种形状，但并不限于这些。此时，更优选乳饮料、发酵乳、清 凉饮料、果冻饮料、片剂、粉末食品，进一步优选酸乳。
[0059] 在含有本发明的乳酸菌的饮食品中，只要是水、蛋白、糖质、脂质、维生素类、矿物 质类、有机酸、有机碱、果汁、香精、功能性成分、食品添加剂等普通食品中所含的成分，均可 包含在内。在上述饮食品的制造中，作为蛋白源，可以使用例如全脂奶粉、脱脂奶粉、部分脱 脂奶粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、酪蛋白、β_酪蛋 白、K-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白、肉蛋白等动植物性 蛋白、它们的水解物等在食品制造中通常使用的蛋白或含蛋白的原材料。作为糖类的供给 源的例子，可以列举加工淀粉(除了糊精以外，还有可溶性淀粉、英国淀粉、氧化淀粉、淀粉 酯、淀粉醚等）、食物纤维等。作为脂质源，例如可以列举:猪油、鱼油等、它们的分馏油、氢化 油、酯交换油等动物性油脂;棕榈油、红花油、玉米油、菜籽油、椰子油、它们的分馏油、氢化 油、酯交换油等植物性油脂等。作为维生素类，例如可以列举维生素 A、胡萝卜素类、维生素 B 群、维生素 C、维生素 D群、维生素 E、维生素 K群、维生素 P、维生素 Q、尼克酸、烟酸、泛酸、生物 素、肌醇、胆碱、叶酸等，作为矿物质类，例如可以列举1丐、钾、镁、钠、铜、铁、猛、锌、硒等。作 为有机酸，例如可以列举苹果酸、枸橼酸、乳酸、酒石酸等。作为功能性成分，例如可以列举 寡糖、葡萄糖胺、胶原、神经酰胺、蜂王浆、多元酚等。作为食品添加剂，例如可以列举乳化 剂、稳定剂、增稠剂、凝胶化剂、甜味剂、酸味料、保存剂、抗氧化剂、pH调节剂、着色剂等。黄 油、乳性矿物质、奶油、乳清、非蛋白态氮、唾液酸、磷脂、乳糖等各种来自乳的成分等是可适 用于制造含有本发明的乳酸菌的饮食品的成分例。
[0060] 这些成分可以组合两种以上进行使用。另外，上述原材料可以使用天然物、天然物 加工品、合成品和/或含有大量的这些材料的食品的任意一种。
[0061] 本发明的乳酸菌可以制成感染预防或治疗用药品。制备上述药品时，本发明的双 歧乳杆菌或乳酸菌可以以活菌、或者在杀菌后进行破碎或未粉碎的处理物的形式使用。另 外，使用的菌可以是单独的菌，也可以是多种菌。
[0062] 上述药品中的本发明的乳酸菌的量可以根据其目的、用途(预防剂、治疗剂等)任 意确定。作为含量的一个例子，可以例示相对于总量为0.001~100% (W/V)、特别是0.1~ 100%，但本发明并不限于此。
[0063] 以本发明的乳酸菌作为有效成分的药品的给药量可以考虑给药途径、包括人在内 的给药对象动物的年龄、体重、症状等各种因素而适当设定。作为适当的给药量之一例，可 以列举以有效成分计为1~l〇〇〇 mg/kg/天，但本发明并不限于此。例如，在为了预防的目的 而长期摄取时，可以是比上述范围少的量。另外，由于该有效成分没有发现安全性的问题， 因此认为即使使用量多于上述范围也没关系。
[0064] 为了使本发明的乳酸菌到达肠内，上述药品的剂型优选为可以进行口服给药的剂 型。作为本发明的药品的优选剂型的例子，例如可以列举锭剂、包衣片、胶囊剂、颗粒剂、散 剂、液剂、糖浆剂、片剂等。上述的各种制剂可以是按照常规方法在作为主药的本发明的菌 体和/或处理物中使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味矫臭剂、助溶剂、悬浮 剂、包衣剂等药品制剂技术领域中通常能够使用的辅助剂而制成制剂。
[0065] 将本发明的抗菌肽诱导剂用作药品时，例如在口服给药时，可以直接给予(摄取） 乳酸菌或将乳酸菌发酵而获得的原材料，例如可以按照药品的常规制备方法制成片剂、颗 粒剂、粉末剂、胶囊剂、散剂后使用。
[0066] 本发明的抗菌肽诱导剂可以在消化道的所有部位期待其效果，消化道可以例示即 口腔、咽喉、食道、胃、十二指肠、小肠、大肠、盲肠、直至肛门的一系列部位。这里，虽然例示 了代表性的消化道的名称，但如果是例如结肠（小肠下部）、回肠、空肠（小肠上部）、上腹部 消化道、下腹部消化道、大肠上位部、大肠下位部等公知和/或技术常识范畴的名称的消化 道，则在摄取(投与)本发明的抗菌肽诱导剂时也可以期待同样的效果。
[0067] 本发明的抗菌肽诱导剂对以人为首的所有哺乳动物均有效，因此还可用作摄取 (给予）该抗菌肽诱导剂的各种疾病的治疗和/或预防方法。这里所说的哺乳动物是指人、 牛、猪、绵羊、海豚、鲸、虎、狮子、猎豹、河马、长颈鹿、胳盤、羊盤、狗、猫、猴、狐、絡、熊、松鼠、 海狗、海豹、熊猫、野猪、鹿、马、猩猩、袋鼠等公知的家畜、宠物、观赏动物、野生动物等，相当 于分类为哺乳类的所有动物。另外，即使在哺乳动物以外的动物中，对于具有消化道的动 物、例如昆虫、爬虫类、鸟类、鱼类、两栖类、软体动物等，也可应用本发明的抗菌肽诱导剂的 给药和/或摄取方法。这里所说的各种疾病只要是通过诱导抗菌肽可以进行治疗和/或预防 的疾病即可。没有限定，例如有由机会性致病细菌引起的感染症、由病原细菌、真菌引起的 感染症、幽门螺旋杆菌感染症、细菌易位、肠粘膜炎症的持续、肠内菌群平衡的变化(肠内菌 群平衡的紊乱等）、以及由这些炎症诱导的疾病、克罗恩病、溃疡性大肠炎等炎症性大肠炎、 调节性T细胞分化所诱导的过剩的炎症或过敏症状。实施例
[0068] 下面，列举实施例，以进一步详细说明本发明，但本发明并不受实施例的限定。
[0069] (试验例1)
[0070] (实验动物）
[0071] 研究了乳酸菌的摄取对大龄小鼠的抗菌肽诱导的影响。购入8月龄的ICR雄性小鼠 (日本SLC株式会社)作为大龄小鼠制作组，驯养1周。此时，为了防止打斗和紧张，将纸制的 蔽所放入笼子内。驯养后，从尾静脉采血，通过离心分离采集血浆，作为因感染而增加的代 表性的细胞因子，通过ELISA法测定了血浆IL-Ιβ浓度、血浆IL-6浓度和血浆TNFa浓度。以体 重和上述的各细胞因子浓度相等的方式分成两组(两组中ri = 39)。以幼龄小鼠作为对照组， 使用3月龄的ICR雄性小鼠。
[0072](使乳发酵而得到的原材料）
[0073]调合原料乳、乳产品和原料水，使乳脂肪分达到3.0重量％、无脂乳固体达到9.5重 量％，加热至70°C左右，之后在15MPa的压力下进行均质化处理，使乳脂肪球径达到一定的 大小，通过在95 °C下保持2分钟进行加热杀菌。杀菌后，在40~45 °C下冷却，之后添加由市售 的"明治保加利亚（文少力'酸乳"分离的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合引子，在 40~45°C下发酵4小时，调整成0.9重量％的乳酸酸度，冷却至10°C以下，以所得物质作为通 过乳酸菌使乳发酵而获得的原材料，将其作为试验样品。在Ig试验样品中存在1亿个德氏乳 杆菌保加利亚亚种和10亿个唾液链球菌嗜热亚种。
[0074](针对实验动物的给药方法）
[0075]对小鼠给予该试验样品时，在作为基本饲料的AIN-93M(酪蛋白为14重量％、L-胱 氨酸为0.18重量％、玉米淀粉为46.5692重量％、α化玉米淀粉为15.5重量％、蔗糖为10重 量％、大豆油为4重量％、纤维素粉末为5重量％)預-931矿物质混合物为3.5重量％)預-93维生素混合物为1重量％、重酒石酸胆碱为0.25重量％、叔丁基氢醌为0.0008重量％ )中 加入该试验样品和水进行混合，形成团状后进行给药。对大龄小鼠制作组中的一组给予混 有该试验样品的饲料，将该组方便地称作试验样品大龄小鼠制作组(试验样品给药组）。另 外，对大龄小鼠制作组的一组给予不含该试验样品的基本饲料，称作基本饲料大龄小鼠制 作组（阴性组）。再对幼龄小鼠对照组给予不含该试验样品的基本饲料，称作基本饲料幼龄 小鼠对照组(基本饲料幼龄组）。给药期间如下:试验样品给药组和阴性组为20个月、基本饲 料幼龄组为2个月。而且，各饲料的给药量为20g/kg体重/天。在给药期间定期测定体重和摄 食量，再每隔2个月采集150yL血，采集血浆。给药期间结束后，开腹采集空肠、回肠、结肠，将 这些组织中的一部分在作为RNA提取用的组织用样品的10倍容量的RNAlater试剂(Ambion 公司）中、在4°C下处理一夜，之后在-80°C下保存。除此以外的组织在液氮中快速冻结，之后 在-80°C下保存。
[0076] (DNA微阵列分析）
[0077]由通过上述获得的各组的组织提取了RNA。在该提取中，使用了RNeasy试剂盒 (Qiagen公司）。将来自同一组小鼠的总RNA分别等量混合，调制了 DNA微阵列分析用样品。在 具体的调制方法中，使用了Affymetrix公司推荐的试剂。对于各总RNA样品，使用3'IVT'表 达试剂盒，通过包含T7启动子序列的引物合成cDNA，之后以其为模板，通过T7RNA聚合酶合 成cRNA，与此同时用生物素进行了标记。使生物素标记后的cRNA与小鼠基因组4302.0阵列 (Affymetrix公司）杂交。杂交时，使用杂交用烘箱（GeneChip? Hybridization Oven 630、 Affymetrix公司），在45°C下杂交了 16小时。再用自动清洗/染色装置(GeneChip? Fluidics Station 450、Affymetrix公司）清洗阵列，之后利用链霉亲和素-藻红蛋白对阵列上结合的 单链cRNA进行了荧光标记。需要说明的是，自动清洗/染色装置的控制采用了设备控制软件 (Affymetrix? GeneChip? Command Console? Software第2版（以后记作AGCC)、 Affymetrix公司）。
[0078] 使用激光扫描仪(GeneChip? Scanner 30007G、Affymetrix公司）对焚光标记操作 后的阵列进行扫描，得到了图像数据。尚需说明的是，使用激光扫描仪获得图像数据时是利 用AGCC软件来进行的。使用分析软件(Expression Console? 1 · 1版、Affymetrix公司），将 所采集的图像数据进行标准化，再使用GeneSpringGX分析软件（GeneSpring GX 11版， Agilent TechnoIogies公司）或GCOS(Affymetrix公司），对各组间的基因表达量进行了比 较分析。关于所得的试验样品给药组和阴性组的基因表达量，算出了以基本饲料幼龄组的 各基因表达量为1.0时的基因表达量的相对值。
[0079] 对各组的空肠和结肠的样品进行DNA微阵列分析，提取了因加龄或给予试验样品 而受到影响的抗菌肽基因。
[0080] 空肠中属于作为抗菌肽之一的Reg肽家族的RegIIIa基因、RegIII γ基因的表达量 在阴性组中有所降低，属于作为抗菌肽之一的防卫素家族的防卫素 rs基因、防卫素 rs7基因 在阴性组中显著降低。在试验样品给药组中，上述4种基因表达量较阴性组高2倍以上，接近 基本饲料幼龄组的值。另外，关于空肠中RegII基因的表达量，阴性组较基本饲料幼龄组高， 但在试验样品给药组中看到了更高的趋势(表1)。
[0081] 回肠中属于作为抗菌肽之一的防卫素家族的防卫素 W的表达量在阴性组中有所 降低。在试验样品给药组中，看到了该基因表达量较阴性组和基本饲料幼龄组有所增加的 趋势(表2)。
[0082]结肠中属于作为抗菌肽之一的Reg肽家族的RegI基因和RegIII γ的相对表达量在 阴性组中显著降低。在试验样品给药组中，看到了这两种基因的相对表达量比阴性组高的 趋势(表3)。由此可知：除小肠（消化道）的RegII以外，抗菌肽的基因表达因老化而降低。认 为通过摄取该乳酸菌的样品，可抑制抗菌肽的基因表达因老化而降低。
[0083][表1]
[0084] 空肠中的抗菌肽基因的表达量
[0092] (试验例2)
[0093] (定量PCR分析）
[0094] 使用实时RT-PCR用转录试剂盒Takara Prime Script RTMasterMix(TAKARABK)公 司），由通过上述得到的组织中提取的各组的RNA样品合成了cDNA。以所合成的cDNA为模板， 使用实时PCR试剂SYBRPremix Ex TaqlKTli RNaseH Plus)(TAKARABIO公司），通过热循环 仪Thermal Cycler Dice Real Time System(TAKARABK)公司）进行了定量的PCR反应和检 测。另外，此次为了定量RegIIΙβ和RegIII γ的表达量，通过使用持家基因的Actb作为内源 性对照的相对定量，以相对表达量的形式算出了这些基因的表达量。需要说明的是，统计处 理方法采用了Mann-Whitney U-检验或G-检验。当ρ值不足0.05时，判定为存在显著差异。 [0095]比较了上述的试验样品给药组、阴性组、基本饲料幼龄组的RegIIIfi和RegIII γ的 相对表达量。在阴性组中，基本饲料幼龄组的RegIIie和RegIII γ的相对表达量明显低。相 对于此，在试验样品给药组和基本饲料幼龄组中没有差别，RegIIΙβ和RegIII γ的相对表达 量相同。
[0096] 产业实用性
[0097]本发明可以提供一种可发挥人所具备的自身生物体防御机制的、安全、无副作用 的、抗菌肽的体内分泌诱导剂。而且，通过摄取本发明的抗菌肽的体内分泌诱导剂，在体内 诱导该抗菌肽，从而可以期待提高因各种感染防御而产生的免疫力、或抗衰老、延长健康寿 命等。
【主权项】
1. 一种抗菌肽诱导剂，其中，以乳酸菌或经乳酸菌发酵的原材料或其两者作为有效成 分，诱导抗菌肽的基因表达。2. 根据权利要求1所述的抗菌肽诱导剂，其中，抗菌肽为防卫素或再生胰岛衍生家族肽 (Reg肽)或其两者。3. 根据权利要求1或2所述的抗菌肽诱导剂，其中，乳酸菌为乳杆菌属乳酸菌或链球菌 属乳酸菌或其两者。4. 一种抗菌肽诱导用组合物，其中含有权利要求1~3中任一项所述的抗菌肽诱导剂。5. 根据权利要求4所述的抗菌肽诱导用组合物，其中，乳酸菌是选自乳杆菌属乳酸菌的 一种或两种或多于两种的菌株和选自链球菌属乳酸菌的一种或两种或多于两种的菌株的 组合。6. 根据权利要求4所述的抗菌肽诱导用组合物，其中，诱导用组合物的每单位包装含有 1亿个以上的乳酸菌。7. 根据权利要求1~6中任一项所述的抗菌肽诱导用组合物，其中，所述乳酸菌是活菌。8. -种具有感染预防作用的食品或药品组合物，其中，权利要求4~7所述的抗菌肽诱 导用组合物诱导抗菌肽的基因表达。9. 根据权利要求8所述的具有感染预防作用的食品或药品组合物，其中，所述食品或药 品组合物通过经口摄取、经肠摄取而被诱导。10. 作为诱导抗菌肽的基因表达的有效成分的乳酸菌或经乳酸菌发酵的原材料或其两 者在制备抗菌肽诱导剂中的应用。11. 作为诱导抗菌肽的基因表达的有效成分的乳酸菌或经乳酸菌发酵的原材料或其两 者在制备含有抗菌肽诱导剂的抗菌肽诱导用组合物中的应用。12. 作为诱导抗菌肽的基因表达的有效成分的乳酸菌或经乳酸菌发酵的原材料或其两 者在制备含抗菌肽诱导剂的具有感染预防作用的食品或药品组合物中的应用。
【文档编号】A61P31/04GK105960244SQ201480074970
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2014年12月10日
【发明人】浅见幸夫, 萩原智子
【申请人】株式会社明治