专利名称：一种诱导植物过敏性反应的激发子、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明一种诱导植物过敏性反应和抗病性的激发子及其制备方法，属于生物技术研究领域。专用于从水稻黄单胞菌中制备一种蛋白类激发子，用于防治植物病虫害，并提高作物产量。
激发子(elicitor)是能诱导植物产生防卫反应的一类物质，这类物质有蛋白、寡聚糖、糖蛋白等类型。激发子有生物来源和非生物来源两种类型，其中生物来源包括植物病原真菌(如Phytophthora infestants，Phytophthora sojae)、植物病原细菌和植物胞壁等。
植物病原细菌是一种重要的激发子生物来源。植物病原细菌在非寄主植物上引起的过敏性反应是植物的一种防卫反应，具体表现为接种区植物细胞的快速死亡，形成局部枯斑，从而阻止病原菌进一步扩展并杀死病原菌。已经报道梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和棒形杆菌(Clavibactermichiganeasis)能产生蛋白类激发子。由Hrp基因编码的harpin也属于蛋白类激发子。但到目前为止，未有文献和专利报道从水稻黄单胞菌中分离出激发子。
本发明的目的是提供一种能诱导植物过敏性反应的激发子、制备方法及其应用，提取一种能够激发烟草过敏性反应的活性物质，并对其进行纯化，用于防治植物病虫害，并能提高作物产量。
本发明所提供的植物过敏性反应激发子，其特征在于，激发子来源于水稻黄单胞菌，属蛋白类，分子量为10KD-100KD，等电点为4.0-7.0，甘氨酸含量为15-30％(摩尔百分比)，谷氨酸含量为10-25％(摩尔百分比)。该激发子引起烟草过敏性反应的浓度为3-10μg/mL。本发明所提供的植物过敏性反应激发子的制备方法，包括1.激发子的提取
菌体在NB培养基中液体培养，离心收集菌体，滤液经冻干浓缩20-50倍；沉淀菌体重悬于原培养液1/5-1/20体积的磷酸缓冲液(pH6.5)，加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，浓度为0.5-2mM；菌悬液经超声波破碎，离心去除菌残体，上清沸水浴5-20′，然后再经30,000-200,000g超速离心30′-120′，上清经20-80％饱和度硫酸铵沉淀，沉淀经透析后得到激发子粗提蛋白；2.激发子的纯化激发子粗提蛋白通过制备式等电聚焦初步纯化，再通过强阴离子交换层析，平衡液为5mM磷酸缓冲液(pH6.5)，0-2M NaCl梯度洗脱，收集活性蛋白，透析后冻干浓缩制成纯品。某些激发子需通过分子筛进一步纯化，平衡液和淋洗液均为5mM磷酸缓冲液(pH6.5，含0.15M NaCl)，收集活性蛋白，透析后冻干浓缩制成纯品。
上述诱导植物过敏性反应激发子的使用方法为，将浓度为10-100μg/mL的激发子浸种、蘸根或喷雾使用1-4次，用于防治小麦纹枯病、白粉病、赤霉病、蚜虫，棉花立枯、炭疽病，植物细菌性青枯病，水稻细菌病害，蔬菜病毒病，辣椒和草莓灰霉病，烟草病毒病，油菜菌核病等，对上述植物促进生长和增加产量。
本发明所提供的植物过敏性反应激发子来源于水稻黄单胞菌，属蛋白类，分子量为10-100KD，等电点为4.0-7.0，甘氨酸含量为15-30％(摩尔百分比)，谷氨酸含量为10-25％(摩尔百分比)。该激发子与E.amylovora的HarpinEa在生理生化特性方面有许多相似之处，在烟草上引起典型的过敏性反应；热稳定且对蛋白酶敏感。本发明所提供的水稻黄单胞菌来源的激发子比Erwiniaamylovora、Pseudomonas syringae来源的Harpin类蛋白激发子具有更强的生物活性，引起烟草过敏性反应的浓度更低，它们引起烟草过敏性反应的浓度分别为3-10μg/mL、40-60μg/mL和100-200μg/mL，。
本发明的激发子可用于植物病虫害的生物防治，防治对象包括小麦纹枯病、白粉病、赤霉病、蚜虫，棉花立枯、炭疽病，植物细菌性青枯病，水稻细菌病害，蔬菜病毒病，草莓灰霉病，烟草病毒病，油菜菌核病等，防治效果为60-95％。还可用于提高作物产量，增产效果为10-100％。使用浓度为10-100μg/mL，浸种、蘸根或喷雾使用。使用1-4次。
实施例1从水稻白叶枯病菌JXOIII中制备的激发子属蛋白类，分子量为13KD，等电点为4.5，甘氨酸含量为22％(摩尔百分比)，谷氨酸含量为16％(摩尔百分比)，缺乏半胱氨酸与色氨酸。该激发子与E.amylovora的HarpinEa在生理生化特性方面有许多相似之处，在烟草上引起典型的过敏性反应；均富含甘氨酸、热稳定且对蛋白酶敏感。与E.amylovora提取的HarpinEa不同的是，HarpinEa分子量为44KD，等电点为4.2。该激发子比Erwinia amylovora、Pseudomonassyringae来源的Harpin类蛋白激发子具有更强的生物活性，引起烟草过敏性反应的浓度更低，它们引起烟草过敏性反应的浓度分别为10μg/mL、40-60μg/mL和100-200μg/mL。
从水稻白叶枯病菌JXOIII中制备激发子，制法包括1.激发子的提取JXOIII在NB培养基中液体培养，离心收集菌体，滤液经冻干浓缩30倍；沉淀菌体重悬于原培养液1/10体积的磷酸缓冲液(pH6.5)，加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，浓度为1mM；菌悬液经超声波破碎(40％输出功率，20′)，离心去除菌残体，上清沸水浴15′，然后再经80,000g超速离心60′，上清经30％饱和度硫酸铵沉淀，沉淀经透析后得到激发子粗提蛋白；2.激发子的纯化激发子粗提蛋白通过制备式等电聚焦(RotoforTM，Bio-Rad)初步纯化，阳极缓冲液为0.1mol/L H3PO4，阴极缓冲液为0.1mol/L NaOH。样品中加两性电解质Ampholine(pH3.5-10)，浓度为2％，电泳时间为4.5小时。聚焦后收集活性蛋白组份，再通过Q-Sepharose F.F.(XK26/7)离子交换层析(FPLCSystem，Pharmacia)，平衡液为5mM磷酸缓冲液(pH6.5)，0-2M NaCl梯度洗脱，洗脱浓度为0.66M的收集液透析后浓缩得到纯化蛋白。
该提纯的激发子在多种作物上具有防病增产作用(表一)实施例2从水稻细菌性条斑病菌Rs105中制备的激发子属蛋白类，分子量为65KD，等电点为6.5，富含甘氨酸和谷氨酸，甘氨酸含量为25％(摩尔百分比)，谷氨酸含量为17％(摩尔百分比)。该激发子与E.amylovora的HarpinEa在生理生化特性方面有许多相似之处，在烟草上引起典型的过敏性反应；热稳定且对蛋白酶敏感。与E.amylovora提取的HarpinEa不同的是，HarpinEa分子量为44KD，等电点为4.2。该激发子比Erwinia amylovora、Pseudomonassyringae来源的Harpin类蛋白激发子具有更强的生物活性，引起烟草过敏性反应的浓度更低，它们引起烟草过敏性反应的浓度分别为3μg/mL、40-60μg/mL和100-200μg/mL，。
从水稻细条斑病菌Rs105中制备激发子，制法包括1.激发子的提取Rs105在NB培养基培养，离心收集菌体，滤液经冻干浓缩50倍；沉淀菌体重悬于原培养液1/8体积的磷酸缓冲液(pH6.5)，加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，浓度为1mM；菌悬液经超声波破碎(40％输出功率，20′)，离心去除菌残体，上清沸水浴10′，然后再经100,000g超速离心45′，上清经60％饱和度硫酸铵沉淀，沉淀经透析后得到激发子粗提蛋白；2.激发子的纯化激发子粗提蛋白通过制备式等电聚焦(RotoforTM，Bio-Rad)初步纯化，阳极缓冲液为0.1mol/L H3PO4，阴极缓冲液为0.1mol/L NaOH。样品中加两性电解质Ampholine(PH3.5-10)，浓度为2％，电泳时间为5小时。聚焦后收集活性蛋白组份，再通过Q-Sepharose F.F.(XK26/7)离子交换层析(FPLCSystem，Pharmacia)，平衡液为5mM磷酸缓冲液(pH6.5)，0-2M NaCl梯度洗脱，收集活性组份，通过SephadexG75(XK16/65)分子筛(FPLC System，Pharmacia)，平衡液和淋洗液均为5mM磷酸缓冲液(pH6.5，含0.15M NaCl)，收集活性蛋白，透析后冻干浓缩制成纯品。
该提纯的激发子在多种作物上具有防病增产作用(表二)表一 水稻黄单胞菌JXOIII蛋白类激发子对作物病虫防治作用及增产作用作 物使用方法 防治对象防治效果 增产效果水 稻蘸根及后期喷雾2次，使用浓度为30μg/mL 白叶枯病 60％ 11％小 麦浸种和后期喷雾2次，使用浓度为40μg/mL 纹枯病67％ 15喷雾3次，使用浓度为30μg/mL白粉病85％ 18％喷雾3次，使用浓度为30μg/mL赤霉病87％ 18％喷雾3次，使用浓度为30μg/mL粘虫 85％ 18％棉 花喷雾1次，使用浓度为100μg/mL 炭疽病71％ 11％喷雾1次，使用浓度为100μg/mL 立枯病70％ 12％番 茄喷雾3次，使用浓度为60μg/mL病毒病89％ 42％喷雾3次，使用浓度为60μg/mL晚疫病82％ 42％喷雾3次，使用浓度为60μg/mL叶霉病66％ 42％蘸根及后期喷雾2次，使用浓度为60μg/mL 青枯病72％ 35％辣 椒喷雾4次，使用浓度为30μg/mL病毒病90％ 100％烟 草喷雾3次，使用浓度为60μg/mL病毒病67％ 11％草 莓喷雾3次，使用浓度为30μg/mL灰霉病65％ 20％油 菜喷雾3次，使用浓度为30μg/mL菌核病67％ 15％表二 水稻细菌性条斑病菌蛋白类激发子对作物病虫防治作用及增产作用作 物使用方法防治对象防治效果 增产效果水 稻蘸根及后期喷雾2次，使用浓度为25μg/mL 白叶枯病65％ 15％小 麦浸种和后期喷雾2次，使用浓度为25μg/mL 纹枯病 68％ 18％喷雾3次，使用浓度为20μg/mL 白粉病 88％ 20％喷雾3次，使用浓度为20μg/mL 赤霉病 84％ 23％喷雾3次，使用浓度为20μg/mL 粘虫87％ 21％棉 花喷雾1次，使用浓度为80μg/mL 炭疽病 75％ 15％喷雾1次，使用浓度为80μg/mL 立枯病 76％ 13％番 茄喷雾3次，使用浓度为60μg/mL 病毒病 92％ 40％喷雾3次，使用浓度为60μg/mL 晚疫病 85％ 40％喷雾3次，使用浓度为60μg/mL 叶霉病 70％ 40％蘸根及后期喷雾2次，使用浓度为60μg/mL 青枯病 75％ 40％辣 椒喷雾4次，使用浓度为30μg/mL 病毒病 95％ 100％烟 草喷雾3次，使用浓度为50μg/mL 病毒病 71％ 12％草 莓喷雾3次，使用浓度为30μg/mL 灰霉病 70％ 25％油 菜喷雾3次，使用浓度为30μg/mL 菌核病 72％ 16％
权利要求
1.一种诱导植物过敏性反应和抗病性激发子，其特征在于激发子来源于水稻黄单胞菌，属蛋白类，分子量为10KD-100KD，等电点为4.0-7.0，甘氨酸含量为15-30％(摩尔百分比)，谷氨酸含量为10-25％(摩尔百分比)，该激发子引起烟草过敏性反应的浓度为3-10μg/mL。
2.权利要求1所述诱导植物过敏性反应激发子的制备方法，包括2.1)激发子的提取菌体在NB培养基中液体培养，离心收集菌体，滤液经冻干浓缩20-50倍；沉淀菌体重悬于原培养液1/5-1/20体积的磷酸缓冲液(pH6.5)，加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，浓度为0.5-2mM；菌悬液经超声波破碎，离心去除菌残体，上清沸水浴5-20′，然后再经30,000-200,000g超速离心30′-120′，上清经20-80％饱和度硫酸铵沉淀，沉淀经透析后得到激发子粗提蛋白；2.2)激发子的纯化激发子粗提蛋白通过制备式等电聚焦初步纯化，再通过强阴离子交换层析，平衡液为5mM磷酸缓冲液(pH6.5)，0-2M NaCl梯度洗脱。
3.根据权利要求2所述诱导植物过敏性反应激发子的制备方法，其特征在于将所提激发子粗提蛋白通过等电聚焦初步纯化，通过强阴离子离子交换层析，再通过分子筛进一步纯化。
4.权利要求1-3之一所述诱导植物过敏性反应激发子的使用方法为，将浓度为10-100μg/mL的激发子浸种、蘸根或喷雾使用1-4次，用于防治小麦纹枯病、白粉病、赤霉病、蚜虫，棉花立枯、炭疽病，植物细菌性青枯病，水稻细菌病害，蔬菜病毒病，草莓灰霉病，烟草病毒病，油菜菌核病等，对上述植物促进生长和增加产量。
全文摘要
本发明水稻黄单胞菌诱导植物过敏性反应和抗病性的激发子、制备方法及其应用,属于生物技术领域。利用超声波破碎细胞,从水稻黄单胞菌菌体中提取到一种能够诱导植物过敏性反应和抗病性的蛋白类激发子,并通过等电聚焦及柱层析技术对其进行纯化。该激发子可用于多种植物病害的生物防治,对害虫有驱避作用,并具有促进植物生长和增加作物产量的作用。浸种、蘸根或喷雾使用。使用浓度为10—100μg/mL,使用1—4次。防治效果60%以上,增产效果为10%以上。
文档编号C07K14/195GK1251371SQ99114368
公开日2000年4月26日 申请日期1999年8月10日 优先权日1999年8月10日
发明者王金生, 闻伟刚, 陆徐忠, 宋从凤, 吴健胜 申请人:南京农业大学