专利名称：具有诱导金丝桃属植物次生代谢活性的新化合物的制作方法
技术领域：
本发明的技术方案涉及含1，2-二唑的杂环化合物及其诱导植物次生代谢的作用，具体涉及[1，2，3]噻二唑衍生物以及这些衍生物诱导金丝桃属植物贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质如金丝桃素(Hyperisin，简称HP)、伪(假)金丝桃素(Pseudohypericin，简称PHP)、原假金丝桃素(Protopseudohypericin，简称PPHP)、贯叶金丝桃素(Hyperforin，简称HF)的活性。
背景技术：
噻二唑类衍生物具有广泛的生物活性，是重要的医药和农药中间体，噻二唑有[1，2，3]噻二唑、[1，2，4]噻二唑、[1，2，5]噻二唑、[1，3，4]噻二唑4种异构体，目前应用最多的是[1，3，4]噻二唑的衍生物，由于[1，2，3]噻二唑是几个异构体中唯一能够通过热解和光解很容易产生N2的异构体，因此，该类化合物正在成为研究的热点。文献报道的部分高活性[1，2，3]噻二唑衍生物的化学结构见表1，其中比较值得关注的是该类化合物中的BTH和TDL以及SV-03均具有很好的诱导植物产生对病原菌的抗性。BTH英文通用名acibenzolar-S-methyl；IUPAC名S-甲基苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸酯；在植物体内迅速降解为无活性的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸，但BTH能激活植物的免疫系统产生对真菌、细菌、线虫和病毒的保护作用(Sonnemannet al.，Does induced resistance in plant affect the belowground community？Applied Soil Ecology，2002，21179-185)；噻酰菌胺即3’-氯-4，4’-二甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰胺(TDL)具有很好杀菌活性(Tsubata et al.Thiadiazole carboxamide derivative，plant disease controlling agent，and methodof using the same.WO 9923084，1999-05-14)，它和中间体[1，2，3]-噻二唑-5-甲酸(SV-03)都能诱导烟草抗性基因的表达并产生对烟草抗烟草花叶病毒(TMV)的抗性(Yasuda et al.Thiadiazolecarboxylic acid moiety of tiadinil，SV-03，induces systemic acquired resistance in tobacco withoutsalicylic acid accumulation.J.Pestic.Sci.，2006，31(3)329-334)。有关[1，2，3]噻二唑的合成、反应、性质和应用见Bakulev和Dehaen教授出版的“The Chemistry of 1，2，3-thiadiazole”一书。
植物诱导抗病激活剂的创制研究在国内报道不多，本发明的发明人在前期建立植物抗病激活剂诱导活性筛选体系的基础上对BTH和TDL两个先导化合物进行了较系统结构改造，合成了100多个新的衍生物，发现部分化合物具有很好的诱导烟草抗TMV的活性，部分新化合物有很好的杀菌活性(范志金等，苯并噻二唑衍生物及其合成方法和诱导抗病活性的筛选，中国国家发明专利，公开号CN1680342A，2005-10-12；范志金等，新型[1，2，3]噻二唑表1 高活性1，2，3-噻二唑类化合物的化学结构
衍生物及其合成方法和用途，中国国家发明专利，公开号CN1810808A，2006-8-2)。由于茉莉酸甲酯(表2)和上述3个化合物都具有诱导植物对农业病害产生抗病性的活性，文献也报道了贯叶连翘提取物的主要成分就是金丝桃素类物质(Tatsis，et al.，Identification of the majorconstituents of hypericum perforatum by LC/SPE/NMR and/or LC/MS.Phytochemistry，2007，68383-393)，同时，茉莉酸甲酯具有诱导贯叶连翘产生金丝桃素类物质(结构见表2)的活性(Sirvent，et al.，Induction of hypericins and hyperforin in Hypericum perforatum L.in response tobiotic and chemical elicitors.Physiol.Mol.Plant Pathol.，2002，60311-320；Walker，et al.，Jasmonic acid-induced hypericin production in cell suspension cultures of Hypericum perforatum L.(St.John′s wort).Phytochemistry，2002，60(3)289-293)，考虑到金丝桃素类物质具有很好的抗忧郁活性、抗微生物、抗肿瘤和抗病毒及防治禽流感的作用(娄海容等，在防治禽流感中引人注目的中草药-金丝桃属和金丝桃素，现代医院，2006，6(4)3-5.)，我们预期自己合成的[1，2，3]噻二唑衍生物及其中间体可能与茉莉酸甲酯一样具有共同的诱导贯叶连翘的活性，因此，发明人在国家自然科学基金(批准号20672062和30270883)和国家重点基础研究发展计划“973”项目(批准号2003CB114402)及天津市自然科学基金(批准号07JCYBJC01200)和元素有机化学国家重点实验室开放基金(0602和0702)的资助下对已合成的具有诱导烟草抗TMV活性的化合物进行了诱导贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质活性的测定，结果在国际上首次发现，[1，2，3]噻二唑的衍生物具有诱导金丝桃属植物产生金丝桃素类物质的特性。
表2 茉莉酸甲酯及金丝桃素类化合物的化学结构
本发明的目的本发明的目的是提供新型诱导贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质的1，2，3-噻二唑衍生物以及这些化合物用于诱导贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质的方法。
本发明的内容本发明所要解决的技术问题是提供新型1，2，3-噻二唑的衍生物，利用组织培养的方法测定这些化合物诱导贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质的活性，同时以茉莉酸甲酯为对照。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是分别利用固体培养基和液体培养基进行新型1，2，3-噻二唑衍生物分别诱导，分别进行贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质的活性测定，并系统评价各化合物的诱导活性，本发明具体涉及的化合物的化学结构式(I)描述的具体化合物的化学结构式见表3
表3 本发明涉及的具有诱导植物产生金丝桃素类物质的化学结构特征
I.MS固体培养基的制备和继代诱导培养MS固体培养基含有6-卞基腺嘌呤(BA)0.1毫克/升，4-吲哚-3-丁酸(IBA)0.05毫克/升，琼脂0.6％，蔗糖3％，121度(0.105MPa)高温灭菌15分钟，待培养基温度降至约50度，将化合物以50微摩尔/升终浓度加入培养基中，充分摇匀后静置待用，以培养基中添加1微升/毫升的DMF为对照；取继代培养(MS+BA0.1毫克/升+IBA0.05毫克/升)约一年的贯叶连翘或元宝草组培苗，剪切成3～4个节点，接入含有不同化合物的培养基中，光照(16小时/8小时)培养，光强3700Lux，培养温度25±2度，以100毫升锥形瓶为培养容器，每瓶12个外植体，每个处理8瓶，培养28天后，取出植物材料液氮冷冻后，待测提取和检测。化合物配制SZG系列和LD系列化合物配制成50微摩尔/毫升DMF溶液，MJA和TDL配制成50微摩尔/毫升乙醇溶液，经0.45微摩尔/升Nylon膜过滤后配制成50微摩尔/毫升DMF溶液，各种化合物在培养基中的母液的添加量为1微升/毫升培养基，药剂在培养基中的最终浓度为50微摩尔/升，对照为不添加溶剂的固体培养的组培苗。
II.MS液体培养基的制备和继代诱导培养MS液体培养基含有6-卞基腺嘌呤(BA)0.1毫克/升，4-吲哚-3-丁酸(IBA)0.05毫克/升，蔗糖3％，不加琼脂，121度(0.105MPa)高温灭菌15分钟，待培养基温度降至约50度，将化合物以50微摩尔/升终浓度加入培养基中，充分摇匀后静置待用，以培养基中添加1微升/毫升的DMF为对照；取继代培养(MS+BA0.1毫克/升+IBA0.05毫克/升)约一年的贯叶连翘或元宝草组培苗，剪切成3～4个节点，接入含有不同化合物的培养基中，光照(16小时/8小时)培养，光强3700Lux，培养温度25±2度，以100毫升锥形瓶为培养容器，每瓶12个外植体，每个处理8瓶，培养28天后，取出植物材料液氮冷冻后，待测提取和检测。化合物配制BTH配制成50微摩尔/毫升水溶液，SZG-7配制成50微摩尔/毫升DMF溶液，MJA和TDL配制成50微摩尔/毫升乙醇溶液，分别将50微摩尔其他化合物于溶1毫升N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，经0.45微摩尔/升Nylon膜过滤后配制成50微摩尔/毫升DMF溶液，各种化合物在培养基中的添加量为1微升/毫升培养基，药剂在培养基中的最终浓度为50微摩尔/升，对照为不添加溶剂的液体培养的组培苗。
III.生物反应器和活体植株的诱导培养生物反应器的诱导培养和上述液体培养基的诱导培养类似，将整个体系移植到生物反应器中进行。活体植株的诱导可以采用50微摩尔/升整体植株喷雾，植物材料的提取和测定采用下述方法进行。
IV.组培苗中金丝桃素类化合物的提取和HPLC含量测定金丝桃素类化合物的提取样品冷冻干燥18小时，研磨后称取0.200g，用10毫升甲醇(含2％吡啶)超声波冰浴提取15分钟，4000g冷冻离心15分钟，上清液经0.45微米尼龙膜过滤后用于HPLC分析。操作过程在低温下尽量避光进行，防止提取物的光分解和热分解。
金丝桃素类化合物含量的HPLC测定采用日本岛津高效液相色谱分析系统SCL-10A控制器和SPD-M10A检测器，Diamonsil C18(5微摩尔/升，4.6mm×150mm)色谱柱；20微升进样量，流动相为乙腈和0.05摩尔/升三乙铵乙酸缓冲液(80∶20)，流速1.0毫升/分钟。HF在290nm检测，HP和PHP在588nm检测，各化合物的保留时间分别为6分钟(PHP)、18分钟(HP)和9分钟(HF)左右；HF的甲醇标准溶液浓度分别为2.5，5.0，10.0，25.0，50微克/毫升；PHP的甲醇标准溶液浓度分别为5.0，7.5，10.0，25.0，50.0，75.0微克/毫升；HP的甲醇标准溶液浓度分别为1.0，2.0，4.0，6.0，10.0微克/毫升，采用峰面积外标法定量。
本发明的有益效果是TDL和茉莉酸甲酯(MJA)具有诱导植物产生对农业病原真菌抗病性的特点，而MJA具有诱导金丝桃属植物贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质的性能，金丝桃素类物质具有很好的抗忧郁活性、抗微生物、抗肿瘤和抗病毒及防治禽流感的作用，广泛应用于药物和食品中，本发明首次成功进行了MJA以外的其他化合物诱导金丝桃属植物贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质的试验。
本发明将通过特定实施例更加具体地说明TDL及其衍生物诱导贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素(Hyperisin)、伪(假)金丝桃素(Pseudohypericin)、原假金丝桃素(Protopseudohyericin)、贯叶金丝桃素(Hyperforin)的活性，但所述实施例仅用于具体的说明本发明而非限制本发明，具体的实施方式如下实施例1组培苗中金丝桃素类化合物的提取和HPLC含量测定的方法按照前述方法进行诱导贯叶连翘和元宝草中金丝桃素类化合物的提取和金丝桃素类化合物含量的HPLC测定，HPLC测定方法能有效的检测本发明涉及的金丝桃素类化合物，三个化合物测定方法的相关性好，R2均大于0.99，三个化合物的线性相关性分别为y＝8.846×10-5x+3.755×10-2(HF)；y＝2.922×10-5x+1.082(HP)；y＝8.375×10-6x+0.436(PHP)(x为峰面积，y为浓度，微克/毫升)。
实施例2SZG系列化合物和LD系列化合物对贯叶连翘组培苗生长及代谢产物合成的影响按照前述方法进行测定，SZG系列化合物，即SZG-7、SZG-II和SZG-4诱导贯叶连翘组培苗后，能促进假金丝桃素(PHP)和金丝桃素(HP)的合成；SZG-7和SZG-4能同时促进包括贯叶金丝桃素(HF)的三种代谢产物合成；SZG-II与其他两种同类化合物相比，不能促进HF的合成(可能与其某个结构基团有关)，但它能促进植物生物量的增加。LD系列两种化合物LD43和LD44中，LD43与对照相比能促进PHP和HP合成，但HF含量会随之降低；LD44显著抑制贯叶连翘组培苗生长和三种有效成分的代谢合成；TDL-7处理与对照之间没有显著差异；TDLA也具有一定的诱导活性，以上分析见表1及图1-图4。这些化合物用于诱导元宝草产生金丝桃素类物质的测定结果也有相同的结果。诱导作用除了组织培养诱导以外，还可以用活体植株和室内生物反应器诱导培养，这些化合物也能产生同样的诱导效果。
表1 SZG系列和LD系列化合物对贯叶连翘组培苗生长及代谢产物合成的影响
实施例3SZG-7和MJA诱导贯叶连翘次生代谢产物的测定结果按照前述方法进行测定，实验结果见表3，MJA50微摩尔/升能显著促进PHP、HP和HF的合成，与表2结果相似，但生物量增加为7.92毫克，少于表2的18.33毫克，与溶解MJA的溶剂有关；SZG-7能促进PHP和HP的合成，与表1结果相似，但SZG-7对HF代谢合成的影响与表1中的结果有差异。这些化合物用于诱导元宝草产生金丝桃素类物质的测定结果也有相同的结果。诱导作用除了组织培养诱导以外，还可以用活体植株和室内生物反应器诱导培养，这些化合物也能产生同样的诱导效果。
表3 SZG-7和MJA诱导贯叶连翘次级代谢产物试验
实施例4SZG-7、TDL和MJA诱导贯叶连翘水培苗及次级代谢产物合成按照前述方法进行测定，对照液体培养基中添加1微升/毫升DMF，贯叶连翘组培苗中PHP、HP、HF含量都比对照低，尤其HF的含量显著低于不添加DMF的对照，此试验结果见表4，表4的结果能解释表3中SZG-7处理后HF含量比不加DMF的对照降低的原因。培养初期添加SZG-7能促进PHP，HP，HF的代谢合成，随着添加SZG-7诱导物的时间延迟，诱导代谢产物合成的能力逐渐降低；但添加培养初始添加SZG-7后，植物组织生物量增加会受到抑制，并且随着SZG-7添加的逐渐延迟，这种抑制作用会逐渐消失，组织培养至第12天加入SZG-7诱导物后生物量增加与对照没有显著差异，就两种物质添加时间的结果看，随着诱导物添加时间的延迟，诱导代谢产物合成的效果会降低。TDLA也具有一定的诱导效果和诱导趋势；这些化合物用于诱导元宝草产生金丝桃素类物质的测定结果也有相同的结果。诱导作用除了组织培养诱导以外，还可以用活体植株和室内生物反应器诱导培养，这些化合物也能产生同样的诱导效果。
表4 SZG-7、TDL和MJA诱导贯叶连翘水培苗及次级代谢产物合成
实施例5不同浓度SZG-7、TDL和MJA诱导贯叶连翘组培苗代谢产物研究测定结果见表5，表5表明，SZG-7能诱导贯叶连翘组培苗中PHP和HP的合成，对于HF诱导效果不显著可能是对照的没有添加DMF的原因；同时SZG-7的添加会在一定程度上抑制生物量增长(与表1结果相似)；25微摩尔/升与50微摩尔/升的SZG-7相比，对代谢产物的合成影响差异不显著。这些化合物用于诱导元宝草产生金丝桃素类物质的测定结果也有相同的结果。诱导作用除了组织培养诱导以外，还可以用活体植株和室内生物反应器诱导培养，这些化合物也能产生同样的诱导效果。
表5 不同浓度SZG-7、TDL和MJA诱导贯叶连翘组培苗代谢产物研究
实施例6测定结果的总结以上试验设计较为合理和完善，研究结果表明SZG系列的化合物和LD系列化合物其及中间体具有诱导贯叶连翘和元宝草组培苗代谢产物PHP，HP或HF合成的能力；在水培条件下验证了SZG-7的诱导活性，并且诱导时间的规律得到基本确定；在固体培养条件下，添加25微摩尔/升与50微摩尔/升的SZG-7相比，对代谢产物的合成影响的差异不显著。活体植株以及生物反应器诱导培养也能产生同样的诱导效果。
图1SZG系列和LD系列化合物对贯叶连翘组培苗生物量的影响图2SZG系列和LD系列化合物对贯叶连翘组培苗PHP含量的影响图3SZG系列和LD系列化合物对贯叶连翘组培苗HP含量的影响图4SZG系列和LD系列化合物对贯叶连翘组培苗HF含量的影响
权利要求
1.新型1，2，3-噻二唑的衍生物，其特征在于它是结构式(I)描述的化合物和该化合物是4-(2’，4’-二氯苯基-5-正丙基-1，3-噻唑-2-胺 其中R分别是对甲氧基苯胺基、2，6-二氯苯胺基、羟基、5-甲基-1，3-噻唑-2-胺基、3-氯-4-甲基苯胺基、1，3-噻唑-2-胺基以及整个是4-(2’，4’-二氯苯基-5-正丙基-1，3-噻唑-2-胺。
2.4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰对甲氧基苯胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-2’，6’-二氯苯胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-5’-甲基-1’，3’-噻唑-2’-胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-3’-氯-4’-甲基苯胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-1’，3’-噻唑-2’-胺和4-(2’，4’-二氯苯基-5-正丙基-1，3-噻唑-2-胺用于组织培养诱导贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质金丝桃素(Hyperisin，简称HP)、伪(假)金丝桃素(Pseudohypericin，简称PHP)、原假金丝桃素(Protopseudohypericin，简称PPHP)、贯叶金丝桃素(Hyperforin，简称HF)以及生物量的增加。
3.4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰对甲氧基苯胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-2’，6’-二氯苯胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-5’-甲基-1’，3’-噻唑-2’-胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-3’-氯-4’-甲基苯胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-1’，3’-噻唑-2’-胺和4-(2’，4’-二氯苯基-5-正丙基-1，3-噻唑-2-胺用于活体植株诱导贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质金丝桃素(Hyperisin，简称HP)、伪(假)金丝桃素(Pseudohypericin，简称PHP)、原假金丝桃素(Protopseudohypericin，简称PPHP)、贯叶金丝桃素(Hyperforin，简称HF)以及生物量的增加。
4.4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰对甲氧基苯胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-2’，6’-二氯苯胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-5’-甲基-1’，3’-噻唑-2’-胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-3’-氯-4’-甲基苯胺、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰-1’，3’-噻唑-2’-胺和4-(2’，4’-二氯苯基-5-正丙基-1，3-噻唑-2-胺用于在田间诱导和室内生物反应器内诱导诱导贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质金丝桃素(Hyperisin，简称HP)、伪(假)金丝桃素(Pseudohypericin，简称PHP)、原假金丝桃素(Protopseudohypericin，简称PPHP)、贯叶金丝桃素(Hyperforin，简称HF)以及生物量的增加。
全文摘要
本发明系统的评价了噻酰菌胺(TDL)及其杂环酰胺和芳环酰胺及其中间体4－甲基－1，2，3－噻二唑－5－甲酸、4－甲基－1，2，3－噻二唑－5－甲酰对甲氧基苯胺、4－甲基－1，2，3－噻二唑－5－甲酰－2’，6’－二氯苯胺、4－甲基－1，2，3－噻二唑－5－甲酰－5’－甲基－1’，3’－噻唑－2’－胺、4－甲基－1，2，3－噻二唑－5－甲酰－3’－氯－4’－甲基苯胺、4－甲基－1，2，3－噻二唑－5－甲酰－1’，3’－噻唑－2’－胺和4－(2’，4’－二氯苯基－5－正丙基－1，3－噻唑－2－胺通过组织培养和活体植株以及室内生物反应器诱导贯叶连翘和元宝草产生金丝桃素类物质金丝桃素(Hyperisin，简称HP)、伪(假)金丝桃素(Pseudohypericin，简称PHP)、原假金丝桃素(Protopseudohypericin，简称PPHP)、贯叶金丝桃素(Hyperforin，简称HF)的活性。研究发现，SZG系列的化合物和LD系列化合物其及中间体具有诱导贯叶连翘和元宝草组培苗代谢产物PHP，HP或HF合成的能力并能诱导生物量的增加；在水培条件下验证了SZG－7的诱导活性，并且诱导时间的规律得到基本确定；在固体培养条件下，添加25微摩尔/升与50微摩尔/升的SZG－7相比，对代谢产物的合成影响的差异不显著。活体植株以及生物反应器诱导培养也能产生同样的诱导效果。本发明公开了上述化合物的诱导活性及其测定方法。
文档编号C07D417/12GK101020667SQ200710056909
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月12日 优先权日2007年3月12日
发明者范志金, 刘晓娜, 孙君社, 石祖贵, 吴琼, 刘秀峰, 巴库勒夫·瓦西里耶·阿勒克什维奇 申请人:南开大学