专利名称：一种简便、高效诱导辣椒疫霉菌产生游动孢子的方法
技术领域：
本发明属于农业植物保护技术领域，具体涉及一种简便、高效诱导植物病原菌辣椒疫霉菌产生大量游动孢子的方法。
背景技术：
由辣椒疫霉菌iPhytophthora capsici Leonian)侵染引起的辣椒疫病是一种毁灭性的世界病害，该病害在适宜发病的条件下，可在短期内暴发成灾，病原菌可侵染辣椒引起根、茎和果实腐烂，甚至造成寄主作物绝收，给辣椒生产造成严重的经济损失。辣椒是我国的传统产业，改革开放以来，随着市场经济的推进，我国辣椒产业每年以7%的速度发展，我国辣椒出口也在不断增长，韩国、日本、澳大利亚、美国和东南亚等已成为我国辣椒的常年进口国。由于辣椒的适应性强，栽培区域广泛，种植辣椒的经济效益和社会效益都很高，对于中国蔬菜市场的周年供应有重要意义，辣椒已成为我国部分贫困山区脱贫致富的好帮手、城市菜篮子的当家菜。但是近年来，辣椒疫病在我国不少省份发生为害日益严重，重病田死秧率达30-100%，成为影响我国辣椒生产的重要障碍，如何有效地对辣椒疫病进行综合管理并使之造成的经济损失降低至最小是农业科研推广部门的一大挑战。研究并明确辣椒疫病发生流行规律是制定病害综合管理措施的前提条件，研究病害流行规律需借助病原菌人工接种技术，而通过分离纯化获得目标病原菌的纯培养，再由纯培养获得大量的人工接种体是人工接种的第一步。在辣椒疫病研究中人工接种体是游动孢子，传统的获得游动孢子的方法是获得孢子囊，再通过刺激孢子囊使之释放游动孢子，从而获得最终的接种体。辣椒疫霉菌产生游动孢子的传统或常规方法比较复杂，操作步骤繁多，产孢量低，产孢时间长，且效果不稳定，难以满足大批量接种试验的需求。因此，很有必要建立一种简易、高效的诱导辣椒疫霉菌产生大量游动孢子的方法，旨在为开展辣椒疫霉菌的群体遗传研究及揭示病害的传播和发生规律奠定基础，为建立有效的病害管理措施提供科依据和技术手段。
发明内容
为了解决上述难题，本发明提供了一种简便、高效诱导辣椒疫霉菌产生游动孢子的方法。为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案得以实现。(1)辣椒疫霉菌菌丝体的培养将辣椒疫霉菌菌丝块接种于黑麦培养基平板上，置于500-600勒克斯的白色日光灯下连续光照的25°C 培养箱中培养；
(2)辣椒疫霉菌菌丝体的抹伤待步聚(1)菌丝长满整个平板后，以无菌的L型玻棒涂抹长满菌丝的平板；
(3)辣椒疫霉菌孢子囊的诱导将步骤(2)得到的平板放置于500-600勒克斯的白色日光灯下连续光照的生化培养箱中培养对-3他；(4)游动孢子的释放在步骤(3)得到的平板中加入无菌水，移至4°C冰箱或生化培养箱中静置l_2h，然后再置于生化培养箱中孵育1- ；
(5)辣椒疫霉菌游动孢子的收集用灭过菌的毛笔轻轻拨动步骤(4)得到的培养基平板表面的菌丝，以达到刷洗游动孢子的目的，双层无菌纱布过滤，所得到的过滤液即为辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液。本发明的显著优点
诱导辣椒疫霉菌产生大量孢子囊或游动孢子对开展辣椒疫霉菌的生物学、生态学、遗传分析、分子分析以及致病性测定和制定植物病害适时有效的综合管理措施等研究都具有重要的意义。辣椒疫霉菌孢子囊和游动孢子的传统诱导方法也能产生孢子囊和游动孢子， 这些方法步骤比较复杂，且产生孢子囊的数量不稳定，比如土壤浸出液法和黄瓜接种保湿法(发明专利申请号201110022114. 2)也能诱导辣椒疫霉菌产生大量的孢子囊，但这些方法要求需不断的换水或保湿，而且要通过收集孢子囊后再刺激游动孢子释放，存在工作量大的缺点，无法满足大量试验的需求。本发明采用了抹伤辣椒疫霉菌菌丝体，再通过光照和低温刺激受伤菌体可直接产生大量游动孢子，本发明具有取材容易、成本低、操作步骤简便、 游动孢子产生时间短等优点。本发明为植物病害辣椒疫病的研究中游动孢子的产生提供了一种经济、快速和有效的简便方法。本发明为实现在短时间内诱导辣椒疫霉菌产生大量游动孢子提供了保证，本发明具有简易、高效、无杂菌污染的优点，对于开展辣椒疫病的研究具有重大意义。
图1辣椒疫霉菌菌丝体抹伤处理； 图2辣椒疫霉菌孢子囊形态特征；
图3辣椒疫霉菌游动孢子释放。
具体实施例方式下面结合实例对本发明一种简便、高效诱导辣椒疫霉菌产生游动孢子的方法进一步描述。实施例1:
辣椒品种对辣椒疫病的抗性鉴定，按以下程序进行
(1)将供试的辣椒种子(种子可购于蔬菜种子公司或辣椒种子育种单位，品种适为辣椒疫病感品种)播于72格的穴盘(每格大小为4. 2X4. 2X5. 5cm3)内的培养土中，培养土为育苗专用泥炭士，发芽后每穴蔬成1苗，放置于温室中(日温维持在25-28°C )生长4个星期， 植株长出约4-6片真叶时便可用于接种试验；
(2)供试辣椒疫霉菌菌株(菌株可分离自辣椒疫病发病的根、茎、果实和叶片组织)培养于黑麦培养基平板上，放置于的光照生化培养箱(500勒克斯的白色日光灯照射)中生长，经5d后菌丝生满整个平板，以涂抹菌丝方法促进游动孢子囊产生以供接种使用(如图1 所示)。首先以无菌的9cm的L型玻棒涂抹长满菌丝的平板后，放置于光照生化培养箱 (500勒克斯的白色日光灯照射)中培养Mh，便能刺激产生大量孢子囊(如图2所示)，再将已产生孢子囊的培养基平板加入ISmL无菌水后移至4°C冰箱中lh，以促进游动孢子分化，然后再取出置于生化培养箱中孵育lh，使游动孢子同时大量释放，以利于收集大量游动孢子悬浮液(如图3所示);用灭过菌的毛笔轻轻拨动培养基平板表面的菌丝，以达到刷洗游动孢子的目的，双层无菌纱布过滤，所得到的过滤液即为辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液。再以血球计数板计算游动孢子数目后，调整游动孢子浓度为IX IO5个/mL作为接种体。接种的方法是采用灌根法，将游动孢子悬浮液直接灌注于每个植株的根部及培养土中，每株各 5ml。接种后的植株放置于温室内，其日温必需维持在25°C以上，每天浇水两次，以维持高湿度的土壤而有利于病情进展；
所述的黑麦培养基的配制方法如下取50 g黑麦种子在1000 mL去离子水中浸泡 Μ-3Μι，在121 ！下高压蒸汽灭菌30 min，4层纱布过滤去渣，上清液补足水至1000 ml，加入琼脂20 g，加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布过滤。而后分装三角瓶，培养基在121。C 下高压蒸汽灭菌20 min。(3)病害反应的调查及抗感病反应的分类接种经过7、14、21d后，调查植株的存活百分率，再按下述等级归类其抗感病之反应高度抗病=植株存活率大于80% ；中度抗病=植株存活率为50-79% ；中度感病=植株存活率为30-49% ；高度感病=植株存活率低于 29%。(5)结果显示供试的辣椒疫霉菌所产生的游动孢子具有很强的致病力，感病的辣椒品种接种4d后植株便全部死亡，植株存活率为0。实施例2:
不同诱导方法对辣椒疫霉菌产孢量的影响，按以下程序进行
(1)日光照射受伤菌丝供试菌株(见实例1)培养于黑麦培养基平板上，置于500-600 勒克斯的白色日光灯连续照射的25V 光照培养箱中培养，待菌丝长满整个平板后， 以涂抹菌丝方法促进游动孢子囊产生以供作接种体。先以L型玻棒涂抹长满菌丝的平板， 即利用玻棒的涂抹压倒所有的菌丝贴于培养基平板上，再放置于观°C下光照培养箱(与前述相同)中培养M-36 h，然后向培养基平板加入18-20mL无菌水，移至4°C冰箱或生化培养箱中静置l_2h，然后再置于生化培养箱中孵育1- ；用消毒毛笔刷洗菌丝表面，双层纱布过滤，吸取10-20 μ L过滤液制成玻片，于100倍视野下镜检，每块玻片观察10个视野， 记录游动孢子数量，然后根据菌丝块面积，换算成每平方厘米菌丝块上产生孢子囊数；
(2)菌丝块水培法将供试辣椒疫霉菌株移至胡萝卜培养基上，28°C光照中培养4d，用直径为7 mm无菌打孔器沿菌落边缘打取菌丝块(所有菌丝块菌龄一致)，把菌丝块分别挑入灭好菌的培养皿中，每皿移入10块菌碟，菌丝块的菌丝面朝上，加入灭菌自来水，让自来水刚刚淹过菌丝面。培养皿置光照培养箱(与前述相同)中培养M-48 h，用消毒毛笔刷洗菌丝表面，双层纱布过滤，所得滤液移至4°C冰箱或生化培养箱中静置l_2h，然后再置于生化培养箱中孵育l_2h，吸取10 μ L过滤液制成玻片，于100倍视野下镜检，每块玻片观察 10个视野，记录游动孢子数量，然后根据菌丝块面积，换算成每平方厘米菌丝块上产生游动孢子数；
(3)结果显示在黑麦培养基平板上培养的辣椒疫霉菌，用玻棒的涂抹压倒所有的菌丝使其贴于培养基平板上，再放置于观°C下光照培养箱中培养M-36 h，然后向培养基平板加入18-20mL无菌水，移至4°C冰箱或生化培养箱中静置l_2h，然后再置于生化培养箱中孵育l_2h，可产生大量的游动孢子，菌丝块上孢子囊的平均密度为2. 56X IO6个/ cm2。菌丝块水培法培养M h未产生孢子囊，但培养48 h后也能产生一定数量的孢子囊，菌丝块上孢子囊的密度为2. 02X IO4个/ cm2，其数量比日光照射受伤菌丝法少。
权利要求
1. 一种简便、高效诱导辣椒疫霉菌产生游动孢子的方法，其特征和步聚如下(1)辣椒疫霉菌菌丝体的培养将辣椒疫霉菌菌丝块接种于黑麦培养基平板上，置于500-600勒克斯的白色日光灯下连续光照的25°C 培养箱中培养；(2)辣椒疫霉菌菌丝体的抹伤待步聚(1)菌丝长满整个平板后，以无菌的L型玻棒涂抹长满菌丝的平板；(3)辣椒疫霉菌孢子囊的诱导将步骤(2)得到的平板放置于500-600勒克斯的白色日光灯下连续光照的生化培养箱中培养对-3他；(4)游动孢子的释放在步骤(3)得到的平板中加入无菌水，移至4°C冰箱或生化培养箱中静置l_2h，然后再置于生化培养箱中孵育1- ；(5)辣椒疫霉菌游动孢子的收集用灭过菌的毛笔轻轻拨动步骤(4)得到的培养基平板表面的菌丝，以达到刷洗游动孢子的目的，双层无菌纱布过滤，所得到的过滤液即为辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液。
全文摘要
本发明涉及一种简便、高效诱导辣椒疫霉菌产生游动孢子的方法。该方法将辣椒疫霉菌培养于黑麦琼脂培养基平板上，置于28℃光照生化培养箱中培养，待菌丝长满整个平板后，以无菌L型玻棒涂抹长满菌丝的培养基平板，再置于28℃光照生化培养箱中培养24h以诱导孢子囊的产生，再将已产生孢子囊的培养基平板加入18mL的无菌水后移至4℃冰箱中1h，以促进游动孢子分化，然后再取出放置28℃生化培养箱中1h，使游动孢子同时大量释放，以利收集大量游动孢子悬浮液。本发明为实现在短时间内诱导辣椒疫霉菌产生大量游动孢子提供了保证，本发明具有简易、高效、无杂菌污染的优点，对于开展辣椒疫病的研究具有重大意义。
文档编号C12N3/00GK102391980SQ20111037941
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者兰成忠, 李本金, 翁启勇, 赵健, 陈庆河 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所