专利名称：用作葡萄霜霉菌拮抗剂物质的包含内生真菌互隔交链孢霉菌和/或其代谢物的抗真菌组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含真菌互隔交链孢霉菌(J/"rAmnVi 和/或属 于二酮艰溱(DKP)家族的其代谢物的组合物，用于控制病原体真菌葡萄 霜霉菌(户/fls附印flm v/ft'co/fl)，其为葡萄霜霉病的药剂。主要的三种代谢 物分别是具有以下各式的下述化合物
环(L-苯丙氨酸-反式-4-羟基-L-脯氨酸)(1)
环(L-亮氨酸-反式-4-羟基-L-脯氨酸)(2)
环(L-丙氨酸-反式斗羟基-L-脯氨酸)(3)
背景技术：
所有品种的葡萄(v/rtiy^rfl)都易感染霜霉病，这种病是由病原 体葡萄霜霉菌引起的。相反地，来自其中寄生虫的存在对地方种群的选 择发挥强大作用的潮湿地区的美洲葡萄(F "'s fl附w/owm)品种则具有 抵抗力0
直到50年代，化学性对抗葡萄霜霉病几乎完全基于使用涂覆rameic 产品波尔多混合剂(Bordeaux mixture)和氧氯化铜，所述产品除了强 的抗霜霉病活性以外，还具有不可忽略的抗粉孢子(Oidium)和葡萄孢属(Botritis)的活性。二价铜产品已经被几种有机合成产品(氨基甲酸 酯类、邻苯二甲酸类似物(phthalymmidic)等)部分替代。直到如今， 还主要采取以下两种策略来减少由所述病原体引起的损伤持续涂覆和 导引性对抗(guided struggle )。
所提议的解决办法可能不够适当，尤其是在持续降雨时期，这时一 旦发生感染，必须通过使用可一次性施用的系统性杀真菌剂进行紧急处 理。然而，这样介入的风险在于可能产生真菌的耐药林。
而且，根据当前对于涂覆非二价铜产品进行的研究，已突出表明尽 管它们与铜不同不对葡萄产生危害植物的毒性，但它们可能对人有毒。 事实上，已发现在种植葡萄和制造葡萄酒的工人中，ETU(亚乙基硫脲， 代森锰锌(Mancozeb )的降解产物)的平均痕量是可在其余人群中发现 的平均痕量的4倍。应当提醒，亚乙基硫脲被认为是一种潜在的致癌物 质，从这一点本身来讲，足以解释寻找替代方法的原因。
考虑到仅基于植物药物介入(phytoiatric intervention )的对抗策略 容易产生各种缺点，因此探寻了将具有部分单一功效的不同和互补的对 抗方法进行协同联合。这样的方法通常称为综合性对抗方法，其基本上 基于联合使用低剂量抗真菌剂和病原体拮抗剂。然而，它们并不具有完 全功效。由Raziq和Fox ( 2002 )进行的研究是综合性对抗cryptogram 病的一个具体实例，其中利用拮抗剂和抗真菌剂对苹果植株上的蜜环菌 (^7W///tf/7Vl/lie//e")进行综合控制。在葡萄霜霉菌的具体情况下，目前 还没有综合方法被授予专利权。
在葡萄的生物栽培中，迄今为止对抗葡萄霜霉病的方法主要是基于 使用天然物质尤其是铜。然而，由于其在土壤中积累可能对环境产生负 面的后效应，其使用存在争议。由于这一原因，自2002年开始，二价 铜化合物在生物农业领域中的使用已经受到具体法规的限制，目的在于 规定可应用的金属铜的最大值。
一种用于防护该病原体的真正可替代方法是使用拮抗剂生物。所述 拮抗剂(或生物控制剂)是一种天然存在的生物，其可限制该病原体的 生长并使其保持在经济损失的阈值以下；所述拮抗剂并不完全消除病原 体，但其限制病原体的生长并因此减少对作物的损害。在文献中，有应用拮抗剂控制由病原体生物引起的不同植物品种的
一些疾病的实例，并且其中一些涉及葡萄霜霉病(Falk et al., 1996; Kortekamp， 1997 )。然而，对于葡萄而言，还没有关于^"吏用内生真菌(尤 其是互隔交链孢霉菌)作为拮抗剂生物以及由其产生的代谢物的应用的报 道.
内生菌是其部分或整个生物周期都在宿主植物体内度过但不引起可 见的疾病症状的微生物(真菌、细菌和放线菌)。那么，所述内生真菌 就是"无症状的"，其与植物的关系可解释为共生型的相互作用(Clay, 1991)。内生菌能够合成多种可广泛用于医药、医药工业和农业中的次 生代谢物(Gusman e Vanhaelen， 2000 )。
发明内容
现已出乎意料地发现，葡萄的内生真菌互隔交链孢霉菌和/或其某些 次生代谢物可用作葡萄霜霉菌的拮抗剂。有利地，其用途以组合物的形式 实现，所述组合物包含上述拮抗剂和通常用于待用于植物的抗真菌组合物 中的赋形剂与添加剂。
因此，本发明的一个目的是抗真菌组合物，其包含作为葡萄霜霉菌 拮抗剂的各种形式的互隔交链孢霉菌真菌以及适用于农业中所用的抗真 菌组合物中的赋形剂和添加剂。有利地，使用活跃生长中的互隔交链孢霉 菌的菌丝体。
本发明的另一个目的是由互隔交链孢霉菌制备葡萄霜霉菌拮抗剂提取 物的方法，其包括以下步骤
a. 将互隔交链孢霉菌的生长中的菌丝体部分接种到培养用肉汤中， 并且可能地进行搅拌，孵育12-60小时，冷冻并冻干；
b. 将由步骤a)得到的冻干肉汤溶于水中，过滤并用中等极性的溶 剂(优选正丁醇)萃取水溶液，直到得到有机相；
c. 通过制备性色镨在硅胶层上利用重量比为60:15:25的正丁醇/ 乙酸/水的混合物进行洗脱而将所述有机相进行分级分离，直到 得到三个级分A、 B和C;d.通过薄层色镨，利用重量比为9:1的二氯甲烷/甲醇的混合物进 行洗脱，将级分A和B继续分级分离，直到得到下式(l)(Rf 0.48)和(2)(Rf0.43)的化合物
还可针对上述方法增加额外的步骤e)(仍构成本发明的主题)，在该 步骤中将所述级分C进行薄层色谱处理，利用重量比为85:15的二氯甲 烷/甲醇的混合物进行洗脱，直到得到下述式(3)(Rf0.40)的化合物
根据本发明，可制备葡萄霜霉菌的拮抗剂组合物，其包含所述三种级 分A、 B和/或C中的一种或多种，和/或所述化合物(1)、 (2)和/或(3) 中的一种或多种，以及常用于农业中所用的抗真菌组合物中的添加剂和/ 或赋形剂。
已知互隔交链孢霉菌在几种草本和乔木树种中作为内生真菌；迄今为 止对其在葡萄中所知甚少(Cardinali et al., 1994)，但还没有关于通过 葡萄内生菌互隔交链孢霉菌制备二酮嗛嚷(DKP)的报道。
互隔交链孢霉菌的次生代谢物是已知的属于二酮艰唤(DKP)化学物 质家族中的化合物，本发明提出了其用途。
所述二酮哌溱是可见于自然界(动物界和植物界)中的小肽衍生物。 其化学构型简单，对蛋白水解稳定，其合成路线众所周知，因此，其可
7在实验室中容易地合成(Horton et al.， 2000 )。
在医药领域中，它们用作抗生素、合成疫苗、化疗产品和抗高血压 药；在农业中，已经利用它们对抗非生物胁迫(abiotic stress)和作为 抗菌物质和抗真菌物质(Horton et al" 2000; McCleland et al ， 2004 )， 但还从来没有被报道过用于抗葡萄病原体，尤其是抗葡萄霜霉菌。
就有关抗病原体真菌(其中包括葡萄霜霉菌)的其它活性二肽分子 的才艮道而言，可引用Camaggi等的美国专利6,084,065和Filippini等 的美国专利6,448,228。上述专利公开了用于制备具有抗微生物作用和杀 虫作用的肽分子的新合成方法。
使用真菌对抗葡萄霜霉菌的优点如下该内生真菌既不引起症状，也 不导致葡萄的其它变化，但其能够通过破环孢子形成的能力而显著改变病 原体；直接由培养基提取的DKP可作为从"天然"生物中提取的天然化 合物用于葡萄的生物栽培。
以下报道本发明的一些实施例。
具体实施例方式
在室温下，在置于150转/分的摆动式搅拌器上的48孔无菌板中的 液体培养基(营养肉汤-NB+蔗糖)中培养126种葡萄内生菌微生物。
将含有900 nl NB和一种微生物的悬液(悬液1)放入每一孔中。对 于每种微生物而言，设定5次重复。
随后，将从健康葡萄叶上切下来的小圓片与拮抗剂悬液接触5分钟， 然后在20'C下于含有浓度为4.25xl05个孢子/ml的霜霉菌孢子的板中接 种一夜(悬液2)。
然后，将所述小圆片置于20'C的恒温湿润箱中放置一周。
结束时，借助立体显微镜检查葡萄霜霉菌孢子的存在。该检查在2002 年和2003年期间重复了 6次。在126种微生物中，有5种始终抑制葡萄霜霉菌的孢子形成。因此， 将它们纯化并鉴定。所有这5种分离产物均属于互隔交链孢霉菌种。
接种霜霉菌3天和6天后，从上述同一叶的小圆片中取组织部分， 利用透射电子显微镜(TEM)进行分析，目的是在细胞水平上检查葡萄 霜霉菌和互隔交链孢霉菌的相互作用。
还在对照组织部分(健康葡萄、仅与互隔交链孢霉菌一起孵育的葡 萄、以及仅与葡萄霜霉菌一起孵育的葡萄)进行了取样和观察。
根据通过TEM的观察可以得出，互隔交链孢霉菌不诱导葡萄叶组织 的超结构变化；事实上，该组织看上去M良好；而相反地葡萄霜霉菌则 显示了严重的变化。菌丝体具有非常少的大液泡，这些液泡有时候包含 黑色的沉淀物。卵菌的吸器发育不全。在逃逸阶段(escaping phase)中， 从来没有在气孔保卫细胞之间发现葡萄霜霉菌。
由内生菌互隔交链孢霉菌制备低分子量的代谢物是从真菌培养用肉 汤开始进行的。将M于皮氏皿(Petri capsule)中的琼脂化培养基上的 互隔交链孢霉菌的活跃生长的菌丝体部分接种到^^有250 ml营养肉汤的 培养瓶中。然后将肉汤在振荡器上于20'C孵育48小时，然后冷冻(-4(TC ) 并冻干。随后将冻干的肉汤(20 g)溶于水中并过滤；然后用正丁醇萃取 水溶液。通过制备性层色镨(preparatory layer Chromatography)(PLC ) 在> ^板(Merck-Kiesdgel60PF254 )上将此有;M目进行分级分离，利用 60:15:25的正丁醇/乙紛1120的混合物洗脱，直到得到按极性递增顺序 被称为A、 B和C的三个带。通过薄层色镨(TLC )在硅胶板上进一步 纯化级分A (54 mg)和B (48 mg)，利用二氯甲烷和甲醇混合物 (CH2Cl2/MeOH 9:1)洗脱，得到纯化合物1 (1.5 mg， Rf 0.48)和2 (5 mg， Rf 0.43 )。将级分C ( 83 mg )也进行TLC处理(CH2Cl2/MeOH 85:15 )，直到得到另 一种纯化合物3 ( 3.5 mg， Rf 0.40 )。通过质磁共振 语(Bruker AV400， 镨和2D-NMR镨，400 MHz )，利用残留溶剂的 信号(S ( ppm ) ， CHD2OD = 3.31, CHC13 = 7.26, D20 = 4.卯)作为标准， 表征所分离的代谢物。通过镨仪KratosMS80获得质镨数据。通过偏光 计JASCO-DIP-181利用10 cm的池测量旋光。通过电子轰击质镨法(电子轰击质谱法，EIMS)和高分辨EIMS (HREIMS)计算液体培养基 中由互隔交链孢霉菌产生的主要低分子量代谢物的分子式。
与其它化合物相比，以较高量提取到三种DKP。它们是
环(L-苯丙氨酸-反式-4-羟基-L-脯氨酸)(1)
环(L-亮氨酸-反式-4-羟基-L-脯氨酸)(2)
环(L-丙氨酸-反式-4-羟基-L-脯氨酸)(3)，
其化学式如下
1 2 3
以不同浓度单独和相联合测试这些代谢物对抗保存于湿润箱中的叶 的小圆片(体外)和温室中植物的叶的小圃片(植物内)的葡萄霜霉菌的 活性。
制备以下浓度的水溶液1(T3M、 1(T4M、 10_5]\1和10-6]\1。
还通过每次取两种化合物以及一起取所有三种化合物但总是为同样 终浓度而制备溶液。
按上述同样方法对叶的小圆片进行测试。
对于植物内测试而言，使用控制条件下于温室(20'C，光周期12小 时)中生长的葡萄栽培品种Pinot grigio的生根的扦插苗；利用钉将所 述扦插苗排列在聚苯乙烯板上，使下叶面能保持尽可能与所述板相附 着。
=H所述植物内试验在两个实验中进行
1) 接种葡萄霜霉菌2小时后和24小时后评价DKP效力的治疗性实验;
2) 接种葡萄霜霉菌前评价处理效力的预防性实验。
1) 治疗性实验
基于DKP类型和所用的浓度给每片叶标记上数字和字母；而在下 叶面上，画上小圆團以突出其中含有DKP的溶液将定位的位置。然后， 利用含有4.7xl()S个孢子/ml浓度的霜霉孢子的混悬液喷洒叶子(用于预 防性实验的那些除外)。在利用含有霜霉孢子的混悬液接种2小时和24 小时后，将几滴DKP溶液(每滴相当于22nl)置于各小圆圏中。在病 原体的孵育阶段结束时(第7天)，观察叶子以评价是否有葡萄霜霉菌的 孢子形成或者是否其已受到DKP处理的抑制。
2) 预防性试验
同样在本试验中，也是基于DKP类型和所用的浓度给叶标记上数 字和字母；并在下叶面上画上小圆團(每片叶6个)以突出其中含有 DKP分子的液滴将定位的区域。立即将所述含有DKP分子的液滴置于 于各个小圆圏内。在孵育阶段结束时观察叶子以评价是否有葡萄霜霉菌 的孢子形成或者是否其已受到DKP作用的抑制。
不论是治疗性目的还是预防性目的使用DKP，所得的DKP对叶的 小圆片的效力均良好(减少了 80%的葡萄霜霉菌孢子形成)。利用DKP 混合物制备的溶液100%抑制病原体孢子形成。同样在植物内试验中， 无论是治疗性实验(从感染起2小时后和24小时后)中还是在预防性 实验中，DKP均抑制葡萄霜霉菌的孢子形成。
这些物质并不引起葡萄的叶组织的坏死或任何其它毒性作用；其它 的细胞学研究进一步证实了 DKP混合物(浓度为10—4 M)并不引起葡 萄叶组织细胞结构的改变；相反，接种在叶的小圆片上并在2小时后用 DKP处理的葡萄霜霉菌则显示了完全改变的菌丝体。事实上，液泡看上 去变形并且吸器坏死。这些超结构变化已经在利用拮抗剂处理后的其它病 原体真菌中有报导，表现为代谢物和/或毒性酶的作用。特别是，在葡萄霜霉菌菌丝体内部液泡样异常结构(液泡的体积大并数目减少)的存在与真
菌的衰老期相关联；衰老可因为生理性原因(病原体周期的末期)而出现， 也可因拮抗剂和/或毒性物质的存在(如在我们报道的实例中)而出现。
为将我们的发明用于完全保持在田间的葡萄植林，我们制定了以下 两个方案。
第一个方案提供制备浓度为1(T3M的DKP水溶液，于是对葡萄进行 处理，确保良好地喷洒绿色部分。
第二个方案提供制备互隔交链孢霉菌的培养用肉汤。然后通过无菌网 过滤此肉汤并用于通过预防性方式和治疗性方式处理葡萄。还利用互隔交 链孢霉菌的匀浆化菌丝体的水混悬液进行处理。
本文所示的结果证实，由于以下不同原因，从葡萄内生菌即互隔交链 孢霉菌的培养液中提取的DKP看来是用于控制葡萄霜霉菌的具有前景的 方法
1) 其不导致对葡萄的毒性；
2) 其为极易合成的低分子量化合物；
3) 将包含适当的制备成本；
4) 就新的欧洲法律关于葡萄生物栽培中铜使用的额外限制(2002年 3月15日的委员会(EC)条例NR. 473/2002)而言，其效力水平已证 实总体是非常令人感兴趣的。
内生真菌互隔交链孢霉菌作为葡萄霜霉菌拮抗剂物质的用途以及其 次生代谢物(尤其是式(1 )、 ( 2 )和(3 )的那些化合物)作为葡萄霜霉菌 拮抗剂物质的用途，构成了本发明另外的主题。
权利要求
1. 抗真菌组合物，其包含作为葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola)拮抗剂物质的各种形式的真菌互隔交链孢霉菌(Alternaria alternata)以及适用于农业中所用的抗真菌组合物中的赋形剂和添加剂。
2. —种用于由互隔交链孢霉菌制备葡萄霜霉菌拮抗剂提取物的方 法，其包括以下步骤a. 将互隔交链孢霉菌的生长中的菌丝体部分接种到培养用肉汤中， 并且可能地还进行搅拌，孵育12-60小时，冷冻并冻干；b. 将由步骤a)得到的冻干肉汤溶于水中，过滤并用中等极性的 溶剂、优选正丁醇萃取所述水溶液，直到得到有机相；c. 通过制备性色镨在硅胶层上利用重量比为60:15:25的正丁醇/ 乙酸/水的混合物进行洗脱而将所述有机相进行分级分离，直到得 到三个级分A、 B和C;d. 通过薄层色镨，利用重量比为9:1的二氯甲烷/甲醇的混合物 进行洗脱，将级分A和B继续分级，直到得到Rf值为0.48的下 述式(1)化合物和Rf值为0.43的下述式(2 )化合物<formula>formula see original document page 2</formula>
3.根据权利要求2的方法，其中提供了额外的步骤e)，其中利用重 量比为85:15的二氯甲烷/甲醇的混合物将所述级分C进行薄层色镨， 直到得到Rf值为0.40的下述式(3)化合物<formula>formula see original document page 2</formula>
4. 葡萄霜霉菌的拮抗剂组合物，其包含可得自权利要求2的步骤c) 的所述级分A、 B和/或C中的一种或多种以及适用于农业中所用的抗真菌 组合物中的添加剂和/或赋形剂。
5. 根据权利要求4的葡萄霜霉菌的拮抗剂组合物，其包含所述化合物 (1)、 (2)和/或(3)中的一种或多种以及适用于农业中所用的抗真菌组合物中的添加剂和/或赋形剂。
6. 根据权利要求5和/或6的葡萄霜霉菌的拮抗剂组合物，其包含所 述级分A、 B和/或C中的一种或多种、和/或适用于农业中所用的抗真菌 组合物中的所述化合物(1)、 (2)和/或(3)中的一种或多种。
7. 真菌互隔交链孢霉菌作为葡萄霜霉菌的拮抗剂物质的用途。
8. 可得自权利要求2的步骤c)的所述级分A、 B和/或C中一种或多 种作为葡萄霜霉菌的拮抗剂物质的用途。
9. 化合物(1)、 (2)和/或(3)中的一种或多种作为葡萄霜霉菌的拮 抗剂物质的用途。
全文摘要
本发明涉及含有真菌互隔交链孢霉菌(Alternaria alternata)和/或属于二酮哌嗪(DKP)家族的式(1)、式(2)和式(3)的其次生代谢物的组合物，用于控制病原体真菌葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola)。
文档编号A01N43/90GK101484010SQ200780022489
公开日2009年7月15日 申请日期2007年6月14日 优先权日2006年6月16日
发明者丽塔·穆塞蒂, 斯特凡诺·博尔塞利, 米凯莱·德安布罗西奥 申请人:乌迪内大学