专利名称：用于防治黄瓜霜霉病的摩加夫芽孢杆菌及其微生物菌剂的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种用于防治黄瓜霜霉病的摩加夫芽孢杆菌和含有该摩加夫芽孢杆菌的微生物菌剂，以及它们在防治黄瓜霜霉病上的用途。
背景技术：
黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis Rostow)引起的侵染性气传病害，给黄瓜生产带来巨大威胁。防治黄瓜霜霉病的方法主要有抗病育种、化学防治和生态防治(如高温闷棚等)等。由于黄瓜霜霉病为多基因控制的数量性状遗传，抗病育种难以进行且抗性容易丧失；化学防治存在容易产生抗药性和对人、环境污染的问题； 而生态防治的高温闷棚需要黄瓜苗龄、长势和天气情况都合适的条件下才能进行，应用受条件限制。近年来，生物防治方法由于具有对人、畜安全，对环境没有污染，且对防治对象的针对性强，效果好、成本低等优点，已成为防治黄瓜霜霉病的重要途径。生物防治黄瓜霜霉病的方法包括利用植物提取物、植物的抗病性诱导和生防菌防治等。已报道的用于防治黄瓜霜霉病的植物提取物近10余种，但是植物提取物的提取过程繁琐、生产成本高，人工合成单一物质使用后病原菌容易产生抗药性缺点，使该方法难以应用。利用生防菌防治黄瓜霜霉病已报道有枯草芽孢杆菌ZH-8液体制剂(张淑梅等.生物技术.2004 (4))和非致病性镰刀菌F047和F047B10 (杨猛等.西北农林科技大学学报(自然科学版)；2005年05期)。芽孢杆菌(Bacillus)具有分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽孢、贮藏期长和使用方便等特点，是一种理想的生防微生物，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，剂型加工，在环境中存活、定殖与繁殖。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于防治黄瓜霜霉病的摩加夫芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效、广谱杀菌活性等优点。本发明第二目的在于提供一种微生物菌剂。本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。本发明第四目的在于提供上述摩加夫芽孢杆菌菌株在防治黄瓜霜霉病上的用途。本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治黄瓜霜霉病上的用途。本发明通过以下技术方案实现一种摩加夫芽抱杆菌(Bacillus mojavensis)菌株HMB20199,已于2011年12月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5617。利用上述摩加夫芽孢杆菌HMB20199生产的微生物菌剂，其活性成分为摩加夫芽孢杆菌HMB20199菌体和它的胞外代谢产物。上述微生物菌剂可以为液体制剂。
上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤菌种活化，种子液制备和发酵培养。上述微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤(I)菌种活化将低温保存的HMB20199菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上30°C培养24 36小时，得活化的菌株；(2)种子液制备用无菌的接种环刮取一环步骤(I)活化的菌株接种到IOOmLLB 液体培养基中，在26 34°C、、摇床转速为170 210rpm的条件下培养22 25小时，得种子液；(3)发酵培养按照体积比为O. 5% 3. O %的比例将步骤⑵的种子液接入到蔗糖豆饼粉培养基(PH值为5. 8 6. 2)中，在温度为28 34°C、摇床转速为170 210rpm 的条件下发酵培养36 54h，得发酵液；所述的蔗糖豆饼粉培养基，其组成成分及其重量百分比为:蔗糖 2. O 3. 0%，豆饼粉 I. 6 2. 4%，NaCl O. I O. 2%，CaCO3 O. I O. 3%， KH2PO4 O. 01 O. 03%和 MgSO4 · 7H20 O. 01 O. 03%，其余为水；(4)检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的 90%时，停止发酵培养；所得即为HMB20199菌株的液体制剂。上述制备方法步骤(2)和(3)中所述的温度优选为30 32°C ;所述的摇床转速优选为210rpm ;所述的培养时间优选为48h。所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。所述的蔗糖豆饼培养基的制备方法，按照重量百分比将蔗糖、豆饼粉、NaCl、 CaCO3> KH2PO4和MgSO4 · 7H20混合，再加水至所需体积，搅拌均匀即可。上述微生物菌剂，其摩加夫芽孢杆菌HMB20199的活菌数大于I. 03 X 109cfu/mL。所述的摩加夫芽孢杆菌HMB20199在防治黄瓜霜霉病上的应用。上述微生物菌剂在防治黄瓜霜霉病上的应用。本发明微生物菌剂的使用方法将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌数为 107cfu/mL,于黄瓜霜霉病发病前进行叶面喷雾，即可达到控制黄瓜霜霉病的目的。HMB20199菌株的筛选分离过程菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从河北省保定市蔬菜大棚的莴苣田土壤中分离得到的。2009年河北省农林科学院植物保护研究所从河北省保定市蔬菜大棚莴苣田中五点采集土壤，混匀后称取5g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入IOOmL无菌水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液ImL加无菌水9mL，即成lOmLlO—2倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10_3、10_4、10_5、10_6倍稀释液，各浓度取200 μ L微生物悬液涂于LB和KB培养基平板上，每个浓度3次重复，在28°C恒温培养ld_3d，进行细菌的分离和纯化。并以黄瓜霜霉病为靶标，利用叶盘法进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对靶标病害具有明显防治效果的菌株，定名为HMB20199。HMB20199菌株的分类鉴定(I)形态特征鉴定在LB培养基上培养菌体为杆状，培养IOh后产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴孢晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色， 边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社， 2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB20199属于芽孢杆菌 (Bacillus)。(2)利用16S rDNA序列鉴定分类以HMB20199的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16S rDNA进行PCR 扩增，所述的引物序列为F27 5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG3，； (SEQ ID No 2),R1492 :5’ GGCTACCTTGTTACGACTT3’ ； (SEQ ID No 3)；16S rDNA 的扩增反应体系为 50 μ L:10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ L ； dNTPMixture(2. 5mM) 5 μ L ；Taq(5U/y L) I μ L, F27(10 μ mol/L) I μ L, R1492(10 μ mol/ L) I μ L ；HMB20199 的基因组 DNA 50ng ；ddH20 补足至 50 μ L。PCR 的反应条件为 95°C 5min ； 95°C 30s, 55°C 30s, 72°C I. 5min，30个循环-,1 TC IOmin0将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，将所得扩增片段送交上海生工生物工程有限公司测序，得到HMB20199的16S rDNA序列(见SEQ ID No 1) ο将所得HMB20199的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较， 结果菌株HMB20199与芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到99% (见图2);构建系统发育树(见图1)，HMB20199与摩加夫芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB20199属于摩加夫芽孢杆菌 (B. mojavensis),并且是一个新菌株。(3)利用gyrB基因序列鉴定分类以HMB20199基因组DNA为模板，利用芽孢杆菌gyrB基因兼并引物gyrB_F和 gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列为gyrB-F :5，TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3，，(SEQ ID No 5)gyrB-R :5，TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3，； (SEQ ID No 6)gyrB 的 PCR 扩增反应体系为 50 μ L:10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ L ；dNTP Mixture(2. 5mM)5 μ L；Taq (5U/μ L)I μ L；gyrB-F(10 μmol/L)I μ L, gyrB-R (10 μmol/ L)lyL ;HMB20199 基因组 DNA 50ng ;ddH20 补足至 50 μ L。PCR 的反应条件为 95°C 5min ; 95°C 30s, 55°C 45s, 72°C lmin，30个循环；72°C IOmin0将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB20199菌株的gyrB基因序列(见SEQ IDNo 4)。将获得的HMB20199 菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis,分子进化遗传分析)构建系统发育树。结果发现 HMB20199与摩加夫芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高(见图4)，达到99% ;构建系统发育树(见图3)，HMB20199菌株与摩加夫芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB20199为摩加夫芽孢杆菌(B. mojavensis),并且是一个新菌株。(4)利用生理生化特征鉴定分类利用Biolog微生物自动鉴定系统可以测试菌株对95种碳源的利用情况从而进一步确定其种属特征，从而进行分类。先将待测菌株的纯培养菌落接入无菌水中，振荡器震荡制成细胞悬液，然后用多道移液枪接种于96孔GNIII鉴定板上培养，再用Biolog Microstation软件读取数据，确定碳源利用情况。通过与BI0L0G系统数据库MicroLog software (Release Version 4.20.04)比对，可知待测菌株的分类。将HMB20199菌株送交中国农业大学，利用Biolog微生物自动鉴定系统进行鉴定分类，结果菌株HMB20199属于摩加夫芽孢杆菌(B. mojavensis)。综合以上形态特征、16S rDNA和gyr B基因序列同源性对比分析，以及生理生化特征鉴定的结果，可知HMB20199菌株属于摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mo javensis),并且和现有的芽孢杆菌菌株不同，是一个新菌株。本发明具有的优点和有益效果(I)本发明HMB20199菌株对防治黄瓜霜霉病特异性强，且防效高，平均防效在85%以上，为防治黄瓜霜霉病提供了一种有效的生物防治途径；(2)利用本发明防治黄瓜霜霉病不易产生抗药性；(3)本发明微生物菌剂对人、畜安全， 没有环境污染问题；(4)本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、使用方便。
图I.为HMB20199菌株根据16S rDNA序列获得的系统发育树图。图2.为本发明HMB20199菌株与摩加夫芽孢杆菌R0-C-2菌株 (B. mojavensisR0-C-2)的16S rDNA基因序列同源性比较图谱；其中摩加夫芽孢杆菌 R0-C-2菌株序列中表示与HMB20199对应位点的碱基相同，“g、a、C、t”表示摩加夫芽孢杆菌R0-C-2菌株序列中与HMB20199对应位点的碱基为g、a、C、t。图3.为HMB20199菌株根据gyrB基因序列获得的系统发育树图。图4.为摩加夫芽孢杆菌HMB20199菌株与摩加夫芽孢杆菌R0_C_2菌株 (B. mojavensis R0_C_2)的gyrB基因序列同源性对比图谱；其中摩加夫芽孢杆菌R0-C-2序列中表示与HMB20199对应位点的碱基相同，而“g、a、c、t”表示摩加夫芽孢杆菌R0-C-2 序列中与HMB20199对应位点的碱基为g、a、C、t。
具体实施例方式下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。实施例IHMB20199微生物菌剂的制备，按照如下步骤进行(I)菌种活化将保存于_40°C的菌株HMB20199(摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)菌株HMB20199已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5617)在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为胰蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g，氯化钠lg，琼脂粉15g，水IOOOmL)上在30°C进行活化， 挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比为胰蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g， 氯化钠lg，琼脂粉15g，水IOOOmL)上在30°C下培养24 36小时，得活化的菌株；(2)种子液的制备按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为 胰蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g，氯化钠IgjK IOOOmL)，在250mL三角瓶中装入LB培养液 IOOmL,高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤(I)中一接种环上述活化好的菌株，在摇床上进行振荡培养，转速190rpm，并在30°C下培养24h小时，得种子液；(3)蔗糖豆饼培养基的制备按照重量比将蔗糖30g，豆饼粉20g，NaCl lg, CaCO33g，KH2PO4 O. 2g和MgSO4 · 7H20 O. 3g加入水IOOOmL中，搅拌混合均匀，即得蔗糖豆饼培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL ;在121°C对蔗糖豆饼培养基进行灭菌30分钟，再降温到30°C备用；(4)发酵培养向步骤(3)所得每瓶蔗糖豆饼培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL ;在301、摇床转速190rpm条件下进行发酵培养36h，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率；芽孢率达到90%时， 停止发酵培养；共发酵培养约45 50h，得摩加夫芽孢杆菌HMB20199的液体制剂。芽孢率的计算公式为芽孢率)=成熟芽孢数/ (成熟芽孢数+菌体数)X 100实施例2摩加夫芽孢杆菌HMB20199对黄瓜霜霉病防效的对比试验(一 )试验药剂(I)微生物菌剂实施例I制备的HMB20199液体制剂，用水稀释50倍。(2)化学药剂嘧菌酯悬浮剂(250克/升)(英国先正达有限公司)；用水稀释 1000 倍。(3)空白对照清水。( 二 )试验方法本试验2010年冬季在河北省农林科学院植物保护研究所的实验室内进行。本试验所用的黄瓜霜霉病菌来自河北省农林科学院植物保护研究所农药应用技术实验室，配制成孢子囊(I X IO5-L 5X IO5个/mL)的悬浮液，用于本试验接种。取无病完整的黄瓜叶片，分别将其浸在(I)实施例I中制备的HMB20199液体制剂50倍稀释液中；⑵化学药剂嘧菌酯悬浮剂(250克/升)1000倍水稀释液中；⑵空白对照清水中；I h后取出黄瓜叶片放入培养皿，在3 (TC光照培养箱中定殖一天，用打孔器打取直径15mm的叶盘，放置在培养皿中，每皿10个叶盘作为一次重复，每处理重复四次。在每个叶盘中部滴加黄瓜霜霉病菌孢子囊悬浮液IOul ;在18°C光照培养箱中培养7 天，调查病级并且计算病情指数和防效。黄瓜霜霉病级别划分标准和防效计算方法参照 《中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则》(一)杀菌剂防治黄瓜霜霉病GB/T 17980. 26-2000(以下同)。(三)结果(见表I)摩加夫芽孢杆菌HMB20199液体制剂处理后黄瓜霜霉病病指 (11. 28)显著低于空白对照清水处理后的病指(94. 17)和化学药剂处理后的病指(78. 33)， 防治效果达到88. 02%，说明本发明摩加夫芽孢杆菌HMB20199及其微生物菌剂对黄瓜霜霉病具有很好的防治效果。表I摩加夫芽孢杆菌HMB20199对黄瓜霜霉病的防效对比试验结果
处理病情指数防效(％)HMB20199液体制剂11. 28c88. 02化学药剂78. 33b16. 99空白对照94. 17aO. 00 实施例3摩加夫芽孢杆菌HMB20199对黄瓜霜霉病防效的对比试验
(一)、试验药剂(I)微生物菌剂实施例I制备的HMB20199液体制剂，用水稀释50倍；(2)化学药剂银法利悬浮剂(687. 5克/升)(德国拜耳作物科学公司)，用水稀释800倍；(3)空白对照清水。( 二 )、试验时间和地点2010年12月在河北省农林科学院植物保护研究所人工
气候室内进行。(三)试验方法筛选饱满的黄瓜种子，催芽至露白时播种于口径为20cm的塑料花盆中，每个处理15盆(每盆2株)，重复3次。采用随机分组排列方法放置。取长至3-4 片真叶、生长势一致的黄瓜幼苗，在供试植株真叶的正反面上分3次均匀喷洒(I)摩加夫芽孢杆菌HMB20199液体制剂50倍稀释液；(2)化学药剂银法利悬浮剂(687. 5克/升)的 800倍稀释液；(3)空白对照清水。24小时后，喷雾接种黄瓜霜霉病菌(将实施例2中的黄瓜霜霉病菌接种于黄瓜新鲜叶片上繁殖而得)，接种浓度为5000-10000个孢子囊/毫升； 接种后在20°C -22°C培养室中保湿培养4-6天，待空白对照充分发病时调查发病情况，并计算病情指数和防效。(四)结果(见表2)摩加夫芽孢杆菌HMB20199液体制剂处理后黄瓜霜霉病病指 (13. 33)显著低于空白对照处理后的病指(87. 78)，而与化学药剂处理后的病指(5. 56)差异不显著，摩加夫芽孢杆菌HMB20199对黄瓜霜霉病的防治效果达到84. 81 %，说明摩加夫芽孢杆菌HMB20199及其微生物菌剂对黄瓜霜霉病防治效果好。表2摩加夫芽孢杆菌HMB20199对黄瓜霜霉病防效的对比试验结果
权利要求
1.一种摩加夫芽抱杆菌(Bacillus mojavensis)菌株HMB20199,已于2011年12月20 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5617。
2.利用权利要求I所述的摩加夫芽孢杆菌HMB20199生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为摩加夫芽孢杆菌HMB20199菌体和它的胞外代谢产物。
3.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于为液体制剂。
4.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于摩加夫芽孢杆菌HMB20199的活菌数大于 1. 03X 109cfu/mLo
5.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将低温保存的HMB20199菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上30°C培养24 36小时，得活化的菌株；(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到IOOmLLB液体培养基中，在 26 34°C、、摇床转速为170 210rpm条件下培养22 25小时，得种子液；(3)按照体积比为O.5% 3.0%的比例将步骤(2)的HMB20199种子液接入到蔗糖豆饼粉培养基中，在温度为28 34°C，摇床转速为170 210rpm的条件下发酵培养36 54h，得发酵液；所述的蔗糖豆饼粉培养基，其组成成分及其重量百分比为蔗糖2. O 3.0%，豆饼粉 1. 6 2. 4%，NaCl 0.1 0.2%，CaC03 0.1 O. 3%，KH2P04 O. 01 O. 03% 和 MgSO4 · 7H20 O. 01 O. 03%，其余为水；(4)检测发酵液中菌体和芽孢数量,待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90% 时停止发酵培养；所得即为HMB20199菌株的液体制剂。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的温度为30 32℃。
7.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的摇床转速为 210rpm ；
8.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的培养时间为48h。
9.权利要求1所述的摩加夫芽孢杆菌HMB20199在防治黄瓜霜霉病上的应用。
10.权利要求2所述的微生物菌剂在防治黄瓜霜霉病上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于防治黄瓜霜霉病的摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)菌株HMB20199，已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.5617。本发明还公开了利用HMB20199生产的微生物菌剂及其制备方法。微生物菌剂的活性成分为摩加夫芽孢杆菌HMB20199菌体和它的胞外代谢产物。本发明HMB20199菌株对防治黄瓜霜霉病特异性强，且防效高，平均防效在85％以上；其次，利用本发明防治黄瓜霜霉病不易产生抗药性；此外，本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染问题；本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、使用方便。
文档编号C12N1/20GK102586143SQ201210028098
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月9日 优先权日2012年2月9日
发明者李宝庆, 李社增, 郭庆港, 马平, 鹿秀云 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所