专利名称：一种防治黄瓜霜霉病的枯草芽孢杆菌及其微生物菌剂的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种用于防治黄瓜霜霉病的枯草芽孢杆菌和含有该枯草芽孢杆菌的微生物菌剂，以及它们在防治黄瓜霜霉病上的应用。
背景技术：
黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis Rostow)引起的侵染性气传病害，给黄瓜生产带来巨大威胁。防治黄瓜霜霉病的方法主要有抗病育种、化学防治和生态防治(如高温闷棚等)等。由于黄瓜霜霉病为多基因控制的数量性状遗传，抗病育种难以进行且抗性容易丧失；化学防治存在容易产生抗药性和对人、环境污染的问题； 而生态防治的高温闷棚需要黄瓜苗龄、长势和天气情况都合适的条件下才能进行，应用受条件限制。近年来，生物防治方法由于具有对防治对象针对性强，防效高；以及对人、畜安全，没有环境污染等优点而受到越来越多的重视。生物防治黄瓜霜霉病的方法主要包括利用植物提取物、植物的抗病性诱导和生防菌防治。目前，已报道的用于防治黄瓜霜霉病的植物提取物近10余种。但是植物提取物的提取过程繁琐、生产成本高，人工合成单一物质使用后病原菌容易产生抗药性缺点，使该方法难以应用。利用生防菌防治已报道有枯草芽孢杆菌ZH-8液体制剂(张淑梅等.生物技术.2004 (4))和非致病性镰刀菌F047和F047B10 (杨猛等.西北农林科技大学学报(自然科学版).2005年05期)。芽孢杆菌(Bacillus)具有分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽孢、贮藏期长和使用方便等特点，是一种理想的生防微生物，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，剂型加工，在环境中存活、定殖与繁殖。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于防治黄瓜霜霉病的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效、广谱杀菌活性等优点。本发明第二目的在于提供一种微生物菌剂。本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。本发明第四目的在于提供上述枯草芽孢杆菌菌株在防治黄瓜霜霉病上的用途。本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治黄瓜霜霉病上的用途。本发明通过以下技术方案实现一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB20428，已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5616。利用上述枯草芽孢杆菌HMB20428生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌HMB204^菌体和它的胞外代谢产物。上述微生物菌剂可以为液体制剂。
上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤菌种活化，种子液制备和发酵培养。上述微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤(1)菌种活化将低温保存的HMB20^8菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上30°C培养M 36小时，得活化的菌株；(2)种子液制备用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到IOOmLLB 液体培养基中，在26 34°C、摇床转速为170 210rpm的条件下培养22 25小时，得种子液；(3)发酵培养按照体积比为0. 5% 3. 0%的比例将步骤⑵的种子液接入到蔗糖豆饼粉培养基(pH值为5. 8 6. 2)中，在温度为28 34°C，摇床转速为170 210rpm的条件下发酵培养36 Mh ；所述的蔗糖豆饼粉培养基，其组成成分及其重量百分比为蔗糖 2. 0 3. 0%，豆饼粉 1. 6 2. 4%, NaCl 0. 1 0. 2%, CaCO3O. 1 0. 3%, KH2PO4 0. 01 0. 03%和 MgSO4 · 7H20 0. 01 0. 03%，其余为水；(4)检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的 90%时，停止发酵培养；所得即为HMB204^菌株的液体制剂。上述制备方法步骤( 和(3)中所述的温度优选为30 32°C ；所述的摇床转速优选为210rpm ；所述的培养时间优选为48h。所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。所述的蔗糖豆饼培养基的制备方法，按照重量百分比将蔗糖、豆饼粉、NaCl、 CaCO3> KH2PO4和MgSO4 · 7H20混合，再加水至所需体积，搅拌均勻即可。上述微生物菌剂，其枯草芽孢杆菌HMB20428的活菌数大于5. 0 X 109cfu/mL。所述的枯草芽孢杆菌HMB20^8在防治黄瓜霜霉病上的应用。上述微生物菌剂在防治黄瓜霜霉病上的应用。本发明微生物菌剂的使用方法将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌数为 107cfu/mL,于黄瓜霜霉病发病前进行叶面喷雾，即可达到控制黄瓜霜霉病的目的。HMB20428菌株的筛选分离过程HMB20^8菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从河北省邱县的棉田土壤中分离得到的。2008年河北省农林科学院植物保护研究所从河北省邱县棉田中五点采集土壤，混勻后称取5g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入IOOmL无菌水，放到摇床上，170r/min 振荡30min，静置2h，取上清液ImL加无菌水9mL，即成lOmLlO—2倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10_3、10_4、10_5、10_6倍稀释液，各浓度取200 μ L微生物悬液涂于LB和KB培养基平板上，每个浓度3次重复，在恒温培养ld-3d，进行细菌的分离和纯化。并以黄瓜霜霉病为靶标，利用叶盘法进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对靶标病害具有明显防治效果的菌株，定名为HMB20428。HMB20428菌株的分类鉴定(1)形态特征鉴定在LB培养基上培养菌体为杆状，培养IOh后产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴孢晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色， 边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静
4止培养，表面形成白色菌膜。与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社， 2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB204^属于芽孢杆菌 (Bacillus)。(2)利用16S rDNA序列鉴定分类以HMB20428的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16S rDNA进行PCR 扩增，所述的引物序列为F27 :5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG3，； (SEQ ID No 2)R1492 :5，GGCTACCTTGTTACGACTT3，； (SEQ ID No 3)16S rDNA 的扩增反应体系为 50yL:10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ L ； dNTPMixture(2. 5mM) 5 μ L ；Taq(5U/y L) 1 μ L, F27(10 μ mol/L) 1 μ L, R1492(10 μ mol/ L) 1 μ L ；ΗΜΒ20428 的基因组 DNA 50ng ；ddH20 补足至 50 μ L。PCR 的反应条件为 95°C 5min ； 95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 1. 5min，30个循环；72°C lOmin。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上海生工生物工程有限公司测序，得到HMB20^8的16S rDNA序列(见SEQ ID No: 1)。将所得HMB20428的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB20^8 与芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到99% (见图2)；构建系统发育树(见图1)，HMB20^8 与枯草芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB204^属于枯草芽孢杆菌属(Bacillussubtilis)，而且和现有的枯草芽孢杆菌菌株不同，是一个新菌株。(3)利用生理生化特征鉴定分类利用Biolog微生物自动鉴定系统可以测试菌株对95种碳源的利用情况从而进一步确定其种属特征，提高菌株鉴定的可靠性。方法是先将待测菌株的纯培养菌落接入无菌水中，振荡器震荡制成细胞悬液，然后用多道移液枪接种于96孔GNIII鉴定板上培养，再用Biolog Microstation软件读取数据，确定碳源利用情况。通过与BIOLOG系统数据库MicroLog software (Release Version 4.20.04)比对，可知待测菌株的分类。将 HMB20428菌株送交中国农业大学，利用Biolog微生物自动鉴定系统进行鉴定分类，结果菌株HMB20428属于枯草芽孢杆菌(B. subtil is)。综合以上形态特征、16S rDNA序列同源性对比分析，以及生理生化特征鉴定的结果，可知HMB20^8属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并且和现有的芽孢杆菌菌株不同，是一个新的枯草芽孢杆菌菌株。本发明具有的优点和有益效果(1)本发明枯草芽孢杆菌菌株HMB204^对黄瓜霜霉病特异性强，而且防效高，平均防效在85%以上；( 利用本发明方法防治黄瓜霜霉病不易产生抗药性；C3)本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染；(4)本发明制备方法简单、成本低、使用方便。
图1为HMB20^8菌株根据16S rDNA序列获得的系统发育树图。图2为本发明HMB20428菌株与枯草芽孢杆菌168菌株(B. subtilis 168) 的16SrDNA基因序列同源性比较图谱；其中枯草芽孢杆菌168菌株序列中“-”表示与 HMB20428对应的碱基相同，“g、a、c、t”表示枯草芽孢杆菌168菌株序列中与HMB20^8对应位点的碱基为g、a、c、t。
具体实施例方式下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。实施例1HMB20428微生物菌剂的制备，按照如下步骤进行(1)菌种活化将保存于-40 °C的菌株HMB20^8 (枯草芽孢杆菌(Baci 1 Ius subtilis)菌株HMB20428已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5616)在LB平板培养基(其组成成分及其重量比例为胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化钠lg，琼脂粉15g，水IOOOmL)上在30°C下进行活化，挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比例为胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化钠lg，琼脂粉15g，水IOOOmL)上30°C培养M 36小时，得活化的菌株；(2)种子液的制备按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比例为胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化钠IgdK IOOOmL)，在250mL三角瓶中装入LB培养液IOOmL,高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤(1)中一接种环上述活化好的菌株，在摇床上进行振荡培养，转速190rpm，并在30°C下培养24h小时，得种子液；(3)蔗糖豆饼培养基的制备按照重量百分比将蔗糖3.0%，豆饼粉2 %， NaClO. 1 %, CaCO3 0. 3%, KH2PO4 0. 02%禾口 MgSO4 · 7H20 0. 03%加入水中，搅拌混合均勻，即得蔗糖豆饼培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL ；在121°C对蔗糖豆饼培养基进行灭菌30分钟，再降温到30°C备用；(4)发酵培养向步骤(3)所得每瓶蔗糖豆饼培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL ；在30°C、摇床转速190rpm条件下进行发酵培养36h，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率(芽孢率(％ )= 成熟芽孢数/(成熟芽孢数+菌体数)X 100)；芽孢率达到90%时停止发酵培养；共发酵培养约45 50h，所得即为枯草芽孢杆菌HMB20428的液体制剂。实施例2枯草芽孢杆菌HMB20^8对黄瓜霜霉病防治效果的对比试验(一)试验药剂:(1)微生物菌剂实施例1制备的HMB20^8液体制剂；用水稀释50倍。(2)化学药剂嘧菌酯悬浮剂O50克/升)(英国先正达有限公司)，用水稀释 1000 倍。(3)空白对照清水(二)试验方法本试验在河北省农林科学院植物保护研究所的实验室内进行。本试验所用的黄瓜霜霉病菌2010年来自河北省农林科学院植物保护研究所农药应用技术实验室，配制成孢子囊(IX IO5-L 5 X IO5个/mL)的悬浮液。取无病完整的黄瓜叶片，分别将其浸在(1)实施例1中制备的HMB204^液体制剂50倍稀释液中；(2)化学药剂对照嘧菌酯悬浮剂050克/升)1000倍水稀释液中；(3)空白对照清水中；Ih后取出放入培养皿；在30°C光照培养箱中定殖一天，用打孔器打取直径 15mm的叶盘，放置在培养皿中，每种处理重复4次，每皿10个叶盘作为一次重复；将制备好的黄瓜霜霉病菌孢子囊悬浮液在每个叶盘中部滴加IOul ；在18°C光照培养箱中培养7天， 调查病级并且计算防效。黄瓜霜霉病级别划分标准和防效计算方法参照《中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则》(一)杀菌剂防治黄瓜霜霉病GB/T 17980. 26-2000(以下同)。(三)结果(见表1)枯草芽孢杆菌HMB20^8液体制剂处理后黄瓜霜霉病病指(0.00)显著低于空白对照病指(94. 17)和化学药剂对照病指(78. 33)，防治效果达到 100. 00%，说明本发明枯草芽孢杆菌HMB20^8及其微生物菌剂对黄瓜霜霉病具有很好的防治效果。表1枯草芽孢杆菌HMB20^8对黄瓜霜霉病防效的对比试验结果
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB20428，已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5616。
2.利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB20^8生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为枯草芽孢杆菌HMB204^菌体和它的胞外代谢产物。
3.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于为液体制剂。
4.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于HMB20428的活菌数大于 5. OX 109cfu/mL。
5.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将低温保存的HMB20^8菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上30°C培养M 36小时，得活化的菌株；(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到IOOmLLB液体培养基中，在 26 34°C、摇床转速为170 210rpm条件下培养22 25小时，得种子液；(3)按照体积比为0.5% 3. 0%的比例将步骤(2)的种子液接入到蔗糖豆饼粉培养基中，在温度为28 34°C，摇床转速为170 210rpm的条件下发酵培养36 Mh ；所述的蔗糖豆饼粉培养基，其组成成分及其重量百分比为蔗糖2. 0 3. 0%，豆饼粉1. 6 2. 4%， NaCl 0. 1 0. 2 %，CaCO3 0. 1 0. 3 %，KH2PO4 0. 01 0. 03 % 和 MgSO4 · 7Η20 0. 01 0. 03%，其余为水；(4)检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90% 时，停止发酵培养。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的温度为30 32 °C。
7.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的摇床转速为 2IOrpmο
8.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的培养时间为48h。
9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB20^8在防治黄瓜霜霉病上的应用。
10.权利要求2所述的微生物菌剂在防治黄瓜霜霉病上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于防治黄瓜霜霉病的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB20428，已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.5616。本发明还公开了利用上述菌株生产的微生物菌剂及其制备方法。所述微生物菌剂的其活性成分为枯草芽孢杆菌HMB20428菌体和它的胞外代谢产物。本发明菌株HMB20428对黄瓜霜霉病特异性强，而且防效高，平均防效在85％以上；其次，利用本发明方法防治黄瓜霜霉病不易产生抗药性；此外，本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染；还有本发明制备方法简单、成本低、使用方便。
文档编号C12R1/125GK102533610SQ20121002810
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月9日 优先权日2012年2月9日
发明者李宝庆, 李社增, 郭庆港, 马平, 鹿秀云 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所