用于二萜生产的微生物的制作方法
【专利说明】用于二萜生产的微生物 发明领域
[0001] 本发明涉及利用重组微生物在细胞外生产二萜和/或糖基化的二萜的方法。本发 明还涉及一种发酵液，其中所述发酵液包括通过这种方法可获得的二萜和/或糖基化的二 砲。
[0002] 发明背景
[0003] 世界各地对高效甜味剂的需求不断增长，而且混合不同的人工甜味剂正在逐渐变 成一种常规做法。然而，对甜味剂替代品的需求预计将会增加。多年生草本植物-甜叶菊 (Stevia rebaudiana Bert.)-的叶子中积聚了大量极甜的化合物，它们被称为甜菊糖苷。 虽然这些化合物的生物学功能还不明确，但由于甜叶菊甜味剂是天然植物产品这一附加优 势，它们作为备选的高效甜味剂具有商业意义。
[0004] 这些甜的甜菊糖苷显示出优于许多高效甜味剂的功能特性和感官性状。此外，研 究表明甜菊苷(stevioside)能降低II型糖尿病人的血糖水平和中度高血压患者的血压。
[0005] 甜菊糖苷积聚于甜菊叶中，它们可以占甜菊叶干重的10-20 %。甜菊苷和莱鲍迪甙 (rebaudioside)A都具有热稳定性和pH稳定性，因此适合用于碳酸饮料和许多其它食物中。 甜菊苷比蔗糖甜110-270倍，莱鲍迪甙A比蔗糖甜150-320倍。此外，莱鲍迪甙D也是积聚于甜 菊叶的高效二萜糖苷甜味剂，它可能比蔗糖甜约200倍。
[0006] 目前，甜菊糖苷是从甜菊植物中提取的。在甜菊中，（-)-贝壳杉烯酸(kaurenoic acid，赤霉素(GA)生物合成的中间物)被转换为四环的二萜-甜菊醇，然后甜菊醇继续通过 多步骤的葡糖基化途径形成各种甜菊糖苷。然而，产率是可变的并受农业和环境条件的影 响。而且，种植甜菊需要大量陆地面积、收获前的长久时间、密集的劳动力以及提取和纯化 糖苷的额外费用。
[0007] 为了满足对高效、天然甜味剂日益增长的商业需求，需要新的、更标准的、完全单 一成分的、没有后味的糖苷来源。
[0008] 发明概述
[0009] 在甜菊中，通过脱氧木酮糖磷酸酯途径（deoxyxylulose 5-phosphate pathway) 形成香叶基香叶基焦磷酸（GGPP)，甜菊醇就是从GGPP合成的。（-)-柯巴基二磷酸合酶 (copalyl diphosphate synthase，CPS)和（-)_贝壳杉稀合酶（kaurene synthase，KS)这两 个二萜环化酶的活性导致(-)_贝壳杉烯的形成，然后在一个三步骤的反应中，（-)_贝壳杉 稀被(-)-贝壳杉稀氧化酶(kaurene oxidase，K0)氧化形成(-)_贝壳杉稀酸。
[001 0]在甜菊叶中，（-)_贝壳杉烯酸接着被内根-贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)羟基化以 形成甜菊醇。然后，甜菊醇被一系列UDP-葡糖基转移酶(UGTs)葡糖基化。
[0011] 本发明涉及能够产生二萜(例如甜菊醇)或糖基化的二萜（即二萜糖苷，例如甜菊 单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱 鲍迪甙F、甜茶苷或杜克甙A)的微生物。
[0012] 在共同待决专利申请W02013/110673中，描述了能够产生二萜或二萜糖苷的重组 微生物。本文描述了这样的重组微生物，其包含额外的修饰，特别是一个或多个基因的下 调，这导致二萜或二萜糖苷的生产水平提高。
[0013] 因此，本发明提供包括一种或多种核苷酸序列的重组微生物，其中所述核苷酸序 列编码：
[0014] 具有内根-柯巴基焦磷酸合酶的多肽；
[0015] 具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；
[0016] 具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽;和 [0017]具有贝壳杉稀酸13-羟化酶活性活性的多肽，
[0018] 通过所述核苷酸序列的表达使微生物具有至少生产甜菊醇的能力，且
[0019] 其中所述重组微生物的基因组已经被修饰，使得其导致以下中的一种或多种的产 生缺陷(deficiency):
[0020] (i)能够作用于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)从而导致香叶基香叶醇(G0H)的形成 的磷酸酶；
[0021 ] ( ii )能够作用于法尼基焦磷酸（FPP)从而导致法尼醇（farnesol)和橙花叔醇 (nero 1 ido 1)的形成的磷酸酶；
[0022] (1^)外-1，3_0葡聚糖酶；
[0023] (iv)糖原合酶(或者影响糖原积累的多肽）；
[0024] (v)缺氧基因 （hypoxic genes)的转录抑制子（transcriptional repressor)
[0025] (vi)NADPH 氧化酶;或者
[0026] (vii)单駿酸转运体（monocarboxylate transporter)
[0027] (v i i i)由开放阅读框YJL064w编码的多肽;或者
[0028] (ix)由开放阅读框YPL062W编码的多肽。
[0029] 这些修饰中的一种或多种最终导致代谢工程菌株中的二萜和或二萜糖苷生产得 到改进。
[0030] 本发明还涉及这样的重组微生物，其中所述重组微生物的基因组已经被修饰，使 得其导致以下中的一种或多种的产生缺陷：
[0031] (i)能够作用于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)从而导致香叶基香叶醇(G0H)的形成 的磷酸酶，其包含与SEQ ID N0:225的序列同一性为至少约30%的氨基酸序列；
[0032] (ii)能够作用于法尼基焦磷酸(FPP)从而导致法尼醇和橙花叔醇的形成的磷酸 酶，其包含与SEQ ID N0:227的序列同一性为至少约30%的氨基酸序列；
[0033] (iii)外-1，3-β葡聚糖酶，其包含与SEQ ID N0:229或231的序列同一性为至少约 30%的氨基酸序列；
[0034] (iv)糖原合酶(或者影响糖原积累的多肽），其包含与SEQ ID N0:233、235或250的 序列同一性为至少约30%的氨基酸序列；
[0035] (v)缺氧基因的转录抑制子，其包含与SEQ ID N0:237的序列同一性为至少约30% 的氨基酸序列；
[0036] (vi)NADPH氧化酶，其包含与SEQ ID N0:239的序列同一性为至少约30%的氨基酸 序列；
[0037] (vii)单羧酸转运体，其包含与SEQ ID N0:241的序列同一性为至少约30%的氨基 酸序列；
[0038] (viii)具有由开放阅读框YJL064w编码的活性的多肽，其包含与SEQ ID N0:243的 序列同一性为至少约30 %的氨基酸序列;或者
[0039] (ix)具有由开放阅读框YJL062W编码的活性的多肽，其包含与SEQ ID N0:245的序 列同一性为至少约30 %的氨基酸序列。
[0040] 本发明还涉及这样的本发明的重组微生物，其中所述重组微生物的基因组已经在 以下一个或多个的至少一个位置处被修饰：
[0041] (i)核酸，其编码能够作用于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)从而导致香叶基香叶醇 (G0H)形成的磷酸酶，其包含与SEQ ID N0:224的序列同一性为至少约60%的核酸序列； [0042] (ii)核酸，其编码能够作用于法尼基焦磷酸(FPP)从而导致法尼醇和橙花叔醇形 成的磷酸酶，其包含与SEQ ID N0:226的序列同一性为至少约60%的核酸序列；
[0043] (iii)核酸，其编码外-l，3-β葡聚糖酶，其包含与SEQIDN0:228或230的序列同一 性为至少约60 %的核酸序列；
[0044] (iv)核酸，其编码糖原合酶（或者影响糖原积累的多肽），其包含与SEQ ID N0: 232、234或249的序列同一性为至少约60 %的核酸序列；
[0045] (v)核酸，其编码缺氧基因的转录抑制子，其包含与SEQ ID N0:236的序列同一性 为至少约60 %的核酸序列；
[0046] (vi)核酸，其编码NADPH氧化酶，其包含与SEQ ID N0:238的序列同一性为至少约 60%的核酸序列；
[0047] (vii)核酸，其编码单羧酸转运体，其包含与SEQ ID N0:240的序列同一性为至少 约60 %的核酸序列；
[0048] (vi i i)核酸，其编码具有由开放阅读框YJL064W编码的活性的多肽，其包含与SEQ ID N0:242的序列同一性为至少约60%的氨基酸序列;或者
[0049] (ix)核酸，其编码具有由开放阅读框YJL062W编码的活性的多肽，其包含与SEQ ID NO :244的序列同一性为至少约60 %的氨基酸序列。
[0050] 微生物可具有所述修饰中的一种或两种或更多种。
[0051] 本发明还提供包括一种或多种核苷酸序列的重组微生物，其中所述核苷酸编码一 种或多种具有UDP-葡糖基转移酶(UGT)活性的多肽，
[0052] 通过所述核苷酸的表达使重组微生物具有能生产甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊 苷、莱鲍迪戒A、莱鲍迪戒B、莱鲍迪戒C、莱鲍迪戒D、莱鲍迪戒E、莱鲍迪戒F、甜茶苷或杜克戒 A中的至少一种的能力。
[0053]本发明还提供：
[0054] -制备二萜或糖基化的二萜的方法，其中所述方法包括在合适的发酵培养基中发 酵本发明所述的重组微生物；以及任选地，回收二萜或糖基化的二萜；
[0055] -制备二萜或糖基化的二萜的方法，其中所述方法包括在约29°C或更低的温度下， 在合适的发酵培养基中发酵能够产生二萜或糖基化的二萜的重组微生物；以及任选地，回 收二萜或糖基化的二萜；
[0056] --种发酵液，其中所述发酵液包括通过本发明所述的方法可以得到的二萜或糖 基化的二萜；
[0057] -通过本发明所述的方法得到的或从根据本发明所述的发酵液中可以得到的得到 的二萜或糖基化的二萜；
[0058] -根据本发明所述的二萜或糖基化的二萜，其是莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D;和
[0059] -含有根据本发明所述的二萜或糖基化的二萜的食品、饲料或饮料。
[0060] 本发明还提供将初次糖基化的二萜转换为二次糖基化的二萜的方法，所述方法包 括：
[0061] 将所述初次糖基化的二萜与根据本发明所述的微生物、来源于这种微生物的无细 胞提取物或者来源于上述微生物或无细胞提取物之一的酶制剂接触，
[0062] 从而将初次糖基化的二萜转换为二次糖基化的二萜。
【附图说明】
[0063] 图1展示了质粒pUG7_EcoRV的示意图。
[0064] 图2展示了设计ERG20、tHMGl和BTS1过表达盒(A)，并将其整合至酵母基因组(B)的 方法的不意图。（C)显不了利用Cre重组酶移除KANMX标记后的最终状态。
[0065]图3展示了ERG9敲低构建体的示意图。所述构建体由500bp ERG9的3'部分、98bp TRP1的启动子、TRP1的开放阅读框和终止子以及之后的400bp ERG9的下游序列组成。由于 在ERG9的开放阅读框的终点引入了Xbal位点，因此最后的氨基酸变成了丝氨酸，终止密码 子变成了精氨酸。新的终止密码子位于TRP1的启动子中，这导致延长了 18个氨基酸。
[0066]图4展示了将UGT2整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同片段;B.整合后的 状态;C. Cre重组酶表达后的状态。
[0067]图5展示了将GGPP到RebA的途径整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同片 段;B.整合后的状态。
[0068] 图6展示了如何构建特定基因缺失的示意图。A.亲本菌株中的基因组;B.整合后的 状态;C.向外重组后的状态。
[0069] 图7展示了生物合成甜菊糖苷的潜在途径的示意图。
[0070] 图8展示了质粒pMB6969的示意图。
[0071] 图9展示了质粒pMB6856的示意图。
[0072] 图10展示了质粒pMB6857的示意图。
[0073] 图11展示了质粒pMB6948的示意图。
[0074] 图12展示了质粒pMB6958的示意图。
[0075] 图13展示了质粒pMB7015的示意图。
[0076] 图14展示了质粒pMB6986的示意图。
[0077] 图15展示了质粒pMB7059的示意图。
[0078] 图16展示了质粒pMB4691的示意图。
[0079] 图17展示了破坏GSY1基因的示意图。
[0080] 序列表说明
[0081] 表1展示了序列说明。本文描述的序列可以引用序列表或数据库访问号（同样展示 于表1)来定义。
[0082] 发明详述
[0083] 在本说明书和附属的权利要求书的各个部分，词语"包括"、"包含"和"具有"及其 变形应被理解为"包含在内"。也就是说，在语境允许的情况下，这些词语意图传达的意思 是:可以包括其它没有明确列举的元素或整体。
[0084] 本文中不使用数量词修饰时指的是一个或多于一个(即一个或至少一个)对象。例 如，"元素"可能意味着一个元素或多于一个元素。
[0085] 本发明涉及能够产生二萜或糖基化的二萜(通常分别是甜菊醇或甜菊糖苷）的重 组微生物。为了本发明的目的，二萜通常意味着由4个异戊二烯单元组成的有机物。这种化 合物可来源于香叶基香叶基焦磷酸。糖基化的二萜或二萜糖苷是一种结合有糖的二萜，其 中糖通常与非碳水化合物部分相结合。通常，在二砲糖苷中，糖基通过其异头碳(anomric carbon)经由糖苷键与另外一个基团结合。优选的二萜和二萜糖苷分别是甜菊醇和甜菊糖 苷。因此，特别地，本发明涉及能够产生甜菊醇和甜菊糖苷的重组微生物。
[0086] 根据本发明，提供了重组微生物。所述重组微生物包括一种或多种核苷酸序列，所 述核苷酸序列编码：
[0087] 具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；
[0088] 具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；
[0089] 具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽;和
[0090] 具有贝壳杉烯酸13-轻化酶活性的多肽，
[0091] 通过所述核苷酸的表达使重组微生物具有至少能够生产甜菊醇的能力。
[0092] 关键性地，所述重组微生物的基因组被修饰，使得其导致以下中的一种或多种的 产生缺陷：
[0093] (i)能够作用于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)从而导致香叶基香叶醇(G0H)的形成 的磷酸酶；
[0094] (ii)能够作用于法尼基焦磷酸(FPP)从而导致法尼醇和橙花叔醇的形成的磷酸 酶；
[0095] (1^)外-1，3_0葡聚糖酶；
[0096] (iv)糖原合酶(或者影响糖原积累的多肽）；
[0097] (v)缺氧基因的转录抑制子(R0X1)
[0098] (vi)NADPH 氧化酶;或者
[0099] (vii)单羧酸转运体(JEN1)
[0100 ] (v i i i)具有由开放阅读框YJL064W编码的活性的多肽;或者 [0101] (ix)具有由开放阅读框YPL062W编码的活性的多肽。
[0102] -种或多种以上的产生缺陷导致比不具有所述产生缺陷的重组微生物更高的二 萜或二萜糖苷生产。
[0103] 能够作用于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)从而导致香叶基香叶醇(G0H)形成的磷酸 酶可以是具有所述活性的任何多肽，例如二酰基甘油焦磷酸磷酸酶，例如由DPP 1 (YDR284C) 编码的那种。
[0104] 能够作用于法尼基焦磷酸(FPP)从而导致法尼醇和橙花叔醇形成的磷酸酶可以是 具有所述活性的任何多肽，例如脂质磷酸磷酸酶，例如由LPP1基因（YDR503C)编码的那种。
[0105] 外-1，3-β葡聚糖酶可以是具有所述活性的任何多肽，例如由EXG1(YLR300W)或 EXG2(YDR261C)基因编码的那种。
[0106] 糖原合酶（或者影响糖原积累的多肽）可以是具有所述活性的任何多肽，例如由 GSY1(YFR015C 或 YALI0F18502)或 GSY2(YLR258W)基因编码的那种。
[0107] 缺氧基因的转录抑制子可以是具有所述活性的任何多肽，例如由R0X1基因 (YPR065W)编码的那种。
[0108] NADPH氧化酶可以是具有所述活性的任何多肽，例如由YN01(YGL160W)基因编码的 那种。
[0109] 单羧酸转运体可以是具有所述活性的任何多肽，例如由JEN1基因编码的那种。
[0110] 具有由开放阅读框YJL064W编码的活性的多肽可以是具有所述活性的任何多肽。 具有由开放阅读框YPL062W编码的活性的多肽可以是具有所述活性的任何多肽。
[0112] 本文中提及的开放阅读框和基因可在酵母属基因组数据库（Saccharomyces Genome Database) (http://www·yeastgenome · com)中被石角定。
[0113] 本发明还涉及这样的重组微生物，其中所述重组微生物的基因组已经被修饰，使 得其导致以下中的一种或多种的产生缺陷：
[0114] (i)能够作用于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)从而导致香叶基香叶醇(G0H)的形成 的磷酸酶，其包含与SEQ ID N0:225的序列同一性为至少约30%的氨基酸序列；
[0115] (ii)能够作用于法尼基焦磷酸(FPP)从而导致法尼醇和橙花叔醇的形成的磷酸 酶，其包含与SEQ ID N0:227的序列同一性为至少约30%的氨基酸序列；
[0116] (iii)外-1，3-β葡聚糖酶，其包含与SEQ ID N0:229或231的序列同一性为至少约 30%的氨基酸序列；
[0117] (iv)糖原合酶(或者影响糖原积累的多肽），其包含与SEQ ID N0:233、235或250的 序列同一性为至少约30%的氨基酸序列；
[0118] (v)缺氧基因的转录抑制子，其包含与SEQ ID N0:237的序列同一性为至少约30% 的氨基酸序列；
[0119] (vi)NADPH氧化酶，其包含与SEQ ID N0:239的序列同一性为至少约30%的氨基酸 序列；
[0120] (vii)单羧酸转运体，其包含与SEQ ID N0:241的序列同一性为至少约30%的氨基 酸序列；
[0121] (viii)具有由开放阅读框YJL064W编码的活性的多肽，其包含与SEQ ID N0:243的 序列同一性为至少约30 %的氨基酸序列;或者
[0122] (ix)具有由开放阅读框YJL062W编码的活性的多肽，其包含与SEQ ID N0:245的序 列同一性为至少约30 %的氨基酸序列。
[0123] 本发明还涉及这样的重组微生物，其中所述重组微生物的基因组已经被修饰，使 得其导致以下中的一种或多种的产生缺陷：
[0124] (i)核酸，其编码能够作用于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)从而导致香叶基香叶醇 (G0H)形成的磷酸酶，其包含与SEQ ID N0:224的序列同一性为至少约60%的核酸序列；
[0125] (ii)核酸，其编码能够作用于法尼基焦磷酸(FPP)从而导致法尼醇和橙花叔醇形 成的磷酸酶，其包含与SEQ ID N0:226的序列同一性为至少约60%的核酸序列；
[0126] (iii)核酸，其编码外-l，3-β葡聚糖酶，其包含与SEQIDN0:228或230的序列同一 性为至少约60 %的核酸序列；
[0127] (iv)核酸，其编码糖原合酶（或者影响糖原积累的多肽），其包含与SEQ ID NO: 232、234或249的序列同一性为至少约60 %的核酸序列；
[0128] (v)核酸，其编码缺氧基因的转录抑制子，其包含与SEQ ID N0:236的序列同一性 为至少约60 %的核酸序列；
[0129] (vi)核酸，其编码NADPH氧化酶，其包含与SEQ ID N0:238的序列同一性为至少约 60%的核酸序列；
[0130] (vii)核酸，其编码单羧酸转运体，其包含与SEQ ID N0:240的序列同一性为至少 约60 %的核酸序列；
[0131] (vi i i)核酸，其编码具有由开放阅读框YJL064W编码的活性的多肽，其包含与SEQ ID N0:242的序列同一性为至少约60%的氨基酸序列;或者
[0132] (ix)核酸，其编码具有由开放阅读框YJL062W编码的活性的多肽，其包含与SEQ ID NO :244的序列同一性为至少约60 %的氨基酸序列。
[0133] 重组微生物可包含上述修饰中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或 全部。重组微生物可包含上述修饰中的两种或更多种的任意组合。
[0134] 重组微生物在至少一种本文所提及多肽的产生中缺陷被定义为表型特征，其中当 在基本相同的条件下分析时，较之其基因组未被根据本发明修饰的重组微生物，细胞由于 基因组的修饰:a)产生较少所述多肽，和/或b)具有降低的由编码所述多肽的基因转录的 mRNA的表达水平，和/或c)产生具有降低的蛋白活性或降低的蛋白比活性的多肽，和/或d) 产生较少由所述多肽产生的产物，以及这些可能性中的一种或多种的组合。
[0135]在该语境中，基因就此被定义为包含开放阅读框(0RF)和其转录控制元件（启动子 和终止子)的多核苷酸，所述0RF是基因上的将被转录并且翻译成蛋白序列的区域。
[0136] 因此，如果与基因组未被修饰的亲本宿主细胞相比，微生物宿主细胞的缺陷可通 过测定由基因组被修饰的重组微生物产生的相关多肽的量和/或(比）活性来测量，和/或它 可以通过测定由编码所述多肽的基因转录的mRNA的量来测量，和/或它可以通过测定如上 文定义的基因组被修饰的重组微生物中的所述多肽产生的产物的量来测量，和/或它可以 通过基因或基因组测序来测量。可使用对技术人员而言可得到的任何检验，例如转录谱、 Northern印迹法、RT-PCR、Q-PCR和Western印迹法来测量多肽的产生缺陷。
[0137] 重组微生物的基因组修饰在本文中被定义为导致细胞基因组中的多核苷酸序列 改变的任何事件。修饰被解释为一种/个或多种/个修饰。可通过典型的菌株改进，随机诱变 随后选择来引入修饰。可通过引入(插入）、替换或去除(缺失）核苷酸序列中的一个或多个 核苷酸来完成修饰。该修饰可例如在编码序列或对多核苷酸的转录或翻译而言必需的调节 元件中。例如，可插入或去除核苷酸，以引入终止密码子、去除起始密码子或使编码序列的 开放阅