一种微生物解磷制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一种含解淀粉芽孢杆菌的菌剂及其制 备方法和在提高土壤中磷的利用上的应用。
【背景技术】
[0002] 磷是植物生长所必需的矿质元素之一，是植物体内核酸及多种酶、辅酶、三磷酸腺 苷（ATP)等的重要组成部分，并以多种方式参与植物体内的光合作用和生理生化过程，对 促进植物的生长发育和新陈代谢具有重要作用。植物缺磷会影响核酸、蛋白质合成，使细胞 形成和增殖受到抑制，导致生长发育停滞，根系发育不良，植物矮小，各类作物分蘖将减少 或延迟，抽穗推迟，开花晚，成熟迟，穗粒数减少，籽粒不饱满，玉米果穗秃顶，马铃薯块茎变 小等。因此，磷对农业生产来说是非常重要的。
[0003]自然界的磷库主要存在于土壤中，其循环主要在土壤、植物和微生物之间进行。土 壤作为植物磷素的供给源，其供磷水平的高低影响着植物的生长发育。土壤中的磷含有机 磷和无机磷两种，有机磷占土壤全磷的1/3~1/2,主要以核酸、磷酸和植素存在。无机磷 占全磷的40%~75%，除少量可溶性磷酸盐外，大部分为不溶性磷酸盐（磷酸钙、磷酸铁、 铝磷酸盐等），这些形态的无机磷化物很难被植物吸收利用，土壤中能被植物直接吸收利用 的有效态磷仅占全磷的2%~3%。据统计，全世界有43%的耕地土壤属于缺磷土壤；我国 有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷以稳定的铝硅酸盐和磷灰石等为无效形式 存在，植物很难直接吸收利用，因此绝大多数农作物及林木都要追施磷肥。施入的磷肥当 季作物利用率为5%~25%，一部分磷肥随雨水流入江河湖泊，造成水体的富营养化，引起 水质污染；大部分磷由于土壤的固定作用，与土壤中的Ca' Fe' Fe' Al3+结合，形成难溶 性磷酸盐，因此，大部分磷肥作为无效态（难溶态）在土壤中积累。由于长期施用磷肥，事 实上大多数农田土壤潜在的磷库含量很大，而且磷肥过多使用会造成土壤重金属含量的增 加，土壤理化性质改变，且有机磷农药的大量施用，造成环境污染，影响农产品质量，对人类 的健康带来很大的危害。
[0004] 磷是许多发展中国家农业生产上的重要限制因素，提高土壤中磷的利用效率将具 有重大意义。大量研究结果表明，某些微生物具有很强的解磷功能，通过其分泌物或吸收作 用可把土壤中无效态磷转化成有效态磷，还分泌生长素等物质刺激植物生长。解磷微生物 最直接的作用就是溶解土壤中的难溶性或不溶性磷素。解磷微生物肥料除了有提供作物可 吸收磷素以外还具有以下优点：（1)促进农作物对锌、铜、钙等其他营养元素的吸收。（2)增 强植物抗病能力。（3)肥效高。（4)减少环境污染。（5)解磷微生物肥料的生产工艺简单， 投资少，见效快，效益好，具有极强的市场竞争力。因此，筛选解磷微生物，生产含有解磷功 能的微生物有机肥料对解决植物磷素供应问题是一条很好的途径。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在土壤中磷的利用效率较低，以及植 物的生长主要靠施用化肥、化学农药会带来环境污染等缺陷，其发明的目的是通过一种微 生物解磷制剂分解土壤难溶无机磷，为植物提供可以直接吸收的磷素。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案如下：
[0007] 1. -种微生物解磷制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
[0008] (1)将解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2010_KC CGMCC No. 5722活化后，按5~10 %接种量，将活化的所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No. 5722接种到种子培养基，在培养温度35°C、转速 120rpm/min条件下，摇床培养24~36h，得到一级种子液，所述种子培养基由以质量分数计 的以下成分组成：葡萄糖 〇· 5 ~1%，（NH4)2SO4 0· 03 ~0· 05%，NaCl 0· 02 ~0· 03%，KCl 0· 02 ~0· 03%，Ca3(P04)2 0· 1 ~0· 2%，MgS04 ·7Η20 0· 02 ~0· 03%，MnS04 ·4Η20 0· 001 ~ 0· 003%，余量为水，pH 7· 0 ~7· 2 ;
[0009] (2)按10~12%接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在 28~37°C，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0. 01~0. 03MPa条件下培养 36~48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：玉米 粉1. 5~3%，麸皮粉1~2%，酵母膏0. 05~0. 3%，蛋白胨0. 5~1 %，磷矿粉1~2%， MgSO4 · 7H20 0· 01 ~0· 03%，NaCl 0· 1 ~0· 3%，（NH4)2SO4 0· 03 ~0· 05%，余量为水，pH 7. 0 ~7. 2 ;
[0010] (3)按10~12 %接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在28~ 37°C，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0. 01~0. 03MPa条件下培养48~ 72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No. 5722的有效活菌数3 IX lO^fu/ml时，将发酵液用医用塑料瓶包装，即为所述微生物 解磷制剂，所述发酵培养基与步骤（2)所述二级种子培养基相同。
[0011] 2. -种微生物解磷制剂，其特征在于：它的活性成分为一株解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No. 5722 的发酵液。
[0012] 3. -种微生物解磷制剂，其特征在于：所述生物解磷制剂通过技术方案1所述的 一种生物解磷制剂的制备方法制备得到。
[0013] 4.技术方案2或3所述的微生物解磷制剂在降解土壤难溶无机磷中的应用。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0015] 1、本发明微生物解磷制剂通过本发明保藏号为CGMCC No. 5722的一株解淀粉芽孢 杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2010_KC发酵而成的液体制剂，能提高土壤中难溶 性磷的生物有效性和土壤磷的利用率，节肥增产，改善土壤环境，能有效促进植物包括农作 物对土壤磷元素的吸收，分解作物根系周围的难溶磷元素，可以作为降解土壤难溶无机磷 的解磷制剂。
[0016] 2、本发明微生物解磷制剂可作为微生物肥料，在生产中避免了 "三废"污染，属环 境友好型生物制剂，能减少环境污染并能修复土壤。
[0017] 3、本发明微生物解磷制剂的制备工艺简单，成本低，施用方法简单易行。
[0018] 本发明所述的解淀粉芽抱杆菌 Bacillus amyloliquefaciens YN2010-KC 于 2012 年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称：CGMCC)，保藏 号为CGMCC No. 5722,并于2012年1月12日检测为存活。该普通微生物中心地址：中国北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例进一步说明，各实施例无特殊说明为常规方法。
[0020] 实施例 1 本发明解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2010_KC 的 获得、鉴定和保臧
[0021] 1、本发明解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的获得
[0022] I. 1 材料
[0023] 采自云南农业大学后山农场玉米根际周围的土壤。
[0024] 1.2培养基制备
[0025] 将LB固体培养基和PSA培养基（马铃薯蔗糖琼脂培养基）融化，分别倒入灭菌培 养皿，冷却，制成LB和PSA平板。
[0026] 1. 3分尚培养
[0027] 采用稀释平皿分离法和平板划线分离，将分离纯化所得的一菌株命名为 YN2010-KC。
[0028] 2、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的鉴定
[0029] 2. 1、形态学鉴定
[0030] 取菌株YN2010-KC在LB培养基上培养，37°C培养36小时，进行形态观察鉴定，菌 体为杆状、端圆，周生鞭毛、具运动性，产生椭圆形芽孢；在LB和PSA平板上菌落圆形、淡 茶褐色、菌落中央颜色略深、隆起、表面干燥有褶皱。与《常见细菌系统鉴定手册》（东秀 珠等编著，科学出版社，2001年）中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株 YN2010-KC 属于芽抱杆菌（Bacillus spp.) 〇
[0031] 2. 2、生理生化鉴定
[0032] 菌株革兰氏染色、芽孢染色、淀粉水解、葡萄糖利用、柠檬酸盐利用、V-P反应、接触 酶反应、硝酸盐还原、明胶液化等均呈阳性。
[0033] 3、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的保藏
[0034] 经上述鉴定表明所分离获得的菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，其代号为YN2010-KC，所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensYN2010_KC于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（简称：CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 5722,并于2012年1月12日检测为 存活。该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
[0035] 实施例2本发明微生物解磷制剂的制备
[0036] 本发明生物解磷制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0037] (1)将 _8〇°C保存的解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2OlO-KC CGMCC No. 5722接种在液体LB培养基上，32°C培养24~36h，得活化的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No. 5722,按 10%接种量，将活化的所述 解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) YN2010-KC CGMCC No. 572 接种到种子培 养基，在培养温度35°C、转速120rpm/min条件下，摇床培养36h，得到一级种子液，所述种子 培养基由以质量分数计的以下成分组成：葡萄糖1%，（NH 4)2SO4 0. 05%，NaCl 0. 02%，KCl 0· 03 %，Ca3 (PO4) 20 · 2 %，MgSO4 · 7H20 0· 03 %，MnSO4 · 4H20 0· 003 %，余量为水，pH 7· O ~ 7. 2 ；
[0038] (2)按10%接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在32°C，转 速100rpm/min，通气量为100