一种复合微生物制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。由以下重量份的原料组成：粪肠球菌菌粉0.1~15份、酿酒酵母菌粉0.1~15份、枯草芽孢杆菌菌粉0.1~10份、酵母多糖0.1份、玉米淀粉59.9~74.9份。相对于现有技术，本发明将粪肠球菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌进行有机组合，充分发挥各菌种的优势，能够适应不同宿主和多种条件，具有部分甚至完全替代抗生素、调整胃肠道生态平衡、促进生长、提高饲料转化率及增强免疫力等多种功能，可改善动物肠道微生物环境，抑制有害菌生长，促进有益菌增殖；提高动物免疫力，增强抗病能力；为动物提供营养物质，提高饲料利用率，促进动物生长。
【专利说明】
一种复合微生物制剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物饲料技术领域，具体涉及一种复合微生物制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 抗生素作为药物或饲料添加剂，大大推动了畜牧业的发展，但抗生素大规模使用 于畜牧业，特别是作为饲料添加剂，其种种弊端越来越明显，具有药物残留、出现耐药菌株、 破坏动物肠道正常菌群等缺点。为克服抗生素的弊端，世界各国加强了新型绿色饲料添加 剂的研究和应用，特别是微生物饲料添加剂受到了人们的重视，快速发展起来。
[0003] 粪肠球菌/'aecaJis)是革兰氏阳性菌，1994年出版的《伯杰氏细 菌鉴定手册》将该菌列为肠球菌属。粪肠球菌存在于人和大多数动物的肠道内，是人体肠道 内的重要菌群，能耐受胃酸和胆汁酸。粪肠球菌作为微生物制剂，可以对宿主胃肠道进行微 生态调节，增强动物免疫力。
[0004] 酿酒酵母ce/wisiae)属于真菌，兼性厌氧的一类微生物。酵母 菌在人或动物胃肠道中所占比例较小，但其有丰富的营养物质。酵母菌菌体蛋白占干物质 的32%~75%，酵母细胞中含有20多种氨基酸，4. 5%~8. 5%的核糖核酸，和多种维生素，其中B 族维生素含量极其丰富。酵母细胞壁主要成分有甘露寡糖(6.6%)、β-葡聚糖（57%)、糖蛋 白22%，还有少量的其他蛋白质、几丁质、脂类和灰分等。酵母菌细胞内还有丰富的酶类，如 淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、植酸酶、葡聚糖酶、几丁质酶等。酿酒酵母作为微生物制剂，可以 为宿主提供营养物质，促进有益菌的增殖，调节肠道微生态平衡，提供动物消化能力，促进 动物的生长。
[0005] 枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌类有益菌，具有其它益生菌没 有的特点，（1)当芽孢杆菌以芽孢的形式存在时，进入人或动物胃肠道时可以耐受胃酸和胆 盐，且保持高活性；（2)由于芽孢的存在可以耐受100 °C的高温，在生产制剂制粒的过程中 损失率比较小，活性高，保存时间长；（3)芽孢杆菌类可以产生活性很强的淀粉酶、蛋白酶、 脂肪酶、纤维素酶等多种酶类物质，还可以产生某些小环肽类细菌素或者一些多肽类物质， 其对肠道中的致病菌均有拮抗作用。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是抗生素作为药物或饲料添加剂，具有药物残留、出现 耐药菌株、破坏动物肠道正常菌群等缺点，为解决上述问题，本发明提供一种复合微生物制 剂及其制备方法。
[0007] 本发明的目的是以下述方式实现的： 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至 少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
[0008] 由以下重量份的原料组成：粪肠球菌菌粉0. 1~15份、酿酒酵母菌粉0. 1~15份、枯 草芽孢杆菌菌粉〇. 1~1〇份、酵母多糖〇. 1份、玉米淀粉59. 9~74. 9份。
[0009] 具体步骤如下： (1) 粪肠球菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37°C下培养24 h ; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1. 0 mL/L，磷酸氢二钾2. 0 g/L，柠檬酸三铵2. 0 g/L，硫酸镁0. 2 g/L，硫酸 锰0.05 g/L，乙酸钠2.0 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.1 ±0.1，121 °C灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37°C下静置培养 18-20 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨30~34 g/L，酵母粉9.0~11 g/L， 葡萄糖26~30 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸钙10 g/L ;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7. 1±0. 1，121°C下灭菌20 min， 待培养基冷却后，即为液体发酵培养基； e. 液体发酵：按照2. 5~5. 0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温 度为34~37 °C，振荡速度为120~150 r/min的条件下发酵12~14 h，即得到粪肠球菌发酵 液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:20~40的比例混合，得到粪肠球 菌菌粉，其活菌数在2. 0 X 101° cfu/g以上； (2) 酿酒酵母菌种培养： a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30°C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，磷酸氢二钾 1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6. 0±0.1，121 °C灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养22~24 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖110~120 g/L、红砂糖20 g/L、蛋 白胨 28~32 g/L、酵母粉 10 g/L、KH2P04 1.0 g/L、K2HP04 10 g/L、MgS04 1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6. 0±0. 1，121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后， 即为发酵培养基； e. 液体发酵：按照5. (FdO%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温 度为27~30 °C，振荡速度为180~200 r/min下发酵16~18 h，即得到酿酒酵母发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:5~10的比例混合，得到酿酒酵母 菌粉，其活菌数在1. 〇 X 101° cfu/g以上； (3) 枯草芽孢杆菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 °C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7·0±0·2，121 °C灭菌20 min，待 培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养18~24 h，即得一级种子液； d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮80. 5~85. 5份，玉米粉10~15份，葡 萄糖0. 5份，蛋白胨2份，NaCl 0. 5份，硫酸锰0. 5份，硫酸镁0. 5份，碳酸钙0. 5份，料水 比1:0. 8,121 °C灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养； e. 发酵：以2. 5°Ρ5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层 纱布封口，35~38°C下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次； f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2. OX 101° cfu/g，芽孢数达 1.4X101Q cfu/g; (4)将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均 匀，即为复合微生物制剂。
[0010] 相对于现有技术，本发明将粪肠球菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌进行有机组合，充 分发挥各菌种的优势，能够适应不同宿主和多种条件，具有部分甚至完全替代抗生素、调整 胃肠道生态平衡、促进生长、提高饲料转化率及增强免疫力等多种功能，可改善动物肠道微 生物环境，抑制有害菌生长，促进有益菌增殖；提高动物免疫力，增强抗病能力；为动物提 供营养物质，提高饲料利用率，促进动物生长。
[0011] 本发明所使用的菌种粪肠球菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌均为从健康猪肠道中自 主分离、筛选，具有优良益生特性和发酵特性，功能明确，功效明显，稳定性好。所用菌种均 为农业部《饲料添加剂品种目录》所列菌种，可安全用于畜禽、水产动物。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至 少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
[0013] 由以下重量份的原料组成：粪肠球菌菌粉0. 1~15份、酿酒酵母菌粉0. 1~15份、枯 草芽孢杆菌菌粉〇. 1~1〇份、酵母多糖〇. 1份、玉米淀粉59. 9~74. 9份。
[0014] 具体步骤如下： (1)粪肠球菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37°C下培养24 h ; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1. 0 mL/L，磷酸氢二钾2. 0 g/L，柠檬酸三铵2. 0 g/L，硫酸镁0. 2 g/L，硫酸 锰0.05 g/L，乙酸钠2.0 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.1 ±0.1，121 °C灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37°C下静置培养 18-20 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨30~34 g/L，酵母粉9.0~11 g/L， 葡萄糖26~30 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸钙10 g/L ;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7. 1±0. 1，121°C下灭菌20 min， 待培养基冷却后，即为液体发酵培养基； e. 液体发酵：按照2. 5~5. 0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温 度为34~37 °C，振荡速度为120~150 r/min的条件下发酵12~14 h，即得到粪肠球菌发酵 液； f.将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:20~40的比例混合，得到粪肠球 菌菌粉，其活菌数在2. Ο X 101° cfu/g以上； (2) 酿酒酵母菌种培养： a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30°C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，磷酸氢二钾 1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6·0±0·1，121 °C灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养22~24 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖110~120 g/L、红砂糖20 g/L、蛋 白胨 28~32 g/L、酵母粉 10 g/L、KH2P04 1.0 g/L、K2HP04 10 g/L、MgS04 1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6. 0±0. 1，121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后， 即为发酵培养基； e. 液体发酵：按照5. (FdO%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温 度为27~30 °C，振荡速度为180~200 r/min下发酵16~18 h，即得到酿酒酵母发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:5~10的比例混合，得到酿酒酵母 菌粉，其活菌数在1. 〇 X 101° cfu/g以上； (3) 枯草芽孢杆菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 °C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7·0±0·2，121 °C灭菌20 min，待 培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养18~24 h，即得一级种子液； d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮80. 5~85. 5份，玉米粉10~15份，葡 萄糖0. 5份，蛋白胨2份，NaCl 0. 5份，硫酸锰0. 5份，硫酸镁0. 5份，碳酸钙0. 5份，料水 比1:0. 8,121 °C灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养； e. 发酵：以2. 5°Ρ5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层 纱布封口，35~38°C下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次； f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2. OX 101° cfu/g,芽孢数达 1.4 X 101° cfu/g; (4) 将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均 匀，即为复合微生物制剂。
[0015] 实施例2: 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
[0016] 具体步骤如下： (1)粪肠球菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37°C下培养24 h ; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1. 0 mL/L，磷酸氢二钾2. 0 g/L，柠檬酸三铵2. 0 g/L，硫酸镁0. 2 g/L，硫酸 锰0.05 g/L，乙酸钠2.0 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.0,121 °C灭菌20 min， 待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37°C下静置培养 18 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨30 g/L，酵母粉9.0 g/L，葡萄糖 26 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸 钙10 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.0,121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后， 即为液体发酵培养基； e. 液体发酵：按照2. 5%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为 34 °C，振荡速度为120 r/min的条件下发酵12 h，即得到粪肠球菌发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:20的比例混合，得到粪肠球菌菌 粉，其活菌数在2. 0 X 101° cfu/g以上； (2) 酿酒酵母菌种培养： a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30°C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，磷酸氢二钾 1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至5. 9,121 °C灭菌20 min，待 培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养22 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖110 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨 28 g/L、酵母粉 10 g/L、KH2P04 1.0 g/L、K2HP04 10 g/L、MgS04 1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L，用 氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至5. 9,121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培 养基； e. 液体发酵：按照5. (FdO%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温 度为27 °C，振荡速度为180 r/min下发酵16 h，即得到酿酒酵母发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:5的比例混合，得到酿酒酵母菌 粉，其活菌数在1. 〇 X 101° cfu/g以上； (3) 将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物 制剂。
[0017] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉0. 1kg、酿酒酵母菌粉0. 1 kg、酵 母多糖0. 1 kg、玉米淀粉59. 9 kg。
[0018] 实施例3: 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
[0019] 具体步骤如下： (1)粪肠球菌菌种培养： a.菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37°C下培养24 h ; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1. 0 mL/L，磷酸氢二钾2. 0 g/L，柠檬酸三铵2. 0 g/L，硫酸镁0. 2 g/L，硫酸 锰0· 05 g/L，乙酸钠2. 0 g/L ;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7. 1，121 °C灭菌20 min， 待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37°C下静置培养 19 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨32 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖 28 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸 钙10 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.1，121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后， 即为液体发酵培养基； e. 液体发酵：按照4. 0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为 36 °C，振荡速度为135 r/min的条件下发酵13 h，即得到粪肠球菌发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:30的比例混合，得到粪肠球菌菌 粉，其活菌数在2. 0 X 101° cfu/g以上； (2) 酿酒酵母菌种培养： a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30°C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，磷酸氢二钾 1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0,121 °C灭菌20 min，待 培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养23 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖115 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨 30 g/L、酵母粉 10 g/L、KH2P04 1.0 g/L、K2HP04 10 g/L、MgS04 1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L，用 氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6. 0,121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培 养基； e. 液体发酵：按照7. 5%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为 28°C，振荡速度为190 r/min下发酵16 h，即得到酿酒酵母发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:7. 5的比例混合，得到酿酒酵母 菌粉，其活菌数在1. 〇 X 101° cfu/g以上； (3) 将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物 制剂。
[0020] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉3kg、酿酒酵母菌粉3 kg、酵母多 糖0.1 kg、玉米淀粉63 kg。
[0021] 实施例4: 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
[0022] 具体步骤如下： (1)粪肠球菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37°C下培养24 h ; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1. 0 mL/L，磷酸氢二钾2. 0 g/L，柠檬酸三铵2. 0 g/L，硫酸镁0. 2 g/L，硫酸 锰0.05 g/L，乙酸钠2.0 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.2,121 °C灭菌20 min， 待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37°C下静置培养 20 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨34 g/L，酵母粉11 g/L，葡萄糖 30 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸 钙10 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.2,121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后， 即为液体发酵培养基； e. 液体发酵：按照5. 0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为 37 °C，振荡速度为150 r/min的条件下发酵14 h，即得到粪肠球菌发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:40的比例混合，得到粪肠球菌菌 粉，其活菌数在2. 0 X 101° cfu/g以上； (2) 酿酒酵母菌种培养： a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30°C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，磷酸氢二钾 1.〇8/1，硫酸镁0.58/1;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节？!1至6.1，1211：灭菌2〇1^11，待 培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养24 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖120 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨 32 g/L、酵母粉 10 g/L、KH2P04 1.0 g/L、K2HP04 10 g/L、MgS04 1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L，用 氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6. 1，121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培 养基； e. 液体发酵：按照10%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为 30 °C，振荡速度为200 r/min下发酵18 h，即得到酿酒酵母发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:10的比例混合，得到酿酒酵母菌 粉，其活菌数在1. 〇 X 101° cfu/g以上； (3) 将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物 制剂。
[0023] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉6kg、酿酒酵母菌粉6 kg、酵母多 糖0.1 kg、玉米淀粉66 kg。
[0024] 实施例5 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
[0025] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉9kg、酿酒酵母菌粉9 kg、酵母多 糖0.1 kg、玉米淀粉69 kg。
[0026] 其他同实施例2。
[0027] 实施例6 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
[0028] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉12kg、酿酒酵母菌粉12 kg、酵母 多糖0. 1 kg、玉米淀粉72 kg。
[0029] 其他同实施例2。
[0030] 实施例7 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
[0031] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉15kg、酿酒酵母菌粉15kg、酵母多 糖0· 1 kg、玉米淀粉74. 9 kg。
[0032] 其他同实施例2。
[0033] 实施例8 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0034] 具体步骤如下： (1) 粪肠球菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37°C下培养24 h ; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1. 0 mL/L，磷酸氢二钾2. 0 g/L，柠檬酸三铵2. 0 g/L，硫酸镁0. 2 g/L，硫酸 锰0.05 g/L，乙酸钠2.0 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.0,121 °C灭菌20 min， 待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37°C下静置培养 18 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨30 g/L，酵母粉9. Og/L，葡萄糖 26 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸 钙10 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.0,121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后， 即为液体发酵培养基； e. 液体发酵：按照2. 5%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为 34 °C，振荡速度为120 r/min的条件下发酵12 h，即得到粪肠球菌发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:20的比例混合，得到粪肠球菌菌 粉，其活菌数在2. 0 X 101° cfu/g以上； (2) 枯草芽孢杆菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 °C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 8/1，似(：15.〇8/1;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节？!1至6.8，1211：灭菌2〇1^11，待培养基 冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养18 h，即得一级种子液； d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮80. 5kg，玉米粉10 kg，葡萄糖0. 5 kg,蛋白胨2 kg,NaCl 0.5 kg,硫酸猛0.5 kg,硫酸镁0.5 kg,碳酸?丐0.5 kg,料水比1:0. 8， 121 °C灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养； e. 发酵：以2. 5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布 封口，35°C下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次； f.将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2. OX 101° cfu/g，芽孢数达 1.4X101Q cfu/g; (3)将粪肠球菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微 生物制剂。
[0035] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉0. 1 kg、枯草芽孢杆菌菌粉0. 1 kg、酵母多糖0. 1 kg、玉米淀粉59. 9 kg。
[0036] 实施例9 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0037] 具体步骤如下： (1) 粪肠球菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37°C下培养24 h ; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1. 0 mL/L，磷酸氢二钾2. 0 g/L，柠檬酸三铵2. 0 g/L，硫酸镁0. 2 g/L，硫酸 锰0· 05 g/L，乙酸钠2. 0 g/L ;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7. 1，121 °C灭菌20 min， 待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37°C下静置培养 19 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨32 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖 28 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸 钙10 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.1，121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后， 即为液体发酵培养基； e. 液体发酵：按照4%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为35 °C，振荡速度为135 r/min的条件下发酵13 h，即得到粪肠球菌发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:30的比例混合，得到粪肠球菌菌 粉，其活菌数在2. 0 X 101° cfu/g以上； (2) 枯草芽孢杆菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 °C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 8/1，似(：15.08/1;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节？!1至7.0，1211：灭菌2〇1^11，待培养基 冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养21 h，即得一级种子液； d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮83kg，玉米粉12 kg，葡萄糖0. 5 kg,蛋白胨2 kg,NaCl 0.5 kg,硫酸猛0.5 kg,硫酸镁0.5 kg,碳酸?丐0.5 kg,料水比1:0. 8， 121 °C灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养； e. 发酵：以4%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封 口，36°C下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次； f.将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2. OX 101° cfu/g，芽孢数达 1.4X101Q cfu/g; (3)将粪肠球菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微 生物制剂。
[0038] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉3 kg、枯草芽孢杆菌菌粉2 kg、酵 母多糖0.1 kg、玉米淀粉63 kg。
[0039] 实施例10 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0040] 具体步骤如下： (1) 粪肠球菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37°C下培养24 h ; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1. 0 mL/L，磷酸氢二钾2. 0 g/L，柠檬酸三铵2. 0 g/L，硫酸镁0. 2 g/L，硫酸 锰0.05 g/L，乙酸钠2.0 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7. 2,121 °C灭菌20 min， 待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37°C下静置培养 20 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨34 g/L，酵母粉11 g/L，葡萄糖 30 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸 钙10 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.2,121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后， 即为液体发酵培养基； e. 液体发酵：按照5. 0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为 37 °C，振荡速度为150 r/min的条件下发酵14 h，即得到粪肠球菌发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:40的比例混合，得到粪肠球菌菌 粉，其活菌数在2. 0 X 101° cfu/g以上； (2) 枯草芽孢杆菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 °C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 8/1，似(：15.08/1;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节？!1至7.2，1211：灭菌2〇1^11，待培养基 冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养24 h，即得一级种子液； d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮85. 5 kg，玉米粉15 kg，葡萄糖0. 5 kg,蛋白胨2 kg,NaCl 0.5 kg,硫酸猛0.5 kg,硫酸镁0.5 kg,碳酸?丐0.5 kg,料水比1:0. 8， 121 °C灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养； e. 发酵：以5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封 口，38°C下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次； f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2. OX 101° cfu/g，芽孢数达 1.4X101Q cfu/g; (3)将粪肠球菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微 生物制剂。
[0041] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉6 kg、枯草芽孢杆菌菌粉4kg、酵 母多糖0.1 kg、玉米淀粉66 kg。
[0042] 实施例11 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0043] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉9 kg、枯草芽孢杆菌菌粉6kg、酵 母多糖0.1 kg、玉米淀粉69 kg。
[0044] 其他同实施例8。
[0045] 实施例12 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0046] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉12 kg、枯草芽孢杆菌菌粉8kg、酵 母多糖0.1 kg、玉米淀粉72 kg。
[0047] 其他同实施例8。
[0048] 实施例13 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0049] 步骤（3)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉15 kg、枯草芽孢杆菌菌粉10kg、 酵母多糖0. 1 kg、玉米淀粉74. 9 kg。
[0050] 其他同实施例8。
[0051] 实施例14: 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0052] 具体步骤如下： (1)酿酒酵母菌种培养： a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30°C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，磷酸氢二钾 1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至5. 9,121 °C灭菌20 min，待 培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养22 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖110 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨 28 g/L、酵母粉 10 g/L、KH2P04 1.0 g/L、K2HP04 10 g/L、MgS04 1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L，用 氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至5. 9,121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培 养基； e. 液体发酵：按照5. 0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为 27 °C，振荡速度为180 r/min下发酵16 h，即得到酿酒酵母发酵液； f.将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:5的比例混合，得到酿酒酵母菌 粉，其活菌数在1. 〇 X 101° cfu/g以上； (2) 枯草芽孢杆菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 °C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 8/1，似(：15.〇8/1;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节？!1至6.8，1211：灭菌2〇1^11，待培养基 冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养18 h，即得一级种子液； d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮80. 5kg，玉米粉10 kg，葡萄糖0. 5 kg，蛋白胨2份，NaCl 0. 5 kg，硫酸锰0. 5 kg，硫酸镁0. 5 kg，碳酸钙0. 5 kg，料水比1:0. 8， 121 °C灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养； e. 发酵：以2. 5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布 封口，35°C下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次； f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2. OX 101° cfu/g，芽孢数达 1.4X101Q cfu/g; (3) 将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均 匀，即为复合微生物制剂。
[0053] 步骤（3)中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉0. 1 kg、枯草芽孢杆菌菌粉0. 1 kg、酵母多糖0. 1 kg、玉米淀粉59. 9 kg。
[0054] 实施例15 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0055] 具体步骤如下： (1)酿酒酵母菌种培养： a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30°C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，磷酸氢二钾 1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0,121 °C灭菌20 min，待 培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养23 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖115 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨 30 g/L、酵母粉 10 g/L、KH2P04 1.0 g/L、K2HP04 10 g/L、MgS04 1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L，用 氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6. 0,121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培 养基； e. 液体发酵：按照7. 5%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为 28 °C，振荡速度为190 r/min下发酵17 h，即得到酿酒酵母发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:7. 5的比例混合，得到酿酒酵母 菌粉，其活菌数在1. ο X 101° Cfu/g以上； (2) 枯草芽孢杆菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 °C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 8/1，似(：15.08/1;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节？!1至7.0，1211：灭菌2〇1^11，待培养基 冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养21 h，即得一级种子液； d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮83kg，玉米粉12 kg，葡萄糖0. 5 kg,蛋白胨2 kg,NaCl 0.5 kg,硫酸猛0.5 kg,硫酸镁0.5 kg,碳酸?丐0.5 kg,料水比1:0. 8， 121 °C灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养； e. 发酵：以4%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封 口，37°C下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次； f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2. OX 101° cfu/g，芽孢数达 1.4 X 101° cfu/g; (3) 将酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微 生物制剂。
[0056] 步骤（3)中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉3kg、枯草芽孢杆菌菌粉2 kg、酵 母多糖0.1 kg、玉米淀粉63 kg。
[0057] 实施例16 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0058] 具体步骤如下： (1) 酿酒酵母菌种培养： a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30°C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，磷酸氢二钾 1.〇8/1，硫酸镁0.58/1;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节？!1至6.1，1211：灭菌2〇1^11，待 培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养24 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖120 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨 32 g/L、酵母粉 10 g/L、KH2P04 1.0 g/L、K2HP04 10 g/L、MgS04 1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L，用 氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6. 1，121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培 养基； e. 液体发酵：按照10%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为 30 °C，振荡速度为200 r/min下发酵18 h，即得到酿酒酵母发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:10的比例混合，得到酿酒酵母菌 粉，其活菌数在1. 〇 X 101° cfu/g以上； (2) 枯草芽孢杆菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 °C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 8/1，似(：15.08/1;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节？!1至7.2，1211：灭菌2〇1^11，待培养基 冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养24 h，即得一级种子液； d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮85. 5 kg，玉米粉15 kg，葡萄糖0. 5 kg,蛋白胨2 kg,NaCl 0.5 kg,硫酸猛0.5 kg,硫酸镁0.5 kg,碳酸?丐0.5 kg,料水比1:0. 8， 121 °C灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养； e. 发酵：以5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封 口，38°C下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次； f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2. OX 101° cfu/g，芽孢数达 1.4X101Q cfu/g; (3)将酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微 生物制剂。
[0059] 步骤（3)中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉6 kg、枯草芽孢杆菌菌粉4 kg、酵 母多糖0.1 kg、玉米淀粉66 kg。
[0060] 实施例17 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0061] 步骤（3)中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉9 kg、枯草芽孢杆菌菌粉6 kg、酵 母多糖0.1 kg、玉米淀粉69 kg。
[0062] 其他同实施例14。
[0063] 实施例18 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0064] 步骤（3)中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉12 kg、枯草芽孢杆菌菌粉8 kg、 酵母多糖o.l kg、玉米淀粉72 kg。
[0065] 其他同实施例14。
[0066] 实施例19 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米 淀粉。
[0067] 步骤（3)中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉15 kg、枯草芽孢杆菌菌粉10 kg、 酵母多糖0. 1 kg、玉米淀粉74. 9 kg。
[0068] 其他同实施例14。
[0069] 实施例2〇 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至 少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
[0070] 步骤（4)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉0. 1 kg、酿酒酵母菌粉0. 1 kg、枯 草芽孢杆菌菌粉o.l kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉59. 9 kg。
[0071] 其他同实施例1。
[0072] 实施例21 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至 少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
[0073] 步骤（4)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉3 kg、酿酒酵母菌粉3 kg、枯草芽 孢杆菌菌粉2 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉63 kg。
[0074] 其他同实施例1。
[0075] 实施例22 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至 少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
[0076] 步骤（4)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉6 kg、酿酒酵母菌粉6 kg、枯草芽 孢杆菌菌粉4 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉66 kg。
[0077] 其他同实施例1。
[0078] 实施例23 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至 少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
[0079] 步骤（4)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉9 kg、酿酒酵母菌粉9 kg、枯草芽 孢杆菌菌粉6 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉69 kg。
[0080] 其他同实施例1。
[0081] 实施例24: 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至 少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
[0082] 步骤（4)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉12 kg、酿酒酵母菌粉12 kg、枯草 芽孢杆菌菌粉8 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉72 kg。
[0083] 其他同实施例1。
[0084] 实施例25 : 一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至 少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
[0085] 步骤（4)中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉15 kg、酿酒酵母菌粉15 kg、枯草 芽孢杆菌菌粉10 kg、酵母多糖0. 1 kg、玉米淀粉74. 9 kg。
[0086] 其他同实施例1。
[0087] 临床试验 试验例1 :复合微生物制剂在肉鸡中的应用 本次试验的复合微生物制剂为实施例7制备的产品，选用1日龄健康肉鸡雏3000只， 随机分为3组，每组1000只。对照组为日粮中不添加任何添加剂；试验组为全程日粮中添 加0. 1%微生物制剂，饲用管理和饲料变更均相同。于28日龄时，每组随机抽取体重相近的 鸡8只(每组重复4只)，空腹称个体体重后屠宰，摘取胸腺、脾脏和法氏囊，剔除脂肪后称鲜 重。计算胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数，免疫器官指数以免疫器官鲜重（g)占每1 kg 体重的此例表示，即：免疫器官指数=免疫器官质量+体重X 100%。于42日龄称重、结料， 计算日采食量、日增重和饲料转化率；记录全期试验鸡只死亡情况。
[0088] 如表1和表2所示，试验结果表明，试验组肉鸡的日增重和日采食量高于对照组肉 鸡，而料肉比较低；试验组的肉鸡死亡率也低于对照组肉鸡；在免疫器官指数方面，对照组 肉鸡的脾脏指数、法氏囊指数和胸腺指数均高于对照组肉鸡。说明复合微生物制剂可改善 肉鸡肠道微生态平衡，促进有益菌的增殖，增强了肉鸡的抗病能力，提高饲料利用率，降低 料肉比。
[0089] 表1复合微生物制剂对肉鸡生长性能的影响
表2复合微生物制剂对肉鸡免疫器官指数的影响
试验例2 :复合微生物制剂在猪中的应用 本次试验的复合微生物制剂为实施例25制备的产品，选用50日龄体重相近、健康的 杜-长-大三元杂种猪100头，随机分为2组，每组50头。对照组为日粮中不添加任何添 加剂；试验组为日粮中添加0. 1%的复合微生物制剂。分别在65、80、95日龄时采血，测定血 清中的IgA、IgG和外周淋巴细胞变化情况。
[0090] 如表3所示，试验表明，试验组猪血清中IgA、IgG及T淋巴细胞0D值均均高于对 照组，说明复合微生物制剂可以提高猪的免疫力，原因在于复合微生物制剂中的益生菌在 猪肠道内增殖并产生细菌素等有益物质，改善肠道内微生态平衡，抑制了病原菌的生长，从 而增强猪的免疫能力。
[0091] 表3复合微生物制剂对猪免疫性能的影响
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不 脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种复合微生物制剂，其特征在于：包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草 芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。2. 根据权利要求1所述的一种复合微生物制剂，其特征在于：由以下重量份的原料组 成：粪肠球菌菌粉〇. 1~15份、酿酒酵母菌粉0. 1~15份、枯草芽孢杆菌菌粉0. 1~10份、酵母 多糖〇. 1份、玉米淀粉59. 9~74. 9份。3. 根据权利要求1或2所述的一种复合微生物制剂的制备方法，其特征在于：具体步 骤如下： (1) 粪肠球菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37°C下培养24 h ; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1. 0 mL/L，磷酸氢二钾2. 0 g/L，柠檬酸三铵2. 0 g/L，硫酸镁0. 2 g/L，硫酸 锰0.05 g/L，乙酸钠2.0 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.1 ±0.1，121 °C灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37°C下静置培养 18-20 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨30~34 g/L，酵母粉9.0~11 g/L， 葡萄糖26~30 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸钙10 g/L ;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7. 1±0. 1，121°C下灭菌20 min， 待培养基冷却后，即为液体发酵培养基； e. 液体发酵：按照2. 5~5. 0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温 度为34~37 °C，振荡速度为120~150 r/min的条件下发酵12~14 h，即得到粪肠球菌发酵 液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:20~40的比例混合，得到粪肠球 菌菌粉，其活菌数在2. 0 X 101° cfu/g以上； (2) 酿酒酵母菌种培养： a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30°C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，磷酸氢二钾 1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6. 0±0.1，121 °C灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养22~24 h，即得一级种子液； d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖110~120 g/L、红砂糖20 g/L、蛋 白胨 28~32 g/L、酵母粉 10 g/L、KH2P04 1.0 g/L、K2HP04 10 g/L、MgS04 1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6. 0±0. 1，121°C下灭菌20 min，待培养基冷却后， 即为发酵培养基； e. 液体发酵：按照5. (FdO%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温 度为27~30 °C，振荡速度为180~200 r/min下发酵16~18 h，即得到酿酒酵母发酵液； f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:5~10的比例混合，得到酿酒酵母 菌粉，其活菌数在1. 〇 X 101° cfu/g以上； (3) 枯草芽孢杆菌菌种培养： a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 °C培养24 h; b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L;用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7·0±0·2，121 °C灭菌20 min，待 培养基冷却后，即可作为一级种子培养基； c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35°C， 振荡速度为150 r/min的条件下培养18~24 h，即得一级种子液； d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮80. 5~85. 5份，玉米粉10~15份，葡 萄糖0. 5份，蛋白胨2份，NaCl 0. 5份，硫酸锰0. 5份，硫酸镁0. 5份，碳酸钙0. 5份，料水 比1:0. 8,121 °C灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养； e. 发酵：以2. 5°Ρ5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层 纱布封口，35~38°C下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次； f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2. OX 101° cfu/g，芽孢数达 1.4X101Q cfu/g; (4) 将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均 匀，即为复合微生物制剂。
【文档编号】C12R1/125GK105985916SQ201510040788
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月28日
【发明人】张要齐, 宋志元, 张新蕾, 朱静静
【申请人】河南惠通天下动物药业有限公司