相关申请的交叉引用本申请要求以下美国临时申请号的权益：2013年9月25日提交的61/882,211、2013年9月25日提交的61/882,214、2013年9月25日提交的61/882,219、2013年9月25日提交的61/882,220、2013年9月25日提交的61/882,225、2013年9月25日提交的61/882,229、2013年9月25日提交的61/882,232、2013年9月25日提交的61/882,234、2013年9月25日提交的61/882,235、2013年9月25日提交的61/882,240、2013年9月25日提交的61/882,129、2013年9月25日提交的61/882,243、2013年9月25日提交的61/882,246、2013年9月25日提交的61/882,250、2013年9月25日提交的61/882,254、2013年9月25日提交的61/882,260、2013年9月25日提交的61/882,264、2013年9月25日提交的61/882,267、2013年9月25日提交的61/882,271、2013年9月25日提交的61/882,274、2013年9月25日提交的61/882,180、2013年9月25日提交的61/882,189、2013年9月25日提交的61/882,198、2013年9月25日提交的61/882,212、2013年9月25日提交的61/882,222、2013年9月25日提交的61/882,300、2013年9月25日提交的61/882,295和2013年9月25日提交的61/882,305；所述美国临时申请的整个公开内容据此出于所有目的以引用的方式整体并入本文。背景膳食性蛋白质是为人类健康和生长所必需的营养物。世界卫生组织建议当处于能量平衡和重量稳定时，膳食性蛋白质应占能量摄取的约10至15％。各个国家的平均每日蛋白质摄取量指示这些推荐与全世界消耗的蛋白质的量一致。当在能量平衡下消耗时，平均20至30％的能量来自蛋白质的餐食代表高蛋白质膳食。身体不能合成为健康和生长所必需的某些氨基酸，并且代之以必须从食物获得它们。称为“必需氨基酸”的这些氨基酸是组氨酸(h)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、赖氨酸(k)、甲硫氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、苏氨酸(t)、色氨酸(w)和缬氨酸(v)。提供所有必需氨基酸的膳食性蛋白质来源被称为“高品质”蛋白质。诸如肉、鱼、家禽、蛋和乳制品的动物性食物通常被认为是提供必需氨基酸的良好平衡的高品质蛋白质来源。酪蛋白(casein)(一种通常见于哺乳动物奶中，占牛奶中的蛋白质的80％的蛋白质)和乳清(在奶已凝固和应变之后剩余的呈液体形式的蛋白质)是高品质膳食性蛋白质的主要来源。不提供必需氨基酸的良好平衡的食物被称为“低品质”蛋白质来源。大多数水果和蔬菜是蛋白质的不良来源。包括菜豆、豌豆、小扁豆、坚果和谷物(诸如小麦)的一些植物性食物是蛋白质的较好来源，但可具有过敏原性问题。大豆，作为一种由黄豆制造的植物性蛋白质，被一些人视为高品质蛋白质。关于重量减轻的高蛋白质膳食研究已显示蛋白质积极影响能量消耗和瘦性身体质量。进一步研究已显示就含有的能量的至少5％来自蛋白质的膳食而言，过度进食会产生显著较小重量增加，并且高蛋白质膳食会降低能量摄取。通常见于食物中的蛋白质未必以高效方式提供满足诸如人的哺乳动物的氨基酸需求的氨基酸组成。结果是为达到各必需氨基酸的最小需求，在膳食中消耗的总蛋白质的量必须大于如果膳食性蛋白质的品质较高所将需要的量。通过提高膳食中的蛋白质的品质，有可能相较于包括品质较低的蛋白质的膳食，降低必须消耗的蛋白质的总量。在传统上，合乎需要的氨基酸混合物(诸如包含必需氨基酸的混合物)已通过水解必需氨基酸的水平相对较高的蛋白质(诸如乳清蛋白质)和/或通过以任选也包括诸如乳清的水解蛋白质的混合物形式组合游离氨基酸来提供。这个类型的混合物可具有苦味(即不合需要的口感)和不良可溶性，并且可被视为不适于某些用途或不合乎某些用途的需要。因此，所述混合物有时包括调味剂以掩蔽游离氨基酸和/或水解蛋白质的味道。在一些情况下，发现其中一定比例的氨基酸内含物由多肽或蛋白质提供的组合物具有的味道好于总氨基酸的较高比例以游离氨基酸和/或某些水解蛋白质形式提供的组合物。然而，所述组合物的可用性已受到限制，因为营养性制剂在传统上已由从天然食物产品分离的蛋白质(诸如从奶分离的乳清或从大豆分离的大豆蛋白质)制得。那些蛋白质的氨基酸分布未必满足哺乳动物的氨基酸需求。此外，商品蛋白质通常由蛋白质和/或蛋白质水解物的混合物组成，所述混合物在它们的蛋白质组成方面可变化，由此导致关于它们的营养价值的不可预测性。此外，所述高品质蛋白质的来源的数目有限已意味着仅某些氨基酸组合可以蛋白质形式大规模用于摄取。为供给高品质动物性蛋白质来源(诸如酪蛋白和乳清、蛋以及肉)以及植物性蛋白质(诸如大豆)所需的农业方法也需要大量能量输入，并且具有潜在有害环境影响。因此，在某些情况下，将适用的是具有供给供哺乳动物消耗的蛋白质的替代性来源和方法。可增强营养性蛋白质的效用的一个特征是它的溶解度。溶解度较高的营养性蛋白质可展现合乎需要的特征，诸如增加的稳定性、抗聚集性和合乎需要的味道分布。举例来说，展现溶解度增强的营养性蛋白质可被配制成呈相对较低体积的溶液形式的包括高浓度营养性蛋白质的饮料或液体制剂，由此递送每单位体积较大剂量的蛋白质营养。可溶性营养性蛋白质可适用于其中使用者(例如运动员)想要在身体活动之前、期间或之后摄取营养性蛋白质的运动饮料或恢复饮料中。展现溶解度增强的营养性蛋白质也可特别适用于其中受试者(例如患者或年长人士)需要蛋白质营养，但不能消耗固体食物或大体积的液体的临床环境中。发明概述在一个方面，本发明提供预防或降低人受试者的肌肉质量和/或肌肉功能的损失的方法，其包括以下步骤：i)鉴定罹患糖尿病或糖尿病前期病状或处于糖尿病或糖尿病前期病状的风险下的人受试者，以及ii)以足以预防或降低肌肉质量和/或肌肉功能的损失的量向所述人受试者施用营养性制剂，其中所述营养性制剂包括分离的营养性多肽，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述制剂包括至少1.0g所述营养性多肽；其中所述制剂以液体、半液体或凝胶形式以不大于约500ml的体积或以固体或半固体形式以不大于约200g的总质量存在；并且其中所述制剂大致上不含非可食产品。在一个实施方案中，人受试者罹患糖尿病或糖尿病前期病状，并且已接受一个或多个剂量的药物组合物，其中施用所述药物组合物使肌肉质量和/或肌肉功能的损失的风险增加。在一个实施方案中，人受试者罹患糖尿病或糖尿病前期病状，并且已接受一个或多个剂量的药物组合物，其中i)所述疾病、病症或病状或ii)施用所述药物组合物或i)与ii)两者使肌肉质量和/或肌肉功能的损失的风险增加。在另一方面，本发明提供治疗罹患糖尿病或糖尿病前期病状的人受试者的肌肉损耗疾病、病症或病状的方法，其包括以足以治疗所述疾病、病症或病状的量向所述人受试者施用营养性制剂的步骤，其中所述营养性制剂包括分离的营养性多肽，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述制剂包括至少1.0g所述营养性多肽。在一个实施方案中，按照足以在不存在由受试者消耗农业源性食物产品下向人受试者提供实质性蛋白质营养的剂量时程施用制剂。在另一方面，本发明提供降低人受试者显现特征在于蛋白质营养失调或因蛋白质营养失调而加剧的肌肉损耗疾病、病症或病状的风险的方法，其包括以下步骤：(i)将所述人受试者鉴定为处于显现糖尿病或糖尿病前期病状的风险下；以及(ii)以一个或多个剂量施用包括分离的营养性多肽的营养性制剂，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述制剂包括至少1.0g所述营养性多肽。在一个实施方案中，人受试者处于显现营养不良或蛋白质营养不良的风险下。在一个实施方案中，人受试者展现肌肉减少症和/或恶病质。在一个实施方案中，人受试者患有炎症性反应或自体免疫病症。在一个实施方案中，人受试者患有心血管疾病。在一个实施方案中，人受试者是超重或肥胖的。普拉德威尔斯病(praderwills)或其它罕见疾病会引起肥胖症吗？在一个实施方案中，人受试者已经受手术程序或已遭受创伤性损伤。在一个实施方案中，营养性制剂与运动方案联合施用。在一个实施方案中，营养性制剂作为用以施用药物剂和/或手术程序的辅助物来施用。在一个实施方案中，受试者在手术程序之后被固定或活动性受损。在一个实施方案中，营养性制剂作为用以施用药物组合物的辅助物来施用。在一个实施方案中，人受试者患有骨质疏松或处于显现骨质疏松的风险下。在另一方面，本发明提供增加罹患糖尿病或糖尿病前期病状的人受试者的肌肉合成代谢的方法，其包括以一个或多个剂量向人受试者施用包括分离的营养性多肽的营养性制剂，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述制剂包括至少1.0g所述营养性多肽，其中所述营养性制剂在足以在其施用之后增加所述受试者的肌肉合成代谢的频率下向所述人受试者施用。在另一方面，本发明提供配制用于治疗人受试者的营养性产品的方法，其包括以下步骤：向罹患糖尿病或糖尿病前期病状或处于糖尿病或糖尿病前期病状的风险下的人受试者提供包括分离的营养性多肽的营养性组合物，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；以及与可接受的赋形剂一起配制所述营养性多肽，其中所述分离的营养性多肽在ph7下具有至少12.5g/l的水溶解度，并且其中所述分离的营养性多肽具有小于30分钟的模拟胃消化半衰期。在一个实施方案中，方法进一步包括组合营养性组合物与促味剂、营养性碳水化合物和营养性脂质中的至少一种，其中产品以液体、半液体或凝胶形式以不大于约500ml的体积或以固体或半固体形式以不大于约200g的总质量存在。在一个实施方案中，产品大致上不含非可食产品。在另一方面，本发明提供用于选择营养性多肽的氨基酸序列的方法，其中所述营养性多肽适用于治疗罹患糖尿病或糖尿病前期病状或处于糖尿病或糖尿病前期病状的风险下的人受试者，所述方法包括i)提供包括多种氨基酸序列的氨基酸序列文库，ii)在所述文库中鉴定一种或多种包括至少一种目标氨基酸的氨基酸序列，以及iii)选择所述一种或多种鉴定的氨基酸序列，由此选择营养性多肽的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供用于选择营养性多肽的氨基酸序列的方法，其中所述营养性多肽适用于治疗罹患糖尿病或糖尿病前期病状或处于糖尿病或糖尿病前期病状的风险下的人受试者，所述方法包括i)提供包括多种氨基酸序列的氨基酸序列文库，ii)在所述文库中鉴定一种或多种包括至少一种目标氨基酸残基与总氨基酸残基的比率大于或等于所选比率的氨基酸序列，以及iii)选择所述一种或多种鉴定的氨基酸序列，由此选择营养性多肽的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供用于选择营养性多肽的氨基酸序列的方法，其中所述营养性多肽适用于治疗罹患糖尿病或糖尿病前期病状或处于糖尿病或糖尿病前期病状的风险下的人受试者，所述方法包括i)提供包括多种氨基酸序列的氨基酸序列文库，ii)在所述文库中鉴定一种或多种包括至少一种目标氨基酸残基与总氨基酸残基的比率小于或等于所选比率的氨基酸序列，以及iii)选择所述一种或多种鉴定的氨基酸序列，由此选择营养性多肽的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供用于治疗或预防罹患糖尿病或糖尿病前期病状的人受试者的肌肉损耗疾病、病症或病状的营养性制剂，其包括分离的营养性多肽，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述营养性多肽以足以向蛋白质吸收能力降低的人受试者提供营养性益处的量存在。在一个实施方案中，多肽序列包括必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率至少34％，并且其中多肽序列是营养全面的。在一个实施方案中，存在于营养性多肽中的必需氨基酸是实质上生物可用的。在一个实施方案中，分离的营养性多肽在ph7下具有至少12.5g/l的水溶解度。在一个实施方案中，分离的营养性多肽具有小于30分钟的模拟胃消化半衰期。在一个实施方案中，营养性多肽被配制在药学上可接受的载体中。在一个实施方案中，营养性多肽被配制在食物或食物成分中或被配制成食物或食物成分。在一个实施方案中，营养性多肽被配制在饮料或饮料成分中或被配制成饮料或饮料成分。在一个实施方案中，氨基酸序列编码具有主要活性的酶，并且其中营养性多肽实质上缺乏所述主要活性。在一个实施方案中，制剂以液体、半液体或凝胶形式以不大于约500ml的体积或以固体或半固体形式以不大于约200g的总质量存在。在一个实施方案中，营养性多肽包括与长度是至少50个氨基酸的可食用物种多肽或其片段至少约90％同一的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在至少25个氨基酸上与已知过敏原具有小于约50％同一性。在一个实施方案中，制剂进一步包括选自以下的组分：促味剂、蛋白质混合物、多肽、肽、游离氨基酸、碳水化合物、脂质、矿物质或矿物质来源、维生素、补充剂、生物体、药物和赋形剂。在一个实施方案中，人受试者罹患胃肠蛋白质吸收不良疾病、病症或病状。在一个实施方案中，氨基酸序列含有的必需氨基酸的密度约等于或大于存在于全长参照营养性多肽或含有参照多肽的混合物中的必需链氨基酸的密度。在一个实施方案中，氨基酸序列含有的至少一种选自由亮氨酸、精氨酸和谷氨酰胺组成的组的氨基酸的密度约等于或大于存在于全长参照营养性多肽或含有参照多肽的混合物中的所选氨基酸的密度。在另一方面，本发明提供包括至少一种营养性多肽的制剂，所述营养性多肽包括与能够从微生物分泌的可食用物种多肽至少约99％同一的氨基酸序列，其中所述营养性多肽以足以提供等于或大于参照每日蛋白质摄取值的至少约2％的营养性益处的量存在于制剂中。在另一方面，本发明提供用于治疗或预防罹患糖尿病或糖尿病前期病状的人受试者的肌肉损耗疾病、病症或病状的营养性制剂，包括营养性氨基酸组合物，所述营养性氨基酸组合物包括多种游离氨基酸，所述多种游离氨基酸包括的氨基酸比率与本文提供的多肽序列的氨基酸比率至少约90％同一，其中所述营养性氨基酸组合物是营养全面的；其中所述营养性氨基酸组合物以足以向蛋白质吸收能力降低的人受试者提供营养性益处的量存在。在一个实施方案中，制剂以液体、半液体或凝胶形式以不大于约500ml的体积或以固体或半固体形式以不大于约200g的总质量存在。在另一方面，本发明提供预防或降低超重或肥胖人受试者的肌肉质量和/或肌肉功能的损失的方法，其包括以下步骤：i)鉴定罹患肥胖症或处于肥胖症的风险下的人受试者，以及ii)以足以预防或降低肌肉质量和/或肌肉功能的损失的量向所述人受试者施用营养性制剂，其中所述营养性制剂包括分离的营养性多肽，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述制剂包括至少1.0g所述营养性多肽；其中所述制剂以液体、半液体或凝胶形式以不大于约500ml的体积或以固体或半固体形式以不大于约200g的总质量存在；并且其中所述制剂大致上不含非可食产品。在一个实施方案中，人受试者罹患肥胖症，并且已接受一个或多个剂量的药物组合物，其中施用所述药物组合物使肌肉质量和/或肌肉功能的损失的风险增加。在一个实施方案中，人受试者罹患肥胖症，并且已接受一个或多个剂量的药物组合物，其中i)所述疾病、病症或病状或ii)施用所述药物组合物或i)与ii)两者使肌肉质量和/或肌肉功能的损失的风险增加。在另一方面，本发明提供治疗罹患肥胖症的人受试者的肌肉损耗疾病、病症或病状的方法，其包括以足以治疗所述疾病、病症或病状的量向所述人受试者施用营养性制剂的步骤，其中所述营养性制剂包括分离的营养性多肽，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述制剂包括至少1.0g所述营养性多肽。在一个实施方案中，按照足以在不存在由受试者消耗农业源性食物产品下向人受试者提供实质性蛋白质营养的剂量时程施用制剂。在另一方面，本发明提供降低人受试者显现特征在于蛋白质营养失调或因蛋白质营养失调而加剧的肌肉损耗疾病、病症或病状的风险的方法，其包括以下步骤：(i)将所述人受试者鉴定为处于显现肥胖症的风险下；以及(ii)以一个或多个剂量施用包括分离的营养性多肽的营养性制剂，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述制剂包括至少1.0g所述营养性多肽。在一个实施方案中，人受试者处于显现营养不良或蛋白质营养不良的风险下。在一个实施方案中，人受试者展现肌肉减少症和/或恶病质。在一个实施方案中，人受试者患有炎症性反应或自体免疫病症。在一个实施方案中，人受试者患有心血管疾病。在一个实施方案中，人受试者患有糖尿病或糖尿病前期病状。在一个实施方案中，人受试者已经受手术程序或已遭受创伤性损伤。在一个实施方案中，营养性制剂与运动方案联合施用。在一个实施方案中，营养性制剂作为用以施用药物剂和/或手术程序的辅助物来施用。在一个实施方案中，受试者在手术程序之后被固定或活动性受损。在一个实施方案中，营养性制剂作为用以施用药物组合物的辅助物来施用。在一个实施方案中，人受试者患有骨质疏松或处于显现骨质疏松的风险下。在另一方面，本发明提供增加罹患肥胖症的人受试者的肌肉合成代谢的方法，其包括以一个或多个剂量向人受试者施用包括分离的营养性多肽的营养性制剂，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述制剂包括至少1.0g所述营养性多肽，其中所述营养性制剂在足以在其施用之后增加所述受试者的肌肉合成代谢的频率下向所述人受试者施用。在另一方面，本发明提供配制用于治疗人受试者的营养性产品的方法，其包括以下步骤：向罹患肥胖症或处于肥胖症的风险下的人受试者提供包括分离的营养性多肽的营养性组合物，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；以及与可接受的赋形剂一起配制所述营养性多肽，其中所述分离的营养性多肽在ph7下具有至少12.5g/l的水溶解度，并且其中所述分离的营养性多肽具有小于30分钟的模拟胃消化半衰期。在一个实施方案中，方法进一步包括组合营养性组合物与促味剂、营养性碳水化合物和营养性脂质中的至少一种，其中产品以液体、半液体或凝胶形式以不大于约500ml的体积或以固体或半固体形式以不大于约200g的总质量存在。在一个实施方案中，产品大致上不含非可食产品。在另一方面，本发明提供用于选择营养性多肽的氨基酸序列的方法，其中所述营养性多肽适用于治疗罹患肥胖症或处于肥胖症的风险下的人受试者，所述方法包括i)提供包括多种氨基酸序列的氨基酸序列文库，ii)在所述文库中鉴定一种或多种包括至少一种目标氨基酸的氨基酸序列，以及iii)选择所述一种或多种鉴定的氨基酸序列，由此选择营养性多肽的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供用于选择营养性多肽的氨基酸序列的方法，其中所述营养性多肽适用于治疗罹患肥胖症或处于肥胖症的风险下的人受试者，所述方法包括i)提供包括多种氨基酸序列的氨基酸序列文库，ii)在所述文库中鉴定一种或多种包括至少一种目标氨基酸残基与总氨基酸残基的比率大于或等于所选比率的氨基酸序列，以及iii)选择所述一种或多种鉴定的氨基酸序列，由此选择营养性多肽的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供用于选择营养性多肽的氨基酸序列的方法，其中所述营养性多肽适用于治疗罹患肥胖症或处于肥胖症的风险下的人受试者，所述方法包括i)提供包括多种氨基酸序列的氨基酸序列文库，ii)在所述文库中鉴定一种或多种包括至少一种目标氨基酸残基与总氨基酸残基的比率小于或等于所选比率的氨基酸序列，以及iii)选择所述一种或多种鉴定的氨基酸序列，由此选择营养性多肽的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供用于治疗或预防罹患肥胖症的人受试者的肌肉损耗疾病、病症或病状的营养性制剂，其包括分离的营养性多肽，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述营养性多肽以足以向蛋白质吸收能力降低的人受试者提供营养性益处的量存在。在一个实施方案中，多肽序列包括必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率至少34％，并且其中多肽序列是营养全面的。在一个实施方案中，存在于营养性多肽中的必需氨基酸是实质上生物可用的。在一个实施方案中，分离的营养性多肽在ph7下具有至少12.5g/l的水溶解度。在一个实施方案中，分离的营养性多肽具有小于30分钟的模拟胃消化半衰期。在一个实施方案中，营养性多肽被配制在药学上可接受的载体中。在一个实施方案中，营养性多肽被配制在食物或食物成分中或被配制成食物或食物成分。在一个实施方案中，营养性多肽被配制在饮料或饮料成分中或被配制成饮料或饮料成分。在一个实施方案中，氨基酸序列编码具有主要活性的酶，并且其中营养性多肽实质上缺乏所述主要活性。在一个实施方案中，制剂以液体、半液体或凝胶形式以不大于约500ml的体积或以固体或半固体形式以不大于约200g的总质量存在。在一个实施方案中，营养性多肽包括与长度是至少50个氨基酸的可食用物种多肽或其片段至少约90％同一的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在至少25个氨基酸上与已知过敏原具有小于约50％同一性。在一个实施方案中，制剂进一步包括选自以下的组分：促味剂、蛋白质混合物、多肽、肽、游离氨基酸、碳水化合物、脂质、矿物质或矿物质来源、维生素、补充剂、生物体、药物和赋形剂。在一个实施方案中，人受试者罹患胃肠蛋白质吸收不良疾病、病症或病状。在一个实施方案中，氨基酸序列含有的必需氨基酸的密度约等于或大于存在于全长参照营养性多肽或含有参照多肽的混合物中的必需链氨基酸的密度。在一个实施方案中，氨基酸序列含有的至少一种选自由亮氨酸、精氨酸和谷氨酰胺组成的组的氨基酸的密度约等于或大于存在于全长参照营养性多肽或含有参照多肽的混合物中的所选氨基酸的密度。在另一方面，本发明提供包括至少一种营养性多肽的制剂，所述营养性多肽包括与能够从微生物分泌的可食用物种多肽至少约99％同一的氨基酸序列，其中所述营养性多肽以足以提供等于或大于参照每日蛋白质摄取值的至少约2％的营养性益处的量存在于制剂中。在另一方面，本发明提供用于治疗或预防罹患肥胖症的人受试者的肌肉损耗疾病、病症或病状的营养性制剂，包括营养性氨基酸组合物，所述营养性氨基酸组合物包括多种游离氨基酸，所述多种游离氨基酸包括的氨基酸比率与本文提供的多肽序列的氨基酸比率至少约90％同一，其中所述营养性氨基酸组合物是营养全面的；其中所述营养性氨基酸组合物以足以向蛋白质吸收能力降低的人受试者提供营养性益处的量存在。在一个实施方案中，制剂以液体、半液体或凝胶形式以不大于约500ml的体积或以固体或半固体形式以不大于约200g的总质量存在。在另一方面，本发明提供诱导超重或肥胖人受试者的卡路里限制的方法，其包括以下步骤：i)鉴定罹患肥胖症或处于肥胖症的风险下或超重的人受试者，以及ii)以足以促进卡路里限制的量向所述人受试者施用营养性制剂，其中所述营养性制剂包括分离的营养性多肽，所述分离的营养性多肽包括在至少约50个氨基酸上与本文提供的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述制剂包括至少1.0g所述营养性多肽；其中所述制剂以液体、半液体或凝胶形式以不大于约500ml的体积或以固体或半固体形式以不大于约200g的总质量存在；并且其中所述制剂大致上不含非可食产品。附图简述本发明的这些和其它特征、方面和优势将关于以下描述和附图而变得被更充分理解，其中：图1是说明对通过imac进行的seqid-00105纯化的sds-page分析的图像。图2是说明被预测会结合阴离子或阳离子交换树脂的营养性多肽的随ph而变的每个氨基酸净电荷的图。(1)seqid-00105、(2)seqid-00008、(3)seqid-00009、(4)seqid-00475、(5)seqid-00472、(6)seqid-00640、(7)seqid-00019。图3是说明示例性营养性多肽的在一定ph范围内的每个氨基酸总电荷的图。(1)seqid-00475、(2)seqid-00009、(3)seqid-00478、(4)seqid-00433、(5)seqid-00472。图4是说明seqid-00009的纯度随硫酸铵浓度而变的图。图5是说明sds-page分析的图像，所述分析说明相较于天然信号肽，在新信号肽下，seqid-00409(左)和seqid-00420(右)的分泌。图6是说明在刺激之后在上清液中检测的glp-1(7-36)的上清液浓度的图，误差棒是技术平行测定的标准偏差。图7是说明在媒介物、seqid-00105、精氨酸和seqid-00338的ogtt期间随时间的平均血糖值的图。显示的误差棒是平均值标准误差。图8是说明在急性seqid-00105、精氨酸和seqid-00338给药之后，从0至120分钟(左)以及从0至60分钟(右)积分的血糖的曲线下面积的图。图9是说明每个处理组n＝6只大鼠随时间的平均血浆胰岛素浓度的图。误差棒显示平均值标准误差。图10是说明所有处理组的在0-240和0-60分钟之间积分的血浆胰岛素曲线下面积的图。误差棒显示平均值标准误差。图11是说明每个处理组n＝6只大鼠随时间的平均血浆glp-1浓度的图。此处显示的误差棒对应于平均值标准误差。图12是说明随时间的平均血糖值的图。显示的误差棒是平均值标准误差。图13是说明各治疗组在葡萄糖激发时间(0分钟)与60分钟之间以及在时间0与120分钟之间的积分auc的图。显示的误差棒是平均值标准误差。图14是说明在媒介物和seqid-00105的情况下每个治疗组n＝6只大鼠以及在seqid-00338的情况下每个治疗组n＝5只大鼠在实验过程中的平均血浆胰岛素浓度的图。显示的误差棒是平均值标准误差。图15是说明媒介物、seqid-00105和seqid-00338在0与90分钟之间以及在0与60分钟之间的积分曲线下面积的图。此处显示的误差棒对应于平均值标准误差。图16是说明对于媒介物和seqid-00105而言每个治疗组n＝6只大鼠以及对于seqid-00338而言n＝5只大鼠在实验过程中的平均血浆glp-1浓度的图。此处显示的误差棒对应于平均值标准误差。图17是说明各治疗组的对于0-90和0-60分钟积分的glp-1(7-36)曲线下面积的图。此处显示的误差棒对应于平均值标准误差。图18是说明在媒介物、seqid-00105、阿格列汀和组合的ogtt期间的每个治疗组n＝6只大鼠的平均血糖值的图。此处显示的误差棒对应于平均值标准误差。图19是说明媒介物和在3种不同剂量下施用的seqid-00105的随时间的alphalisa血浆胰岛素的图。此处显示的误差棒是平均值标准误差。图20是说明媒介物以及seqid-00426、seqid-00338、seqid-00341的随时间的alphalisa血浆胰岛素的图。此处显示的误差棒是平均值标准误差。图21是说明seqid-00105在3种剂量下在0与240分钟之间以及在0与60分钟之间的血浆胰岛素浓度的积分曲线下面积的图。此处显示的误差棒是平均值标准误差。图22是说明媒介物、seqid-00426、seqid-00338和seqid-00341的在0与240分钟之间以及在0与60分钟之间的血浆胰岛素浓度的积分曲线下面积的图。此处显示的误差棒是平均值标准误差。图23是说明seqid-00423、seqid-00587、seqid-00105的随时间的alphalisa血浆胰岛素的图。此处显示的误差棒是平均值标准误差。图24是说明媒介物、seqid-00424、seqid-00425和seqid-00429的随时间的alphalisa血浆胰岛素的图。此处显示的误差棒是平均值标准误差。图25是说明媒介物、seqid-00423、seqid-00587和seqid-00105的在0与240分钟之间以及在0与60分钟之间的血浆胰岛素浓度的积分曲线下面积的图。此处显示的误差棒是平均值标准误差。图26是说明媒介物、seqid-00424、seqid-00425和seqid-00429的在0与240分钟之间以及在0与60分钟之间的血浆胰岛素浓度的积分曲线下面积的图。此处显示的误差棒是平均值标准误差。图27是说明媒介物以及seqid-00105、seqid-00240和seqid-00559的随时间的elisa血浆胰岛素的图。此处显示的误差棒是平均值标准误差。图28是说明媒介物、seqid-00105、seqid-00240和seqid-00559的在0与240分钟之间以及在0与60分钟之间的血浆胰岛素浓度的积分曲线下面积的图。此处显示的误差棒是平均值标准误差。图29是说明媒介物和seqid-00240(分别n＝4和n＝5只大鼠)的在4小时时间过程中的glp-2浓度的图。显示的误差棒是平均值标准误差。图30是说明在第一小时和全部4小时中的积分glp-2曲线下面积的图。显示的误差棒是95％置信区间。图31是说明所有受试者随时间对seqid-00105的平均血浆胰岛素应答的图。图32是说明超过基线的对seqid-00105的平均血浆胰岛素倍数应答的图。图33是说明所有受试者随时间对seqid-00426的平均血浆胰岛素应答的图。图34是说明超过基线的对seqid-00426的平均血浆胰岛素倍数应答的图。图35是说明所有患者对seqid-00426的平均总胃抑制性多肽(gip)应答的图。图36是说明所有患者对seqid-00426的胃抑制性多肽(gip)倍数应答的图。图37是说明在不同亮氨酸浓度下测量的alphascreen信号(y轴)的图。显示的误差棒是平行测定的标准偏差。图38是说明原代rskmc中最低氨基酸培养基中的亮氨酸剂量应答的图。显示的误差棒是标准偏差。图39是说明分离的比目鱼肌中rps6磷酸化的体外亮氨酸剂量应答的图。显示的误差棒是标准偏差。图40是说明分离的腓肠肌中rps6磷酸化的体外亮氨酸剂量应答的图。显示的误差棒是标准偏差。图41是说明分离的趾长伸肌中rps6磷酸化的体外亮氨酸剂量应答的图。显示的误差棒是标准偏差。图42是说明leu/tyr/arg对rps6磷酸化的组合活性的图。显示的误差棒是标准偏差。图43是说明在leu/tyr背景中精氨酸刺激rps6的图。显示的误差棒是标准偏差。图44是说明在arg/tyr背景中亮氨酸刺激rps6的图。显示的误差棒是标准偏差。图45是说明在arg/leu背景中酪氨酸刺激rps6的图。显示的误差棒是标准偏差。图46是说明在胰酶消化seqid-00105期间，游离leu释放的时间过程的图。图47是说明seqid-00105在4c(闭合圆圈)和25c(空心圆圈)下以及乳清在4c(闭合方块)和25c(空心方块)下在一定范围的蛋白质浓度内以厘泊计量的粘度的图。图48是说明seqid-00105的初始和最终(在加热至90℃，接着冷却至20℃之后)蛋白质圆二色性光谱(左)以及那个seqid-00105在给定波长下在温度范围内的椭圆率变化(右)的图。图49是说明对含有甘露糖的聚糖的蛋白质印迹分析的图像。a)coomassie染色凝胶。b)gna印迹膜。在两个图版中，泳道如下：1)预染色蛋白质阶梯，2)来自黑曲霉的seqid-00363(5μg)，3)来自用编码seqid-00363的表达载体转化的大肠杆菌的全细胞提取物(5μg)，4)gna阳性对照羧肽酶(5μg)，5)来自用编码seqid-00363的表达载体转化的大肠杆菌的可溶性溶解产物(5μg)。图50是说明对neu5gc的蛋白质印迹分析的图像。a)coomassie染色凝胶。b)抗neu5gc探测膜。在两个图版中，泳道如下：1和10)预染色蛋白质阶梯(newenglandbiolab)，2和11)牛肉提取物(30μg)，3)猪肉提取物(30μg)，4)鹿肉提取物(30μg)，5)羊羔肉提取物(30μg)，6)火鸡肉提取物(30μg)，7)鸡肉提取物(30μg)，8)鳕鱼提取物(30μg)，9)蛋白质混合物1(10μg)，12-15)在12)大肠杆菌(imac纯化的溶解产物)、13)枯草芽孢杆菌(上清液)、14)枯草芽孢杆菌(溶解产物)、15)枯草芽孢杆菌(imac纯化的溶解产物)中表达的168种营养性多肽文库(30μg)，16-20)在16)枯草芽孢杆菌(ph951grac溶解产物)、17)大肠杆菌(rosetta可溶性溶解产物)、18)大肠杆菌(rosetta全细胞)、19)大肠杆菌(gamib溶解产物)和20)大肠杆菌(gami2溶解产物)中表达的cdna文库(30μg)。图51是说明对木糖和海藻糖的蛋白质印迹分析的图像。a)coomassie染色凝胶。b)抗neu5gc探测膜。在蛋白质印迹分析中，蛋白质的样品从植物和真菌提取或由大肠杆菌和黑曲霉重组表达。含有木糖和含有海藻糖的聚糖于a)coomassie染色凝胶，b)抗neu5gc印迹膜中。在两个图版中，泳道如下：1和11)预染色蛋白质阶梯(newenglandbiolab)，2)酵母提取物(30μg)，3)亚麻籽提取物(30μg)，4)鸡肉提取物(30μg)，5)玉米提取物(30μg)，6)马铃薯提取物(30μg)，7)蘑菇提取物(30μg)，8)蛋白质混合物2(30μg)，9)hrp(2μg)，10)胎球蛋白(2μg)，12)大豆提取物(30μg)，13)稻米提取物(30μg)，14)花椰菜提取物(30μg)，15)番茄提取物(30μg)，16)蓝莓提取物(30μg)，17)葡萄提取物(30μg)，18)蛋白质混合物2(30μg)，19)hrp(2μg)，20)胎球蛋白(2μg)。图52是一系列图，其说明在表e33a中所列的剂量下口服施用指示的营养性多肽之后，在4小时内从大鼠(n＝2-4)收集的血液样品中测量的血浆氨基酸浓度的平均曲线下面积(auc)(±sd)(μm·h)的变化。bcaa：支链氨基酸，eaa：必需氨基酸。图53是一系列图，其说明在2.85g/kg下口服施用seqid-00105的大鼠(n＝4)的平均血浆氨基酸浓度(±sd)-时间曲线。bcaa：支链氨基酸，eaa：必需氨基酸。图54是一系列图，其说明seqid-00105的剂量-应答效应。在表e33a中所列的剂量下口服施用seqid-00105之后，在4小时内从大鼠(n＝4)收集的血液样品中测量的(左)平均血浆leu浓度(±sd)-时间曲线(右)血浆氨基酸浓度的平均曲线下面积(auc)(±sd)(μm·h)。图55是一系列图，其说明在seqid-00363的天然和修饰形式的大鼠药物动力学研究期间的血浆氨基酸浓度。在口服施用盐水(圆圈(●)，实线)(n＝4)、天然seqid-00363(方块(■)，实线)(n＝4)、去糖基化seqid-00363(空心圆圈(○)，虚线)(n＝2)和水解的seqid-00363(空心方块(□)，虚线)(n＝4)之后，必需氨基酸(eaa)(a)、亮氨酸(b)、丝氨酸(c)和苏氨酸(d)的血浆氨基酸分布。数据代表如上指示的n＝2-4只大鼠的平均值±平均值标准偏差。图56是一系列图，其说明wpi、seqid-00105和seqid-363的平均fsr的变化。图57是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸的人血浆时间过程。图58是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸的人血浆时间过程。图59是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸的人血浆时间过程。图60是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸以及各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的人血浆时间过程。图61是说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸的积分曲线下面积(auc)的图。图62是说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸的积分曲线下面积(auc)的图。图63是说明关于wpi和seqid-00105的各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的积分曲线下面积(auc)的图。图64是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸的人血浆时间过程。图65是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸的人血浆时间过程。图66是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸的人血浆时间过程。图67是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸以及各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的人血浆时间过程。图68是说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸的积分曲线下面积(auc)的图。图69是说明关于wpi和seqid-00105的测量氨基酸的积分曲线下面积(auc)的图。图70是说明关于wpi和seqid-00105的各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的积分曲线下面积(auc)的图。图71是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00363的测量氨基酸的人血浆时间过程。图72是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00363的测量氨基酸的人血浆时间过程。图73是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00363的测量氨基酸的人血浆时间过程。图74是一系列图，其说明关于wpi和seqid-363的测量氨基酸以及各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的人血浆时间过程。图75是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00426的测量氨基酸的人血浆时间过程。图76是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00426的测量氨基酸的人血浆时间过程。图77是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00426的测量氨基酸的人血浆时间过程。图78是一系列图，其说明关于wpi和seqid-00426的测量氨基酸以及各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的人血浆时间过程。详细描述除非另外规定，否则如以下阐述来定义用于权利要求和说明书中的术语。必须注意的是，除非上下文另外明确规定，否则如说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一(a,an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。定义。“农业源性食物产品”是由土壤栽培或饲养动物产生的食物产品。术语“改善”是指在治疗疾病状态方面的任何治疗有益结果，例如包括其防治、减轻严重性或进展、缓解或治愈。如本文所用，术语“自养性”是指生物体使用来自光(通过光合作用)或无机化学反应(化学合成)的能量从简单无机分子产生复杂有机化合物(诸如碳水化合物、脂肪和蛋白质)。如本文所用，“身体质量指数”或“bmi”或“克托莱指数(queteletindex)”是以千克计的受试者的重量除以以米计的受试者的身高的平方(kg/m2)。对于成人，常使用bmi来评估个体的体重偏离具有他的或她的身高的人士的正常或合乎需要体重的程度。重量过度或不足可部分地用身体脂肪来解释，但诸如肌肉发达性的其它因素也显著影响bmi。世界卫生组织将bmi小于18.5视为重量不足，并且可指示营养不良、进食病症或其它健康问题，而bmi大于25被视为超重，并且高于30被视为肥胖。(世界卫生组织bmi分类)。如本文所用，“支链氨基酸”是选自亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的氨基酸。如本文所用，“恶病质”是指导致肌肉损耗和重量减轻的多层面临床综合征。它是一种复杂病状，其中蛋白质分解代谢超过蛋白质合成代谢，此使得肌肉损耗成为所述病状的主要特征。除在蛋白质代谢方面的代谢紊乱之外，它的特征也在于厌食和炎症。这些紊乱加上蛋白质代谢受损在不同程度上对营养疗法起应答。如本文所用，“卡路里控制”和“卡路里限制”是指相对于受试者的先前卡路里摄取或相对于适当卡路里摄取标准，降低受试者从食物产品摄取卡路里的过程。通常，术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长不受调控的生理病状。更具体来说，使用任何一种或多种酪氨酸激酶抑制剂、阻断受体或它们的配体的其它药物或其变体以及与本文提供的方法关联加以治疗的癌症包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、间皮瘤、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌(其包括大细胞癌、肺腺癌和肺鳞状癌))、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric/stomachcancer)(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney/renalcancer)、前列腺癌、子宫颈癌、阴门癌、甲状腺癌、头颈部癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性小痣黑素瘤、肢端雀斑性黑素瘤、结节性黑素瘤、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma，nhl)；小淋巴细胞性(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级成免疫细胞性nhl；高级成淋巴细胞性nhl；高级小非分裂细胞nhl；巨大肿块疾病nhl；套膜细胞淋巴瘤；aids相关的淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(waldenstrom'smacroglobulinemia))；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性骨髓性白血病(aml)；慢性骨髓性白血病(cml)；急性成淋巴细胞性白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；或移植后淋巴组织增生性病症(ptld)以及与瘢痣病、水肿(诸如与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯综合征(meigs'syndrome)相关的异常血管增生。“可食产品”包括可食用产品，而“非可食产品”通常是不可食用产品或含有不可食用产品。就“大致上不含非可食产品”来说，其意指组合物不具有足以致使所述组合物不可食用、危险或另外不适于由它的预期消耗者消耗的量或水平的非可食产品。或者，多肽可大致上不含非可食产品，此意味着所述多肽不含有或具有与此相关的足以致使含有所述多肽的组合物不可由它的预期消耗者食用或对它的预期消耗者不安全或有害的量或水平的非可食产品。在优选实施方案中，大致上不含非可食产品的组合物可以营养量由预期消耗者消耗，所述消耗者未遭受由所述消耗引起的有害事件或不处于遭受所述有害事件的风险增加下。举例来说，各种水平的铅和其它金属被充分记载为当存在于食物，特别是含有在被铅和/或其它金属污染的土壤中生长的农业源性产品的食物中时对人具有重大风险(包括毒性)。因此，金属含量高于某一百万分率(ppm)的含有工业生产多肽的产品(诸如食物、饮料和化合物)被视为非可食产品，所述金属含量取决于如本领域中所认定的金属。举例来说，铅或镉在使得当由哺乳动物消耗时铅将具有有害生物作用的水平下包括在工业生产多肽中将通常致使含有所述工业生产多肽的组合物是非可食的。尽管存在以上描述，但一些多肽具有络合或并入其中的某些量的金属(诸如铁、锌、钙和镁)，并且所述金属将未必致使多肽是非可食的。术语“控制序列”意图至少涵盖其存在为表达所必需的任何组分，并且也可涵盖其存在是有利的其它组分，例如前导序列和融合配偶体序列。如本文所用，如果患者由于医学疾病而经历身体质量指数和肌肉质量中的至少一个的变化(例如肌肉减少症)，那么所述患者患有“医学上危急疾病”。在一些实施方案中，患者持续他们的醒来时间的至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％被限制卧床。在一些实施方案中，患者是无意识的。在一些实施方案中，患者已如这个段落中所述被限制卧床至少1天、2天、3天、4天、5天、10天、2周、3周、4周、5周、10周或长于10周。如本文所用，短语参照核酸序列的“简并变体”涵盖可根据标准遗传密码翻译以提供与从所述参照核酸序列翻译的氨基酸序列同一的氨基酸序列的核酸序列。术语“简并寡核苷酸”或“简并引物”用于表示能够与在序列方面未必同一，但在一个或多个特定区段内彼此同源的靶标核酸序列杂交的寡核苷酸。如本文所用，“合乎需要的身体质量指数”是约18.5至约25的身体质量指数。因此，如果受试者的bmi低于约18.5，那么所述受试者的bmi增加就是所述受试者的bmi的合乎需要性得以增加。如果相反，受试者的bmi高于约25，那么所述受试者的bmi降低就是所述受试者的bmi的合乎需要性得以增加。如本文所用，术语“糖尿病”包括其中受试者不能产生任何量或足量胰岛素或另外不能调控血糖水平的任何代谢疾病。术语“糖尿病前期”也称为“空腹葡萄糖受损”，包括其中空腹葡萄糖高于接受的正常限度的病状。如本文所用，“年长”哺乳动物是经历身体质量指数和肌肉质量中的至少一个的年龄相关变化(例如年龄相关的肌肉减少症)的哺乳动物。在一些实施方案中，“年长”人是至少50岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁、至少80岁、至少85岁、至少90岁、至少95岁或至少100岁。在一些实施方案中，年长动物、哺乳动物或人是已经历肌肉质量从峰值寿命肌肉质量损失至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的人。因为已知身体质量指数和肌肉质量中的至少一个的年龄相关变化与年龄增加相关，所以在一些实施方案中，仅基于年龄鉴定或确定年长哺乳动物。因此，在一些实施方案中，“年长”人是仅通过他们的年龄是至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁、至少80岁、至少85岁、至少90岁、至少95岁或至少100岁的事实，而不依靠测量身体质量指数和肌肉质量中的至少一个来鉴定或确定。如本文所用，“必需氨基酸”是选自组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸的氨基酸。然而，应了解“必需氨基酸”可贯穿典型寿命而变化，例如半胱氨酸、酪氨酸和精氨酸被视为人在婴儿期的必需氨基酸。imurak,okadaa(1998)."aminoacidmetabolisminpediatricpatients".nutrition14(1):143–8。此外，氨基酸精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸在成人中被视为是“条件性必需的”，此意味着通常不需要它们处于膳食中，但必须以外源性方式向不以足量合成它们的特定群体供给。fürstp,stehlep(2004年6月1日)."whataretheessentialelementsneededforthedeterminationofaminoacidrequirementsinhumans？".journalofnutrition134(6增刊):1558s–1565s；以及reedspj(2000年7月1日)."dispensableandindispensableaminoacidsforhumans".j.nutr.130(7):1835s–40s。如本文所用，最广泛来说，“运动”是增强或维持身体康健以及总体健康和安康的任何身体活动。运动是出于各种原因来进行，包括强化肌肉和心血管系统、磨练运动技能、减轻或维持重量以及出于享乐的目的。如本文所用，“运动方案”包括用于促进健康或用于治疗或预防疾病的任何运动过程。如本文所用，“表达控制序列”是指为实现它们所操作性地连接的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括适当转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效rna加工信号，诸如剪接和聚腺苷酸化信号；使细胞质mrna稳定的序列；增强翻译效率的序列(例如核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；和当需要时，增强蛋白质分泌的序列。所述控制序列的性质视宿主生物体而不同；在原核生物中，所述控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。如本文所用，“功能”和“功能性能”是指模拟每日活动的功能性测试。“肌肉功能”或“功能性能”通过任何适合接受测试来测量，所述测试包括定时举步测试(从4英寸台阶尽可能快速地上下举步5次)、定时平台传送测试(在平台上尽可能快速地从立位变为仰卧位，并且此后再次向上变为立位，重复一次)和身体性能连串测试(静态平衡测试、坐椅测试和行走测试)(borsheim等,“effectofaminoacidsupplementationonmusclemass,strengthandphysicalfunctioninelderly,”clinnutr2008；27:189-195)。如本文所用，诸如组织损伤或组织损害的“行为相关的”损伤或损害由诸如身体或运动行为的机能活动所致。术语“融合蛋白”是指包含偶联于异源性氨基酸序列的多肽或片段的多肽。融合蛋白是适用的，因为它们可被构建来含有两个或更多个可来自两种或更多种不同蛋白质的所需功能性元件。融合蛋白包含至少10个来自目标多肽的连续氨基酸、或至少20或30个氨基酸、或至少40、50或60个氨基酸、或至少75、100或125个氨基酸。融合蛋白内包括的异源性多肽的长度通常是至少6个氨基酸、或至少8个氨基酸、或至少15、20或25个氨基酸。包括较大多肽(诸如iggfc区)以及甚至整个蛋白质(诸如含有绿色荧光蛋白(“gfp”)发色团的蛋白质)的融合物具有特定效用。融合蛋白可通过与编码不同蛋白质或肽的核酸序列同框构建编码多肽或其片段的核酸序列，接着表达融合蛋白来重组产生。或者，可通过使多肽或其片段交联于另一蛋白质来化学产生融合蛋白。也被称为序列同一性百分比的多肽序列同源性通常使用序列分析软件测量。参见例如威斯康星大学生物技术中心的遗传学计算机组(gcg)的序列分析软件包(910universityavenue,madison,wis.53705)。蛋白质分析软件使用对各种取代、缺失和其它修饰(包括保守性氨基酸取代)指定的同源性量度匹配类似序列。举例来说，gcg含有可以缺省参数用于确定密切相关多肽(诸如来自不同物种的生物体的同源性多肽)之间或野生型多肽与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性的程序，诸如“gap”和“bestfit”。参见例如gcg第6版。当将特定多肽序列与含有来自不同生物体的许多序列的数据库进行比较时，一示例性算法是计算机程序blast(altschul等,j.mol.biol.215:403-410(1990)；gish和states,naturegenet.3:266-272(1993)；madden等,meth.enzymol.266:131-141(1996)；altschul等,nucleicacidsres.25:3389-3402(1997)；zhang和madden,genomeres.7:649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(altschul等,nucleicacidsres.25:3389-3402(1997))。如本文所用，“胃肠病症”或“胃肠疾病”包括涉及胃肠道或其区域(即食道、胃、小肠、大肠或直肠)以及与消化相关的器官和组织(例如胰腺、胆囊和肝)的任何病症或疾病。如本文所用，术语“异养性”是指生物体不能固定碳，并且使用有机碳来生长。如本文所用，如果编码多肽的核酸序列与编码第二多肽的核酸序列具有类似序列，那么所述多肽与所述第二多肽具有“同源性”或与所述第二多肽“同源”。或者，如果两个多肽具有类似氨基酸序列，那么某一多肽与第二多肽具有同源性。(因此，术语“同源性多肽”被定义来意指两个多肽具有类似氨基酸序列。)当“同源”关于多肽或肽使用时，应认识到不同一的残基位置常因保守性氨基酸取代而不同。“保守性氨基酸取代”是其中某一氨基酸残基被具有化学性质(例如电荷或疏水性)类似的侧链(r基团)的另一氨基酸残基取代的取代。一般来说，保守性氨基酸取代将不实质上改变多肽的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守性取代而不同于彼此的情况下，序列同一性百分比或同源性程度可向上调整以修正取代的保守性性质。用于进行这个调整的手段为本领域技术人员所熟知。参见例如pearson,1994,methodsmol.biol.24:307-31以及25:365-89。以下六组各自含有是彼此的保守性取代的氨基酸：1)丝氨酸、苏氨酸；2)天冬氨酸、谷氨酸；3)天冬酰胺、谷氨酰胺；4)精氨酸、赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。在一些实施方案中，如果聚合分子(例如多肽序列或核酸序列)的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一，那么它们被视为彼此同源。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％类似，那么它们被视为彼此“同源”。术语“同源”必须是指至少两个序列(核苷酸序列或氨基酸序列)之间的比较。在一些实施方案中，如果两个核苷酸序列编码的多肽关于至少一个具有至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50个或超过50个氨基酸的链段是至少约50％同一的，至少约60％同一的，至少约70％同一的，至少约80％同一的或至少约90％同一的，那么所述两个核苷酸序列被视为同源。在一些实施方案中，同源性核苷酸序列的特征在于能够编码具有至少4-5个独特指定的氨基酸的链段。这些氨基酸相对于彼此的同一性与大致间隔两者均必须为将核苷酸序列考虑为同源时所考虑。在长度小于60个核苷酸的核苷酸序列的一些实施方案中，通过编码具有至少4-5个独特指定的氨基酸的链段的能力来确定同源性。在一些实施方案中，如果两个多肽序列关于至少一个具有至少约20个氨基酸的链段是至少约50％同一的，至少约60％同一的，至少约70％同一的，至少约80％同一的或至少约90％同一的，那么所述多肽被视为同源。在其它实施方案中，如果两个多肽序列关于至少一个具有至少约20个氨基酸的链段是类似的，诸如是至少约50％类似的，至少约60％类似的，至少约70％类似的，至少约80％类似的至少约90％类似的，或至少约95％类似的，那么所述多肽被视为同源。在一些实施方案中，通过导致某一氨基酸变化的较少核苷酸变化来说明类似性(例如具有单一核苷酸变化的核酸序列比具有两个核苷酸变化的核酸序列更类似于参照核酸序列，即使两种变化均导致相同氨基酸取代)。术语“原位”是指过程发生在与活生物体分开生长，例如在组织培养中生长的活细胞中。如本文所用，术语“体外”是指事件发生在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养中，在皮氏培养皿(petridish)中等，而非在生物体(例如动物、植物或微生物)内。如本文所用，术语“离体”是指在生物体外部的环境中在组织中或组织上进行实验。术语“体内”是指过程发生在活生物体中。如本文所用，“修饰的衍生物”是指在一级结构序列方面与参照多肽序列大致上同源，但包括例如体内或体外化学和生物化学修饰或并有不见于参照多肽中的氨基酸的多肽或其片段。所述修饰包括例如乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记(例如用放射性核素标记)和各种酶修饰，如将易于为本领域技术人员所了解。多种用于标记多肽的方法和适用于所述目的的取代基或标记在本领域中是熟知的，并且包括放射性同位素(诸如125i、32p、35s和3h)、结合标记的抗配体(例如抗体)的配体、荧光团、化学发光剂、酶和可充当标记的配体的特异性结合对成员的抗配体。对标记的选择取决于所需灵敏性、与引物缀合的简易性、稳定性需求和可用仪器。用于标记多肽的方法在本领域中是熟知的。参见例如ausubel等,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociates(1992以及直至2002的补编)。如本文所用，“肌肉强度”是指在单次最大出力下，肌肉可产生的力量。存在两种类型的肌肉强度，即静态强度和动态强度。静态强度是指肌肉的等长收缩，其中肌肉产生力量，而肌肉长度保持恒定和/或此时不存在关节运动。实例包括固持或携带物件或相对于墙壁推进。动态强度是指肌肉产生导致运动的力量。动态强度可为等张收缩，其中肌肉在恒定负荷或等动力收缩下缩短，其中肌肉在恒定速度下收缩并缩短。动态强度也可包括等惯性强度。此外，术语“肌肉强度”是指最大动态肌肉强度，如由术语“一次重复最大值”(1rm)所描述。这是可在不失败或损伤下完全移动(提升、推进或牵拉)最大负荷(以千克计)一次的测量结果。这个值可直接测量，但这样做需要增加重量直至受试者未能将活动进行完毕。或者，通过使用小于受试者可移动的最大量的负荷，对受试者可达成的最大运动重复次数进行计数来估计1rm。常在临床试验中测量腿部伸展和腿部弯曲(borsheim等,“effectofaminoacidsupplementationonmusclemass,strengthandphysicalfunctioninelderly,”clinnutr2008；27:189-195；paddon-jones等,“essentialaminoacidandcarbohydratesupplementationamelioratesmuscleproteinlossinhumansduring28daysbedrest,”jclinendocrinolmetab2004；89:4351-4358)。如本文所用，“肌肉质量”是指受试者的身体中的肌肉重量。类似地，“肌肉合成代谢”包括合成肌肉蛋白质，并且是获得肌肉质量所依的过程的组成部分。肌肉质量包括骨骼肌、平滑肌(诸如心脏和消化道肌肉)和这些肌肉中含有的水。特定肌肉的肌肉质量可使用双能x射线吸光测定术(dexa)来测定(padden-jones等,2004)。总瘦性身体质量(减去脂肪)、总身体质量和骨矿物质含量也可通过dexa来测量。在一些实施方案中，受试者的特定肌肉的肌肉质量的变化是例如通过dexa来测定，并且所述变化用作所述受试者的肌肉质量的总变化的代表。因此，举例来说，如果受试者消耗如本文公开的营养性蛋白质，并且在一段时期内经历特定肌肉或肌肉群中的肌肉质量增加，那么可推断所述受试者已经历肌肉质量增加。可以多种方式测量肌肉质量的变化，所述方式包括蛋白质合成、分数合成速率和某些关键活性，诸如mtor/mtorc。一般来说，“瘦性肌肉质量”是指在不存在诸如脂肪的其它组织下的肌肉组织的质量。如本文所用的术语“核酸片段”是指相较于全长参照核苷酸序列，具有缺失(例如5’末端或3’末端缺失)的核酸序列。在一实施方案中，核酸片段是连续序列，其中所述片段的核苷酸序列与天然存在的序列中的相应位置同一。在一些实施方案中，片段的长度是至少10、15、20或25个核苷酸、或至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个核苷酸。在一些实施方案中，核酸序列的片段是开放阅读框序列的片段。在一些实施方案中，这种片段编码由开放阅读框核苷酸序列编码的蛋白质的多肽片段(如本文所定义)。如果组合物、制剂或产品向它的预期消耗者提供可观营养量，此意味着消耗者将所述组合物或制剂的全部或一部分吸收至细胞、器官和/或组织中，那么它是“营养性的(nutritional/nutritive)”。通常，所述向细胞、器官和/或组织中的吸收例如通过维持或改进所述细胞、器官和/或组织的健康和/或天然功能来向消耗者提供益处或效用。如本文所述加以吸收的营养性组合物或制剂称为“营养”。非限制性地举例来说，如果多肽向它的预期消耗者提供可观多肽营养量，此意味着消耗者将通常呈单一氨基酸或小肽形式的蛋白质的全部或一部分吸收至细胞、器官和/或组织中，那么它是营养性的。“营养”也意指向诸如人或其它哺乳动物的受试者提供营养性组合物、制剂、产品或其它物质的过程。营养性产品无需是“营养全面的”，此意味着如果以足量消耗，那么产品提供为消耗者的健康所需的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、必需氨基酸、条件性必需氨基酸、维生素和矿物质。另外，“营养全面的蛋白质”含有所有需要的蛋白质营养(此意味着量为生物体达成生理常态所需)，但未必含有微量营养物，诸如维生素和矿物质、碳水化合物或脂质。在优选实施方案中，组合物或制剂在它以足以提供“营养性益处”的量提供能够分解(即破坏肽键，常称为蛋白质消化)成单一氨基酸和/或小肽(例如两个氨基酸、三个氨基酸或四个氨基酸，有可能多达十个氨基酸)的多肽方面是营养性的。此外，在某些实施方案中，提供跨越胃肠壁转送，并且以小肽(例如大于单一氨基酸，但小于约十个氨基酸)或较大肽、寡肽或多肽(例如>11个氨基酸)形式被吸收至血流中的营养性多肽。含有多肽的组合物的营养性益处可通过许多量度来说明以及任选定量。举例来说，营养性益处是对于消耗性生物体的等于或大于参照每日蛋白质摄取值的至少约0.5％，诸如参照每日摄取值的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或大于约100％的益处。或者，营养性益处通过由消耗者感觉到和/或认识到饱腹感来说明。在其它实施方案中，营养性益处通过将组合物或制剂的大量多肽组分并入消耗者的细胞、器官和/或组织中来说明，所述并入通常意味着单一氨基酸或短肽用于在细胞内重新产生多肽。“消耗者”或“消耗性生物体”意指能够摄取具有营养性益处的产品的任何动物。通常，消耗者将为哺乳动物，诸如健康人，例如健康婴儿、儿童、成人或年长成人。或者，消耗者将为处于显现或罹患特征在于(i)缺乏足够营养和/或(ii)由本发明的营养性产品使其减轻的疾病、病症或病状的风险下的哺乳动物，诸如人(例如婴儿、儿童、成人或年长成人)。“婴儿”通常是年龄低于约1或2岁的人，“儿童”通常是年龄低于约18岁的人，并且“年长成人”或“年长”人是年龄约65岁或大于65岁的人。在其它优选实施方案中，组合物或制剂在它提供能够由预期消耗者水解的碳水化合物(称为“营养性碳水化合物”)方面是营养性的。含有碳水化合物的组合物的营养性益处可通过许多量度来说明以及任选定量。举例来说，营养性益处是对于消耗性生物体的等于或大于参照每日碳水化合物摄取值的至少约2％的益处。如本文所用的多肽“营养性结构域”意指多肽的能够提供营养的任何结构域。优选地，多肽营养性结构域提供一种或多种超过含有营养性结构域的全长多肽的优势，诸如营养性结构域比全长多肽提供更多营养。举例来说，相较于(i)参照多肽或含有参照多肽的混合物或组合物，(ii)存在于农业源性食物产品中的蛋白质或多肽，和/或(iii)存在于哺乳动物受试者的膳食中的蛋白质或多肽产品，多肽营养性结构域具有更高浓度的合乎需要的氨基酸，具有更低浓度的不合需要的氨基酸，含有由消化蛋白酶裂解的位点，更易于消化和/或更易于由消化较大多肽而产生，具有改进的储存特征，或这些和/或其它要素的组合。多肽营养性结构域的其它优势包括相对于全长多肽，更易于和/或更高效产生，生理化学性质不同或更有利，和/或具有不同或更有利的安全性质(例如消除一个或多个过敏结构域)。参照多肽可为天然存在的多肽或重组产生的多肽，其转而可具有与天然存在的多肽同一或不同的氨基酸序列。参照多肽也可为不存在于天然存在的多肽中的共有氨基酸序列。另外，含有参照多肽的混合物或组合物可为天然存在的混合物，诸如存在于诸如奶或乳清的乳制品中的多肽的混合物，或可为多肽(其转而可为天然存在的或合成的)的合成混合物。在某些实施方案中，营养性结构域含有n末端氨基酸和/或c末端氨基酸不同于参照分泌多肽(诸如全长分泌多肽)的n末端氨基酸和/或c末端氨基酸的氨基酸序列。举例来说，营养性结构域具有对应于在含有营养性结构域的较大分泌多肽内部的氨基酸序列的n末端氨基酸序列。营养性结构域可包括或排除较大分泌多肽的信号序列。如本文所用，“含有”多肽营养性结构域的多肽含有所述多肽营养性结构域的全部以及至少一个在所述多肽营养性结构域的n末端或c末端的其它氨基酸。通常，多肽营养性结构域从含有编码营养性结构域的核酸的细胞或生物体分泌，并且称为“分泌多肽营养性结构域”，并且在其中营养性结构域从单细胞(或单细胞化)生物体分泌的情况下，它被称为“单细胞分泌多肽营养性结构域”。在其它优选实施方案中，组合物或制剂在它提供能够由预期消耗者消化、并入、转化或进行其它细胞用途的脂质(称为“营养性脂质”)方面是营养性的。含有脂质的组合物的营养性益处可通过许多量度来说明以及任选定量。举例来说，营养性益处是对于消耗性生物体的等于或大于参照每日脂质(即脂肪)摄取值的至少约2％的益处。如本文所用，“肥胖”受试者具有使受试者罹患包括心脏病、ii型糖尿病、骨质疏松和骨关节炎以及癌症的疾病的可能性增加的过度体脂水平，而“超重”受试者高于被认定为正常、可接受或合乎需要而非肥胖的重量。在西方国家，bmi值超过30的受试者被视为肥胖，而bmi值在25-30之间的受试者被视为超重。如本文所用，“操作性地连接的”或“可操作地连接的”表达控制序列是指以下连接：其中表达控制序列与目标基因邻接以控制所述目标基因，以及表达控制序列反式或在一定距离下起控制所述目标基因的作用。术语“序列同一性百分比”或“同一”在核酸序列的情形下是指当对准以达成最大对应时，两个序列中的残基是相同的。存在本领域中已知的可用于测量核苷酸序列同一性的许多不同算法。举例来说，可使用威斯康星程序包10.0版(geneticscomputergroup(gcg),madison,wis.)中的程序fasta、gap或bestfit比较多核苷酸序列。fasta提供在查询序列与搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和序列同一性百分比。pearson,methodsenzymol.183:63-98(1990)。术语“多核苷酸”、“核酸分子、“核酸”或“核酸序列”是指长度是至少10个碱基的聚合形式的核苷酸。所述术语包括dna分子(例如cdna或基因组或合成dna)和rna分子(例如mrna或合成rna)、以及dna或rna的含有非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键或两者的类似物。核酸可呈任何拓扑构象。举例来说，核酸可为单链、双链、三链、四链体、部分双链、分支式、发夹式、环状或呈挂锁(padlocked)构象。“合成”rna、dna或混合聚合物是在细胞外部产生的rna、dna或混合聚合物，例如化学合成的rna、dna或混合聚合物。如本文所用的术语“核酸片段”是指相较于全长参照核苷酸序列，具有缺失(例如5’末端或3’末端缺失)的核酸序列。在一实施方案中，核酸片段是连续序列，其中所述片段的核苷酸序列与天然存在的序列中的相应位置同一。在一些实施方案中，片段的长度是至少10、15、20或25个核苷酸、或至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800个或大于1800个核苷酸。在一些实施方案中，核酸序列的片段是开放阅读框序列的片段。在一些实施方案中，这种片段编码由开放阅读框核苷酸序列编码的多肽的多肽片段(如本文所定义)。术语“多肽”和“蛋白质”可相互交换，并且这些术语涵盖天然存在的多肽与非天然存在的多肽两者及其如本文提供或如本领域中通常已知的片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可为单体，此意味着它具有单链，或可为聚合的，此意味着它由两个或更多个可共价或非共价缔合的链组成。此外，多肽可包含各自具有一种或多种不同活性的许多不同结构域。为免除怀疑，多肽可为大于或等于两个氨基酸的任何长度。术语“分离的多肽”是就它的起源或获得来源而言，(1)不与在它的任何天然状态下伴随它的天然相伴组分相伴，(2)以不见于自然界中的纯度存在，其中纯度可关于其它细胞物质的存在加以断定(例如不含来自相同物种或来自其中产生多肽的宿主物种的其它多肽)，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)由细胞重组表达(例如如果多肽由存在于宿主细胞中的重组核酸产生并从所述产生性宿主细胞分离，那么它是“分离的多肽”)，(5)不存在于自然界中(例如它是见于自然界中的多肽的结构域或其它片段或它包括不见于自然界中的氨基酸类似物或衍生物或除标准肽键以外的键联)，或(6)另外通过人手来产生、制备和/或制造的多肽。因此，“分离的多肽”包括在宿主细胞中由重组核酸(诸如载体)产生的多肽，而无论所述宿主细胞是否天然产生具有同一氨基酸序列的多肽。“多肽”包括由宿主细胞通过过度表达产生的多肽，所述过度表达例如是诸如通过改变多肽的启动子以使它的表达增加至高于它在不存在改变的启动子下在宿主细胞中的正常表达水平的水平来由宿主细胞同源性过度表达多肽。化学合成或在不同于它所天然源于的细胞的细胞系统中合成的多肽将与它的天然相伴组分“分离”。也可通过使用本领域中熟知的蛋白质纯化技术进行分离来致使多肽大致上不含天然相伴组分。如由此所定义，“分离”未必需要如此描述的蛋白质、多肽、肽或寡肽已从于其中合成它的细胞物理移除。如本文所用的术语“多肽片段”或“蛋白质片段”是指相较于参照多肽(例如全长多肽或天然存在的蛋白质的多肽结构域)具有较少氨基酸的多肽或其结构域。“天然存在的蛋白质”或“天然存在的多肽”包括具有由非重组细胞或生物体产生的氨基酸序列的多肽。在一实施方案中，多肽片段是连续序列，其中所述片段的氨基酸序列与天然存在的序列中的相应位置同一。片段的长度通常是至少5、6、7、8、9或10个氨基酸、或至少12、14、16或18个氨基酸、或至少20个氨基酸、或至少25、30、35、40或45个氨基酸、或至少50、60、70、80、90或100个氨基酸、或至少110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个氨基酸、或225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600个或大于600个氨基酸。片段可为在细胞内部或外部消化的较大多肽序列的一部分。因此，长度是50个氨基酸的多肽可在细胞内产生，但在细胞内部或外部被蛋白水解以产生长度小于50个氨基酸的多肽。这对于短于约25个氨基酸的多肽特别重要，所述多肽可比较大多肽更难以重组产生或更难以一旦重组产生即纯化。如本文所用的术语“肽”是指短多肽或寡肽，例如通常含有小于约50个氨基酸，并且更通常小于约30个氨基酸，或更通常小于约15个氨基酸，诸如小于约10、9、8、7、6、5、4或3个氨基酸的短多肽或寡肽。如本文所用的所述术语涵盖模拟结构功能以及因此生物功能的类似物和模拟物。如本文所用，“多肽突变体”或“突变蛋白”是指相较于参照蛋白质或多肽(诸如天然或野生型蛋白质)的氨基酸序列，其序列含有一个或多个氨基酸的插入、重复、缺失、重排或取代的多肽。突变蛋白可具有一个或多个氨基酸点取代，其中在某一位置处的单一氨基酸已变为另一氨基酸；一个或多个插入和/或缺失，其中一个或多个氨基酸分别被插入在参照蛋白质的序列中或在参照蛋白质的序列中缺失；和/或氨基酸序列在氨基或羧基末端的任一者或两者处的截短。突变蛋白相较于参照蛋白质可具有相同或不同生物活性。在一些实施方案中，突变蛋白与它的对应参照蛋白质具有例如至少85％总体序列同源性。在一些实施方案中，突变蛋白与野生型蛋白质具有至少90％总体序列同源性。在其它实施方案中，突变蛋白展现至少95％序列同一性，或98％或99％或99.5％或99.9％总体序列同一性如本文所用，“用于亲和纯化的多肽标签”是具有可用于分离或纯化融合于第一“标签”多肽的目标第二蛋白质或多肽序列的结合配偶体的任何多肽。若干实例在本领域中是熟知的，并且包括his-6标签、flag表位、c-myc表位、strep-tagii、生物素标签、谷胱甘肽5-转移酶(gst)、几丁质结合蛋白(cbp)、麦芽糖结合蛋白(mbp)或金属亲和标签。如本文所用，“蛋白质-能量营养不良”是指一种形式的营养不良，其中存在蛋白质摄取不足。类型包括夸休可尔症(kwashiorkor)(突出性蛋白质营养不良)、消瘦(缺乏卡路里与蛋白质营养两者)和消瘦性夸休可尔症(存在显著蛋白质缺乏和显著卡路里不足征象，有时被称为最重度形式的营养不良)。“营养失调”和“营养不良”在本文中被等效使用。术语“纯化(purify/purifying)”和“纯化的(purified)”是指物质(或实体、组合物、产物或材料)已与至少一些它在初始产生(在自然界中抑或在实验环境中)时或在它初始产生之后的任何时间期间与其相伴的组分分离。如果诸如营养性多肽的物质在产生时，或在直至并包括最终产物的任何层面或阶段被分离，那么它将被视为是纯化的，但最终产物可含有多达约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或高于约90％的其它物质，并且仍然被视为是“分离的”。纯化物质或实体可与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或大于90％的它们初始与其相伴的其它组分分离。在一些实施方案中，纯化物质的纯度大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％。在本文提供的多肽和其它多肽的情况下，这种多肽可从一种或多种能够从分泌多肽的单细胞生物体分泌的其它多肽纯化。如本文所用，如果多肽物质大致上不含其它组分或其它多肽组分，那么它是“纯的”。如本文所用，“重组”是指例如基因或多肽的生物分子(1)已从它的天然存在的环境移除，(2)不与在自然界中发现所述基因所处的多核苷酸的全部或一部分相伴，(3)操作性地连接于它在自然界中不连接的多核苷酸，或(4)不存在于自然界中。此外，“重组”是指细胞或生物体(诸如单细胞生物体(在本文中称为“重组单细胞生物体”)、“重组宿主”或“重组细胞”)含有、产生和/或分泌可为重组生物分子或非重组生物分子的生物分子。举例来说，重组单细胞生物体可含有提供重组多肽或非重组多肽的产生和/或分泌增强的重组核酸。重组细胞或生物体也意指诸如重组载体的重组核酸已被引入其中的细胞。“重组单细胞生物体”包括重组微生物宿主细胞，并且不仅是指特定主题细胞，而且是指这种细胞的子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而发生在继代中，所以所述子代可能实际上不与亲本细胞相同，但仍然被包括在本文术语的范围内。术语“重组”可关于克隆的dna分离物、化学合成的多核苷酸类似物或由异源性系统生物合成的多核苷酸类似物、以及由所述核酸编码的多肽和/或mrna加以使用。因此，举例来说，例如如果由微生物合成的多肽由从存在于细胞中的重组基因或其它核酸序列转录的mrna产生，那么它是重组的。如本文所用，如果邻近于生物体的基因组中的内源性核酸序列放置异源性序列以使这个内源性核酸序列的表达被改变，那么所述内源性核酸序列(或那个序列的编码多肽产物)在本文中被视为是“重组的”。在这个情形下，异源性序列是不天然邻近于内源性核酸序列的序列，无论所述异源性序列是否本身是内源性的(源于相同宿主细胞或其子代)或外源性的(源于不同宿主细胞或其子代)。举例来说，启动子序列可取代(例如通过同源性重组)宿主细胞的基因组中的基因的天然启动子，以使这个基因具有改变的表达样式。这个基因现将变为“重组的”，因为它与至少一些天然侧接它的序列分离。如果核酸含有不天然存在于基因组中的相应核酸中的任何修饰，那么它也被视为是“重组的”。举例来说，如果内源性编码序列含有例如通过人为干预来人工引入的插入、缺失或点突变，那么它被视为是“重组的”。“重组核酸”也包括在异源性位点处整合至宿主细胞染色体中的核酸和以游离体形式存在的核酸构建体。如本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“重组细胞”或“宿主细胞”)意指诸如重组载体的重组核酸已被引入其中的细胞。在一些情况下，用词“细胞”由指定细胞类型的名称替代。举例来说，“重组微生物”是作为微生物宿主细胞的重组宿主细胞，而“重组蓝细菌”是作为蓝细菌宿主细胞的重组宿主细胞。应了解所述术语意图不仅指代特定主题细胞，而且指代这种细胞的子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而发生在继代中，所以所述子代可能实际上不与亲本细胞相同，但仍然被包括在如本文所用的术语“重组宿主细胞”、“重组细胞”和“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可为培养生长的分离的细胞或细胞系或可为存在于活组织或生物体中的细胞。如本文所用，“肌肉减少症”是指骨骼肌质量(通常在25岁之后每年损失0.5-1％)、品质和强度的与衰老相关的退化性损失。肌肉减少症是虚弱综合征的组成部分。欧洲关于年长人的肌肉减少症的工作组(europeanworkinggrouponsarcopeniainolderpeople，ewgsop)已建立针对年龄相关的肌肉减少症的实际临床规定和统一诊断准则。对于肌肉减少症的诊断，工作组已提出使用存在低肌肉质量与低肌肉功能(强度或性能)两者。肌肉减少症的特征首先在于肌肉萎缩(肌肉尺寸降低)，以及由诸如肌肉纤维被脂肪置换、纤维化增加、肌肉代谢变化、氧化应激和神经肌肉接点退化的因素引起的肌肉组织“品质”降低。这些变化组合在一起导致肌肉功能进行性损失，并且最终导致虚弱。虚弱是一种在年长成人中常见的体现灾难性健康和功能衰退的风险升高的老年综合征。虚弱的因素可包括肌肉减少症、骨质疏松和肌肉衰弱。肌肉衰弱，也称为肌肉疲劳(或“缺乏强度”)，是指不能用骨骼肌施加力量。衰弱常在肌肉萎缩和活动减少之后，诸如在由于疾病的一段长期卧床休息之后。也存在由于肌肉减少症的肌肉衰弱逐渐发作。因此，肌肉减少症是与肌肉损耗相关的一示例性病状。如本文所用，“饱足”是当进食时变饱或对进食的需求降低的举动。这会使进食停止或减少。如本文所用，“饱腹感”是餐后保持饱满的举动，其表现为餐后不进食的时期。如本文所用，“分泌(secrete/secretion)”和“分泌的(secreted)”全都是指多肽从多细胞生物体或单细胞生物体的细胞的细胞质重定位至其细胞外环境中所依的举动或过程。如本文所提供，所述分泌可主动或被动发生。此外，术语“排泄(excrete/excretion)”和“排泄的”通常暗示从细胞或单细胞生物体被动清除物质；然而，适当时，所述术语可与产生并从细胞或单细胞生物体向外转移物质相关。一般来说，在一组特定条件下在比特定dna杂交物的热解链点(tm)低约25℃下进行“严格杂交”。在一组特定条件下在比特定dna杂交物的tm低约5℃的温度下进行“严格洗涤”。tm是50％的靶标序列与完全匹配探针杂交所处的温度。参见sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1989),第9.51页，据此以引用的方式并入本文。出于本文目的，溶液相杂交的“严格条件”被定义为在65℃下在6xssc(其中20xssc含有3.0mnac1和0.3m柠檬酸钠)、1％sds中进行水性杂交(即不含甲酰胺)8-12小时，随后在65℃下在0.2xssc、0.1％sds中进行2次20分钟洗涤。熟练工作者应了解在65℃下杂交将取决于许多因素而在不同速率下发生，所述因素包括杂交的序列的长度和同一性百分比。术语“大致上同源性”或“大致上类似性”在关于核酸或其片段时指示当在适当核苷酸插入或缺失下与另一核酸(或它的互补链)最优比对时，在至少约76％、80％、85％、或至少约90％、或至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，如通过序列同一性的任何熟知算法，诸如如上讨论的fasta、blast或gap所测量。术语“足量”意指足以产生所需作用的量，例如足以调节细胞中的蛋白质聚集的量。“合成”rna、dna或混合聚合物是在细胞外部产生的rna、dna或混合聚合物，例如化学合成的rna、dna或混合聚合物。术语“治疗有效量”是有效改善疾病的症状的量。治疗有效量可为“防治有效量”，因为防治可被视为疗法。如本文所用，“产热”是哺乳动物中的热产生过程。产热伴随有能量消耗增加。产热具体来说是在食物组分(诸如蛋白质)代谢之后燃烧能量。这也可被称为食物的热效应。由个体消耗的总能量等于静息能量消耗(在空腹状态下在静息时被消耗来支持基础代谢的能量)、食物的热效应和与身体活动相关的能量消耗的总和。静息能量消耗占人中总能量消耗的约65-75％。肌块的数量和活性是静息能量消耗的一个影响因素。足以支持肌肉的蛋白质消耗也影响静息能量消耗。蛋白质的摄取倾向于增加餐后能量消耗；这是食物的热效应。食物的热效应占人中总能量消耗的约10％。尽管这是总能量消耗的较小比例，但这个值的较小增加可影响体重。蛋白质具有的热效应高于脂肪或碳水化合物；这个效应连同蛋白质的其它代谢影响一起使得蛋白质成为适用于重量控制、糖尿病管理和其它情况的底物。如本文所用，“载体”意指能够运送它已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其通常是指可向其中连接其它dna区段的环状双链dna环，但也包括线性双链分子，诸如通过聚合酶链反应(pcr)由扩增或由用限制酶处理环状质粒产生的那些。其它载体包括粘粒、细菌人工染色体(bac)和酵母人工染色体(yac)。另一类型的载体是病毒载体，其中可将其它dna区段连接至病毒基因组中(以下更详细讨论)。某些载体能够在它们被引入其中的宿主细胞中自主复制(例如具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其它载体可在引入宿主细胞中后整合至所述宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们所操作性地连接的基因的表达。所述载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。营养性多肽和氨基酸序列存在于膳食性食物来源中的蛋白质在它们的营养价值方面可极大变化。提供由于它们的氨基酸含量和可消化性而具有增强的营养价值以及生理和药理学作用的营养性多肽。提供具有增强的必需氨基酸水平的营养性多肽，所述必需氨基酸在某人中的可用性不足会通过细胞功能的网络的扰动来负面影响总体健康和生理机能，并且与一大批健康问题和疾病相关联。也提供某些氨基酸的水平降低的营养性多肽，所述氨基酸在受影响受试者的膳食中存在或过于丰富会导致致病性和致命性增加。在传统上，营养学家和健康研究者已利用特定来源成分(例如乳清蛋白质、蛋白、大豆)或分级物和分离物(例如大豆蛋白质分离物)来调节膳食中总蛋白质的相对浓度，而未能调节特定氨基酸组分。本文提供能够转变健康状况以及治疗、预防与氨基酸病理生理学相关的众多疾病、病症和病状和减轻其严重性的营养性多肽，因为它们由于特定生理益处被选择来改进健康状况和解决许多营养相关病状，包括胃肠吸收不良、肌肉损耗、糖尿病或糖尿病前期、肥胖症、肿瘤学疾病、代谢疾病和其它细胞和全身性疾病。也提供呈食物、饮料、医学食物、补充剂和药物形式的含有营养性多肽的组合物和制剂。本文在营养性多肽的基因组学、蛋白质组学、蛋白质表征和产生方面提供重要阐明。本发明利用在以下方面的本文所述的协同进步：(a)可食用物种—那些人食物来源生物体的基因组学和人基因组学，(b)在食物蛋白质和食物核酸文库中鉴定和定量蛋白质方面的实质性进步，(c)蛋白质物理化学、溶解度、结构-可消化性关系与氨基酸在动物和人中吸收和代谢之间的新关联，(d)营养性多肽的组分氨基酸如何影响蛋白质营养不良、慢性疾病、对急性损伤的应答和衰老的生理学和病理生理学信息，(e)利用在系统发生方面广泛范围的宿主生物体产生重组营养性多肽，(f)对过敏原性和产毒性的定性以及体外和体内测试以评估口服消耗的营养性多肽的人安全性。鉴定和选择编码营养性多肽的氨基酸序列。在营养性多肽的最广泛意义上，它涵盖能够向它的预期消耗者递送氨基酸和肽营养的多肽，所述消耗者从所述消耗获得益处。各营养性多肽含有一种或多种氨基酸序列，并且本发明提供氨基酸序列被鉴定和用于产生、配制和施用具有这种氨基酸序列的营养性多肽所依的方法。在一些实施方案中，营养性多肽氨基酸序列的来源涵盖已知由例如人或其它生物体(特定来说哺乳动物)进食，或另外被视为适于消耗，而无有害作用的任何含蛋白质物质，例如食物、饮料、组合物或其它产品。源于可食用物种的营养性多肽氨基酸序列。在一些实施方案中，营养性多肽包括天然存在于可食用产品(诸如食物)中，或产生用于食物中或用作食物的生物物质的生物体中的蛋白质或蛋白质的片段或由其组成。在一些实施方案中，“可食用物种”是已知会产生可由人进食而无有害作用的蛋白质的物种。存在于可食用物种中或由存在于可食用物种中的核酸编码的蛋白质或多肽称为“可食用物种蛋白质”或“可食用物种多肽”，或如果可食用物种是由人消耗的物种，那么术语“天然存在的人食物蛋白质”在本文中可互换使用。一些可食用产品是处于限定地理位置的仅一小组某一类型的哺乳动物的膳食的不常见但已知的组分，而其它可食用产品是遍及世界上大部分区域的膳食主要成分。在其它实施方案中，可食用产品是未知先前由任何哺乳动物进食，但在测试或分析产品或产品中含有的一种或多种蛋白质后被证明可食用的产品。食物生物体包括但不限于2013年3月15日提交的pct/us2013/032232、2013年3月15日提交的pct/us2013/032180、2013年3月15日提交的pct/us2013/032225、2013年3月15日提交的pct/us2013/032218、2013年3月15日提交的pct/us2013/032212、2013年3月15日提交的pct/us2013/032206以及2013年4月29日提交的pct/us2013/038682中公开的可食用物种的那些生物体和任何在系统发生方面相关的生物体。在一些实施方案中，营养性多肽氨基酸序列鉴定于存在于食物来源中的蛋白质(诸如食物中的丰富蛋白质)中，或是其衍生物或突变蛋白，或是食物中的蛋白质或其衍生物或突变蛋白的氨基酸序列的片段。丰富蛋白质是相对于食物中存在的其它蛋白质，以较高浓度存在于所述食物中的蛋白质。或者，营养性多肽氨基酸序列是从以相对较低丰度产生含有所述氨基酸序列的蛋白质的可食用物种鉴定，但所述蛋白质在源于所述可食用物种或由所述可食用物种产生的生物物质的食物产品中可检测到。在一些实施方案中，编码蛋白质的核酸在源于可食用物种的食物产品中可检测到，或所述核酸可从由可食用物种产生的生物物质检测到。可食用物种可产生是处于限定地理位置的仅一小组某一类型的哺乳动物的膳食的已知组分，或是遍及世界上大部分区域的膳食主要成分的食物。示例性可食用物种包括动物，诸如山羊、母牛、鸡、猪和鱼。在一些实施方案中，食物中的丰富蛋白质选自鸡蛋蛋白质，诸如卵清蛋白、卵铁传递蛋白和卵类粘蛋白；肉蛋白质，诸如肌球蛋白、肌动蛋白、原肌凝蛋白、胶原蛋白和肌钙蛋白；谷类蛋白质，诸如酪蛋白、α1酪蛋白、α2酪蛋白、β酪蛋白、κ酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、谷蛋白、谷醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、白蛋白、球蛋白；鸡肌肉蛋白质，诸如白蛋白、烯醇酶、肌酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸丙糖异构酶、载脂蛋白、卵铁传递蛋白、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、血红蛋白、丝切蛋白、糖原磷酸化酶、果糖-1,6-二磷酸酶、肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白a链、酪蛋白激酶、糖原磷酸化酶、果糖-1,6-二磷酸酶、醛缩酶、微管蛋白、波形蛋白、内质蛋白(endoplasmin)、乳酸脱氢酶、肌动蛋白解聚因子(destrin)、转甲状腺素蛋白、双磷酸果糖醛缩酶、碳酸酐酶、醛脱氢酶、膜联蛋白、腺苷基高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase)；猪肉肌肉蛋白质，诸如肌动蛋白、肌球蛋白、烯醇酶、肌联蛋白(titin)、丝切蛋白、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸脱氢酶、糖原磷酸化酶、磷酸丙糖异构酶、肌激酶；以及鱼蛋白质，诸如小白蛋白、丙酮酸脱氢酶、肌间线蛋白(desmin)和磷酸丙糖异构酶。营养性多肽可含有存在于可食用物种多肽中的氨基酸序列。在一个实施方案中，分析来自可食用物种的生物物质以测定所述生物物质中的蛋白质含量。一示例性分析方法在于使用对生物物质的质谱测定法分析，如以下实施例中所提供。另一示例性分析方法在于产生生物物质的cdna文库以产生可食用物种cdna的文库，接着在适当重组表达宿主中表达cdna文库，如以下实施例中所提供。另一示例性分析方法是查询核酸和/或蛋白质序列数据库，如以下实施例中所提供。测定营养性多肽中的氨基酸比率和氨基酸密度。在本文的一些情况下，特定类型的氨基酸在多肽、蛋白质或组合物内所占的部分是基于所述类型的氨基酸与所论述多肽、蛋白质或组合物中存在的氨基酸的总重量的重量比来定量。这个值是通过用多肽、蛋白质或组合物中的特定氨基酸的重量除以多肽、蛋白质或组合物中存在的所有氨基酸的重量来计算。在其它情况下，使用多肽或蛋白质中存在的特定类型的氨基酸残基与所论述多肽或蛋白质中存在的氨基酸的总数的比率。这个值是通过用各多肽或蛋白质分子中存在的所论述氨基酸的数目除以各多肽或蛋白质分子中存在的氨基酸残基的总数来计算。熟练技术人员了解的是这两种方法可互换，并且多肽或蛋白质中存在的某一类型的氨基酸的重量比例可换算成特定类型的氨基酸残基的比率，并且反之亦然。在一些方面，选择营养性多肽以具有一种或多种必需氨基酸(eaa)的所需密度。必需氨基酸缺乏症可以有效施用一种或多种另外不存在或以不足量存在于受试者的膳食中的必需氨基酸来治疗或预防。举例来说，eaa密度约等于或大于存在于诸如牛乳球蛋白、牛β-酪蛋白或牛i型胶原蛋白的全长参照营养性多肽中的必需氨基酸的密度，例如营养性多肽中的eaa密度比参照营养性多肽或存在于农业源性食物产品中的多肽大至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％或高于500％。在一些方面，选择营养性多肽以具有芳族氨基酸(“aaa”，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、组氨酸和甲状腺素)的所需密度。aaa例如适用于神经发育以及预防运动诱发的疲劳。举例来说，aaa密度约等于或大于存在于诸如牛乳球蛋白、牛β-酪蛋白或牛i型胶原蛋白的全长参照营养性多肽中的必需氨基酸的密度，例如营养性多肽中的aaa密度比参照营养性多肽或存在于农业源性食物产品中的多肽大至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％或高于500％。在一些方面，选择营养性多肽以具有支链氨基酸(bcaa)的所需密度。举例来说，个别bcaa或总bcaa内含物的bcaa密度约等于或大于存在于诸如牛乳球蛋白、牛β-酪蛋白或牛i型胶原蛋白的全长参照营养性多肽中的支链氨基酸的密度，例如营养性多肽中的bcaa密度比参照营养性多肽或存在于农业源性食物产品中的多肽大至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％或高于500％。也可选择营养性多肽中的bcaa密度以与一种或多种属性(诸如eaa密度)组合。在一些方面，选择营养性多肽以具有氨基酸精氨酸、谷氨酰胺和/或亮氨酸(rql氨基酸)的所需密度。举例来说，rql氨基酸密度约等于或大于存在于诸如牛乳球蛋白、牛β-酪蛋白或牛i型胶原蛋白的全长参照营养性多肽中的必需氨基酸的密度，例如营养性多肽中的rql氨基酸密度比参照营养性多肽或存在于农业源性食物产品中的多肽大至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％或高于500％。在一些方面，选择营养性多肽以具有翻译后修饰(ptm)的所需密度或分布。举例来说，ptm包括添加、移除或重新分布生物素化、聚乙二醇化、酰化、烷基化、丁酰化、糖基化、羟基化、碘化、氧化、丙酰化、丙二酰化、豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、丁二酰化、硒化、sumo化、泛素化以及糖基磷脂酰肌醇化移除或重新分布二硫桥键。在本文的某些实施方案中，乳清、蛋或大豆中的支链氨基酸、亮氨酸和/或必需氨基酸的重量比例用作测量多肽、蛋白质或包含多肽和蛋白质中的至少一个的组合物的氨基酸组成的基准。在那些实施方案中，应了解两种量度不完全等效，但也应了解所述量度产生的测量结果足够类似来用于这个目的。举例来说，当目标蛋白质被表征为包含的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于24％(乳清中存在的支链氨基酸残基的重量比例)时，那就是对蛋白质的支链氨基酸含量的精确描述。同时，那个蛋白质中存在的支链氨基酸残基的重量比例未必恰好等于24％。即使如此，熟练技术人员也应了解这是一种适用比较。如果提供目标蛋白质中存在的氨基酸残基的总数，那么熟练技术人员也可确定目标蛋白质中的支链氨基酸残基的重量比例。在一些实施方案中，本公开的蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包括可食用物种多肽的片段。在营养性蛋白质的一些实施方案中，蛋白质由第一多肽序列组成。在营养性蛋白质的一些实施方案中，蛋白质由可食用物种多肽的片段组成。在一些实施方案中，本公开的蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于存在于乳清蛋白质、蛋蛋白质和大豆蛋白质中的至少一个中的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。因此，在所述实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于选自24％、20％和18％的比率。在其它实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、80、85、90、95或100％的百分比率。在一些实施方案中，本公开的蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的l(亮氨酸)残基与总氨基酸残基的比率等于或大于存在于乳清蛋白质、蛋蛋白质和大豆蛋白质中的至少一个中的l残基与总氨基酸残基的比率。在其它实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的亮氨酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或大于30％的百分比率。在一些实施方案中，本公开的蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于存在于乳清蛋白质、蛋蛋白质和大豆蛋白质中的至少一个中的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。在其它实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的必需链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、80、85、90、95或100％的百分比率。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于存在于乳清蛋白质、蛋蛋白质和大豆蛋白质中的至少一个中的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率；和/或包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的l(亮氨酸)残基与总氨基酸残基的比率等于或大于存在于乳清蛋白质、蛋蛋白质和大豆蛋白质中的至少一个中的l残基与总氨基酸残基的比率，和/或包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于存在于乳清蛋白质、蛋蛋白质和大豆蛋白质中的至少一个中的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于存在于乳清蛋白质、蛋蛋白质和大豆蛋白质中的至少一个中的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率；以及包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于存在于乳清蛋白质、蛋蛋白质和大豆蛋白质中的至少一个中的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于24％的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率以及等于或大于49％的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于20％的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率以及等于或大于51％的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于18％的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率以及等于或大于40％的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的l(亮氨酸)残基与总氨基酸残基的比率等于或大于存在于乳清蛋白质、蛋蛋白质和大豆蛋白质中的至少一个中的l残基与总氨基酸残基的比率；以及包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率等于或大于存在于乳清蛋白质、蛋蛋白质和大豆蛋白质中的至少一个中的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于11％的l(亮氨酸)残基与总氨基酸残基的比率以及等于或大于49％的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于9％的l(亮氨酸)氨基酸残基与总氨基酸残基的比率以及等于或大于51％的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于8％的l(亮氨酸)氨基酸残基与总氨基酸残基的比率以及等于或大于40％的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。在蛋白质的一些实施方案中，第一多肽序列包括包含等于或大于24％的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率、等于或大于11％的l(亮氨酸)残基与总氨基酸残基的比率的第一多肽序列，并且包含每种必需氨基酸中的至少一种。在蛋白质的一些实施方案中，第一多肽序列包括包含等于或大于24％的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率和等于或大于49％的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率的第一多肽序列。提供营养全面的营养性多肽。在蛋白质的一些实施方案中，第一多肽序列包括含有每种必需氨基酸中的至少一种的第一多肽序列。糖基化被调节的营养性糖蛋白和营养性多肽。术语“聚糖”或“糖基”是指可被连接于多肽、脂质或蛋白聚糖的多糖或寡糖。在一些实施方案中，聚糖共价或非共价连接于多肽。在一些实施方案中，键联通过糖苷键而发生。在一些实施方案中，键联直接介于聚糖(或糖基)与多肽之间或通过中间分子来达成。在一些实施方案中，糖苷键是n连接的或o连接的。术语“多糖”或“寡糖”是指一个或多个由糖苷键接合在一起的单糖单元。在一些实施方案中，多糖或寡糖具有直链或分支结构。在一些实施方案中，单糖单元包括n-乙酰基半乳糖胺、n-乙酰基葡萄糖胺、半乳糖、神经氨酸、果糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、n-乙酰基神经氨酸、n-羟乙酰基神经氨酸、o-乳酰基-n-乙酰基神经氨酸、o-乙酰基-n-乙酰基神经氨酸或o-甲基-n-乙酰基神经氨酸。在一些实施方案中，单糖被磷酸酯、硫酸酯或乙酸酯基团修饰。术语“糖基化接受体位点”是指沿多肽的在天然组成中携带聚糖或糖基的氨基酸。在一些实施方案中，接受体位点由糖苷键的亲核接受体组成。在一些实施方案中，亲核接受体位点由氨基组成。在一些实施方案中，氨基酸由天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、色氨酸、磷酸苏氨酸、丝氨酸或磷酸丝氨酸组成。术语“外源性糖基化接受体位点”是指不存在于多肽的天然组成中的糖基化接受体位点。在一些实施方案中，外源性糖基化接受体位点的氨基酸在天然组成中不携带聚糖或糖基。在一些实施方案中，在天然组成中，所述氨基酸不存在于多肽的一级序列中。术语“外源性聚糖”或“外源性糖基”是指占据糖基化接受体位点的聚糖或糖基，其在天然组成中不存在于同一糖基化接受体位点上。在一些实施方案中，糖基化接受体位点是外源性糖基化位点或天然糖基化位点。术语“糖蛋白”是指结合于至少一种聚糖或糖基的多肽。本文公开含有分离的营养性多肽的制剂，其中至少一个外源性糖基化接受体位点存在于营养性多肽的氨基酸上。在一些方面，至少一个外源性糖基化接受体位点由外源性糖基或聚糖占据，或者未被占据，或由非天然占据性糖基或聚糖占据。在一些实施方案中，营养性多肽是氨基酸序列与seqid00001-03909和seqid04129-44483至少90％同一的多肽，或是长度是至少50个氨基酸的可食用物种多肽序列或其片段，或是当糖基化接受体位点不存在或未被占据时具有实质性免疫原性的多肽。营养性多肽比氨基酸序列与营养性多肽同一，但糖基化接受体位点不存在或在参照多肽中未被占据的所述参照多肽更加热稳定，更可消化，和/或具有较低聚集评分。含有外源性糖基化接受体位点的氨基酸(例如天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、羟基脯氨酸和羟基赖氨酸)对蛋白水解具有抗性。示例性聚糖是n-乙酰基半乳糖胺、n-乙酰基葡萄糖胺、半乳糖、神经氨酸、果糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、n-乙酰基神经氨酸、n-羟乙酰基神经氨酸、o-乳酰基-n-乙酰基神经氨酸、o-乙酰基-n-乙酰基神经氨酸和o-甲基-n-乙酰基神经氨酸。在一些实施方案中，提供含有营养性多肽的制剂，所述营养性多肽与参照可食用物种糖蛋白中的多肽的氨基酸序列同一，但所述营养性多肽的碳水化合物组分不同于所述参照可食用物种糖蛋白的碳水化合物组分。例如通过在非天然宿主中表达参照糖蛋白的多肽来产生营养性多肽，所述宿主诸如曲霉属(aspergillus)、芽孢杆菌属(bacillus)、酵母属(saccharomyces)或哺乳动物细胞。也提供变异营养性多肽，其中氨基酸序列与参照糖蛋白中的多肽的氨基酸序列有<1％、<5％、<10％或大于10％的不同，并且营养性多肽的碳水化合物组分的质量不同于参照糖蛋白的碳水化合物组分的质量。通过在参照糖蛋白的多肽的氨基酸序列中插入、缺失、取代或置换氨基酸残基来产生营养性多肽变体。优选地，营养性多肽与参照糖蛋白具有可区分的化学、生物化学、生物物理、生物或免疫性质。举例来说，营养性多肽比参照糖蛋白更吸湿、亲水或可溶于水溶液中。或者，营养性多肽的吸湿性、亲水性或在水溶液中的可溶性小于参照糖蛋白。在另一实例中，营养性多肽比参照糖蛋白更具抗原性、免疫原性或过敏原性，或者，营养性多肽的抗原性、免疫原性或过敏原性小于参照糖蛋白。营养性多肽比参照糖蛋白更稳定或对酶促降解更具抗性，营养性多肽比参照糖蛋白更不稳定或更易受酶促降解。营养性多肽的碳水化合物组分大致上不含n-羟乙酰基神经氨酸或相较于参照糖蛋白具有降低的n-羟乙酰基神经氨酸。或者，相较于参照糖蛋白，营养性多肽的碳水化合物组分具有升高的n-羟乙酰基神经氨酸。也提供一种营养性多肽，其具有至少一个存在于所述营养性多肽的氨基酸上的外源性糖基化接受体位点，并且所述至少一个外源性糖基化接受体位点由外源性糖基或聚糖占据，并且所述营养性多肽包括氨基酸序列与seqid00001-03909和seqid04129-44483至少90％同一的多肽，其中基于质量，所述营养性多肽以至少0.5g在至少10％的浓度下存在，并且其中制剂大致上不含非可食产品。参照营养性多肽和参照营养性多肽混合物。通常被认为是高品质氨基酸的良好来源的三种天然蛋白质来源是乳清蛋白质、蛋蛋白质和大豆蛋白质。各来源包含多种蛋白质。表rnp1呈现各氨基酸在蛋白质来源中的表示为百分比的重量比例表示(gaa/g蛋白质)。表rnp2呈现各蛋白质来源的必需氨基酸、支链氨基酸(l、i和v)和亮氨酸(l)(单独)重量比例。被依赖来确定乳清的氨基酸含量的出处是：belitzhd.,groschw.和schieberlep.foodchemistry(第4版).springer-verlag,berlinheidelberg2009；gnc.com/product/index.jsp？productid＝2986027；nutrabio.com/products/whey_protein_concentrate.htm；以及nutrabio.com/products/whey_protein_isolate.htm。将来自那些出处的氨基酸含量值平均化以给出表rnp1和rnp2中呈现的数值。用于大豆蛋白质的出处是egg,nationalnutrientdatabaseforstandardreference,发布版24(ndb.nal.usda.gov/ndb/foods/list)。用于大豆蛋白质的出处是selfnutritiondata(nutritiondata.self.com/facts/legumes-and-legume-products/4389/2)。根据usda营养数据库，乳清可包括各种非蛋白质组分：水、脂质(诸如脂肪酸和胆固醇)、碳水化合物和糖、矿物质(诸如ca、fe、mg、p、k、na和zn)和维生素(诸如维生素c、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素b-6、叶酸、维生素b-12和维生素a)。根据usda营养数据库，蛋白可包括各种非蛋白质组分：水、脂质、碳水化合物、矿物质(诸如ca、fe、mg、p、k、na和zn)和维生素(诸如硫胺素、核黄素、烟酸、维生素b-6、叶酸和维生素b-12)。根据usda营养数据库，大豆可包括各种非蛋白质组分：水、脂质(诸如脂肪酸)、碳水化合物、矿物质(诸如ca、fe、mg、p、k、na和zn)和维生素(诸如硫胺素、核黄素、烟酸、维生素b-6、叶酸)。工程改造的营养性多肽。在一些实施方案中，蛋白质包括蛋白质的衍生物或突变蛋白、或可食用物种蛋白质或天然存在于食物产品中的蛋白质的片段或由其组成。这种蛋白质可被称为“工程改造的蛋白质”。在所述实施方案中，天然蛋白质或其片段是“参照”蛋白质或多肽，并且工程改造的蛋白质或其第一多肽序列相对于参照蛋白质或多肽的氨基酸序列包含至少一种序列修饰。举例来说，在一些实施方案中，工程改造的蛋白质或其第一多肽序列与至少一种参照蛋白质氨基酸序列是至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一的。通常，存在于工程改造的蛋白质或其第一多肽序列中的支链氨基酸残基与总氨基酸残基、必需氨基酸残基与总氨基酸残基、以及亮氨酸残基与总氨基酸残基中的至少一个的比率大于存在于参照蛋白质或多肽序列中的支链氨基酸残基与总氨基酸残基、必需氨基酸残基与总氨基酸残基、以及亮氨酸残基与总氨基酸残基中的至少一个的相应比率。营养性多肽—直系同源物和同源物。在另一方面，提供含有与可食用物种多肽同源的氨基酸序列的营养性多肽，其任选从单细胞生物体分泌并从其纯化。所述同源性多肽可为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％类似的，或可与可食用物种多肽70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一。所述营养性多肽对于宿主细胞可为内源性的或外源性的，可在宿主细胞中天然分泌，或两者，并且可被工程改造以达成分泌。也提供营养性多肽的直系同源物。对营养性多肽序列的公开涵盖对这种营养性多肽序列的来自在系统发生方面相关的生物体，或者来自与营养性多肽同源的在系统发生方面不同的生物体的所有直系同源物的公开，诸如30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％类似，或可为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一的。营养性多肽片段、营养性多肽长度。在本文的一些实施方案中，营养性多肽含有可食用物种多肽的片段。在一些实施方案中，片段包含至少25个氨基酸。在一些实施方案中，片段包含至少50个氨基酸。在一些实施方案中，片段由至少25个氨基酸组成。在一些实施方案中，片段由至少50个氨基酸组成。在一些实施方案中，提供一种分离的重组蛋白。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，并且所述第一多肽序列包括可食用物种蛋白质的具有至少25或至少50个氨基酸的片段。在一些实施方案中，蛋白质是分离的。在一些实施方案中，蛋白质是重组的。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包括可食用物种蛋白质的具有至少50个氨基酸的片段。在一些实施方案中，蛋白质是分离的重组蛋白。在一些实施方案中，本文公开的分离的重组蛋白以非分离和/或非重组形式提供。在一些实施方案中，蛋白质包含10至5,000个氨基酸、20-2,000个氨基酸、20-1,000个氨基酸、20-500个氨基酸、20-250个氨基酸、20-200个氨基酸、20-150个氨基酸、20-100个氨基酸、20-40个氨基酸、30-50个氨基酸、40-60个氨基酸、50-70个氨基酸、60-80个氨基酸、70-90个氨基酸、80-100个氨基酸、至少10个氨基酸、至少11个氨基酸、至少12个氨基酸、至少13个氨基酸、至少14个氨基酸、至少15个氨基酸、至少16个氨基酸、至少17个氨基酸、至少18个氨基酸、至少19个氨基酸、至少20个氨基酸、至少21个氨基酸、至少22个氨基酸、至少23个氨基酸、至少24个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸、至少50个氨基酸、至少55个氨基酸、至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少80个氨基酸、至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少95个氨基酸、至少100个氨基酸、至少105个氨基酸、至少110个氨基酸、至少115个氨基酸、至少120个氨基酸、至少125个氨基酸、至少130个氨基酸、至少135个氨基酸、至少140个氨基酸、至少145个氨基酸、至少150个氨基酸、至少155个氨基酸、至少160个氨基酸、至少165个氨基酸、至少170个氨基酸、至少175个氨基酸、至少180个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸、至少200个氨基酸、至少205个氨基酸、至少210个氨基酸、至少215个氨基酸、至少220个氨基酸、至少225个氨基酸、至少230个氨基酸、至少235个氨基酸、至少240个氨基酸、至少245个氨基酸或至少250个氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质由20至5,000个氨基酸、20-2,000个氨基酸、20-1,000个氨基酸、20-500个氨基酸、20-250个氨基酸、20-200个氨基酸、20-150个氨基酸、20-100个氨基酸、20-40个氨基酸、30-50个氨基酸、40-60个氨基酸、50-70个氨基酸、60-80个氨基酸、70-90个氨基酸、80-100个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少2455个氨基酸、至少50个氨基酸、至少55个氨基酸、至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少80个氨基酸、至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少95个氨基酸、至少100个氨基酸、至少105个氨基酸、至少110个氨基酸、至少115个氨基酸、至少120个氨基酸、至少125个氨基酸、至少130个氨基酸、至少135个氨基酸、至少140个氨基酸、至少145个氨基酸、至少150个氨基酸、至少155个氨基酸、至少160个氨基酸、至少165个氨基酸、至少170个氨基酸、至少175个氨基酸、至少180个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸、至少200个氨基酸、至少205个氨基酸、至少210个氨基酸、至少215个氨基酸、至少220个氨基酸、至少225个氨基酸、至少230个氨基酸、至少235个氨基酸、至少240个氨基酸、至少245个氨基酸或至少250个氨基酸组成。在一些方面，蛋白质或其片段包括至少两个结构域：第一结构域和第二结构域。两个结构域中的一个可包括必要时可被移除的标签结构域。各结构域的长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或大于25个氨基酸。举例来说，第一结构域可为长度是18个氨基酸的目标多肽，而第二结构域可为长度是7个氨基酸的标签结构域。作为另一实例，第一结构域可为长度是17个氨基酸的目标多肽，而第二结构域可为长度是8个氨基酸的标签结构域。在本文的一些实施方案中，选择以及任选分离可食用物种多肽的片段。在一些实施方案中，片段包含至少25个氨基酸。在一些实施方案中，片段包含至少50个氨基酸。在一些实施方案中，片段由至少25个氨基酸组成。在一些实施方案中，片段由至少50个氨基酸组成。在一些实施方案中，提供一种分离的重组蛋白。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，并且所述第一多肽序列包括可食用物种蛋白质的具有至少25或至少50个氨基酸的片段。在一些实施方案中，蛋白质是分离的。在一些实施方案中，蛋白质是重组的。在一些实施方案中，蛋白质包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包括可食用物种蛋白质的具有至少50个氨基酸的片段。在一些实施方案中，蛋白质是分离的重组蛋白。在一些实施方案中，本文公开的分离的营养性多肽以非分离和/或非重组形式提供。营养性多肽物理化学性质。可消化性。在一些方面，在由哺乳动物受试者消耗后，营养性多肽大致上可消化。优选地，营养性多肽比至少参照多肽或参照多肽混合物或消耗性受试者的膳食中的其它多肽的一部分更易于消化。如本文所用，“大致上可消化”可通过在消耗后测量营养性多肽的半衰期来说明。举例来说，如果营养性多肽在人受试者的胃肠道中的半衰期小于60分钟或小于50、40、30、20、15、10、5、4、3、2分钟或1分钟，那么它较易于消化。在某些实施方案中，以提供消化增强的制剂形式提供营养性多肽；例如提供不含其它多肽或其它物质的营养性多肽。在一些实施方案中，营养性多肽含有一个或多个供一种或多种內肽酶使用的识别位点。在一特定实施方案中，营养性多肽含有分泌前导(或促分泌前导)序列，其接着从营养性多肽裂解。如本文所提供，营养性多肽涵盖具有或不具有信号肽和/或促分泌前导序列的多肽。在一些实施方案中，营养性多肽易受一种或多种外肽酶的裂解。消化测定可消化性是与蛋白质的益处和效用相关的参数。与相对消化完全性相关的信息可充当肽生物可用度的预测因子(daniel,h.,2003.molecularandintegrativephysiologyofintestinalpeptidetransport.annualreviewofphysiology,第66卷,第361-384页)。在一些实施方案中，筛选本文公开的蛋白质以评估它们的可消化性。可通过本领域中已知的任何适合方法来评估蛋白质的可消化性。在一些实施方案中，可消化性是通过包括一个或两个蛋白质消化阶段(即模拟胃消化和模拟肠消化)的生理相关体外消化反应来评估(参见例如moreno等,2005.stabilityofthemajorallergenbrazilnut2salbumin(bere1)tophysiologicallyrelevantinvitrogastrointestinaldigestion.febsjournal,第341-352页；martos,g.,contreras,p.,molina,e.和lopez-fandino,r.,2010.eggwhiteovalbumindigestionmimickingphysiologicalconditions.journalofagriculturalandfoodchemistry,第5640-5648页；moreno,f.j.,mackie,a.r.和claremills,e.n.,2005).phospholipidinteractionsprotectthemilkallergena-lactalbuminfromproteolysisduringinvitrodigestion.journalofagriculturalandfoodchemistry,第9810-9816页)。简要来说，使测试蛋白质依序暴露于模拟胃液(sgf)120分钟(使90％液体餐食自胃传至小肠所花费的时长；参见kong,f.和singh,r.p.,2008.disintegrationofsolidfoodsinhumanstomach.journaloffoodscience,第67-80页)，接着转移至模拟十二指肠液(sdf)中以再消化120分钟。通过电泳(例如芯片电泳或sds-page)分析不同消化阶段(例如2、5、15、30、60和120分钟)的样品以监测完整蛋白质以及任何大型消化片段(例如大于4kda)的大小和数量。蛋白质随时间消失指示蛋白质在测定中被消化的速率。通过监测随时间观察到的完整蛋白质的量，计算sgf消化半衰期(τ1/2)，并且如果在用sgf处理之后检测到完整蛋白质，那么计算sif消化τ1/2。这个测定可用于评估比较可消化性(即相对于诸如乳清的基准蛋白质)或评估绝对可消化性。在一些实施方案中，蛋白质的可消化性高于(即sgfτ1/2和/或sifτ1/2较短)乳清蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质的sgfτ1/2是30分钟或小于30分钟、20分钟或小于20分钟、15分钟或小于15分钟、10分钟或小于10分钟、5分钟或小于5分钟、4分钟或小于4分钟、3分钟或小于3分钟、2分钟或小于2分钟、或1分钟或小于1分钟。在一些实施方案中，蛋白质的sifτ1/2是30分钟或小于30分钟、20分钟或小于20分钟、15分钟或小于15分钟、10分钟或小于10分钟、5分钟或小于5分钟、4分钟或小于4分钟、3分钟或小于3分钟、2分钟或小于2分钟、或1分钟或小于1分钟。在一些实施方案中，截至2分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟或120分钟，在sgf测定和sif测定中的一者或两者中不可检测到蛋白质。在一些实施方案中，在sgf和sif中的一者或两者中，蛋白质在恒定速率下和/或在控制速率下被消化。在所述实施方案中，可不使蛋白质的消化速率优化以达成最高可能的消化速率。在所述实施方案中，相较于在sgf和sif中的一者或两者中在较快初始速率下消化的具有类似氨基酸组成的蛋白质，蛋白质在由哺乳动物摄取之后的吸收速率可较慢，并且在摄取之后进行吸收所历经的总时期可较长。在一些实施方案中，蛋白质在sgf中被完全或大致上完全消化。在一些实施方案中，蛋白质大致上未由sgf消化或未由sgf消化；在大多数所述实施方案中，蛋白质在sif中被消化。评估蛋白质可消化性也可提供对蛋白质的潜在过敏原性的了解，因为对消化性蛋白酶具有抗性的蛋白质或蛋白质的大片段可具有导致过敏原性反应的较高风险(goodman,r.e.等,2008.allergenicityassessmentofgeneticallymodifiedcrops-whatmakessense？naturebiotechnology,第73-81页)。为检测和鉴定太小以致不能进行芯片电泳分析的肽，可使用液相色谱法和质谱测定法。在sgf样品中，可通过lc/ms直接检测和鉴定肽。sif蛋白质消化可需要在通过lc/ms检测和鉴定之前进行纯化以移除胆汁酸。在一些实施方案中，蛋白质的可消化性是通过鉴定和定量蛋白质氨基酸序列中的消化性蛋白酶识别位点来评估。在一些实施方案中，蛋白质包含至少一个选自胃蛋白酶识别位点、胰蛋白酶识别位点和胰凝乳蛋白酶识别位点的蛋白酶识别位点。如本文所用，“胃蛋白酶识别位点”是多肽序列中以实验方式显示由胃蛋白酶裂解的任何位点。在一些实施方案中，所述位点是在选自phe、trp、tyr、leu、ala、glu和gln的氨基酸残基之后(即下游)的肽键，前提是随后残基不是选自ala、gly和val的氨基酸残基。如本文所用，“胰蛋白酶识别位点”是多肽序列中以实验方式显示由胰蛋白酶裂解的任何位点。在一些实施方案中，所述位点是在选自lys或arg的氨基酸残基之后的肽键，前提是随后残基不是脯氨酸。如本文所用，“胰凝乳蛋白酶识别位点”是多肽序列中以实验方式显示由胰凝乳蛋白酶裂解的任何位点。在一些实施方案中，所述位点是在选自phe、trp、tyr和leu的氨基酸残基之后的肽键。相较于在不存在二硫键下将达成的消化速率，蛋白质中的二硫键键合的半胱氨酸残基倾向于降低蛋白质的消化速率。举例来说，已显示当蛋白质b-乳球蛋白的二硫桥键被裂解时，它的消化速率增加(i.m.reddy,n.k.d.kella和j.e.kinsella.“structuralandconformationalbasisoftheresistanceofb-lactoglobulintopepticandchymotrypticdigestion”.j.agric.foodchem.1988,36,737-741)。因此，二硫键较少的蛋白质的可消化性倾向于高于二硫键的数目较大的类似蛋白质。在一些实施方案中，筛选本文公开的蛋白质以鉴定各蛋白质中存在的半胱氨酸残基的数目，并且特定来说以允许选择包含相对较低数目的半胱氨酸残基的蛋白质。举例来说，可鉴定不包含cys残基或包含相对较低数目的cys残基，诸如10个或少于10个cys残基、9个或少于9个cys残基、8个或少于8个cys残基、7个或少于7个cys残基、6个或少于6个cys残基、5个或少于5个cys残基、4个或少于4个cys残基、3个或少于3个cys残基、2个或少于2个cys残基、1个cys残基，或不包含cys残基的可食用物种蛋白质或片段。在一些实施方案中，通过缺失和/或通过用另一氨基酸取代来移除可食用物种蛋白质或其片段中的一个或多个cys残基。在一些实施方案中，缺失或置换1个cys残基，缺失或置换1个或大于1个cys残基，缺失或置换2个或大于2个cys残基，缺失或置换3个或大于3个cys残基，缺失或置换4个或大于4个cys残基，缺失或置换5个或大于5个cys残基，缺失或置换6个或大于6个cys残基，缺失或置换7个或大于7个cys残基，缺失或置换8个或大于8个cys残基，缺失或置换9个或大于9个cys残基，或缺失或置换10个或大于10个cys残基。在一些实施方案中，本公开的蛋白质包含的cys残基与总氨基酸残基的比率等于或低于5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施方案中，蛋白质包含10个或少于10个cys残基、9个或少于9个cys残基、8个或少于8个cys残基、7个或少于7个cys残基、6个或少于6个cys残基、5个或少于5个cys残基、4个或少于4个cys残基、3个或少于3个cys残基、2个或少于2个cys残基、1个cys残基，或不包含cys残基。在一些实施方案中，蛋白质包含1个或少于1个cys残基。在一些实施方案中，蛋白质不包含cys残基。或者或此外，可移除存在于或可存在于蛋白质中的二硫键。可使用化学方法，通过用诸如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(dtt)或三(2-羧乙基)膦(tcep)的还原剂将二硫化物还原成两个硫醇基团来移除二硫化物。硫醇可接着用诸如碘乙酰胺、n-乙基顺丁烯二酰亚胺或亚硫酸钠的试剂共价修饰或“加帽”(参见例如crankshaw,m.w.和grant,g.a.2001.modificationofcysteine.currentprotocolsinproteinscience.15.1.1–15.1.18)。粘度被调节的营养性多肽和营养性多肽制剂。本文公开含有粘度调节性营养性多肽的组合物、制剂和食物产品。在一个方面，提供大致上不含非可食产品的制剂，其含有以营养量存在的营养性多肽，并且营养性多肽使食物产品的粘度降低。在一些实施方案中，营养性多肽以约10g/l存在，并且制剂的粘度是在25℃下约1,000mpas至约10,000mpas，诸如在25℃下约2,500mpas至约5,000mpas。制剂被并入具有超过缺乏营养性多肽的类似食物产品的优势的食物产品中，或制剂被并入诸如饮料产品或动物饲料产品的其它产品中。举例来说，相较于不具有营养性多肽的食物产品，所述食物产品具有降低的脂肪含量、降低的糖含量和/或降低的卡路里含量。优选地，营养性多肽存在于食物产品中以使消耗营养量的食物产品具有饱足性。在本发明的一实施方案中，明胶(一种动物源性物质)被含有一种或多种营养性多肽的非动物源性产品替换。通常，营养性多肽以有效替换产品中的明胶的量存在。明胶替换物被并入食物产品、饮料产品或动物饲料产品中，并且制剂大致上不含非可食产品。也提供含有以功能量和/或营养量存在，使食物或饮料产品的粘度增加的营养性多肽的制剂，诸如并入食物产品中的含有粘度增加性营养性多肽的制剂，所述食物产品具有超过缺乏营养性多肽的类似食物产品的优势。举例来说，相较于不具有营养性多肽的食物产品，所述食物产品具有降低的脂肪含量、降低的糖含量和/或降低的卡路里含量。粘稠营养性多肽可用作在营养方面有利的低卡路里脂肪替代物。另外，可能需要向组合物和产品中添加一种或多种多糖或乳化剂，从而导致奶油口感进一步改进。在一些实施方案中，通过使营养性多肽交联或使营养性多肽与存在于物质中的其它蛋白质交联来增强含有营养性多肽的物质的粘度。有效交联剂的一实例是转谷氨酰胺酶，其使蛋白质在赖氨酸残基的ε-氨基与谷氨酰胺残基的γ-甲酰胺基团之间交联，从而形成稳定共价键。通过制备转谷氨酰胺酶偶联的营养性蛋白质组合物，随后进行凝胶强度和乳化强度测定来考查如本文所述鉴定和产生的营养性多肽的所得凝胶强度和乳化强度。根据美国专利号5,156,956的教义的源于微生物的适合转谷氨酰胺酶可商购获得。这些可商购获得的转谷氨酰胺酶通常具有约100单位的酶活性。添加至分离的营养性多肽中的转谷氨酰胺酶(具有约100单位的活性)的量表示为转谷氨酰胺酶浓度，其是每100克分离的营养性多肽对应的转谷氨酰胺酶单位数。分离的营养性多肽含有5至95％，优选20至80％，优选58％至72％蛋白质，以及也优选62％至68％蛋白质。转谷氨酰胺酶浓度是每克蛋白质至少0.15，优选0.25，以及最优选0.30单位转谷氨酰胺酶，直至每克蛋白质0.80，以及优选0.65单位转谷氨酰胺酶。可使用更高以及更低量。这个酶处理也可继之以热处理以制备含有营养性多肽的粘稠溶液。为产生含有交联的营养性多肽样品，使样品与转谷氨酰胺酶溶液在ph7.0下混合以给出酶与蛋白质重量比1:25。在大多数实验中，在40℃下进行酶催化的交联反应。振荡剪切测量可用于探究营养性多肽的流变性质。此外，为测定营养性多肽溶液和凝胶的粘度，通过动态振荡流变测定法来探究粘弹性。将营养性多肽溶液或含有转谷氨酰胺酶的营养性多肽溶液的2ml样品倾入流变仪的couette型圆柱池(内径2.5cm，外径2.75cm)中，并且用低粘度硅油薄层覆盖以防止蒸发。对于存在酶的样品，通过在40℃下孵育来原位诱导胶凝。对于无酶的营养性多肽样品，通过使样品经受以下热处理过程来诱导胶凝：在2kmin-1的恒定速率下使温度从40℃增加至90℃，在90℃下保持30分钟，在1kmin-1下从90℃冷却至30℃，并且在30℃下保持15分钟。一些样品可在酶处理之后经受这个热处理。小变形剪切流变性质主要在线性粘弹性方案(最大应变幅度0.5％)中测定，其中在1hz的恒定频率下测量储存和损耗模量(g‘和g“)。此外，随频率而变(例如2×10-3至2hz)来进行一些小变形测量，并且在多达接近100％的应变下进行一些大变形测量。用于预防和治疗糖尿病和肥胖症的营养性多肽及其产生和用于葡萄糖和卡路里控制的方法提供适用于预防和治疗糖尿病和肥胖症的营养性多肽以及含有营养性多肽的组合物和制剂，及其产生和用于葡萄糖和卡路里控制的方法。营养性多肽也适用于治疗和预防受试者，特别是经受糖尿病治疗或处于重量管理治疗下的受试者的肌肉质量和肌肉功能的损失。此外，营养性多肽进一步适用于降低或防止治疗性或防治性糖尿病治疗方案的副作用(其意指药物制剂或医学治疗的通常不合需要的继发性作用)，因为除导致肌肉质量和肌肉功能损失之外，所述方案也可导致氨基酸为受试者的可用性降低。已显示成人中的棕色脂肪沉积物由棕色脂肪细胞和米色脂肪细胞的组合组成(参见wu,jun等"beigeadipocytesareadistincttypeofthermogenicfatcellinmouseandhuman."cell150.2(2012):366-376)。棕色脂肪通过线粒体解偶联蛋白ucp1来产热，从而防御低温和肥胖。米色脂肪细胞是在特定刺激(寒冷和运动)下转换成棕色脂肪样细胞的白色脂肪细胞。白色脂肪“棕色化”现象是白色脂肪组织储库获得产热性脂肪燃烧性质所依的过程，并且特征在于解偶联蛋白ucp1的基因表达显著增加。最初，类似于白色脂肪细胞，米色脂肪细胞具有极低ucp1基础表达，但它们以高ucp1表达和呼吸速率应答于环amp刺激，这类似于棕色脂肪细胞。ucp1是一种位于线粒体的内膜中的在耗散呈热量而非atp形式的能量方面起主要作用的跨膜蛋白。局限于棕色或米色脂肪细胞，它提供用以通过非战栗产热作用来产热的独特机理。在体内，长期寒冷暴露或运动(肾上腺素能刺激)会开启高水平的ucp1表达。在体外，冷处理、电脉冲、β3-肾上腺素能药剂(肾上腺素和去甲肾上腺素)或维生素a的活性代谢物视黄酸刺激ucp1表达。当肌肉收缩时，pgc-1α(过氧化物酶体增殖物活化的受体γ共活化子1-α)(即一种调控线粒体生物发生和呼吸的转录活化子)被活化。肌肉细胞中增加水平的pgc-1α通过结合核受体和转录因子来控制一组广泛代谢程序。举例来说，pgc-1α诱导i型膜蛋白fndc5，其被裂解以形成肌因子激素鸢尾素(irisin)。一旦处于循环中，鸢尾素即作用于wa，并且诱导ucp1和其它棕色脂肪相关的基因的表达。鸢尾素与作为从骨骼肌分泌的缬氨酸的代谢物的α-氨基异丁酸(baiba)两者均已被鉴定为白色脂肪细胞(wa)向米色脂肪细胞(bea)的转化中涉及的试剂，并且两者均由骨骼肌纤维在身体活动期间表达和释放(pontus等"apgc1-[agr]-dependentmyokinethatdrivesbrown-fat-likedevelopmentofwhitefatandthermogenesis."nature481.7382(2012):463-468.；robertsl.d.等b-aminoisobutyricacidinducesbrowningofwhitefatandhepaticb-oxidationandisinverselycorrelatedwithcardiometabolicriskfactors.cellmetab.(2014)19:96-108)。pgc1-α是哺乳动物雷帕霉素靶标(mtor)路径的下游靶标(cunningham,j.t.等mtorcontrolsmitochondrialoxidativefunctionthroughayy1-pgc-1alphatranscriptionalcomplex.nature(2007)450:736-740.)。这个路径由检查点蛋白质激酶mtor复合物i控制，所述复合物是一种在活化时开启控制蛋白质合成机构的表达、线粒体生物发生以及重新脂肪生成的许多生长因子的多蛋白装配体(laplantem.,sabatinid.m.mtorsignalingingrowthcontrolanddisease.cell(2009)149:274-292.)。已显示mtor路径通过感测必需氨基酸来活化，其中亮氨酸在控制mtorc1细胞定位方面起直接作用(hanj.m.等leucyl-trnasynthetaseisanintracellularleucinesensorforthemtorc-1signalingpathway.cell(2012)149:410-424.bonfilsg.等leucyl-trnasynthetasecontrolstorc1viatheegocomplex.mol.cell(2012)46:105-110.)。与这个描绘一致，新近研究已显示在亮氨酸处理之后c2c12细胞中的pgc1-α基因表达被诱导(sun,xiaocun和michaelb.zemel."leucinemodulationofmitochondrialmassandoxygenconsumptioninskeletalmusclecellsandadipocytes."nutrmetab(lond)6(2009):26.)。亮氨酸对于饱腹感的诱导也是重要的。已显示亮氨酸诱导下丘脑中mtorc1复合物的活化，此伴有食物摄取和体重降低(cotad.等hypothalamicmtorsignalingregulatesfoodintake.science.(2006)312:927-930)。含有亮氨酸的营养性多肽被配制以在口服施用之后诱导人或其它哺乳动物的饱腹感和/或饱足。氨基酸药理学。氨基酸是含有氨基与酸基团两者的有机分子。除甘氨酸之外，所有氨基酸都具有不对称碳，并且除脯氨酸之外，所有蛋白质氨基酸都具有结合于羧基和伯氨基的α碳。由于它们的侧链不同，氨基酸展现一定范围的不同生物化学性质和生物功能。除谷氨酰胺和半胱氨酸之外，它们在溶液中在生理ph下是稳定的。在一些蛋白质的情形下，视宿主和翻译机构而定，氨基酸可经受翻译后修饰。这可对它们的生物可用度、代谢功能和体内生物活性具有显著影响。在翻译后附接于蛋白质的糖部分可通过影响氨基酸和包埋肽的胃肠释放来降低营养性蛋白质的适用性。将相同蛋白质的糖基化形式和非糖基化形式的消化进行比较显示非糖基化形式比糖基化形式更快速被消化(我们的数据)。尽管在自然界中存在超过300种氨基酸，但20种充当蛋白质中的构筑嵌段。非蛋白质α-aa和非αaa是这20种蛋白质氨基酸的直接产物，并且在细胞代谢方面起重大作用。由于氨基酸分解代谢的驱动氨基酸之间相互转化的代谢反应，20种标准蛋白质氨基酸中的一子组11种氨基酸被视为是人非必需的，因为它们在体内可从其它代谢物(氨基酸、酮等)合成：丙氨酸；精氨酸；天冬酰胺；天冬氨酸；半胱氨酸；谷氨酸；谷氨酰胺；甘氨酸；脯氨酸；丝氨酸；和酪氨酸。精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸被视为是条件性必需的，因为它们通常不于膳食中被使用，并且在特定群体中不以足量合成来满足当利用速率高于合成速率时的最优需要。然而，当考虑氨基酸是否真正是非必需的或在某一群体中可为条件性必需的时，可考虑诸如繁殖、疾病预防或代谢异常的功能性需要。称为必需氨基酸的其它9种蛋白质氨基酸以食物形式获取，因为它们的碳骨骼不由身体重新合成来满足最优代谢需求：组氨酸；异亮氨酸；亮氨酸；赖氨酸；甲硫氨酸；苯丙氨酸；苏氨酸；色氨酸；和缬氨酸。所有20种蛋白质氨基酸(和非蛋白质代谢物)都用于达成正常细胞功能性，并且通过改变单一氨基酸的可用性来驱动的代谢转变可影响全身体内平衡和生长。另外，氨基酸充当用于维持、生长、繁殖、免疫的关键代谢路径的信号传导分子和调控剂。在体内，骨骼肌由于它占身体质量组成的大部分(约40-45％)而代表游离氨基酸与蛋白质结合的氨基酸两者的最大储库。小肠是用于氨基酸分解代谢的另一重要部位，其支配膳食性氨基酸的首过代谢以及向门静脉中和向外周血浆中的进入。膳食中30-50％的eaa可由小肠在首过代谢中分解代谢。肠粘膜中高活性的bcaa转氨酶导致bcaa转化成支链α-酮酸以为肠上皮细胞提供能量，这与骨骼肌中所进行的类似。肌肉和小肠代谢的生理状态的差异会全身性大幅牵涉人中各组织的氨基酸生物作用。除甘氨酸(非手性)之外，氨基酸可以l-亚型与d-亚型两者存在。除由于它的硫原子在侧链的第二位置处的半胱氨酸(d-cys)之外，蛋白质中几乎所有氨基酸都以l-亚型存在，除非另外被酶促翻译后修饰或化学处理以达成储存或烹调目的。除d-arg、d-cys、d-his、d-lys和d-thr之外的大多数d-氨基酸可由d-aa氧化酶和转氨酶转化成l手性。为被分解代谢，这些d对映异构体被跨越质膜和其它生物膜转运，并且经受d-氧化或使氨基酸脱氨基以转化成它的α-酮酸，或经受外消旋化以使d-aa转化成它的l-亚型。d-异构体的转运受限于l-aa转运体对d-aa的较低亲和力。出于这个原因，基于l-异构体的摩尔数，视氨基酸和物种而定，d-aa利用效率可在20-100％的范围内。丙氨酸：由于丙氨酸能够在肌肉细胞中从bcaa和丙酮酸作为葡萄糖-丙氨酸循环的一部分被合成，所以它是葡萄糖生成性非必需氨基酸。这涉及来自蛋白质的骨骼肌自由能储存以在肝中远侧产生供肝外细胞(包括免疫细胞)和组织使用的葡萄糖所依的严密调控过程。所引起的对葡糖异生的刺激在食物剥夺的时期期间提供呈葡萄糖形式的能量来源。丙氨酸变为一种用以使利用肌肉中的bcaa产生蛋白质和通过肝中葡糖异生产生可用能量平衡的极敏感中间物。此外，丙氨酸诱导葡糖异生为支持不限于肌肉、肝和免疫细胞的许多组织的功能所不可缺少。然而，除充当单纯中间体之外，它也直接调控这个能量平衡中的关键酶丙酮酸激酶的活性。丙氨酸能够通过促进丙酮酸激酶的磷酸化，减缓糖酵解以及驱动丙酮酸向磷酸烯醇丙酮酸(pep)的逆反应以引发葡糖异生来抑制丙酮酸激酶。高量丙氨酸如发生在空腹状态下的atp产生性底物缺乏可导致自体吞噬和溶酶体中细胞内蛋白质的转换以提供能量来源。低水平的葡萄糖生成性氨基酸(包括丙氨酸)可刺激肝自体吞噬，从而导致肝功能退化。当处于高脂肪膳食供食时，β细胞显示自体吞噬增加来作为当身体对血浆葡萄糖浓度上升起反应时对胰岛素产生和蛋白质转换需求增加的应答。在肥胖症中，朝向胰岛素产生增加的这个进展是糖尿病前期的早期标志、胰岛素抗性的指示、以及最终导致在超重个体中发生糖尿病的胰岛β细胞功能性衰退的风险因素。通过营养作用来调控丙氨酸水平的能力可提供用于转变肝和β细胞自体吞噬以扰乱超重个体中受损的胰岛素代谢的强力手段。丙氨酸直接产生β-丙氨酸，其对泛酸(维生素b5)、辅酶a和肌肽(或它是限速性前体)的生物合成是重要的。肌肽以及其它β-丙氨酸源性二肽(其不并入蛋白质中)卡西尼(carcinine)、鹅肌肽(anserine)和巴乐尼(balenine)充当肌肉组织中的抗氧化缓冲剂，构成i型和ii型肌肉纤维中缓冲能力的多达20％。这个缓冲对于在糖原分解成乳酸期间维持肌肉中的组织ph是重要的。在学院运动员中进行的重量减轻/增加试验中，显示用β-丙氨酸进行补充会在重量减轻中防止瘦性质量损失，并且相较于安慰剂使重量增加期间的瘦性质量增加增大。β-丙氨酸也牵涉于减轻疲劳和增加肌肉工作量中。肌肽是抗氧化剂和过渡金属离子螯合剂。它通过抑制高级糖化终产物(age)的形成来充当抗糖化剂。age在糖尿病患者血管结构中是普遍的，并且促进动脉粥样硬化的发展。age在各种细胞类型中存在会影响细胞外结构和功能与细胞内结构和功能两者。(golden,a.等advancedglycosylationendproducts,circulation2006)。此外，age在脑中积累是衰老和退化的特征，特别是在阿尔茨海默氏病(alzheimer’sdisease)中。age积累解释阿尔茨海默氏病的许多神经病理学和生物化学特征，诸如蛋白质交联、氧化应激和神经元细胞死亡。由于肌肽的抗氧化性质和抗糖化性质的组合，所以它能够减小细胞氧化应激，并且抑制细胞内形成反应性氧物质和反应性氮物质。低量丙氨酸在肥胖症和糖尿病的状态下，已显示动物会展现降低的肝自体吞噬，从而导致胰岛素抗性增加。自体吞噬对于维持er和细胞体内平衡是重要的，所述体内平衡在受应激时可导致胰岛素敏感性受损。在动物模型中进行高脂肪膳食供食使er受应激，同时通过过度刺激mtorc1来导致肝自体吞噬受阻抑，此使糖尿病中朝向β细胞胰岛素敏感性功能受损的进展加强。降低全身性丙氨酸的水平提供用以降低mtorc1活性以及恢复自体吞噬的健康水平的机会。精氨酸：精氨酸是葡萄糖生成性非必需氨基酸，其可通过谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸来合成。它由哺乳动物小肠通过氧化谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸来产生，所述氧化产生鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸和丙氨酸。它也可通过脯氨酸氧化酶路径由在肠上皮细胞中使脯氨酸活性降解来产生(连同鸟氨酸和瓜氨酸一起)。在肾和一些内皮细胞(白细胞和平滑肌)中，精氨酸从由肠上皮细胞释放至循环中的瓜氨酸转化。新生儿利用大多数局部处于小肠中的游离瓜氨酸来合成精氨酸，而非全身性释放。由于其它组织的吡咯啉-5-羧酸脱氢酶的活性降低，所以精氨酸和脯氨酸氧化被限于粘膜。高量精氨酸瓜氨酸作为由nos家族催化的反应的副产物从精氨酸产生。已知膳食性补充精氨酸或瓜氨酸会降低作为代谢综合征的风险因素的血浆葡萄糖、高半胱氨酸和不对称二甲基精氨酸水平。l-瓜氨酸使从肌肉移除乳酸加速，可能归因于对血管张力和内皮功能的影响。新近研究也已显示来自西瓜汁的l-瓜氨酸提供从运动的更大程度恢复，以及较少次日酸痛。也似乎以游离形式递送l-瓜氨酸导致在体外向细胞中的摄取小于在西瓜汁(其含有高水平的l-瓜氨酸)的情形下。这表明有机会递送可将精氨酸运送至肌肉组织中以在内皮膜处由enos转化成瓜氨酸来改进功效的肽剂量。精氨酸是牵涉于许多信号传导路径中，以及作为一氧化氮(no)的直接前体的高度功能性氨基酸，其促进组织之间的全身性信号传导以及对营养物代谢和免疫功能的调控。no对于正常内皮功能和心血管健康(包括血管张力、血液动力学和血管生成)是重要的。精氨酸通过直接使β细胞的质膜去极化，从而导致ca2+流入和随后胰岛素胞外分泌来刺激胰岛素分泌。显示精氨酸补充会改进内皮依赖性松弛，这是i型和ii型糖尿病模型中心血管功能的指标。值得注意的是，在zucker糖尿病大鼠和膳食诱发性肥胖大鼠中，精氨酸补充使白色脂肪组织降低，但使棕色脂肪质量增加。精氨酸和/或它的代谢物可增强棕色脂肪细胞的增殖、分化和功能。此外，骨骼肌质量与全身胰岛素敏感性两者均应答于精氨酸补充，通过涉及肌肉mtor和no信号传导增加的机理而增强。惊人地，长期口服施用精氨酸使患有ii型糖尿病的肥胖成人的脂肪质量降低(lucotti等2006)。此外，用精氨酸对常规基于玉米和大豆的膳食进行补充降低脂肪堆积，并且促进蛋白质沉积在生长肥育猪的全身中。在人中进行的小型试探性试验中，数据指示肥胖症和非胰岛素依赖性糖尿病患者(niddm)中的缺陷性胰岛素介导的血管舒张可通过静脉内l-精氨酸来正常化；l-精氨酸也改进健康受试者、肥胖患者和niddm患者的胰岛素敏感性，从而指示不同于恢复胰岛素介导的血管舒张的可能机理。此外，长期施用l-精氨酸改进ii型糖尿病患者的葡萄糖水平、胰岛素诱导的肝葡萄糖产生、以及胰岛素敏感性(piatti等2001)。尚未分离和测试富含精氨酸的肽。通过静脉内或口服途径在高剂量(膳食中可用剂量的10-20倍，或在20分钟内以.1-.3g/kg体重给药)下施用氨基酸可刺激激素通过内分泌细胞从肠分泌。精氨酸是被充分研究的促泌素，其可刺激全身性释放胰岛素、生长激素、促乳激素、升糖素、孕酮和胎盘催乳激素。这个生物作用直接牵涉存在于肠中的营养物的消化生物作用与吸收两者，以及通过触发由内分泌激素介导的饱腹感信号来影响能量平衡。调节这些激素的能力提供用于降低诸如肥胖症的代谢病症中的卡路里摄取，或者触发肌肉损耗、肌肉减少症和恶病质中的食欲，以及转变糖尿病发作中的胰岛素敏感性的治疗机会。精氨酸是用于以细胞特异性方式刺激mtor1磷酸化的重要信号传导分子。这调控细胞蛋白质转换(自体吞噬)，并且使胰岛素样生长信号整合于各组织的蛋白质合成引发。这个生物作用已与骨骼肌中瘦性组织质量的生物发生、肥胖症和胰岛素抗性的疾病状态的代谢转变、以及衰老直接相关联。它也是可被劫持来使快速生长的癌细胞增殖的主要信号传导路径。有证据表明在诸如病毒性感染和营养不良的分解代谢状态下在小肠中，精氨酸使蛋白质合成的水平增加，其中氨基酸水平从它们的正常吸收后状态显著转变。另外，所证明的在肠上皮细胞中由精氨酸达成的mtor活化提供一种通过刺激蛋白质合成和细胞增殖来修复肠上皮的机理。已在肌细胞中观察到应答于精氨酸血浆水平上升的类似合成代谢信号传导，从而导致全身和骨骼肌蛋白质合成增加。精氨酸是维持在足以支持eaa的合成代谢作用的水平下的氨基酸。已显示赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸在添加至12.7％粗蛋白质膳食中时不能支持增加的蛋白质合成和全身生长，从而指示缺乏合成代谢介导性非必需氨基酸，包括精氨酸。精氨酸也上调与线粒体生物发生和底物氧化，刺激脂肪酸储存物的代谢，以及降低脂肪组织质量相关的蛋白质和酶。膳食性精氨酸的补充在由于他们的卡路里摄取增加而遭受胰岛素抗性的肥胖和糖尿病前期群体中提供治疗益处。同样，刺激线粒体生物发生的能力直接牵涉衰老和使经受氧化应激的功能性蛋白质和健康细胞再生的能力。确定的是膳食性缺乏蛋白质使包括精氨酸(尽管它不被视为是必需的)的大多数氨基酸的可用性降低。已知精氨酸缺乏会导致在9天之后精子计数降低90％，从而使非活动精子的比例增加10倍。已在动物中证明精氨酸补充会增加精液中精氨酸、脯氨酸、鸟氨酸和其它精氨酸代谢物(诸如聚胺)的水平，此与精子计数和精子活动性增加一致。在怀孕期间当胎盘生长速率达到峰值时同样观察到no合成和聚胺(凭借)的变化，从而指示精氨酸在妊娠期间在胎儿发育中具有作用。在早期怀孕期间，在子宫液中，精氨酸水平也应答于特定氨基酸转运体在胚胎处的表达而降低。在早期怀孕期间，对动物的膳食补充精氨酸已显示胚胎存活和每窝产仔数增加，从而指示在妊娠期间递送高水平的精氨酸具有重大潜力。基于对no产生(此可增强吞噬细胞的杀灭能力)、激素促泌素活性和刺激mtor的直接影响，精氨酸对增强免疫功能具有充分研究的影响。已知由脯氨酸氧化酶达成的脯氨酸分解代谢在哺乳动物的胎盘和小肠中具有高活性水平。这个活性指向精氨酸在肠免疫和胎盘免疫中具有关键作用，所述免疫两者均通过产生对病原性细菌具有细胞毒性的h2o2以及合成精氨酸而达成。在危急性受损患者中，在6天富含精氨酸的膳食之后，白细胞计数更快速正常化，其中在10天之后恢复至正常tnf应答(100％改进)。在296名手术、创伤或败血症患者中进行的相对于经肠配方来考查富含精氨酸(12.5g/l精氨酸)的制剂的临床研究指示医院停留期高度降低(8-10天)，并且获得感染的频率较大降低。对相对于经肠配方以富含精氨酸(12.5g/l精氨酸)的配方供食的181名败血患者的单独临床研究显示菌血症(8％对22％)、医院感染(6％对20％)显著减少。精氨酸也是用于合成胶原蛋白的关键底物。口服补充精氨酸使健康受试者的伤口愈合和淋巴细胞免疫应答增强。观察到在伤口部位处胶原蛋白沉积增加2.4倍(24nmol/cm对10.1nmol/cm)，以及相对于对照，淋巴细胞增殖增加。精氨酸是n-乙酰基谷氨酸合成酶的变构活化剂，所述合成酶是在线粒体中使谷氨酸和乙酰基-辅酶a转化成n-乙酰基谷氨酸的酶。这将肝尿素循环推向适用于氨解毒的活性状态。这意味着膳食性递送具有低剂量的精氨酸的营养物可适用于其中患者奋力从他们的循环中清除尿素的肾病的情形。从可用氮源消除精氨酸以限制尿毒症，同时能够维持有限蛋白质摄取以防止组织分解代谢是一种针对肾病的破坏性营养后果的新型策略。精氨酸上调gtp环水解酶-i的活性，从而使四氢生物蝶呤(thb)释放以达成no合成以及由芳族氨基酸羟化酶(aaah)使芳族氨基酸(araa)羟基化。出于这个原因，递送高水平的精氨酸以提升细胞thb水平会直接刺激cns毛细血管内皮细胞中许多神经递质的生物合成。araa充当用于生物合成单胺神经递质的前体，所述神经递质包括褪黑素、多巴胺、去甲肾上腺素(norepinephrine/noradrenaline)和肾上腺素(epinephrine/adrenaline)。低量精氨酸过量精氨酸摄取，从而刺激在血液中产生高水平的no可导致细胞的氧化损伤和凋亡。精氨酸过度或耗竭会影响哺乳动物肝细胞中的整体基因表达。使用体外模型，耗竭导致1419种基因的表达显著(p<0.05)改变，其中使用9因素生物信息学分析，56种基因显示至少2倍变化。大多数在表达方面升高，包括多种生长、存活和应激相关的基因，诸如gadd45、ta1/lat1以及卡斯帕酶(caspase)11和12。许多在腔性er应激应答方面是相关的。ldlr，作为胆固醇和类固醇生物合成的调控子，也应答于精氨酸耗竭而被调节。与精氨酸影响基因表达一致，膳食性精氨酸补充上调抗氧化基因，并且降低促炎性基因在脂肪和小肠组织中的表达。较低精氨酸水平抑制神经递质生物合成，此已在诸如躁狂症、帕金森病(parkinson)和运动障碍的适应症中显示临床功效。天冬酰胺：天冬酰胺是葡萄糖生成性非必需氨基酸，其前体是草酰乙酸(oaa)，并且其由转氨酶通过谷氨酰胺和天冬氨酸来合成。它用于达成诸如成淋巴细胞的一些赘生性细胞的功能。天冬酰胺通常位于蛋白质的α螺旋的末端，并且提供n连接的糖基化的重要位点以添加碳水化合物链，此影响对氨基酸摄取的免疫应答。在许多植物源性食物中，通过天冬酰胺与葡萄糖和果糖的羰基之间的热诱导反应形成丙烯酰胺。丙烯酰胺是可具有细胞毒性，导致基因突变，并且通常影响食物品质的氧化剂。具有低水平的天冬酰胺的组合物适用于制备可经受烹调或非冷藏储存条件的较安全食物产品。天冬氨酸：天冬氨酸是由转氨酶通过草酰乙酸(oaa)前体合成的葡萄糖生成性非必需氨基酸。作为尿素循环的一部分，它也可从鸟氨酸和瓜氨酸(或精氨酸)产生，因为释放的反丁烯二酸被转化成苹果酸，并且随后再循环成oaa。天冬氨酸提供肌苷合成中的氮原子，所述肌苷是嘌呤生物合成中的前体。它也涉及于β-丙氨酸的合成中。天冬氨酸在小肠的肠上皮细胞中氧化，从而产生含氮产物鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸和丙氨酸。天冬氨酸是nmda受体(谷氨酸受体)的激动剂，从而释放ca2+作为许多细胞信号传导路径中的第二信使。存在牵涉于精神分裂症中的多巴胺能和谷氨酰胺能异常，其中nmda拮抗剂模拟精神分裂症的一些阳性和阴性症状，同时携有的脑损害风险小于多巴胺激动剂所携有的风险。氯胺酮(ketamine)和pcp例如产生在精神分裂症中观察到的类似表型，其中pcp显示代表性较小的症状，但类似的脑结构变化。谷氨酸受体具有增加的功能，从而促进精神分裂症发作。突触后谷氨酸受体相对于突触前谷氨酸受体的比例增加导致谷氨酸信号传导增加。视moa和受体特异性而定，使nmda受体激动与使nmda受体拮抗两者均已在治疗阿尔茨海默氏痴呆方面显示一定益处。因此，递送具有高水平或低水平的天冬氨酸(其也作为nmda激动剂活性)的蛋白质可对这个患者群体具有治疗性。具有低水平的天冬氨酸的蛋白质将可能与诸如美金刚胺(memantine)的nmda拮抗剂并肩提供协同益处。同样，关于ly2140023的临床试验已将基于谷氨酸的治疗证明为具有治疗精神分裂症而无以异源化学抗精神病剂观察到的副作用的潜力。将共激动剂甘氨酸与抗精神病剂组合的类似研究显示症状改进，从而表明递送高剂量的天冬氨酸(也是nmda激动剂)将在这个患者群体中产生类似治疗益处。天冬氨酸是酸性氨基酸，具有低pka3.9。天冬氨酸通过甲酯与苯丙氨酸呈二肽形式产生用作商业人工甜味剂的阿斯巴甜(aspartame)。半胱氨酸：半胱氨酸是非必需氨基酸，并且从高半胱氨酸合成，所述高半胱氨酸自身由甲硫氨酸的代谢合成。丝氨酸通过与高半胱氨酸缩合以形成胱硫醚而涉及于半胱氨酸的合成中。胱硫醚接着被脱氨基以及水解以形成半胱氨酸和α酮基丁酸。半胱氨酸的硫来自高半胱氨酸，但分子的其余部分来自初始丝氨酸残基。在植物和原核生物中，半胱氨酸的生物合成通过不同机理而发生。半胱氨酸是至关重要的氨基酸，因为它在蛋白质折叠中起重要作用。在半胱氨酸残基之间形成的二硫键有助于稳定蛋白质的三级和四级结构，并且这些二硫键在分泌蛋白质之中最为常见，其中蛋白质暴露于见于细胞内部中的更具氧化性条件。尽管高半胱氨酸具有益处，但具有高全身性水平是显现心血管疾病的风险因素。高半胱氨酸升高可由遗传缺乏胱硫醚β-合成酶引起，并且过度甲硫氨酸摄取可为另一解释。控制甲硫氨酸摄取以及在膳食中补充叶酸和维生素b12已用于降低高半胱氨酸水平。此外，因为半胱氨酸的可用性是限制谷胱甘肽合成的关键组成部分，所以膳食性补充半胱氨酸的前体n-乙酰基-半胱氨酸在广泛范围的疾病状态下高度有效增强免疫性。半胱氨酸经受快速氧化以得到胱氨酸。它促进谷胱甘肽的生物合成，所述谷胱甘肽是可向诸如反应性氧物质(ros)自由基的不稳定分子贡献还原当量的强力抗氧化剂。在还原氧化性物质之后，它可与另一反应性谷胱甘肽形成谷胱甘肽硫化物，从而提供从细胞耗竭氧化应激诱导性分子的机理(肝可维持多达5mm的浓度)。谷胱甘肽是肝中毒素的强力中和剂，并且有助于保护肝免遭毒素的损害作用。另外，这个解毒能力有助于减少肌肉衰弱，防止毛发焦枯，并且防止与这些毒素相关的辐射。因此，它有益于遭受化学物质过敏或暴露于高水平的空气污染者。谷胱甘肽也是inos的辅因子，允许no在arg-no路径中最大合成。no对于正常内皮功能和心血管健康(包括血管张力、血液动力学、血管生成)是重要的。除是谷胱甘肽的前体之外，半胱氨酸也是h2s的前体，所述h2s可诱导内皮依赖性松弛，并且可进一步转化成半胱氨酸亚磺酸盐。半胱氨酸亚磺酸盐可转化成能够降低甲硫氨酸摄取的牛磺酸。甲硫氨酸过度会通过诱发高同型半胱氨酸血症来增加显现动脉粥样硬化的风险，因为高半胱氨酸是甲硫氨酸与半胱氨酸之间的中间体。然而，未知半胱氨酸是否直接或通过还原甲硫氨酸来降低高半胱氨酸(sebastiaanwesseling等,hypertension.2009；53:909-911)。此外，半胱氨酸是调节精氨酸-no路径的牛磺酸的前体。牛磺酸具有若干潜在保护作用。首先，牛磺酸能够通过结合次氯酸来降低氧化应激。已假设牛磺酸与线粒体转移rna缀合，并且在这种情况下，防止形成线粒体超氧化物。另外，牛磺酸抑制血管平滑肌细胞的由高半胱氨酸诱导的内质网应激，并且因此恢复细胞外过氧化物歧化酶的表达和分泌。谷氨酸：谷氨酸在小肠的肠上皮细胞中氧化，从而产生含氮产物鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸和丙氨酸。谷氨酸也调节精氨酸-no路径。no对于正常内皮功能和心血管健康(包括血管张力、血液动力学、血管生成)是重要的。高量谷氨酸如发生在空腹状态下的atp产生性底物缺乏可导致自体吞噬和溶酶体中细胞内蛋白质的转换以提供能量来源。低水平的葡萄糖生成性氨基酸(包括谷氨酸)可刺激肝自体吞噬，从而导致肝功能退化。瓜氨酸作为由nos家族催化的反应的副产物从谷氨酸产生。已知膳食性补充瓜氨酸会降低作为代谢综合征的风险因素的血浆葡萄糖、高半胱氨酸和不对称二甲基精氨酸水平。l-瓜氨酸使从肌肉移除乳酸加速，可能归因于对血管张力和内皮功能的影响。新近研究也已显示来自西瓜汁的l-瓜氨酸提供从运动的更大程度恢复，以及较少次日酸痛。也似乎以游离形式递送l-瓜氨酸导致在体外向细胞中的摄取小于在西瓜汁(其含有高水平的l-瓜氨酸)的情形下。这表明有机会递送可将精氨酸运送至肌肉组织中以在内皮膜处由enos转化成瓜氨酸来改进功效的肽剂量。谷氨酸促进谷胱甘肽的生物合成，所述谷胱甘肽可向诸如反应性氧物质(ros)和自由基的不稳定分子贡献还原当量。在还原氧化性物质之后，它可与另一反应性谷胱甘肽形成谷胱甘肽二硫化物，从而提供从细胞耗竭氧化应激诱导性分子的机理(在肝中维持多达5mm的高浓度)。谷胱甘肽也是inos的辅因子，允许no在arg-no路径中最大合成。谷氨酸与共激动剂甘氨酸或丝氨酸一起是nmda受体的激动剂，从而释放ca2+作为许多细胞信号传导路径中的第二信使。存在牵涉于精神分裂症中的多巴胺能和谷氨酰胺能异常，其中nmda拮抗剂模拟精神分裂症的一些阳性和阴性症状，同时携有的脑损害风险小于多巴胺激动剂所携有的风险。氯胺酮和pcp例如产生在精神分裂症中观察到的类似表型，其中pcp显示代表性较小的症状，但类似的脑结构变化。谷氨酸受体具有增加的功能，从而促进精神分裂症发作。突触后谷氨酸受体相对于突触前谷氨酸受体的比例增加导致谷氨酸信号传导增加。视moa和受体特异性而定，使nmda受体激动与使nmda受体拮抗两者均已在治疗阿尔茨海默氏痴呆方面显示一定益处。因此，递送具有高水平或低水平的谷氨酸(其也作为nmda激动剂活性)的蛋白质可对这个患者群体具有治疗性。具有低水平的谷氨酸的蛋白质将可能与诸如美金刚胺的nmda拮抗剂并肩提供协同益处。同样，关于ly2140023的临床试验已将基于谷氨酸的治疗证明为具有治疗精神分裂症而无以异源化学抗精神病剂观察到的副作用的潜力。将共激动剂甘氨酸与抗精神病剂组合的类似研究显示症状改进，从而表明递送高剂量的天冬氨酸(也是nmda激动剂)将在这个患者群体中产生类似治疗益处。低量谷氨酸谷氨酸和乙酰基-辅酶a在线粒体中转化成n-乙酰基谷氨酸。这将肝尿素循环推向适用于氨解毒的活性状态。这意味着膳食性递送具有低剂量的谷氨酸的营养物可适用于其中患者奋力从他们的循环中清除尿素的肾病的情形。从可用氮源消除谷氨酸以限制尿毒症，同时能够维持有限蛋白质摄取以防止组织分解代谢是一种针对肾病的破坏性营养后果的新型策略。谷氨酰胺：谷氨酰胺在小肠的肠上皮细胞中氧化，从而产生含氮产物鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸和丙氨酸。瓜氨酸作为由nos家族催化的反应的副产物从谷氨酰胺产生。已知膳食性补充瓜氨酸会降低作为代谢综合征的风险因素的血浆葡萄糖、高半胱氨酸和不对称二甲基精氨酸水平。l-瓜氨酸使从肌肉移除乳酸加速，可能归因于对血管张力和内皮功能的影响。新近研究也已显示来自西瓜汁的l-瓜氨酸提供从运动的更大程度恢复，以及较少次日酸痛。也似乎以游离形式递送l-瓜氨酸导致在体外向细胞中的摄取小于在西瓜汁(其含有高水平的l-瓜氨酸)的情形下。这表明有机会递送可将精氨酸运送至肌肉组织中以在内皮膜处由enos转化成瓜氨酸来改进功效的肽剂量。高量谷氨酰胺谷氨酰胺是被充分研究的促泌素，其可刺激全身性释放来自β细胞的胰岛素、生长激素、促乳激素、升糖素、孕酮和胎盘催乳激素。也已显示它会降低循环糖皮质素和应激激素。这个生物作用直接牵涉存在于肠中的营养物的消化生物作用与吸收两者，以及通过触发由内分泌激素介导的饱腹感信号来影响能量平衡。调节这些激素的能力提供用于降低诸如肥胖症的代谢病症中的卡路里摄取，或者触发肌肉损耗、肌肉减少症和恶病质中的食欲，以及转变糖尿病发作中的胰岛素敏感性的治疗机会。膳食性谷氨酰胺补充上调抗氧化基因，并且降低促炎性基因在脂肪和小肠组织中的表达。谷氨酰胺是用于以细胞特异性方式刺激mtor1磷酸化的重要信号传导分子。这调控细胞蛋白质转换(自体吞噬)，并且使胰岛素样生长信号整合于各组织的蛋白质合成引发。这个生物作用已与骨骼肌中瘦性组织质量的生物发生、肥胖症和胰岛素抗性的疾病状态的代谢转变、以及衰老直接相关联。谷氨酰胺是维持在足以支持eaa的合成代谢作用的水平下的氨基酸。已显示赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸在添加至12.7％粗蛋白质膳食中时不能支持增加的蛋白质合成和全身生长，从而指示缺乏合成代谢介导性非必需氨基酸，包括谷氨酰胺。谷氨酰胺被缓慢环化成焦谷氨酸。谷氨酰胺是用于包括肠上皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和肿瘤的快速分裂细胞的优选燃料来源。在膳食中补充谷氨酰胺在手术、急病、灼伤和感染中在肠完整性和免疫功能方面具有重大论证益处。12天谷氨酰胺补充(0.35g/kg)灼烧损伤研究显示肠可渗透性降低，内毒素水平降低，以及医院停留时长缩短。这提供在3天之后乳果糖/甘露糖醇比率降低8.8倍对降低5.5倍以及医院停留期减少6天。对等待手术的营养失调患者的2周谷氨酰胺总胃肠外营养(tpn)(0.23g/kg)对无谷氨酰胺tpn研究显示无谷氨酰胺组中肠可渗透性增加。这提供在2周之后乳果糖/甘露糖醇比率增加3.6倍对0.81倍。这些改进指向在临床中递送高水平的谷氨酰胺以改进肠免疫性和减少菌血症的机会。这也全身性改进淋巴细胞计数，并且减少在医院停留期间的感染性并发症。在具有严重灼烧损伤的患者中进行的谷氨酰胺补充(26g/天直至出院)研究显示相对于富含谷氨酰胺组，在标准总经肠营养(ten)组中血培养阳性频率大3倍，从而显著降低致死率。另外，谷氨酰胺补充显示淋巴细胞计数和功能增加，hgh增加，感染性并发症减少，医院停留期减少，致病率降低，致死率降低，以及肠可渗透性降低。在诸如应激、灼伤、损伤和败血症的分解代谢状态下，肌肉内谷氨酰胺水平降低。这个降低导致瘦性组织中的蛋白质净负性。已显示向骨骼肌施用谷氨酰胺会体外增加蛋白质合成，同时抑制分解。此外，已观察到骨骼肌中从生理浓度(1mm谷氨酰胺)直至增高15倍的浓度的剂量依赖性。所述作用在取自小肠的粘膜细胞中被进一步证明。支链氨基酸都是用于谷氨酰胺合成的代谢底物，在胎儿中提供谷氨酰胺来源，增强胎盘和胎儿生长，从而表明谷氨酰胺在介导它们对哺乳动物中的合成代谢的影响方面具有作用。此外，已显示谷氨酰胺水平和从血浆的可用性的时机影响亮氨酸的细胞摄取，以及随后mtor活化的分布。细胞内谷氨酰胺的积累用于通过谷氨酰胺/亮氨酸反向转运体slc7a5来摄取亮氨酸。在与亮氨酸的相等比例下体外施用谷氨酰胺导致通过mtor更持续刺激蛋白质合成，而在亮氨酸施用之前用谷氨酰胺使细胞致敏导致更快速但短暂的mtor活化(nicklin,p.等cell2009)。如发生在空腹状态下的atp产生性底物缺乏可导致自体吞噬和溶酶体中细胞内蛋白质的转换以提供能量来源。低水平的葡萄糖生成性氨基酸(包括谷氨酰胺)可刺激肝自体吞噬，从而导致肝功能退化。低量谷氨酰胺mtor是可被劫持来使快速生长的癌细胞增殖的主要信号传导路径，如由致癌性细胞对谷氨酰胺的优先摄取所证实。甘氨酸：如发生在空腹状态下的atp产生性底物缺乏可导致自体吞噬和溶酶体中细胞内蛋白质的转换以提供能量来源。低水平的葡萄糖生成性氨基酸(包括甘氨酸)可刺激肝自体吞噬，从而导致肝功能退化。甘氨酸促进谷胱甘肽的生物合成，所述谷胱甘肽可向诸如反应性氧物质(ros)和自由基的不稳定分子贡献还原当量。在还原氧化性物质之后，它可与另一反应性谷胱甘肽形成谷胱甘肽二硫化物，从而提供从细胞耗竭氧化应激诱导性分子的机理(在肝中维持多达5mm的高浓度)。谷胱甘肽也是inos的辅因子，允许no在arg-no路径中最大合成。组氨酸：组氨酸是必需氨基酸，并且是肌肽的前体。肌肽是抗氧化剂和过渡金属离子螯合剂。它通过抑制高级糖化终产物(age)的形成来充当抗糖化剂。age在糖尿病患者血管结构中是普遍的，并且促进动脉粥样硬化的发展。age在各种细胞类型中存在会影响细胞外结构和功能与细胞内结构和功能两者。(golden,a.等advancedglycosylationendproducts,circulation2006)。此外，age在脑中积累是衰老和退化的特征，特别是在阿尔茨海默氏病中。age积累解释阿尔茨海默氏病的许多神经病理学和生物化学特征，诸如蛋白质交联、氧化应激和神经元细胞死亡。由于肌肽的抗氧化性质和抗糖化性质的组合，所以它能够减小细胞氧化应激，并且抑制细胞内形成反应性氧物质和反应性氮物质。组氨酸具有抗氧化、消炎和抗分泌性质。组氨酸的咪唑环能够清除由细胞在急性炎症性应答期间产生的反应性氧物质(ros)。组氨酸施用会抑制细胞和组织损害中涉及的细胞因子和生长因子。组氨酸施用有助于类风湿性关节炎治疗，并且每日施用4.5g已用于有效治疗患有重度类风湿性关节炎的患者。已发现类风湿性关节炎患者具有低血清组氨酸水平，此归因于组氨酸从血液极快速移除。低血浆组氨酸水平也已见于慢性肾衰竭患者、肥胖妇女(其中这也对氧化应激和炎症具有负面影响)、儿科肺炎患者、和哮喘患者中。已显示组氨酸补充会减小胰岛素抗性，降低bmi和脂肪质量。在患有代谢综合征的肥胖受试者中，组氨酸遏制炎症和氧化应激。最后，作为组胺的前体，组氨酸使血液中和脑中的组胺水平增加。低血液组胺见于精神病患者的一些躁狂、精神分裂症、高铜和活动过度群组中。翻译后修饰转录调控中涉及的蛋白质是一种用于调控基因的机理。这个修饰可以特定方式改变蛋白质功能。一种修饰形式是蛋白质甲基化，其是一种最丰富的蛋白质修饰。蛋白质甲基化携带重要生物功能，包括基因调控和信号转导。组氨酸在蛋白质修饰以及最终基因调控中起作用，因为它接受通过蛋白质甲基转移酶从s-腺苷基甲硫氨酸转移的甲基(young-holee和michaelr.stallcup,molendocrinol.2009年4月；23(4):425–433)。组氨酸补充可有助于治疗多种疾病，包括：阿尔茨海默氏病、糖尿病、动脉粥样硬化、妇女代谢综合征、类风湿性关节炎和各种精神病状况(躁狂、精神分裂症、高铜和活动过度群组)。另外，由于组氨酸在蛋白质修饰中的作用，它提供用以抗击由基因去调控所致的疾病(包括癌症)的途径。低量组氨酸存在了解不带电荷的trna如何变构活化gcn2，从而导致与脂肪生成和蛋白质合成以及真核生物中许多生物合成路径相关的转录因子(以下讨论的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的机制。缺乏必需氨基酸的膳食在膳食引入之后数分钟内显著触发这个信号传导(hao等,science2005)。已体内显示通过srebp-1c进行的信号传导通过阻遏与脂肪生成相关的基因而对调动脂质储存物具有显著影响。已显示srebp-1c特异性作用于肝脂质合成，并且能够导致肝脂肪变性表型以及内脏脂肪质量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。已显示对于采用在缺乏组氨酸下补充1-5.4％氨基酸混合物的基本酪蛋白膳食的大鼠，缺乏组氨酸的不平衡膳食会传导gcn2信号。组氨酸剥夺通过它对gcn2的作用而对srebp-1c具有影响，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪组织重量、胆固醇/甘油三酯含量和食物摄取降低。驱动脂肪质量降低同时维持瘦性质量在诸如肥胖症、糖尿病和心血管健康的领域中提供治疗机会。异亮氨酸：异亮氨酸是eaa，并且也是bcaa。异亮氨酸与其它bcaa组合用于改进罹患肝病的患者的营养状态。包括异亮氨酸的bcaa充当代谢应激的时期期间骨骼肌的燃料来源；促进蛋白质合成，遏制蛋白质分解代谢，并且充当葡糖异生的底物。bcaa，并且具体来说异亮氨酸，在骨骼肌中被分解代谢，并且刺激l-丙氨酸和l-谷氨酰胺的产生。已显示bcaa通过在静息人肌肉中增加蛋白质合成的速率以及降低蛋白质降解的速率而对蛋白质代谢具有合成代谢作用。另外，显示bcaa在耐力训练后的恢复期间在人肌肉中具有合成代谢作用。这些作用通过mtor的磷酸化以及70-kds6蛋白质激酶(p70-kds6)和真核起始因子4e结合蛋白1的依序活化来介导。p70-kds6因它在调节细胞周期进展、细胞大小和细胞存活方面的作用而众所周知。应答于有丝分裂原刺激的p70-kds6活化上调核糖体生物合成，并且增强细胞的翻译能力(w-lan等,amjpathol.2003年8月；163(2):591–607；e.blomstrand等,j.nutr.2006年1月136:269s-273s)。真核起始因子4e结合蛋白1是使40s核糖体亚单位向mrna的5’末端募集的多亚单位复合物的限制性组分。p70s6激酶的活化以及核糖体蛋白质s6的随后磷酸化与特定mrna的翻译增强相关。在一个时间段的四头肌肌肉抵抗训练期间以及之后向受试者给与bcaa显示mtor、p70s6激酶增加，并且s6磷酸化见于训练之后的恢复时期中。然而，bcaa对akt或糖原合成酶激酶3(gsk-3)不存在所述作用。在不摄取bcaa下训练导致p70s6激酶的部分磷酸化而不活化所述酶，akt磷酸化降低，并且gsk-3不变化。bcaa输注也以akt非依赖性方式增加静息受试者的p70s6激酶磷酸化。这个mtor活性调控细胞蛋白质转换(自体吞噬)，并且使胰岛素样生长信号整合于各组织的蛋白质合成引发。这个生物作用已与骨骼肌中瘦性组织质量的生物发生、肥胖症和胰岛素抗性的疾病状态的代谢转变、以及衰老直接相关联。异亮氨酸补充可用于改进运动表现和肌肉形成，防止伴随衰老的肌肉损失，辅助罹患肝病者，支持儿童身体生长，并且改进向饥饿群体给与的食物的营养品质。另外，作为l-丙氨酸和l-谷氨酰胺的前体，异亮氨酸介导它们的重大代谢信号传导活性。低量异亮氨酸在肥胖症和糖尿病的状态下，已显示动物会展现降低的肝自体吞噬，从而导致胰岛素抗性增加。自体吞噬对于维持er和细胞体内平衡是重要的，所述体内平衡在受应激时可导致胰岛素敏感性受损。在动物模型中进行高脂肪膳食供食使er受应激，同时通过过度刺激mtorc1来导致肝自体吞噬受阻抑，此使糖尿病中朝向β细胞胰岛素敏感性功能受损的进展加强。降低全身性异亮氨酸的水平提供用以降低mtorc1活性以及恢复自体吞噬的健康水平的机会。存在了解不带电荷的trna如何变构活化gcn2，从而导致与脂肪生成和蛋白质合成以及真核生物中许多生物合成路径相关的转录因子(以下讨论的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的机制。缺乏任何eaa的膳食在膳食引入之后数分钟内显著触发这个信号传导(hao等,science2005)。已体内显示通过srebp-1c进行的信号传导通过阻遏与脂肪生成相关的基因而对调动脂质储存物具有显著影响。已显示srebp-1c特异性作用于肝脂质合成，并且能够导致肝脂肪变性表型以及内脏脂肪质量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。异亮氨酸剥夺通过它对gcn2的作用而对srebp-1c具有影响，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪组织重量、胆固醇/甘油三酯含量和食物摄取降低。驱动脂肪质量降低同时维持瘦性质量在诸如肥胖症、糖尿病和心血管健康的领域中提供治疗机会。亮氨酸：亮氨酸是必需氨基酸和支链氨基酸。包括亮氨酸的支链氨基酸充当代谢应激的时期期间骨骼肌的燃料来源；促进蛋白质合成，遏制蛋白质分解代谢，并且充当葡糖异生的底物。bcaa，并且包括亮氨酸，在骨骼肌中被分解代谢，并且刺激l-丙氨酸和l-谷氨酰胺的产生。亮氨酸通过细胞mtor信号传导和基因表达以及起活化谷氨酸脱氢酶的作用来在蛋白质转换的调控中起直接作用。已显示bcaa通过在静息人肌肉中增加蛋白质合成的速率以及降低蛋白质降解的速率而对蛋白质代谢具有合成代谢作用。另外，显示bcaa在耐力训练后的恢复期间在人肌肉中具有合成代谢作用。这些作用通过mtor的磷酸化以及70-kds6蛋白质激酶(p70-kds6)和真核起始因子4e结合蛋白1的依序活化来介导。p70-kds6因它在调节细胞周期进展、细胞大小和细胞存活方面的作用而众所周知。应答于有丝分裂原刺激的p70-kds6活化上调核糖体生物合成，并且增强细胞的翻译能力(w-lan等,amjpathol.2003年8月；163(2):591–607；e.blomstrand等,j.nutr.2006年1月136:269s-273s)。真核起始因子4e结合蛋白1是使40s核糖体亚单位向mrna的5’末端募集的多亚单位复合物的限制性组分。p70s6激酶的活化以及核糖体蛋白质s6的随后磷酸化与特定mrna的翻译增强相关。在一个时间段的四头肌肌肉抵抗训练期间以及之后向受试者给与bcaa显示mtor、p70s6激酶增加，并且s6磷酸化见于训练之后的恢复时期中。然而，bcaa对akt或糖原合成酶激酶3(gsk-3)不存在所述作用。在不摄取bcaa下训练导致p70s6激酶的部分磷酸化而不活化所述酶，akt磷酸化降低，并且gsk-3不变化。bcaa输注也以akt非依赖性方式增加静息受试者的p70s6激酶磷酸化。此外，已知亮氨酸是用于以细胞特异性方式刺激mtor1磷酸化的主要信号传导分子。这调控细胞蛋白质转换(自体吞噬)，并且使胰岛素样生长信号整合于各组织的蛋白质合成引发。这个生物作用已与骨骼肌中瘦性组织质量的生物发生、肥胖症和胰岛素抗性的疾病状态的代谢转变、以及衰老直接相关联。亮氨酸是被充分研究的促泌素，其可刺激全身性释放来自β细胞的胰岛素、生长激素、促乳激素、升糖素、孕酮和胎盘催乳激素。这个生物作用直接牵涉存在于肠中的营养物的消化生物作用与吸收两者，以及通过触发由内分泌激素介导的饱腹感信号来影响能量平衡。调节这些激素的能力提供用于降低诸如肥胖症的代谢病症中的卡路里摄取，或者触发肌肉损耗、肌肉减少症和恶病质中的食欲，以及转变糖尿病发作中的胰岛素敏感性的治疗机会。亮氨酸活化谷氨酸脱氢酶，其是催化谷氨酸、α-酮戊二酸和氨之间的可逆相互转化的酶。在哺乳动物中，谷氨酸脱氢酶在肝、肾、脑和胰腺中具有高活性水平。在肝中，谷氨酸脱氢酶提供适于门静脉周围肝细胞中的尿素合成的氨和氨基酸比率，并且谷氨酸脱氢酶反应似乎呈接近平衡状态。另外，已显示谷氨酸脱氢酶会产生谷氨酸以供在一小圈中心周围肝细胞中合成谷氨酰胺，从而使得它能够充当氨来源或氨清除剂。在肾中，谷氨酸脱氢酶起用以从谷氨酸产生氨以控制酸中毒的作用(c.spanaki和a.plaitakis,neurotoxres.2012年1月；21(1):117-27)。亮氨酸补充可用于改进运动表现和肌肉形成，防止伴随衰老的肌肉损失，辅助罹患肝病者，支持儿童身体生长，并且改进向饥饿群体给与的食物的营养品质。另外，亮氨酸在肝细胞中的尿素合成中起重要作用，并且可被给与以治疗罹患导致他们患有高氨血症的病状者。最后，亮氨酸可用于治疗酸中毒。低量亮氨酸在肥胖症和糖尿病的状态下，已显示动物会展现降低的肝自体吞噬，从而导致胰岛素抗性增加。自体吞噬对于维持er和细胞体内平衡是重要的，所述体内平衡在受应激时可导致胰岛素敏感性受损。在动物模型中进行高脂肪膳食供食使er受应激，同时通过过度刺激mtorc1来导致肝自体吞噬受阻抑，此使糖尿病中朝向β细胞胰岛素敏感性功能受损的进展加强。降低全身性亮氨酸的水平提供用以降低mtorc1活性以及恢复自体吞噬的健康水平的机会。mtor是可被劫持来使快速生长的癌细胞增殖的主要信号传导路径。耗竭亮氨酸可降低快速生长的细胞维持组成性mtor活化的能力。存在了解不带电荷的trna如何变构活化gcn2，从而导致与脂肪生成和蛋白质合成以及真核生物中许多生物合成路径相关的转录因子(以下讨论的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的机制。缺乏eaa的膳食在膳食引入之后数分钟内显著触发这个信号传导(hao等,science2005)。已体内显示通过srebp-1c进行的信号传导通过阻遏与脂肪生成相关的基因而对调动脂质储存物具有显著影响。已显示srebp-1c特异性作用于肝脂质合成，并且能够导致肝脂肪变性表型以及内脏脂肪质量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。亮氨酸剥夺通过它对gcn2的作用而对srebp-1c具有影响，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪组织重量、胆固醇/甘油三酯含量和食物摄取降低。驱动脂肪质量降低同时维持瘦性质量在诸如肥胖症、糖尿病和心血管健康的领域中提供治疗机会。此外，亮氨酸剥夺已直接显示上调棕色脂肪组织(bat)中的ucp1(产热的直接量度)，增加能量消耗(假定由于bat中产热增加)，以及通过刺激白色脂肪组织(wat)中的脂解来相应降低脂肪质量。ucp1上调导致食物摄取、体重、腹部脂肪质量、脂肪质量降低以及维持瘦性质量(guo,f.thegcn2eif2alphakinaseregulatesfatty-acidhomeostasisintheliverduringdeprivationofanessentialaminoacid.cellmetab.,2007)。赖氨酸：赖氨酸是对于适当生长重要的eaa，并且在肉碱的产生中起至关重要作用。肉碱是在心肌中的能量产生中起重要作用的季胺。肉碱将游离脂肪酸转运至线粒体中，并且在这种情况下，增加心脏中用于氧化代谢的优选底物。另外，肉碱防止在可导致心室性心律不齐的缺血性事件期间发生的脂肪酸积累。因为在缺血性事件期间心肌肉碱水平快速减小，所以外源性补充肉碱会补给耗竭的心肌肉碱水平，并且改进心脏代谢和左心室功能。另外，对4个研究的分析证明相较于安慰剂，在急性心肌梗塞(ami)之后补充l-肉碱在ami之后的第一年中显著降低左心室扩张。这是重要的，因为在ami之后对左心室扩张的预防以及对心脏功能的维护是向心脏衰竭和死亡进展的强力预测因素。另外，肉碱有助于降低胆固醇，此进一步支持心脏健康，并且有助于预防急性心肌梗塞(jamesj.dinicolantonio等,mayoclinicproceedings,2013；88,544-551)。赖氨酸补充适用于支持心脏健康，以及在缺血性事件期间防止心室性心律不齐。此外，赖氨酸补充可帮助心脏病发作患者有效恢复，并且有助于预防左心室扩张者的心脏病发作。此外，赖氨酸可用于降低高胆固醇患者的胆固醇水平。赖氨酸有助于帮助身体吸收钙，并且降低尿中损失的钙量。由于钙在骨健康中的作用，赖氨酸补充有助于预防与骨质疏松相关的骨损失。此外，l-精氨酸和赖氨酸的组合使得骨构筑细胞更具活性，并且增强胶原蛋白的产生，所述胶原蛋白是对于包括以下的骨和结缔组织重要的物质：皮肤、肌腱和软骨。赖氨酸补充适用于罹患骨质疏松的患者和处于显现骨质疏松的风险下者；年长者、绝经妇女、生长儿童，由于它在胶原蛋白产生中的作用而适用于化妆品中，以及适用于运动员以改进韧带完整性。赖氨酸缺乏会导致疲劳、恶心、眩晕、食欲不振、激动、眼充血、生长缓慢、贫血和生殖病症。当定期采用时，赖氨酸有助于预防和遏制唇疱疹和生殖器疱疹的爆发。当以单次或多次剂量向45名患有频繁复发性疱疹感染的患者每日给与312-1200mg赖氨酸时，从感染恢复以及对复发的遏制被证实(griffithr.s.等,dermatologica1978；156:257–267)。这是因为赖氨酸具有抗病毒作用，其通过阻断促进单纯疱疹病毒(hsv)复制的精氨酸的活性来起作用。在组织培养研究中，当精氨酸/赖氨酸比率有利于精氨酸时，疱疹病毒复制被增强。然而，当精氨酸/赖氨酸比率有利于赖氨酸时，病毒复制被遏制，因为hsv的细胞病原性被抑制。(griffithr.s.等,dermatologica1978；156:257–267)。已显示相较于降低爆发的严重性和持续时间，口服赖氨酸更有效预防爆发。对于被hsv感染者，用赖氨酸补充膳食会遏制唇疱疹和生殖器疣的爆发，并且当定期主动采用时，极有益于预防爆发。赖氨酸调节精氨酸-no路径。no对于正常内皮功能和心血管健康(包括血管张力、血液动力学、血管生成)是重要的。赖氨酸是l-精氨酸转运的天然抑制剂，并且与l-精氨酸竞争通过系统y+来摄取，所述系统是哺乳动物细胞中阳离子氨基酸的主要转运系统。过度一氧化氮促成与败血症相关的难治性低血压，并且可因为l-赖氨酸抑制作为no合成的重要组分的精氨酸而以施用l-赖氨酸来抗击(k.g.allman等,britishjournalofanaesthesia(1998)81:188-192)。此外，由于no从作为主要神经退化区域的脑血管结构、脑组织和神经末梢释放，所以no过度可导致疾病。过度no可导致偏头痛、脑细胞损害，所述脑细胞损害可导致神经退化性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病(huntingtondisease)和肌萎缩性侧索硬化。此外，由胰腺产生的no可损害β细胞，如1型糖尿病中所发生。赖氨酸补充适用于通过防止血管舒张来预防与败血症相关的低血压。另外，赖氨酸可用于预防/治疗偏头痛，并且防止/减缓如ad、帕金森氏病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化的神经退化性疾病的进展。低量赖氨酸存在了解不带电荷的trna如何变构活化gcn2，从而导致与脂肪生成和蛋白质合成以及真核生物中许多生物合成路径相关的转录因子(以下讨论的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的机制。缺乏eaa的膳食在膳食引入之后数分钟内显著触发这个信号传导(hao等,science2005)。已体内显示通过srebp-1c进行的信号传导通过阻遏与脂肪生成相关的基因而对调动脂质储存物具有显著影响。已显示srebp-1c特异性作用于肝脂质合成，能够导致肝脂肪变性表型以及内脏脂肪质量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。赖氨酸剥夺通过它对gcn2的作用而对srebp-1c具有影响，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪组织重量、胆固醇/甘油三酯含量和食物摄取降低。驱动脂肪质量降低同时维持瘦性质量在诸如肥胖症、糖尿病和心血管健康的领域中提供治疗机会。甲硫氨酸：甲硫氨酸是必需氨基酸，并且是实际上所有真核蛋白质的合成中的引发氨基酸。甲硫氨酸是一种最具疏水性的aa。球状蛋白质中的大多数甲硫氨酸残基可见于疏水性核心的内部中。常发现甲硫氨酸与跨膜蛋白质结构域中的脂质双层相互作用。归因于甲硫氨酸的位置和强力抗氧化性质，它已被视为蛋白质中的内源性抗氧化剂(johnt.brosnan和margarete.brosnan,j.nutr.2006年6月第136卷第6期1636s-1640s)。甲硫氨酸残基对通过氧化酶、臭氧、过氧化氢、超氧化物、γ-辐射、金属催化氧化、从电子传递链的“泄漏”和黄素或生物异源物质的自氧化达成的氧化具有高易感性。一旦被氧化，甲硫氨酸残基即转化成甲硫氨酸亚砜，其可通过甲硫氨酸亚砜还原酶被转化回甲硫氨酸(rodneyl.levine等,procnatlacadsciusa,1996年12月24日；93(26):15036–15040)。作为一种抗氧化剂，甲硫氨酸补充可有助于预防癌症、退化性疾病、心脏病、肝病变和肾病变。它也可在化妆品中用于对抗uv射线对皮肤的损害。甲硫氨酸是抗脂肪肝aa，并且帮助肝处理脂质，并由此帮助防止脂肪在肝和动脉中积累，所述积累可最终导致向脑、心脏和肾的血流的阻塞。另外，脂肪在肝中积累会驱动称为肝脂肪变性的病变，其可最终导致肝硬化。对于经受药物解毒的个体，甲硫氨酸补充可改进所述过程，对于采用具有毒副作用的药物者也是如此。此外，作为抗脂肪肝aa，甲硫氨酸通过增加肝对已知帮助降低胆固醇水平的卵磷脂的产生来促进心脏健康。甲硫氨酸补充可预防由脂肪沉积在肝中所致的肝硬化。另外，它可通过防止脂肪沉积至动脉中，由此预防可能的心肌梗塞和中风来促进心血管健康。此外，甲硫氨酸可帮助胆固醇水平较高者降低他们的胆固醇，从而改进心血管疾病的风险。甲硫氨酸有助于免疫系统适当起作用，因为甲硫氨酸的水平升高会增加帮助改进免疫功能的牛磺酸以及高半胱氨酸和谷胱甘肽的水平。用于达成免疫功能的潜伏机理可涉及mtor活化、no和谷胱甘肽合成、h2s信号传导和细胞细胞氧化还原态。甲硫氨酸是调节精氨酸-no路径的牛磺酸的前体。no对于正常内皮功能和心血管健康(包括血管张力、血液动力学、血管生成)是重要的。甲硫氨酸也转化成作为谷胱甘肽的前体的半胱氨酸。谷胱甘肽是肝中毒素的强力中和剂，并且有助于保护肝免遭毒素的损害作用。另外，这个解毒能力有助于减少肌肉衰弱，防止毛发焦枯，并且防止与这些毒素相关的辐射。因此，它有益于遭受化学物质过敏或暴露于高水平的空气污染者。甲硫氨酸可有助于免疫系统受损害的患者，诸如aids患者和癌症患者。同样，在流行性感冒季节期间，特别是对于最易感的群组，包括：年长者、儿童和妊娠妇女，它可为适用补充剂。此外，它可用于到他们将可能易感于区域性感染所处的国家旅行者。观察到aids患者中的甲硫氨酸水平较低。这个甲硫氨酸水平降低已与导致如痴呆和记忆回想减弱的症状的神经系统衰退相关联。每天补充6克甲硫氨酸可导致这些患者的记忆回想改进。同样，甲硫氨酸可有益于患有涉及神经系统退化的疾病(包括阿尔茨海默氏病、als、ms和亨廷顿氏病)者。甲硫氨酸参与一碳代谢，并且由此也参与蛋白质和dna的甲基化，此转而帮助调控基因表达和蛋白质的生物活性。对于处于相关遗传病症的风险者，甲硫氨酸补充可用于促进所有个体的适当基因调控。低量甲硫氨酸甲硫氨酸是毒性高半胱氨酸的前体，所述高半胱氨酸通过下调体内ddah来介导adma以代谢adma，从而干扰精氨酸-no路径。no对于正常内皮功能和心血管健康(包括血管张力、血液动力学、血管生成)是重要的。存在了解不带电荷的trna如何变构活化gcn2，从而导致与脂肪生成、蛋白质合成以及真核生物中许多生物合成路径相关的转录因子(以下讨论的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的机制。缺乏任何eea的膳食在膳食引入之后数分钟内显著触发这个信号传导(hao等,science2005)。已体内显示通过srebp-1c进行的信号传导通过阻遏与脂肪生成相关的基因而对调动脂质储存物具有显著影响。已显示srebp-1c特异性作用于肝脂质合成，并且能够导致肝脂肪变性表型以及内脏脂肪质量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。甲硫氨酸剥夺通过它对gcn2的作用而对srebp-1c具有影响，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪组织重量、胆固醇/甘油三酯含量和食物摄取降低。驱动脂肪质量降低同时维持瘦性质量在诸如肥胖症、糖尿病和心血管健康的领域中提供治疗机会。苯丙氨酸：苯丙氨酸是eea、auaa和用于在脑中合成去甲肾上腺素的前体，以及是酪氨酸的代谢前体，所述酪氨酸是另一芳族氨基酸和用于合成多巴胺的前体。去甲肾上腺素(ne)由β-羟化酶以及辅因子抗坏血酸使多巴胺进行β-氧化来在交感神经系统中的肾上腺髓质和节后神经元中合成。它通过分泌至突触间隙中来起作用，在所述突触间隙中，它刺激肾上腺素能受体，并且接着由周围细胞降解或摄取。作为一种儿茶酚胺，它不跨越血脑屏障。ne可用于抗击注意力不足/活动过度病症(adhd)、抑郁和低血压。就如adhd的注意力病症而言，指定的药物倾向于帮助增加ne和多巴胺的水平。此外，抑郁通常用抑制血清素(serotonin)和ne再摄取，由此增加脑中突触后细胞中可用的血清素和ne的量的药物治疗。新近证据已表明血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(snri)也可增加多巴胺传送，因为如果去甲肾上腺素转运体也通常使多巴胺再循环，那么snri将也增强多巴胺能传送。因此，也可与ne水平增加相关的抗抑郁剂作用可部分归因于多巴胺同时增加(特定来说在脑前额皮质中)。ne用于治疗患有危急性低血压的患者。ne是血管加压剂，并且作用于α1肾上腺素能受体与α2肾上腺素能受体两者以导致血管收缩，由此使血压增加。作为ne的前体，苯丙氨酸可用于治疗注意力病症，如adhd和add。另外，它可用于治疗罹患抑郁或创伤后应激综合征者。苯丙氨酸也可用于治疗抑郁或改变诸如ssri的神经递质调节性药物的功能。另外，由于它能够通过增加血管张力来增加血压，所以它可用于治疗具有低血压倾向者。此外，苯丙氨酸可用作酪氨酸水平，以及由此酪氨酸功能的上游调控剂。由于酪氨酸作为l-多巴和多巴胺的前体的作用，所以酪氨酸补充可帮助治疗帕金森氏病。另外，它可用于治疗患有如抑郁的情绪/精神病病症者，以及治疗成瘾性。此外，它可通过增加学习困难或复杂概念或动作期间的奖赏/愉快应答来促进学习。多巴胺，作为一种单胺儿茶酚胺神经递质，在免疫系统中起调控作用。与存在于特定免疫效应细胞中的特定受体相互作用的神经递质和神经肽由免疫系统释放以影响这些细胞在宿主中针对疾病和其它环境应激的功能。已显示多巴胺的免疫调控性作用通过存在于靶标细胞中的五种不同g蛋白偶联受体来调控。存在这些受体的两个广泛类别：g1和g2，其涵盖不同亚型。d1类别的受体包括d2和d5亚型，并且在活化后使细胞内camp增加。d2类别的受体由d2、d3和d4亚型组成，并且已被报道在刺激后抑制细胞内camp。多巴胺受体已见于正常人白细胞上。同样，淋巴组织具有通过交感神经达成的多巴胺能神经支配，此表明多巴胺可能够调控免疫系统效应细胞(basu,sujit和sarkar,chandrani,dopamineandimmunesystem.scitopics2010)。多巴胺通过活化静息t细胞以及抑制受刺激t细胞的活化来影响t细胞。在正常静息外周人t淋巴细胞中，多巴胺活化d2和d3子类的受体，此转而活化整联蛋白(integrin)(α4β1和α5β1)。这些整联蛋白是使细胞附着于细胞外基质组分纤维结合蛋白(fibronectin)的异二聚跨膜糖蛋白。纤维结合蛋白用于使t细胞跨越组织屏障和血管进行迁移和外渗。此外，多巴胺通过d3受体起选择性诱导cd8+t细胞迁移和归巢的作用。此外，多巴胺通过影响由t细胞分泌细胞因子来影响t细胞。当多巴胺刺激d3和d1/d5受体时，tnf-α(一种多效性炎症性细胞因子)的分泌被增加。当刺激d2受体时，il-10(一种消炎性细胞因子)被诱导分泌。然而，多巴胺可通过下调非受体酪氨酸激酶lck和fyn的表达来抑制活化的t细胞受体诱导的细胞增殖以及许多细胞因子(如il-2、ifn-γ和il-4)的分泌，所述激酶是在引发tcr活化方面重要的酪氨酸激酶(basu,sujit和sarkar,chandranidopamineandimmunesystem.scitopics2010)。b细胞具有极高多巴胺d2、d3和d5受体表达。多巴胺能够抑制静息和恶性b淋巴细胞的增殖。多巴胺通过促进周期性b细胞由于氧化应激的凋亡来起作用。然而，尚未在静息淋巴细胞中观察到这个多巴胺能作用，因此表明在预防癌症方面的作用(basu,sujit和sarkar,chandrani,dopamineandimmunesystem.scitopics2010)。酪氨酸，作为多巴胺的前体，可用于改进免疫应答以及改进总体免疫系统功能性。它可向年长者、妊娠妇女、儿童和免疫功能受损害者(如aids患者和癌症患者)提供益处。它也可向教师、旅行者和频繁暴露于病菌的任何人给与。普遍称为肾上腺素(adrenaline)的肾上腺素(epinephrine)是由肾上腺的髓质分泌的激素。肾上腺素应答于诸如恐惧或愤怒的强烈情绪而释放，其导致心率、肌肉强度、血压和糖代谢增加。它导致使身体准备进行困难或激烈活动的惊逃或对抗应答。肾上腺素用作心脏停搏期间的刺激剂、休克期间用以增加血压的血管收缩剂、和支气管哮喘中的支气管扩张剂和抗痉剂。肾上腺素不大量见于体内，但在维持心血管体内平衡方面极其重要，因为它能够使血液转向处于应激下的组织。肾上腺素通过影响肌肉收缩来具有这个作用。当浓度比细胞中的正常值大10倍时，通过钙调蛋白(calmodulin)与钙结合来发生肌肉的收缩。钙-钙调蛋白复合物接着继续活化肌球蛋白轻链激酶，其接着使lc2磷酸化，从而导致收缩。肾上腺素结合肾上腺素受体，此活化腺苷酰基环化酶，并且从atp产生环状amp。camp活化蛋白质激酶，其由此使肌球蛋白轻链激酶磷酸化。这个磷酸化肌球蛋白轻链激酶对钙-钙调蛋白复合物具有较低亲和力，并且因此是非活性的。因此，平滑肌组织被松驰。肾上腺素的这个作用使得它极适用于治疗哮喘、心脏停搏和过敏性休克。酪氨酸，作为肾上腺素的前体，可用于处于心脏停搏的风险下的患者、罹患哮喘者和处于过敏性休克的风险者。肾上腺素是通过结合肝细胞的外部上的受体来分解糖原的两种主要激素中的一种。这个结合导致发生构象变化，由此允许g蛋白进行结合，并且变得具有活性。g蛋白偶联受体的活化导致发生分子构象变化，所述构象变化导致腺苷酸环化酶进行结合。一旦腺苷酸环化酶结合复合物，腺苷酸环化酶即将atp分解成camp，其接着变为这个过程中的第二信使蛋白质，并且活化蛋白质激酶。活化的蛋白质激酶使磷酸化酶活化，所述磷酸化酶是催化糖原分解成葡萄糖的酶。酪氨酸，作为肾上腺素的前体，可用于通过使得葡萄糖可易于用于为运动供以燃料来改进运动表现。黑色素(melanin)是酪氨酸的代谢物，并且是强力抗氧化剂。另外，它在抑制炎症性细胞因子和超氧化物的产生方面具有影响。当促炎性细胞因子被过度产生时，它介导如类风湿性关节炎、移植物抗宿主反应、恶病质和败血症综合征的病理性病状中炎症的损害作用。已发现黑色素抑制正在进行的细胞因子合成，此强烈表明黑色素可适用作针对涉及促炎性细胞因子的病状的叠加疗法(mohagheghpourn.等,cellimmunol.2000年1月10日；199(1):25-36)。酪氨酸可用于治疗类风湿性关节炎、恶病质、败血症综合征、具有与自体免疫病症相关的炎症者、和病理性病状的其它炎症性后遗症。苯丙氨酸上调gtp环水解酶-i的活性，从而使四氢生物蝶呤(thb)释放以达成no合成以及由芳族氨基酸羟化酶(aaah)使araa羟基化。出于这个原因，递送高水平的苯丙氨酸以提升细胞thb水平会直接刺激cns毛细血管内皮细胞中许多神经递质的生物合成。araa充当用于生物合成单胺神经递质的前体，所述神经递质包括褪黑素、多巴胺、去甲肾上腺素(norepinephrine/noradrenaline)和肾上腺素(epinephrine/adrenaline)。在促进no合成方面，苯丙氨酸可用于治疗高血压，降低血压，并且可在潜水或到高海拔旅行者的情形下用于增加血管舒张。低量苯丙氨酸存在了解不带电荷的trna如何变构活化gcn2，从而导致与脂肪生成和蛋白质合成以及真核生物中许多生物合成路径相关的转录因子(以下讨论的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的机制。缺乏任何eaa的膳食在膳食引入之后数分钟内显著触发这个信号传导(hao等,science2005)。已体内显示通过srebp-1c进行的信号传导通过阻遏与脂肪生成相关的基因而对调动脂质储存物具有显著影响。已显示srebp-1c特异性作用于肝脂质合成，并且能够导致肝脂肪变性表型以及内脏脂肪质量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。苯丙氨酸剥夺通过它对gcn2的作用而对srebp-1c具有影响，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪组织重量、胆固醇/甘油三酯含量和食物摄取降低。驱动脂肪质量降低同时维持瘦性质量在诸如肥胖症、糖尿病和心血管健康的领域中提供治疗机会。脯氨酸：瓜氨酸作为由nos家族催化的反应的副产物从谷氨酰胺产生。已知膳食性补充瓜氨酸会降低作为代谢综合征的风险因素的血浆葡萄糖、高半胱氨酸和不对称二甲基精氨酸水平。l-瓜氨酸使从肌肉移除乳酸加速，可能归因于对血管张力和内皮功能的影响。新近研究也已显示来自西瓜汁的l-瓜氨酸提供从运动的更大程度恢复以及较少次日酸痛。也似乎以游离形式递送l-瓜氨酸导致在体外向细胞中的摄取小于在西瓜汁(其含有高水平的l-瓜氨酸)的情形下。这表明有机会递送可将精氨酸运送至肌肉组织中以在内皮膜处由enos转化成瓜氨酸来改进功效的肽剂量。在怀孕期间当胎盘生长速率达到峰值时观察到no合成和聚胺(凭借脯氨酸)的变化，从而指示精氨酸在妊娠期间在胎儿发育中具有作用。丝氨酸：丝氨酸是非必需氨基酸，并且通过3-磷酸甘油酸由糖酵解生物合成。丝氨酸在中间代谢中起至关重要作用，因为它促进磷脂、鞘脂和半胱氨酸生物合成以及细菌中色氨酸合成，并且是甘氨酸的主要来源。身体对甘氨酸具有可能超过膳食摄取量10-50倍的需要。这个需求不仅用于合成蛋白质，特别是胶原蛋白，而且也用于甘氨酸作为以下5个主要代谢生物合成路径的前体：肌酸、卟啉、嘌呤、胆汁酸和谷胱甘肽。另外，由于它在甘氨酸产生中的作用，丝氨酸也是用于生物合成嘌呤和5’-单磷酸2’脱氧胸苷以及使高半胱氨酸再甲基化成甲硫氨酸的叶酸关联一碳单元的主要供体。重要的是应注意对于源于丝氨酸的每个甘氨酸分子，都有一碳单元形成。(cook,r.definingthestepsofthefolateone-carbonshuffleandhomocysteinemetabolism1’2；am.jclinnutr；2000)在一碳代谢中，用于生物合成的一碳单元由称为四氢叶酸(thf)聚谷氨酸的辅因子的家族携带并化学活化。thf介导的一碳代谢是划分在细胞质、线粒体和核中的相互依赖性生物合成路径的代谢系统。在细胞质中，一碳代谢用于合成嘌呤和胸苷酸，以及使高半胱氨酸再甲基化成甲硫氨酸(高半胱氨酸过于丰富可对身体有害)。在线粒体中，一碳代谢用于合成甲酰化甲硫氨酰基-trna；分解代谢胆碱、嘌呤和组氨酸；以及使丝氨酸和甘氨酸相互转化。另外，线粒体是用于细胞质代谢的一碳单元的主要来源。叶酸介导的一碳代谢的破坏已与许多病变和发育异常相关联。(j.t.fox和p.j.stover,第1章,folate‐mediatedone‐carbonmetabolism,geraldlitwack编,vitamins&hormones,academicpress,2008,第79卷,第1-44页)。丝氨酸羟甲基转移酶(shmt)在依赖于叶酸与5-磷酸吡哆醛两者的反应中催化丝氨酸和甘氨酸的自由可逆相互转化。丝氨酸转化成甘氨酸涉及移除c-3丝氨酸和形成5,10-亚甲基四氢叶酸，其可用于叶酸依赖性一碳代谢或通过10-甲酰基四氢叶酸氧化成二氧化碳(robertjcook,amjclinnutr2000年12月第72卷第6期1419-1420)。丝氨酸是半胱氨酸的前体。半胱氨酸从高半胱氨酸合成，所述高半胱氨酸自身由甲硫氨酸的代谢合成。丝氨酸通过与高半胱氨酸缩合以形成胱硫醚而涉及于半胱氨酸的合成中。胱硫醚接着被脱氨基以及水解以形成半胱氨酸和α酮基丁酸。半胱氨酸的硫来自高半胱氨酸，但分子的其余部分来自初始丝氨酸残基。在植物和原核生物中，半胱氨酸的生物合成通过不同机理而发生。半胱氨酸是至关重要的氨基酸，因为它在蛋白质折叠中起重要作用。在半胱氨酸残基之间形成的二硫键有助于稳定蛋白质的三级和四级结构，并且这些二硫键在分泌蛋白质之中最为常见，其中蛋白质暴露于见于细胞内部中的更具氧化性条件。尽管高半胱氨酸具有益处，但高水平可为显现心血管疾病的风险因素。高半胱氨酸升高可由遗传缺乏胱硫醚β-合成酶引起，并且过度甲硫氨酸摄取可为另一解释。控制甲硫氨酸摄取以及在膳食中补充叶酸和维生素b12已用于降低高半胱氨酸水平。同样，增加丝氨酸水平以支持高半胱氨酸向半胱氨酸转化可为有益的。n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)是脑中的一种最基本神经递质。它是谷氨酸受体，并且是用于控制突触可塑性和记忆功能的至关重要分子装置。这个受体是谷氨酸的促离子型受体，并且特征在于对谷氨酸的亲和力较高，单通道电导较高，钙可渗透性较高，并且由镁离子以电压依赖性阻断。为使nmda受体打开，它由谷氨酸和甘氨酸或d-丝氨酸结合。d-丝氨酸是神经递质和胶质递质，在脑中由丝氨酸外消旋酶从l-丝氨酸生物合成。它是使甘氨酸成为nmda受体结合位点的强力或有力激动剂。(jean-pierremothet等,procnatlacadsciusa,2000,97(9)4926-4931；zitok和scheussv.(2009)nmdareceptorfunctionandphysiologicalmodulation.encyclopediaofneuroscience(squirelr编),第6卷,第1157-1164页.oxford:academicpress)。丝氨酸在学习和突触可塑性方面起重要作用，因此，丝氨酸补充可适用于年长者、生长儿童、学龄儿童和经受学习困难者。另外，它可向试图学习新任务的任何人给与，所述新任务无论是仪器或运动员/跳舞者试图改进或学习新运动和动作。此外，由于它作为半胱氨酸的前体的作用，它可作为用于达成半胱氨酸的作用的上游调控剂来给与。作为合成甘氨酸的前体，丝氨酸可用于化妆产品中以抗击衰老，并且由于它在胶原蛋白合成中的作用而促进适当生长。此外，由于它在肌酸生物合成路径中的作用，它可用于改进运动能力。此外，由于它在谷胱甘肽代谢路径中的作用，它可极其适用于解毒和免疫健康中。苏氨酸：苏氨酸是eaa，并且是不通过转氨酶和d-aa氧化酶转化成它的l-异构体的少数aa中的一个。苏氨酸用于合成粘蛋白，所述粘蛋白用于维持肠的完整性和功能。由粘蛋白和无机盐混悬于水中组成的粘液充当对抗与诸如胃酸和烟雾的有害物质接触的扩散屏障。粘液也充当用以使剪切应力最小的润滑剂(g.k.law等,amjphysiolgastrointestliverphysiol292:g1293-g1301,2007)。90％的膳食性苏氨酸在肠中用于粘液合成。粘蛋白被连续合成并对肠蛋白水解极具抗性，并且因此并不极其易于被再循环。因此，大量和连贯供给苏氨酸用于有效维持肠功能和结构。因此，极其重要的是膳食富含苏氨酸以防止粘液产生降低，此可导致肠中癌症、溃疡等(g.k.law等,amjphysiolgastrointestliverphysiol292:g1293-g1301,2007；a.hamard等,journalofnutritionalbiochemistry,2010年10月,第21卷,第10期,第914-921页)。归因于粘液对肠的完整性和结构的重要性，苏氨酸补充可适用于预防肠病症，包括癌症、溃疡、感染和糜烂。苏氨酸在体液免疫中起关键作用，因为苏氨酸是由血液中的b淋巴细胞分泌的免疫球蛋白的主要组分。一旦释放，它们即到达感染部位，识别、结合它们的抗原以及使所述抗原失活。由于免疫球蛋白的苏氨酸含量较高，所以苏氨酸缺乏可负面影响免疫球蛋白产生，并且由此降低免疫应答。苏氨酸补充为它在免疫应答中的作用所必需，并且可支持白血病患者、aids患者和具有免疫缺陷的个体。另外，它可支持在流行性感冒季节期间易感于感染者，诸如年长者和小童，以及全年增强免疫应答。低量苏氨酸存在了解不带电荷的trna如何变构活化gcn2，从而导致与脂肪生成、蛋白质合成以及真核生物中许多生物合成路径相关的转录因子(以下讨论的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的机制。缺乏任何eaa的膳食在膳食引入之后数分钟内显著触发这个信号传导(hao等,science2005)。已体内显示通过srebp-1c进行的信号传导通过阻遏与脂肪生成相关的基因而对调动脂质储存物具有显著影响。已显示srebp-1c特异性作用于肝脂质合成，并且能够导致肝脂肪变性表型以及内脏脂肪质量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。已显示对于采用在缺乏苏氨酸下补充1-5.4％氨基酸混合物的基本酪蛋白膳食的大鼠，缺乏苏氨酸的不平衡膳食会传导gcn2信号。苏氨酸剥夺通过它对gcn2的作用而对srebp-1c具有影响，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪组织重量、胆固醇/甘油三酯含量和食物摄取降低。驱动脂肪质量降低同时维持瘦性质量在诸如肥胖症、糖尿病和心血管健康的领域中提供治疗机会。色氨酸：色氨酸是在免疫功能中起重要作用的eaa。举例来说，色氨酸的浓度由于慢性肺炎症而进行性下降。这表明通过吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)分解代谢色氨酸似乎对于巨噬细胞和淋巴细胞的功能极其重要。因此，邻氨基苯甲酸(ans)抑制促炎性t辅助1细胞因子的产生，并且预防自体免疫神经炎症。色氨酸可用于处理包括关节炎和哮喘或其它自体免疫疾病的某些疾病的炎症性效应。它也是血清素(5-ht)合成的前体，所述血清素是影响食欲、睡眠，并且广泛牵涉于抑郁发作中的神经递质。恢复的抑郁患者(采用ssri或其它神经递质再摄取抑制剂)中的5-ht活性异常导致对血流中低水平的色氨酸的急性敏感性。5-ht产生可通过口服摄取游离色氨酸而增加2倍，从而指示色氨酸施用在抑郁中具有作用。此外，由于明显依赖于5-ht可用性来达成患者结果改进，所以色氨酸可增强ssri的作用。此外，除罹患如抑郁或pms的影响的情绪病症者之外，色氨酸也可用于帮助重量减轻/维持，使罹患睡眠病症者受益，从旅行和时差综合症恢复。低量色氨酸存在了解不带电荷的trna如何变构活化gcn2，从而导致与脂肪生成、蛋白质合成以及真核生物中许多生物合成路径相关的转录因子(以下讨论的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的机制。缺乏任何eaa的膳食在膳食引入之后数分钟内显著触发这个信号传导(hao等,science2005)。已体内显示通过srebp-1c进行的信号传导通过阻遏与脂肪生成相关的基因而对调动脂质储存物具有显著影响。已显示srebp-1c特异性作用于肝脂质合成，并且能够导致肝脂肪变性表型以及内脏脂肪质量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。色氨酸剥夺通过它对gcn2的作用而对srebp-1c具有影响，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪组织重量、胆固醇/甘油三酯含量和食物摄取降低。驱动脂肪质量降低同时维持瘦性质量在诸如肥胖症、糖尿病和心血管健康的领域中提供治疗机会。酪氨酸：酪氨酸是从苯丙氨酸合成的非必需氨基酸。它用作包括肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺的许多重要神经递质的前体。酪氨酸帮助产生黑色素，并且帮助制备和调控激素的器官，如肾上腺、甲状腺和垂体腺。另外，酪氨酸涉及于体内几乎每种蛋白质的结构中。酪氨酸羟化酶使用四氢蝶啶作为辅因子或通过酪氨酸酶使l-酪氨酸转化成左旋多巴。由酪氨酸酶介导的所述转化使左旋多巴特异性氧化成多巴醌，并且左旋多巴由多巴脱羧酶进一步脱羧成多巴胺。多巴胺是极其重要的激素和神经递质，并且在精神健康与身体健康两者中起至关重要作用。多巴胺有助于控制脑的奖赏和愉快中心，有助于调控运动和情绪应答，并且使得能够看见奖赏并采取行动以向那些奖赏移动。含有多巴胺的神经元簇集在称为黑质的区域中的中脑中。在受帕金森氏病折磨者中，这个区域中传送多巴胺的神经元死亡，从而导致不能控制身体运动。为缓和帕金森氏病的症状，向患者给与可被转化成多巴胺的l-多巴。由于酪氨酸作为l-多巴和多巴胺的前体的作用，所以酪氨酸补充可帮助治疗帕金森氏病。另外，它可用于治疗患有如抑郁的情绪/精神病病症者，以及治疗成瘾性。此外，它可通过增加学习困难或复杂概念或动作期间的奖赏/愉快应答来促进学习。多巴胺，作为一种单胺儿茶酚胺神经递质，在免疫系统中起调控作用。与存在于特定免疫效应细胞中的特定受体相互作用的神经递质和神经肽由免疫系统释放以影响这些细胞在宿主中针对疾病和其它环境应激的功能。已显示多巴胺的免疫调控性作用通过存在于靶标细胞中的五种不同g蛋白偶联受体来调控。存在这些受体的两个广泛类别：g1和g2，其涵盖不同亚型。d1类别的受体包括d2和d5亚型，并且在活化后使细胞内camp增加。d2类别的受体由d2、d3和d4亚型组成，并且已被报道在刺激后抑制细胞内camp。多巴胺受体已见于正常人白细胞上。同样，淋巴组织具有通过交感神经达成的多巴胺能神经支配，此表明多巴胺可能够调控免疫系统效应细胞(basu,sujit和sarkar,chandrani,dopamineandimmunesystem.scitopics2010)。多巴胺通过活化静息t细胞以及抑制受刺激t细胞的活化来影响t细胞。在正常静息外周人t淋巴细胞中，多巴胺活化d2和d3子类的受体，此转而活化整联蛋白(α4β1和α5β1)。这些整联蛋白是使细胞附着于细胞外基质组分纤维结合蛋白的异二聚跨膜糖蛋白。纤维结合蛋白用于使t细胞跨越组织屏障和血管进行迁移和外渗。此外，多巴胺通过d3受体起选择性诱导cd8+t细胞迁移和归巢的作用。此外，多巴胺通过影响由t细胞分泌细胞因子来影响t细胞。当多巴胺刺激d3和d1/d5受体时，tnf-α(一种多效性炎症性细胞因子)的分泌被增加。当刺激d2受体时，il-10(一种消炎性细胞因子)被诱导分泌。然而，多巴胺可通过下调非受体酪氨酸激酶lck和fyn的表达来抑制活化的t细胞受体诱导的细胞增殖以及许多细胞因子(如il-2、ifn-γ和il-4)的分泌，所述激酶是在引发tcr活化方面重要的酪氨酸激酶(basu,sujit和sarkar,chandranidopamineandimmunesystem.scitopics2010)。b细胞具有极高多巴胺d2、d3和d5受体表达。多巴胺能够抑制静息和恶性b淋巴细胞的增殖。多巴胺通过促进周期性b细胞由于氧化应激的凋亡来起作用。然而，尚未在静息淋巴细胞中观察到这个多巴胺能作用，因此表明在预防癌症方面的作用(basu,sujit和sarkar,chandrani,dopamineandimmunesystem.scitopics2010)。酪氨酸，作为多巴胺的前体，可用于改进免疫应答以及改进总体免疫系统功能性。它可向年长者、妊娠妇女、儿童和免疫功能受损害者(如aids患者和癌症患者)提供益处。它也可向教师、旅行者和频繁暴露于病菌的任何人给与。ne由β-羟化酶以及辅因子抗坏血酸使多巴胺进行β-氧化来在交感神经系统中的肾上腺髓质和节后神经元中合成。它通过分泌至突触间隙中来起作用，在所述突触间隙中，它刺激肾上腺素能受体，并且接着由周围细胞降解或摄取。作为一种儿茶酚胺，它不跨越血脑屏障。ne可用于抗击adhd、抑郁和低血压。就如adhd的注意力病症而言，指定的药物倾向于帮助增加ne和多巴胺的水平。此外，抑郁通常用抑制血清素和ne再摄取，由此增加脑中突触后细胞中可用的血清素和ne的量的药物治疗。新近证据已表明snri也可增加多巴胺传送，因为如果去甲肾上腺素转运体也通常使多巴胺再循环，那么snri将也增强多巴胺能传送。因此，也可与ne水平增加相关的抗抑郁剂作用可部分归因于多巴胺同时增加(特定来说在脑前额皮质中)。ne用于治疗患有危急性低血压的患者。ne是血管加压剂，并且作用于α1肾上腺素能受体与α2肾上腺素能受体两者以导致血管收缩，由此使血压增加。作为ne的前体，酪氨酸可用于治疗注意力病症，如adhd和add。另外，它可用于治疗罹患抑郁、创伤后应激综合征者和急性低血压者。普遍称为肾上腺素(adrenaline)的肾上腺素(epinephrine)是由肾上腺的髓质分泌的激素。肾上腺素应答于诸如恐惧或愤怒的强烈情绪而释放，其导致心率、肌肉强度、血压和糖代谢增加。它导致使身体准备进行困难或激烈活动的惊逃或对抗应答。肾上腺素用作心脏停搏期间的刺激剂、休克期间用以增加血压的血管收缩剂、和支气管哮喘中的支气管扩张剂和抗痉剂。肾上腺素不大量见于体内，但在维持心血管体内平衡方面极其重要，因为它能够使血液转向处于应激下的组织。肾上腺素通过影响肌肉收缩来具有这个作用。当浓度比细胞中的正常值大10倍时，通过钙调蛋白与钙结合来发生肌肉的收缩。钙-钙调蛋白复合物接着继续活化肌球蛋白轻链激酶，其接着使lc2磷酸化，从而导致收缩。肾上腺素结合肾上腺素受体，此活化腺苷酰基环化酶，并且从atp产生环状amp。camp活化蛋白质激酶，其由此使肌球蛋白轻链激酶磷酸化。这个磷酸化肌球蛋白轻链激酶对钙-钙调蛋白复合物具有较低亲和力，并且因此是非活性的。因此，平滑肌组织被松驰。肾上腺素的这个作用使得它极适用于治疗哮喘、心脏停搏和过敏性休克。酪氨酸，作为肾上腺素的前体，可用于处于心脏停搏的风险下的患者、罹患哮喘者和处于过敏性休克的风险者。肾上腺素是通过结合肝细胞的外部上的受体来分解糖原的两种主要激素中的一种。这个结合导致发生构象变化，由此允许g蛋白进行结合，并且变得具有活性。g蛋白偶联受体的活化导致发生分子构象变化，所述构象变化导致腺苷酸环化酶进行结合。一旦腺苷酸环化酶结合复合物，腺苷酸环化酶即将atp分解成camp，其接着变为这个过程中的第二信使蛋白质，并且活化蛋白质激酶。活化的蛋白质激酶使磷酸化酶活化，所述磷酸化酶是催化糖原分解成葡萄糖的酶。酪氨酸，作为肾上腺素的前体，可用于通过使得葡萄糖可易于用于为运动供以燃料来改进运动表现。黑色素是酪氨酸的代谢物，并且是强力抗氧化剂。另外，它在抑制炎症性细胞因子和超氧化物的产生方面具有影响。当促炎性细胞因子被过度产生时，它介导如类风湿性关节炎、移植物抗宿主反应、恶病质和败血症综合征的病理性病状中炎症的损害作用。已发现黑色素抑制正在进行的细胞因子合成，此强烈表明黑色素可适用作针对涉及促炎性细胞因子的病状的叠加疗法(mohagheghpourn.等,cellimmunol.2000年1月10日；199(1):25-36)。酪氨酸可用于治疗类风湿性关节炎、恶病质、败血症综合征、具有与自体免疫病症相关的炎症者、和病理性病状的其它炎症性后遗症。缬氨酸：缬氨酸是eaa，并且也是bcaa。包括缬氨酸的bcaa通过促进蛋白质合成，遏制蛋白质分解代谢，以及充当葡糖异生的底物来充当代谢应激的时期期间骨骼肌的燃料来源。包括缬氨酸的bcaa是动物组织中合成谷氨酰胺的底物，并且已显示谷氨酰胺可在介导动物中bcaa的合成代谢作用方面起作用。这种作用可能对于泌乳乳腺是重要的，因为它产生的谷氨酰胺多于它从动脉血液所摄取。胎盘中bcaa的分解代谢导致谷氨酰胺合成以及它向胎儿循环中释放，此是在胎儿中循环的谷氨酰胺的主要来源。这表明用缬氨酸以及其它bcaa或其组合补充膳食可增加哺乳动物中的胎儿生长。另外，缬氨酸在丙氨酸的合成中起直接作用，并且因此关于丙氨酸具有调控功能。已显示bcaa通过在静息人肌肉中增加蛋白质合成的速率以及降低蛋白质降解的速率而对蛋白质代谢具有合成代谢作用。另外，显示bcaa在耐力训练后的恢复期间在人肌肉中具有合成代谢作用。这些作用通过mtor的磷酸化以及70-kds6蛋白质激酶(p70-kds6)和真核起始因子4e结合蛋白1的依序活化来介导。p70-kds6因它在调节细胞周期进展、细胞大小和细胞存活方面的作用而众所周知。应答于有丝分裂原刺激的p70-kds6活化上调核糖体生物合成，并且增强细胞的翻译能力(w-lan等,amjpathol.2003年8月；163(2):591–607；e.blomstrand等,j.nutr.2006年1月136:269s-273s)。真核起始因子4e结合蛋白1是使40s核糖体亚单位向mrna的5’末端募集的多亚单位复合物的限制性组分。p70s6激酶的活化以及核糖体蛋白质s6的随后磷酸化与特定mrna的翻译增强相关。在一个时间段的四头肌肌肉抵抗训练期间以及之后向受试者给与bcaa显示mtor、p70s6激酶增加，并且s6磷酸化见于训练之后的恢复时期中。然而，bcaa对akt或糖原合成酶激酶3(gsk-3)不存在所述作用。在不摄取bcaa下训练导致p70s6激酶的部分磷酸化而不活化所述酶，akt磷酸化降低，并且gsk-3不变化。bcaa输注也以akt非依赖性方式增加静息受试者的p70s6激酶磷酸化。这个mtor活性调控细胞蛋白质转换(自体吞噬)，并且使胰岛素样生长信号整合于各组织的蛋白质合成引发。这个生物作用已与骨骼肌中瘦性组织质量的生物发生、肥胖症和胰岛素抗性的疾病状态的代谢转变、以及衰老直接相关联。缬氨酸在肌肉代谢、组织修复、以及体内适当氮平衡的维持中起关键作用。作为三种bcaa中的一种，它可由肌肉组织用作能量来源。缬氨酸是葡萄糖生成性aa，并且因此提供葡萄糖。缬氨酸可适用于治疗肝和胆囊疾病。另外，缬氨酸可适用于矫正重度aa缺乏症的由药物成瘾性引起的类型。此外，已发现缬氨酸会促进精神活力、肌肉调协和情绪平静。它也可用于防止在高海拔处的肌肉损失。缬氨酸补充可用于改进运动表现和肌肉形成，有助于药物成瘾性康复，增强年长者和生长儿童的精神活力，防止伴随衰老的肌肉损失，辅助罹患肝病者，支持儿童身体生长，充当针对胆囊和肝疾病的疗法，增加哺乳动物的泌乳，增加哺乳动物中的胎儿生长，并且改进向饥饿群体给与的食物的营养品质。低量缬氨酸在肥胖症和糖尿病的状态下，已显示动物会展现降低的肝自体吞噬，从而导致胰岛素抗性增加。自体吞噬对于维持er和细胞体内平衡是重要的，所述体内平衡在受应激时可导致胰岛素敏感性受损。在动物模型中进行高脂肪膳食供食使er受应激，同时通过过度刺激mtorc1来导致肝自体吞噬受阻抑，此使糖尿病中朝向β细胞胰岛素敏感性功能受损的进展加强。降低全身性缬氨酸的水平提供用以降低mtorc1活性以及恢复自体吞噬的健康水平的机会。存在了解不带电荷的trna如何变构活化gcn2，从而导致与脂肪生成和蛋白质合成以及真核生物中许多生物合成路径相关的转录因子(以下讨论的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的机制。缺乏任何eaa的膳食在膳食引入之后数分钟内显著触发这个信号传导(hao等,science2005)。已体内显示通过srebp-1c进行的信号传导通过阻遏与脂肪生成相关的基因而对调动脂质储存物具有显著影响。已显示srebp-1c特异性作用于肝脂质合成，并且能够导致肝脂肪变性表型以及内脏脂肪质量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。缬氨酸剥夺通过它对gcn2的作用而对srebp-1c具有影响，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪组织重量、胆固醇/甘油三酯含量和食物摄取降低。驱动脂肪质量降低同时维持瘦性质量在诸如肥胖症、糖尿病和心血管健康的领域中提供治疗机会。氨基酸药理学的体外分析。如本文所提供，氨基酸充当为合成新蛋白质所必需的底物，并且也充当信号传导分子。对给定氨基酸的药理学性质的分析取决于所用细胞系和模型系统。举例来说，已显示氨基酸亮氨酸会增加雷帕霉素(rapamycin)复合物i的哺乳动物靶标和骨骼肌细胞中的合成代谢中涉及的下游靶标的磷酸化(granp和dcameron-smith.2011.theactionsofexogenousleucineonmtorsignalingandaminoacidtransportersinhumanmyotubes.bmcphysiol.11:10)。氨基酸药理学的体外测定也可揭示某些癌症类型中的营养缺陷体。已报道多种永生化癌细胞系中的甲硫氨酸营养缺陷体(cavuotop和mffenech.2012.areviewofmethioninedependencyandtheroleofmethioninerestrictionincancergrowthcontrolandlife-spanextension.cancertreatrev.38:726-736)。在鉴定相关细胞系之后，可设计利用氨基酸、蛋白质消化物或二肽和三肽作为自变量或操纵变量的体外测定。适当细胞系是基于它作为细胞过程的模型的相关性来选择。举例来说，c2c12(atcc，crl-1772)是分化成肌纤维，并且用作骨骼肌纤维分化和发育的模型的鼠类成肌细胞细胞系。细胞被维持在补充以多达10％的供给必需生长因子的胎牛血清、以及青霉素和链霉素的完全培养基中。使粘着细胞系在具有用于过滤气体交换的酚性盖的t75烧瓶中生长，并且于含湿气环境中在37℃下在5％co2下孵育。表aa列出用于测定氨基酸药理学的细胞系。对于体外测定，将细胞在凭经验确定的适当细胞密度下接种于t75烧瓶、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板中。在孵育时期之后，完全生长培养基用缺乏测试物品的培养基替换。在一段时期的培养基耗竭之后，将测试物品添加在适当培养基中。在处理时期之后，测量相关因变量。表aa.用于氨基酸药理学的体外测定中的示例性细胞系的清单。参见例如wu,g.aminoacids:metabolism,functions,andnutrition.aminoacids37(1):1-17(2009)；wu,g.functionalaminoacidsinnutritionandhealth.aminoacids45(3):407-11(2013)；schworer,c.glucagon-inducedautophagyandproteolysisinratliver:mediationbyselectivedeprivationofintracellularaminoacids.pnas76(7):3169-73(1979)；codongo,p.autophagy:apotentiallinkbetweenobesityandinsulinresistance.cellmetabolism11(6):449-51(2010)；leong,h等.short-termargininedeprivationresultsinlarge-scalemodulationofhepaticgeneexpressioninbothnormalandtumorcells:microarraybioinformaticanalysis.nutritionandmetabolism3:37(2006)；harbrecht,b.g.glutathioneregulatesnitricoxidesynthaseinculturedhepatocytes.annalsofsurgery225(1):76-87(1997)；watermelonjuice:apotentialfunctionaldrunkforsoremusclereliefinathletes.j.agric.foodchem.61(31):7522-8(2013)。分泌营养性多肽。在另一方面，提供含有可食用物种多肽的氨基酸序列的营养性多肽，其被工程改造来从单细胞生物体分泌并从其纯化。所述营养性多肽对于宿主细胞可为内源性的或外源性的，可以多肽形式或在宿主细胞中天然分泌，或两者，并且被工程改造以达成营养性多肽的分泌。营养性多肽的有利性质包括能够在宿主细胞中表达和分泌，可溶于广泛多种溶剂中，并且当由预定受试者消耗时，具有营养性益处、降低的过敏原性或无过敏原性，无毒性，并且可消化。所述性质可至少部分基于预期消耗者和消耗营养性多肽的原因(例如为达成总体健康、肌肉合成代谢、免疫健康或治疗或预防疾病、病症或病状)而被重视。例如通过基于一级序列计算所有相关氨基酸的质量分数，一个或多个营养准则得以满足。非限制性地举例来说，本发明的多肽提供于表1中。预测的前导物列显示预测的前导物(如果存在前导物)的序列索引。片段索引列显示片段序列的序列索引。dbid列列出各序列截至2014年9月24日可用的uniprot或genbank登录号，其各自以引用的方式并入本文。仅具有数字字符的dbid来自genbank数据库，而具有混合字母/数字字符的那些来自uniprot数据库。核酸本文也提供编码多肽或蛋白质的核酸。在一些实施方案中，核酸是分离的。在一些实施方案中，核酸是纯化的。在核酸的一些实施方案中，核酸包含编码本文公开的第一多肽序列的核酸序列。在核酸的一些实施方案中，核酸由编码本文公开的第一多肽序列的核酸序列组成。在核酸的一些实施方案中，核酸包含编码本文公开的蛋白质的核酸序列。在核酸的一些实施方案中，核酸由编码本文公开的蛋白质的核酸序列组成。在核酸的一些实施方案中，编码第一多肽序列的核酸序列操作性地连接于至少一种表达控制序列。举例来说，在核酸的一些实施方案中，编码第一多肽序列的核酸序列操作性地连接于启动子，诸如本文所述的启动子。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子编码自身是多肽或蛋白质的多肽或蛋白质。这种核酸分子可被称为“核酸”。在一些实施方案中，核酸编码自身包含以下至少一个的多肽或蛋白质：a)至少24％的支链氨基酸残基与总氨基酸残基的比率；b)至少11％的leu残基与总氨基酸残基的比率；和c)至少49％的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率。在一些实施方案中，核酸包含至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、至少900个核苷酸、至少1,000个核苷酸。在一些实施方案中，营养性核酸包含10至100个核苷酸、20至100个核苷酸、10至50个核苷酸、或20至40个核苷酸。在一些实施方案中，核酸包含编码可食用物种多肽或蛋白质的开放阅读框的全部或一部分。在一些实施方案中，核酸由编码可食用物种蛋白质的片段的开放阅读框组成，其中所述开放阅读框不编码完整可食用物种蛋白质。在一些实施方案中，核酸是cdna。在一些实施方案中，提供包含与可食用物种核酸至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一的序列的核酸分子。在一些实施方案中，提供在严格杂交条件下与至少一种参照核酸杂交的核酸。本公开中提供的核酸及其片段显示在多种系统和方法中具有效用。举例来说，片段可在各种杂交技术中用作探针。视方法而定，靶标核酸序列可为dna或rna。可在杂交之前分级分离(例如通过凝胶电泳)靶标核酸序列，或杂交可对样品原位进行。本领域技术人员将了解具有已知序列的核酸探针在确定染色体结构(例如通过dna印迹)和测量基因表达(例如通过rna印迹)方面具有效用。在所述实验中，序列片段优选被可检测标记，以使可检测以及任选定量它们与靶标序列的特异性杂交。本领域技术人员将了解本公开的核酸片段可用于本文未明确描述的广泛多种印迹技术中。也应了解当固定在微阵列芯片上时，本文公开的核酸序列片段也适用作探针。用于通过将核酸沉积和固定于支撑基材上来产生微阵列的方法在本领域中是熟知的。综述于以下中：dnamicroarrays:apracticalapproach(practicalapproachseries),schena(编),oxforduniversitypress(1999)(isbn:0199637768)；naturegenet.21(1)(增刊):1-60(1999)；microarraybiochip:toolsandtechnology,schena(编),eatonpublishingcompany/biotechniquesbooksdivision(2000)(isbn:1881299376)，其公开内容以引用的方式整体并入本文。使用包含核酸序列片段(诸如本文公开的核酸序列片段)的微阵列芯片分析例如基因表达在细胞和分子生物学领域中是序列片段的明确确定效用。固定在微阵列芯片上的序列片段的其它用途描述于以下中：gerhold等,trendsbiochem.sci.24:168-173(1999)以及zweiger,trendsbiotechnol.17:429-436(1999)；dnamicroarrays:apracticalapproach(practicalapproachseries),schena(编),oxforduniversitypress(1999)(isbn:0199637768)；naturegenet.21(1)(增刊):1-60(1999)；microarraybiochip:toolsandtechnology,schena(编),eatonpublishingcompany/biotechniquesbooksdivision(2000)(isbn:1881299376)。表达载体也提供一种或多种包含至少一种本文公开的核酸分子的载体，包括表达载体，如本文进一步所述。在一些实施方案中，载体包含至少一种编码如本文公开的蛋白质的分离的核酸分子。在替代性实施方案中，载体包含可操作地连接于一种或多种表达控制序列的这种核酸分子。载体可因此用于在重组微生物宿主细胞中表达至少一种重组蛋白。在一些方面，一个载体或一组载体可包括编码例如用以导致本文公开的蛋白质分泌的信号肽的核酸序列。对于对信号肽和分泌的进一步讨论，参见下文。适于在微生物中表达核酸的载体为本领域技术人员所熟知。适用于蓝细菌中的载体例如描述于heidorn等,“syntheticbiologyincyanobacteria:engineeringandanalyzingnovelfunctions,”methodsinenzymology,第497卷,第24章(2011)中。可用于工程改造如本文公开的蓝细菌的示例性复制型载体包括ppmqak1、psl1211、pfc1、psb2a、pscr119/202、psun119/202、prl2697、prl25c、prl1050、psg111m和ppbh201。也可使用能够接受本文公开的核酸序列的其它载体，诸如pjb161。诸如pjb161的载体包含与某些光合微生物内源性质粒(例如某些聚球藻属(synechococcus)物种的质粒paq1、paq3和paq4)中存在的序列同源的序列。所述载体的实例以及如何使用它们在本领域中是已知的，并且例如提供于xu等,“expressionofgenesincyanobacteria:adaptationofendogenousplasmidsasplatformsforhigh-levelgeneexpressioninsynechococcussp.pcc7002,”第21章,robertcarpentier(编),“photosynthesisresearchprotocols,”methodsinmolecularbiology,第684卷,2011中，所述文献据此以引用的方式并入本文。在pjb161与内源性质粒之间进行体内重组产生从它们的内源性质粒表达目标基因的工程改造的微生物。或者，载体可被工程改造来与宿主细胞染色体重组，或载体可被工程改造来独立于宿主细胞染色体或任何宿主细胞的内源性质粒来复制和表达目标基因。适于重组蛋白产生的载体的另一实例是pet系统这个系统已被广泛表征以用于大肠杆菌和其它微生物中。在这个系统中，将靶标基因在强噬菌体t7转录和(任选)翻译信号控制下克隆在pet质粒中；通过在宿主细胞中提供t7rna聚合酶的来源来诱导表达。t7rna聚合酶具有如此选择性和活性以致当被充分诱导时，几乎所有微生物的资源都被转向靶标基因表达；在诱导之后数小时，所需产物可占总细胞蛋白质的50％以上。也有可能仅通过降低诱导剂的浓度来减弱表达水平。降低表达水平可增强一些靶标蛋白质的可溶性产率。在一些实施方案中，这个系统也允许维持靶标基因处于转录沉默未诱导状态。在使用这个系统的一些实施方案中，靶标基因是使用不含有t7rna聚合酶基因的宿主来克隆，由此减轻与归因于产生对宿主细胞具有潜在毒性的蛋白质的质粒不稳定性相关的潜在问题。一旦在非表达宿主中建立，靶标蛋白质表达即可通过用λce6(一种携带在λpl和pi启动子控制下的t7rna聚合酶基因的噬菌体)感染宿主，或通过将质粒转移至含有在lacuv5控制下的t7rna聚合酶基因的染色体拷贝的表达宿主中来引发。在第二种情况下，表达是通过向细菌培养物中添加iptg或乳糖或使用自身诱导培养基来诱导。由lac操纵子控制，但不需要t7rna聚合酶基因而依赖于大肠杆菌的天然rna聚合酶的其它质粒系统包括ptrc质粒套件(invitrogen)或pqe质粒套件(qiagen)。在其它实施方案中，有可能直接克隆至表达宿主中。在它们抑制基础表达水平的严格性方面不同的两种类型的t7启动子和若干宿主是可用的，从而提供优化广泛多种靶标基因的表达的极大灵活性和能力。适于在哺乳动物细胞中表达核酸的载体通常包含由病毒调控元件提供的控制功能。举例来说，通常使用的启动子源于多形瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒或猿猴病毒40。启动子适用于表达本文所述的重组基因的启动子包括组成性启动子与诱导性/阻遏性启动子两者。诱导性/阻遏性启动子的实例包括镍诱导性启动子(例如pnrsa、pnrsb；参见例如lopez-mauy等,cell(2002)第43卷:247-256)和尿素阻遏性启动子，诸如pnira(例如描述于qi等,appliedandenvironmentalmicrobiology(2005)第71卷:5678-5684中)。诱导性/阻遏性启动子的其它实例包括pnira(驱动nira基因的表达的启动子，由硝酸盐诱导，并且由尿素阻遏)和psuf(驱动sufb基因的表达的启动子，由铁应激诱导)。组成性启动子的实例包括pcpc(驱动cpc操纵元的表达的启动子)、prbc(驱动二磷酸核酮糖羧化酶氧合酶(rubisco)的表达的启动子)、ppsbaii(驱动ppsbaii的表达的启动子)、pcro(驱动cro的表达的λ噬菌体启动子)。在其它实施方案中，paphil和/或laclq-ptrc启动子可用于控制表达。当在工程改造的微生物中表达多种重组基因时，不同基因可由不同启动子或由单独操纵元中的相同启动子控制，或两种或更多种基因的表达可由作为操纵元的一部分的单一启动子控制。诱导性启动子的其它非限制性实例可包括但不限于通过表达外源性蛋白质(例如t7rna聚合酶、sp6rna聚合酶)，通过存在小分子(例如iptg、半乳糖、四环素、类固醇激素、脱落酸(abscisicacid))，通过不存在小分子(例如co2、铁、氮)，通过金属或金属离子(例如铜、锌、镉、镍)，以及通过环境因素(例如热、冷、应激、光、黑暗)和通过生长期加以诱导的那些。在一些实施方案中，诱导性启动子受严密调控以使在不存在诱导下，大致上无转录通过启动子被引发。在一些实施方案中，诱导启动子不实质上改变通过其它启动子进行的转录。此外，一般来说，诱导诱导性启动子的化合物或条件不天然存在于寻求表达所处的生物体或环境中。在一些实施方案中，诱导性启动子是通过限制向蓝细菌培养物供给co2来诱导。非限制性地举例来说，诱导性启动子可为在co2限制条件下被上调的集胞藻属(synechocystis)pcc6803诸如cmp基因、ntp基因、ndh基因、sbt基因、chp基因和rbc基因或其变体或片段的启动子序列。在一些实施方案中，诱导性启动子是通过铁饥饿或通过进入稳定生长期来诱导。在一些实施方案中，诱导性启动子可为在fe饥饿条件下被上调的蓝细菌基因(诸如isia)或当培养物进入稳定生长期时被上调的蓝细菌基因(诸如isia、phra、sigc、sigb和sigh基因或其变体或片段)的启动子序列的变异序列。在一些实施方案中，诱导性启动子由金属或金属离子诱导。非限制性地举例来说，诱导性启动子可由铜、锌、镉、汞、镍、金、银、钴和铋或其离子诱导。在一些实施方案中，诱导性启动子由镍或镍离子诱导。在一些实施方案中，诱导性启动子由诸如ni2+的镍离子诱导。在另一示例性实施方案中，诱导性启动子是来自集胞藻属pcc6803的镍诱导性启动子。在另一实施方案中，诱导性启动子可由铜或铜离子诱导。在另一实施方案中，诱导性启动子可由锌或锌离子诱导。在另一实施方案中，诱导性启动子可由镉或镉离子诱导。在另一实施方案中，诱导性启动子可由汞或汞离子诱导。在一替代性实施方案中，诱导性启动子可由金或金离子诱导。在另一替代性实施方案中，诱导性启动子可由银或银离子诱导。在另一替代性实施方案中，诱导性启动子可由钴或钴离子诱导。在另一替代性实施方案中，诱导性启动子可由铋或铋离子诱导。在一些实施方案中，启动子是通过使包含诱导性启动子的细胞暴露于金属或金属离子来诱导。可通过向微生物生长培养基中添加金属来使细胞暴露于金属或金属离子。在某些实施方案中，添加至微生物生长培养基中的金属或金属离子可从培养基高效回收。在其它实施方案中，在回收之后剩余在培养基中的金属或金属离子不实质上阻碍对培养基或细菌基因产物的下游处理。组成性启动子的其它非限制性实例包括来自革兰氏阴性细菌(gram-negativebacteria)或在革兰氏阴性细菌中增殖的噬菌体的组成性启动子。举例来说，可使用编码高度表达的革兰氏阴性基因产物的基因的启动子，诸如lpp、ompa、rrna和核糖体蛋白质的启动子。或者，可调控启动子可用于缺乏那个启动子的调控蛋白的菌株中。举例来说，plac、ptac和ptrc可用作缺乏lacl的菌株中的组成性启动子。类似地，p22pr和pl可用于缺乏λc2阻遏蛋白的菌株中，并且λpr和pl可用于缺乏λc1阻遏蛋白的菌株中。在一个实施方案中，组成性启动子来自噬菌体。在另一实施方案中，组成性启动子来自沙门氏菌属(salmonella)噬菌体。在另一实施方案中，组成性启动子来自蓝绿藻噬菌体。在一些实施方案中，组成性启动子是集胞藻属启动子。举例来说，组成性启动子可为ppsball启动子或它的变异序列、prbc启动子或它的变异序列、pcpc启动子或它的变异序列、以及prnpb启动子或它的变异序列。宿主也提供用本文公开的核酸分子或载体转化的宿主细胞及其后代。在一些实施方案中，宿主细胞是微生物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞携带在可为但无需为自由复制载体的载体上的核酸序列。在其它实施方案中，核酸已整合至宿主细胞的基因组中和/或宿主细胞的内源性质粒中。转化的宿主细胞例如适用于产生本文公开的重组蛋白。多种宿主微生物可用本文公开的核酸序列转化，并且在一些实施方案中，可用于产生本文公开的重组蛋白。适合宿主微生物包括自养性微生物与异养性微生物两者。在一些应用中，自养性微生物允许降低为制备由引入宿主微生物中的重组核酸序列编码的蛋白质所需的化石燃料和/或电输入量。在一些应用中，这转而降低产生蛋白质的成本和/或环境影响，和/或相较于制造替代性蛋白质(诸如乳清、蛋和大豆)的成本和/或环境影响，降低成本和/或环境影响。举例来说，在一些实施方案中，使用如本文公开的宿主微生物制备本文公开的蛋白质的成本和/或环境影响低于通过加工牛奶以适于人消耗的形式制备乳清蛋白质的成本和/或环境影响。异养生物的非限制性实例包括大肠杆菌(escherichiacoli)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)、变铅青链霉菌(streptomyceslividans)、委内瑞拉链霉菌(streptomycesvanezuelae)、玫瑰孢链霉菌(streptomycesroseosporus)、弗雷德氏链霉菌(streptomycesfradiae)、灰色链霉菌(streptomycesgriseus)、棒状链霉菌(streptomycescalvuligerus)、吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)、普拉特链霉菌(streptomycesplatensis)、糖多孢红霉菌(saccharopolysporaerythraea)、谷氨酸棒杆菌、黑曲霉(aspergillusniger)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、米曲霉(aspergillusoryzae)、土曲霉(aspergillusterreus)、酱油曲霉(aspergillussojae)、产黄青霉(penicilliumchrysogenum)、里氏木霉(trichodermareesei)、丙酮丁醇棱菌(clostridiumacetobutylicum)、贝季尔林斯基梭菌(clostridiumbeijerinckii)、热纤梭菌(clostridiumthermocellum)、fusibacterpaucivorans、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、布拉迪酵母(saccharomycesboulardii)、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)和树干毕赤酵母(pichiastipitis)。光合自养性微生物包括真核藻类以及原核蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌和紫色非硫细菌。极端生物也涵盖为适合生物体。提供所述生物体，例如混合营养性生物体也是适合生物体。藻类和蓝细菌被涵盖为适合生物体。参见例如公开于2013年3月15日提交的pct/us2013/032232、2013年3月15日提交的pct/us2013/032180、2013年3月15日提交的pct/us2013/032225、2013年3月15日提交的pct/us2013/032218、2013年3月15日提交的pct/us2013/032212、2013年3月15日提交的pct/us2013/032206和2013年4月29日提交的pct/us2013/038682中的生物体。其它适合生物体包括如venter等美国专利公布号2007/0264688中所述的合成细胞或由合成基因组产生的细胞、以及如glass等美国专利公布号2007/0269862中所述的细胞样系统或合成细胞。其它适合生物体包括大肠杆菌、醋酸杆菌(acetobacteraceti)、枯草芽孢杆菌、酵母和真菌，诸如扬氏梭菌(clostridiumljungdahlii)、热纤梭菌(clostridiumthermocellum)、产黄青霉、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)或运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis)。在一些实施方案中，那些生物体被工程改造来固定二氧化碳，而在其它实施方案中，它们不被工程改造。在一些实施方案中，诸如昆虫细胞或哺乳动物细胞(诸如人细胞)的真核细胞用作宿主细胞。熟知用于所述细胞的载体和表达控制序列，包括启动子和增强子。适用于这个目的的哺乳动物宿主细胞系的实例是由sv40转化的猴肾cv1株系(cos-7，atcccrl1651)；人胚肾株系(293细胞或被亚克隆来达成悬浮培养生长的293细胞，graham等,j.genvirol.36:59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(bhk，atccccl10)；中国仓鼠卵巢细胞/-dhfr(cho，urlaub等,proc.natl.acad.sci.usa77:4216(1980))；小鼠塞尔托利细胞(sertolicell)(tm4，mather,biol.reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(cv1atccccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcccrl-1587)；人宫颈癌细胞(hela，atccccl2)；犬肾细胞(mdck，atccccl34)；水牛大鼠肝细胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺细胞(w138，atccccl75)；人肝细胞(hepg2，hb8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562，atccccl51)；tri细胞(mather等,annalsn.y.acad.sci.383:44-68(1982))；mrc5细胞；fs4细胞；和人肝细胞瘤株系(hepg2)。转染可使用例如如本领域中熟知的重组dna技术和基因转染方法的组合在宿主细胞中产生蛋白质(例如morrison,s.(1985)science229:1202)。对于蛋白质的表达，通过标准技术来将编码蛋白质的表达载体转染至宿主细胞中。术语转染的各种形式意图涵盖通常用于将外源性dna引入原核或真核宿主细胞中的广泛多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、deae-右旋糖苷转染等。产生熟练技术人员了解可用于培养重组细胞以产生(以及任选分泌)如本文公开的蛋白质，以及用于纯化和/或分离表达的蛋白质的许多适合方法。选择用于蛋白质纯化的方法取决于许多变量，包括目标蛋白质的性质、它在细胞内的位置和形式、载体、宿主菌株背景和表达的蛋白质的预定应用。培养条件也可对给定靶标蛋白质的溶解度和定位具有影响。许多方法可用于纯化在如本文公开的重组微生物细胞中表达的靶标蛋白质，所述方法包括不限于离子交换和凝胶过滤。在一些实施方案中，添加肽融合标签至重组蛋白中，从而使得有可能使用利用肽融合标签的多种亲和纯化方法。在一些实施方案中，使用亲和方法使得能够在一步中将靶标蛋白质纯化至接近均质。纯化可包括用例如肠激酶、因子xa、凝血酶或hrv3c蛋白酶裂解融合标签的一部分或全部。在一些实施方案中，在表达的靶标蛋白质的纯化或活性测量之前，对靶标蛋白质的表达水平、细胞定位和溶解度进行初步分析。靶标蛋白质可见于任何或全部以下部分中：可溶性或不溶性细胞质部分、周质或培养基。视预定应用而定，在一些实施方案中，优先定位于包涵体、培养基或周质间隙可有利于通过相对简单程序达成快速纯化。尽管大肠杆菌被广泛认为是用于异源性蛋白质表达的强力宿主，但也广泛已知在这个宿主中过度表达许多蛋白质倾向于以不溶性包涵体形式聚集。一种用于挽救包涵体形成或改进蛋白质自身的滴度的最通常使用的方法在于包括融合于目标蛋白质的氨基末端麦芽糖结合蛋白(mbp)(austinbp,nallamsettys,waughds.hexahistidine-taggedmaltose-bindingproteinasafusionpartnerfortheproductionofsolublerecombinantproteinsinescherichiacoli.methodsmolbiol.2009；498:157-72)、或小泛素相关的修饰因子(sumo)(saitohh,uwadaj,azusak.strategiesfortheexpressionofsumo-modifiedtargetproteinsinescherichiacoli.methodsmolbiol.2009；497:211-21；malakhovmp,matternmr,malakhovaoa,drinkerm,weekssd,butttr.sumofusionsandsumo-specificproteaseforefficientexpressionandpurificationofproteins.jstructfunctgenomics.2004；5(1-2):75-86；panavast,sandersc,butttr.sumofusiontechnologyforenhancedproteinproductioninprokaryoticandeukaryoticexpressionsystems.methodsmolbiol.2009；497:303-17)。这两种蛋白质在大肠杆菌中极其良好，并且以可溶性形式表达以使目标蛋白质也以可溶性形式有效产生。可通过在目标蛋白质与融合蛋白之间设计位点特异性蛋白酶识别序列(诸如烟草蚀刻病毒(tev)蛋白酶)来裂解目标蛋白质。在一些实施方案中，目标蛋白质可存在于包涵体中；在一些方面，包涵体可被配制以向受试者递送。以下进一步详细讨论配制。在一些实施方案中，蛋白质初始未正确折叠或不可溶。熟知用于再折叠不溶性蛋白质的多种方法。大多数方案包括依次通过离心和在变性条件下溶解来分离不溶性包涵体。蛋白质接着被透析或稀释至非变性缓冲液中，在所述缓冲液中发生再折叠。因为每种蛋白质都具有独特折叠性质，所以用于任何给定蛋白质的最优再折叠方案可由熟练技术人员凭经验确定。最优再折叠条件可例如通过矩阵方法在小规模上快速确定，在所述方法中，测试诸如蛋白质浓度、还原剂、氧化还原处理、二价阳离子等的变量。一旦得到最优浓度，它们即可被应用于靶标蛋白质的较大规模溶解和再折叠。在一些实施方案中，蛋白质不包含三级结构。在一些实施方案中，蛋白质中小于半数氨基酸参与三级结构。在一些实施方案中，蛋白质不包含二级结构。在一些实施方案中，蛋白质中小于半数氨基酸参与二级结构。重组蛋白可从以包含这些结构特征中的一个或多个的状态表达它们的细胞的培养物分离。在一些实施方案中，在蛋白质从产生它的培养物分离之后，重组蛋白的三级结构被减小或消除。在一些实施方案中，在蛋白质从产生它的培养物分离之后，重组蛋白的二级结构被减小或消除。在一些实施方案中，在碱性ph下的caps缓冲液与n-月桂酰基肌氨酸的组合用于实现包涵体溶解，随后在dtt存在下透析以促进再折叠。视靶标蛋白质、表达条件和预定应用而定，从洗涤的包涵体溶解的蛋白质可为>90％均质，并且可不需要进一步纯化。使用融合蛋白和固定金属亲和色谱法有可能在完全变性条件下(在再折叠之前)进行纯化。此外，使用6m尿素从包涵体溶解的s·tagtm、和ii融合蛋白可通过稀释以获得2m尿素(s·tag和t7·tag)或1m尿素(strep·tagii)，随后在适当树脂上进行色谱法来在部分变性条件下纯化。再折叠的融合蛋白可使用his·tag、s·tag、strep·tagii和其它适当亲和标签(例如gst·tagtm和t7·tag)在非变性条件下亲和纯化。在一些实施方案中，蛋白质是用于表达它的宿主细胞的内源性蛋白质。也就是说，宿主细胞的细胞基因组包含编码重组蛋白的开放阅读框。在一些实施方案中，将足以增加蛋白质的表达的调控序列插入宿主细胞基因组中，并且操作性地连接于内源性开放阅读框以使所述调控序列驱动从重组核酸过度表达重组蛋白。在一些实施方案中，使异源性核酸序列融合于蛋白质的内源性开放阅读框，并且导致合成包含异源性氨基酸序列的蛋白质，所述异源性氨基酸序列改变重组蛋白的细胞迁移，诸如将它引导至细胞器或分泌路径中。在一些实施方案中，将编码内源性宿主细胞蛋白质的开放阅读框于质粒上引入宿主细胞中，所述质粒进一步包含操作性地连接于所述开放阅读框的调控序列。在一些实施方案中，重组宿主细胞表达的重组蛋白比由在类似条件下生长的类似宿主细胞产生的蛋白质的量多至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或至少100倍。在植物中产生重组蛋白营养性多肽可重组产生于植物，包括但不限于2013年3月15日提交的pct/us2013/032232、2013年3月15日提交的pct/us2013/032180、2013年3月15日提交的pct/us2013/032225、2013年3月15日提交的pct/us2013/032218、2013年3月15日提交的pct/us2013/032212、2013年3月15日提交的pct/us2013/032206和2013年4月29日提交的pct/us2013/038682中公开的那些生物体和产生方法、以及本领域中已知的任何在系统发生方面相关的生物体和其它产生方法。纯化分泌通常认识到几乎所有分泌细菌蛋白质和那些来自其它单细胞宿主的蛋白质以含有称为信号肽的n末端序列的前蛋白质形式被合成。这些信号肽影响蛋白质的最终目的地和它们被转运所依的机理。大多数信号肽可基于它们的易位机理(例如sec或tat介导)和用于从前蛋白质裂解信号肽的信号肽酶的类型而被置于四个组中的一个中。也提供含有脂蛋白信号肽的n末端信号肽。尽管携带这个类型的信号的蛋白质通过sec易位酶加以转运，但它们的肽信号倾向于短于正常sec信号，并且它们在c结构域中在-3至+1位置处含有称为脂框(l(as)(ga)c)的不同序列基序。在+1位置处的半胱氨酸在易位之后被脂质修饰，据此信号序列由ii型信号肽酶裂解。也提供iv型或前菌毛素(prepilin)信号肽，其中iv型肽酶裂解结构域位于n结构域与h结构域之间而非其它信号肽中常见的c结构域中。如本文所提供，可使信号肽连接于含有营养性多肽的异源性多肽序列(即不同于信号肽所源于或获得于的蛋白质)以产生重组营养性多肽序列。或者，如果营养性多肽在宿主生物体中被天然分泌，那么可为足够的是使用天然信号序列或引导分泌的多种信号序列。在营养性多肽的一些实施方案中，连接于信号肽的羧基末端的异源性营养性多肽序列是可食用物种真核蛋白质、其突变蛋白或衍生物、或多肽营养性结构域。在多肽的其它实施方案中，连接于信号肽的羧基末端的异源性营养性多肽序列是可食用物种细胞内蛋白质、其突变蛋白或衍生物、或多肽营养性结构域。营养性多肽的纯化。也提供用于从培养基回收分泌营养性多肽的方法。在一些实施方案中，在指数生长期期间或在指数生长期之后(例如在静止期前或静止期)从培养基回收分泌营养性多肽。在一些实施方案中，在静止期期间从培养基回收分泌营养性多肽。在一些实施方案中，在第一时间点从培养基回收分泌营养性多肽，在足以由微生物产生和分泌重组营养性多肽的条件下继续培养，并且在第二时间点从培养基回收重组营养性多肽。在一些实施方案中，通过连续方法来从培养基回收分泌营养性多肽。在一些实施方案中，通过批式方法来从培养基回收分泌营养性多肽。在一些实施方案中，通过半连续方法来从培养基回收分泌营养性多肽。在一些实施方案中，通过补料批式方法来从培养基回收分泌营养性多肽。本领域技术人员了解可用于培养重组细胞以产生(以及任选分泌)如本文公开的重组营养性多肽，以及用于纯化和/或分离表达的重组多肽的许多适合方法。选择用于多肽纯化的方法取决于许多变量，包括目标多肽的性质。本领域中已知各种纯化方法，包括透滤、沉淀和色谱法。非分泌在一些方面，可在不存在分泌下分离蛋白质。举例来说，可使具有蛋白质(例如在细胞表面上或细胞内)的细胞溶解，并且可使用诸如色谱法或基于抗体的蛋白质分离的标准方法从溶解产物纯化蛋白质。在一些方面，可从表面酶促裂解细胞表面表达的蛋白质。从来自可食用物种的生物物质分离营养性多肽在一些实施方案中，从食物来源，或从来自可食用物种的生物物质分离或纯化具有任选存在于所需氨基酸序列中的一种所需氨基酸或多种氨基酸的营养性多肽。举例来说，植物的生物物质包括坚果仁、种子、叶和根；哺乳动物的生物物质包括奶、肌肉、血清和肝。分离方法包括溶解、色谱法和沉淀。通过特异性溶解靶标营养性多肽来从生物物质分离营养性多肽。使生物物质在溶解溶液中混悬和均质化。基于营养性多肽生理化学性质选择溶解溶液。溶解溶液的组成是水、去污剂、盐、ph、离液剂、亲液剂和/或有机溶剂的混合物。举例来说，已知富含脯氨酸的蛋白质可溶于乙醇溶液中(dickey,l.c.等industrialcropsandproducts10.2(1999):137-143.)。通过在液体与生物物质的比率(w/w)1:1、2:1、3:1、4:1或本领域中认可的其它比率下将生物物质混悬于乙醇中来选择和分离脯氨酸含量较高的营养性多肽。掺合混悬液，并且通过离心来移除不溶性物质。乙醇可溶性营养性多肽被可溶性纯化于乙醇部分中。通过使靶标营养性多肽沉淀或使其它蛋白质沉淀来从生物物质分离营养性多肽。沉淀剂包括盐、ph、热量、絮凝剂、离液剂、亲液剂和有机溶剂。基于蛋白质生理化学性质选择用于给定营养性多肽的沉淀模式。举例来说，通过如本文所述的低溶合评分和低聚集评分来选择在ph7下热稳定的营养性多肽。为纯化这个蛋白质，将生物物质混悬于中性ph水溶液中并均质化。通过离心从溶液移除不溶性物质。为从其它蛋白质纯化营养性多肽，将上清液加热至90℃，持续10分钟。通过离心来移除不溶性物质。通过使用3kda膜进行透析来从上清液移除小分子，从而产生纯净营养性多肽。通过各种色谱方法来从生物物质分离营养性多肽。选择以供使用的色谱模式取决于靶标营养性多肽的物理化学性质。带电荷的营养性多肽通过静电相互作用结合离子交换色谱树脂。疏水性营养性多肽通过疏水性缔合结合疏水性相互作用色谱树脂。混合模式色谱法可用于多种营养性多肽，并且可通过多种相互作用来起作用。金属亲和色谱法可用于结合金属离子的营养性多肽。举例来说，选择营养性多肽以在ph4下具有较高的每个氨基酸电荷以使它紧密结合阳离子交换树脂。将生物物质添加至低离子强度ph4水溶液中并均质化。通过离心来移除不溶性物质。将可溶性物质添加至阳离子交换树脂，诸如来自lifetechnologies的xs强阳离子交换树脂中，并且用低离子强度ph4溶液洗涤。通过添加高离子强度(例如500mmnacl)ph4溶液来从树脂洗脱营养性多肽，从而产生纯化营养性多肽。合成营养性多肽氨基酸组合物在一些实施方案中，本公开的组合物含有代表存在于所选营养性多肽中的多种氨基酸的摩尔比的多种游离氨基酸，在本文中称为“营养性多肽掺合物”。在某些实施方案中，组合物包括游离氨基酸与营养性多肽两者。如本文在这些实施方案中所用，对营养性多肽和含有所述营养性多肽的组合物和制剂的公开包括对营养性多肽掺合物和含有所述营养性多肽掺合物的组合物和制剂、以及其中第一量的氨基酸以营养性多肽的形式存在，并且第二量的氨基酸以游离氨基酸形式存在的组合物的公开。合成产生方法在一些实施方案中，本公开的蛋白质是在不使用重组产生系统下化学合成。可使用本领域中已知的技术在液相系统中或在固相系统中进行蛋白质合成(参见例如atherton,e.,sheppard,r.c.(1989).solidphasepeptidesynthesis:apracticalapproach.oxford,england:irlpress；stewart,j.m.,young,j.d.(1984).solidphasepeptidesynthesis(第2版).rockford:piercechemicalcompany)。肽化学和合成方法在本领域中是熟知的，并且本公开的蛋白质可使用本领域中已知的任何方法制备。这种方法的一非限制性实例是合成树脂结合的肽(包括用于氨基酸脱保护的方法、用于从树脂裂解肽以及用于它的纯化的方法)。举例来说，可用于合成肽的fmoc保护的氨基酸衍生物是推荐的标准物：fmoc-ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh和fmoc-val-oh(由例如anaspec、bachem、irisbiotech或novabiochem供应)。例如使用基于fmoc的化学，在来自proteintechnologies的prelude固相肽合成仪(tucson,ariz.85714u.s.a.)上进行树脂结合的肽合成。适于制备c末端羧酸的树脂是可从novabiochem获得的预装载低载量wang树脂(例如低载量fmoc-thr(tbu)-wang树脂，ll，0.27mmol/g)。适于合成具有c末端酰胺的肽的树脂是可从matrix-innovation获得的pal-chemmatrix树脂。n末端α氨基用boc保护。可用含20％哌啶的nmp持续2x3分钟来实现fmoc脱保护。偶联化学是用dic/hoat/可力丁(collidine)在nmp中来达成。添加氨基酸/hoat溶液(0.3m/0.3m于nmp中，在摩尔过量3-10倍下)至树脂中，随后依次添加相同摩尔当量的dic(3m于nmp中)和可力丁(3m于nmp中)。举例来说，对于以下规模反应，每次偶联使用以下量的0.3m氨基酸/hoat溶液：规模/ml，0.05mmol/1.5ml、0.10mmol/3.0ml、0.25mmol/7.5ml。偶联时间是2x30分钟或1x240分钟。在合成之后，树脂用dcm洗涤，并且通过用tfa/tis/水(95/2.5/2.5)处理2-3小时，随后用乙醚沉淀来从树脂裂解肽。沉淀用乙醚洗涤。将粗肽溶解于水和mecn的适合混合物(诸如水/mecn(4:1))中，并且通过反相制备型hplc(watersdeltaprep4000或gilson)在含有c18硅胶的管柱上纯化。用mecn于含有0.1％tfa的水中的递增梯度进行洗脱。通过分析型hplc或uplc来检查相关洗脱份。混合含有纯净靶标肽的洗脱份并在减压下浓缩。分析(hplc、lcms)所得溶液，并且使用化学发光氮特异性hplc检测器(antek8060hplc-clnd)或通过测量280nm下的uv吸收来定量产物。将产物分配至玻璃小瓶中。小瓶用millipore玻璃纤维预过滤器封盖。冷冻干燥提供呈白色固体状的肽三氟乙酸盐。可例如使用本领域中已知的标准方法，利用lcms和/或uplc来检测和表征所得肽。可在由watersacquityuplc系统和来自micromass的lctpremierxe质谱仪组成的装备上进行lcms。uplc泵连接于两个含有以下的洗脱剂储集器：a)含0.1％甲酸的水；和b)含0.1％甲酸的乙腈。分析通过将适当体积的样品(优选2-10μl)注射于用a和b的梯度洗脱的管柱上来在室温下进行。uplc条件、检测器设置和质谱仪设置是：管柱：watersacquityuplcbeh，c-18，1.7μm，2.1mmx50mm。梯度：在4.0分钟(或者8.0分钟)期间，线性5％-95％乙腈，在0.4ml/min下。检测：214nm(来自tuv(可调谐uv检测器)的模拟输出)。ms离子化模式：api-es扫描：100-2000amu(或者500-2000amu)，步进0.1amu。uplc方法是熟知的。可使用的方法的非限制性实例描述在例如2013年2月28日公开的us2013/0053310a1的第16-17页处。使酶活性失活在一些方面，蛋白质是酶或具有酶活性。在一些方面，可合乎需要的是使酶的酶活性失活或降低。本领域中已知用于达成酶失活的各种方法，包括施加热量，施加一种或多种去污剂，施加一种或多种金属螯合剂，还原，氧化，施加一种或多种离液剂，共价修饰，例如通过酶促或化学改变来改变翻译后修饰，改变ph(酸性和碱性)，或改变盐浓度。举例来说，热失活通常在某一温度下进行某一时间量，例如通过在65℃下孵育20分钟来使大多数核酸内切酶失活。在一些方面，可例如通过使酶错误折叠来使酶突变以消除或降低酶活性。此外，高压二氧化碳(hpcd)已被证明是一种有效用于使酶失活的非热处理技术。参见hu等,enzymeinactivationinfoodprocessingusinghighpressurecarbondioxidetechnology；criticalreviewinfoodscienceandnutrition；第52卷,第2期,2013。本领域中已知各种其它形式的酶失活，其参数可根据需要加以调整以相应改变酶活性。各种酶失活方法和赋形剂诸如氧化，例如漂白，h2o2和氧化乙烯；还原二硫化物，例如dtt、bme和tcep；使用na2co3、tris碱或na2hpo4达成高ph；使用柠檬酸、硼酸、乙酸或trishcl达成低ph；使用温度30℃-100℃在一段时期内加热；用诸如硫氰酸盐、尿素、盐酸胍或cacl2的离液剂使蛋白质展开；用诸如mpd、triton(非离子)、chaps(两性离子)或吐温(tween)(非离子)的表面活性剂(例如去污剂)使蛋白质展开或用edta或柠檬酸盐螯合金属。细胞增殖测定细胞增殖测定可用于测量蛋白质或其部分对增殖过程的相对重要性。在一些方面，可在饥饿条件下在存在或不存在目标蛋白质下测量细胞增殖。举例来说，可在组织培养孵育器中用具有或缺乏各相应目标蛋白质的培养基在一段时期(例如48小时)内使细胞饥饿。在孵育之后，可添加诸如alamarblue的检测剂，并且将荧光测量为增殖输出。在一些方面，细胞增殖可被测量为对目标蛋白质的剂量应答的一部分。举例来说，可在组织培养孵育器中在具有或缺乏各相应目标蛋白质的培养基中使细胞饥饿。在饥饿之后，可接着用不同浓度的在初始培养中于缺乏相应蛋白质的相同来源培养基中缺乏的蛋白质(例如0、20、100或1000μm)处理细胞。可接着在组织培养孵育器中再次孵育细胞。在孵育之后，可添加诸如alamarblue的检测剂，并且读取荧光。过敏原性测定对于一些实施方案，优选的是蛋白质不展现不适当较高的过敏原性。因此，在一些实施方案中，评估蛋白质的潜在过敏原性。这可通过本领域中已知的任何适合方法进行。在一些实施方案中，计算过敏原性评分。过敏原性评分是一种基于who推荐(fao.org/ag/agn/food/pdf/allergygm.pdf)的以一级序列为基础的用于评估蛋白质与任何已知过敏原的类似程度的量度，其中主要预测是靶标与已知过敏原之间的高同一性百分比可能指示交叉反应性。对于给定蛋白质，可通过一对基于序列同源性的互补测试中的一个或两个来评估引发过敏应答的可能性。第一测试通过使用采用blosum50取代矩阵、空位开放罚分10和空位延伸罚分2的fasta算法，与某一数据库的已知过敏原进行整体-整体序列比对来确定蛋白质跨越整个序列的同一性百分比。已表明整体同源性小于50％的蛋白质不可能具有过敏原性(goodmanr.e.等allergenicityassessmentofgeneticallymodifiedcrops—whatmakessense？nat.biotech.26,73-81(2008)；aalberser.c.structuralbiologyofallergens.j.allergyclin.immunol.106,228-238(2000))。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质与用于分析的数据库中任何已知过敏原具有小于50％整体同源性。在一些实施方案中，使用小于40％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用小于30％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用小于20％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用小于10％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用40％至50％的截断值。在一些实施方案中，使用30％至50％的截断值。在一些实施方案中，使用20％至50％的截断值。在一些实施方案中，使用10％至50％的截断值。在一些实施方案中，使用5％至50％的截断值。在一些实施方案中，使用0％至50％的截断值。在一些实施方案中，使用与用于分析的数据库中任何已知过敏原的整体同源性大于50％的截断值。在一些实施方案中，使用50％至60％的截断值。在一些实施方案中，使用50％至70％的截断值。在一些实施方案中，使用50％至80％的截断值。在一些实施方案中，使用50％至90％的截断值。在一些实施方案中，使用55％至60％的截断值。在一些实施方案中，使用65％至70％的截断值。在一些实施方案中，使用70％至75％的截断值。在一些实施方案中，使用75％至80％的截断值。第二测试通过使用采用blosum50取代矩阵、空位开放罚分10和空位延伸罚分2的fasta算法，将各片段与某一数据库的已知过敏原进行整体-局部序列比对以确定所有可能的连续80个氨基酸的片段的局部过敏原性来沿蛋白质序列评估局部过敏原性。任何80个氨基酸的窗口与任何过敏原的最高同一性百分比被取作目标蛋白质的最终评分。who指导方针关于这个片段测试建议使用35％同一性截断值。在蛋白质的一些实施方案中，蛋白质的所有可能的片段都与用于使用这个测试进行分析的数据库中任何已知过敏原具有小于35％局部同源性。在一些实施方案中，使用小于30％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用30％至35％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用25％至30％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用20％至25％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用15％至20％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用10％至15％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用5％至10％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用0％至5％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用大于35％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用35％至40％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用40％至45％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用45％至50％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用50％至55％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用55％至60％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用65％至70％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用70％至75％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用75％至80％同源性的截断值。熟练技术人员能够出于这个目的鉴定和使用已知过敏原的适合数据库。在一些实施方案中，数据库是通过从一个以上数据库来源选择蛋白质加以定制。在一些实施方案中，定制数据库包含由食物过敏研究和资源程序(foodallergyresearchandresourceprogram)(allergenonline.org/)、uniprot注释(uniprotannotations)(uniprot.org/docs/allergen)和过敏原性蛋白质的结构数据库(sdap，fermi.utmb.edu/sdap/sdap_lnk.html)收集的汇合过敏原清单。这个数据库包括由国际免疫学联合会(internationalunionofimmunologicalsocieities)(iuis，allergen.org/)当前认可的所有过敏原以及尚末官方命名的许多其它过敏原。在一些实施方案中，数据库包含可在已知数据库中获得的一小组已知过敏原蛋白质；也就是说数据库是一小组定制选择的已知过敏原蛋白质。在一些实施方案中，已知过敏原的数据库包含至少10种蛋白质、至少20种蛋白质、至少30种蛋白质、至少40种蛋白质、至少50种蛋白质、至少100种蛋白质、至少200种蛋白质、至少300种蛋白质、至少400种蛋白质、至少500种蛋白质、至少600种蛋白质、至少700种蛋白质、至少800种蛋白质、至少900种蛋白质、至少1,000种蛋白质、至少1,100种蛋白质、至少1,200种蛋白质、至少1,300种蛋白质、至少1,400种蛋白质、至少1,500种蛋白质、至少1,600种蛋白质、至少1,700种蛋白质、至少1,800种蛋白质、至少1,900种蛋白质或至少2,000种蛋白质。在一些实施方案中，已知过敏原的数据库包含100至500种蛋白质、200至1,000种蛋白质、500至1,000种蛋白质、500至1,000种蛋白质或1,000至2,000种蛋白质。在一些实施方案中，相对于过敏原数据库测试蛋白质的所有(或一小组选择的)具有不同长度的连续氨基酸窗口(例如70、60、50、40、30、20、10、8或6个氨基酸的窗口)，并且鉴定具有100％同一性、95％或高于95％同一性、90％或高于90％同一性、85％或高于85％同一性、80％或高于80％同一性、75％或高于75％同一性、70％或高于70％同一性、65％或高于65％同一性、60％或高于60％同一性、55％或高于55％同一性、或50％或高于50％同一性匹配的肽序列以进一步考查潜在过敏原性。预测蛋白质的过敏原性的另一方法在于评估所述蛋白质与人来源的蛋白质的同源性。人免疫系统被定期暴露于众多可能的过敏原性蛋白质，并且具有在宿主身体的蛋白质与外源性蛋白质之间进行区分的固有能力。这个能力的精确本质并非总是明确的，并且存在由于身体未能区分自身与非自身而产生的许多疾病(例如关节炎)。尽管如此，基本分析是与人蛋白质共有一定程度的序列同源性的蛋白质引发免疫应答的可能性较小。特定来说，已显示对于一些具有已知过敏原性成员的蛋白质家族(原肌凝蛋白、小白蛋白、酪蛋白)，相对于已知过敏原性蛋白质，携带与它们的人对应物的更大序列同源性的那些蛋白质不被认为具有过敏原性(jenkinsj.a.等evolutionarydistancefromhumanhomologsreflectsallergenicityofanimcalfoodproteins.j.allergyclinimmunol.120(2007):1399-1405)。对于给定蛋白质，人同源性评分是通过由使用采用blosum50取代矩阵、空位开放罚分10和空位延伸罚分2的fasta算法进行整体-局部比对以确定所述蛋白质与某一数据库(例如uniprot数据库)的人蛋白质的最大同一性百分比来测量。根据jenkins等(jenkinsj.a.等evolutionarydistancefromhumanhomologsreflectsallergenicityofanimalfoodproteins.j.allergyclinimmunol.120(2007):1399-1405)，与人蛋白质的序列同一性高于约62％的蛋白质具有过敏原性的可能性较小。熟练技术人员能够出于这个目的鉴定和使用已知人蛋白质的适合数据库，例如通过搜索uniprot数据库(uniprot.org)。在一些实施方案中，数据库是通过从一个以上数据库来源选择蛋白质加以定制。当然，数据库可为但无需为全面的。在一些实施方案中，数据库包含一小组人蛋白质；也就是说数据库是一小组定制选择的人蛋白质。在一些实施方案中，人蛋白质的数据库包含至少10种蛋白质、至少20种蛋白质、至少30种蛋白质、至少40种蛋白质、至少50种蛋白质、至少100,种蛋白质、至少200种蛋白质、至少300种蛋白质、至少400种蛋白质、至少500种蛋白质、至少600种蛋白质、至少700种蛋白质、至少800种蛋白质、至少900种蛋白质、至少1,000种蛋白质、至少2,000种蛋白质、至少3,000种蛋白质、至少4,000种蛋白质、至少5,000种蛋白质、至少6,000种蛋白质、至少7,000种蛋白质、至少8,000种蛋白质、至少9,000种蛋白质或至少10,000种蛋白质。在一些实施方案中，数据库包含100至500种蛋白质、200至1,000种蛋白质、500至1,000种蛋白质、500至1,000种蛋白质、1,000至2,000种蛋白质、1,000至5,000种蛋白质、或5,000至10,000种蛋白质。在一些实施方案中，数据库包含所有已知人蛋白质中的至少90％、至少95％或至少99％。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质与人蛋白质至少20％同源。在一些实施方案中，使用至少30％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用至少40％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用至少50％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用至少60％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用至少70％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用至少80％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用至少62％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用至少20％同源性至至少30％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用至少30％同源性至至少40％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用至少50％同源性至至少60％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用至少60％同源性至至少70％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用至少70％同源性至至少80％同源性的截断值。热稳定性测定如本文所用，“稳定”蛋白质是抵抗改变目标蛋白质的生物物理(例如溶解度)、生物(例如可消化性)或组成(例如亮氨酸氨基酸的比例)性状的变化(例如展开、氧化、聚集、水解等)的蛋白质。可使用本领域中已知的各种测定来测量蛋白质稳定性，并且可选择本文公开并具有高于阈值的稳定性的蛋白质。在一些实施方案中，选择显示的热稳定性类似于或好于乳清蛋白质的热稳定性的蛋白质。热稳定性是可帮助预测蛋白质的储存期限的性质。在测定的一些实施方案中，蛋白质样品的稳定性是通过在暴露于极端温度之后使用尺寸排阻色谱法(sec)监测聚集体形成来测定。将待测试的蛋白质的水性样品放置在90℃下的加热块中，并且在0、1、5、10、30和60分钟之后取样以进行sec分析。蛋白质是通过监测214nm下的吸光度来检测，并且聚集体被表征为洗脱快于目标蛋白质的峰。峰面积无总体变化指示在热处理期间无蛋白质沉淀。当在这种测定中暴露于90℃时，乳清蛋白质已显示快速形成约80％聚集体。在一些实施方案中，蛋白质的热稳定性是通过在结合随温度增加而作为蛋白质变性物形成的聚集蛋白质的疏水性染料(例如热漂移稳定性测定试剂盒，enzolifesciences)存在下将样本从25℃缓慢加热至95℃来测定(niesen,f.h.,berglund,h.和vadadi,m.,2007.theuseofdifferentialscanningfluorimetrytodetectligandinteractionsthatpromoteproteinstability.natureprotocols,第2卷,第2212-2221页)。在结合后，染料的荧光显著增加，此由rtpcr仪器记录并表示为蛋白质的熔解曲线(lavinder,j.j.,hari,s.b.,suillivan,b.j.和magilery,t.j.,2009.high-throughputthermalscanning:ageneral,rapiddye-bindingthermalshiftscreenforproteinengineering.journaloftheamericanchemicalsociety,第3794-3795页)。在完成热漂移之后，考查样品的不溶性沉淀，并且由分析型尺寸排阻色谱法(sec)进一步分析。溶解度测定在本文公开的蛋白质的一些实施方案中，蛋白质是可溶性的。溶解度可通过本领域中已知的任何方法来测量。在一些实施方案中，溶解度通过离心浓缩，随后进行蛋白质浓度测定来考查。根据使用两种方法的方案测试蛋白质于20mmhepes(ph7.5)中的样品的蛋白质浓度，所述方法是coomassie加强型(bradford)蛋白质测定(thermoscientific)和二喹啉甲酸(bca)蛋白质测定(sigmadaldrich)。基于这些测量结果，添加10mg蛋白质至amiconultra3kda离心过滤器(millipore)中。样品通过在10,000xg下离心30分钟来浓缩。考查最终现时浓缩的样品的蛋白质沉淀，接着如上使用两种方法(bradford和bca)测试蛋白质浓度。在一些实施方案中，蛋白质在生理ph下具有的最终溶解度限度是至少5g/l、10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l或100g/l。在一些实施方案中，在生理ph下在浓度大于5g/l、或10g/l、或20g/l、或30g/l、或40g/l、或50g/l、或100g/l下，大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或大于99.5％的蛋白质可溶，其中未观察到蛋白质沉淀。在一些实施方案中，蛋白质的溶解度高于通常在考查乳清(12.5g/l；pelegrine等,lebensm.-wiss.u.-technol.38(2005)77-80)和大豆(10g/l；lee等,jaocs80(1)(2003)85-90)的溶解度限度的研究中报道的溶解度。真核蛋白质常被糖基化，并且连接于蛋白质的碳水化合物链发挥各种功能。n连接和o连接的糖基化是存在于蛋白质中的两种最常见形式的糖基化。n连接的糖基化是糖分子连接于蛋白质中的氨基酸残基中的氮原子。n连接的糖基化存在于天冬酰胺和精氨酸残基处。o连接的糖基化是糖分子连接于蛋白质中的氨基酸残基中的氧原子。o连接的糖基化存在于苏氨酸和丝氨酸残基处。糖基化蛋白质常比它们的未糖基化形式更可溶。就蛋白质药物而言，适当糖基化通常赋予高活性、适当抗原结合性、在血液中的更好稳定性等。然而，糖基化必定意指蛋白质“携带”糖部分。所述糖部分可降低包括重组蛋白的本公开的蛋白质的适用性。举例来说，如实施例中所证明，将相同蛋白质的糖基化形式和非糖基化形式的消化进行比较显示非糖基化形式比糖基化形式更快速被消化。出于这些原因，在一些实施方案中，本公开的营养性蛋白质包含较低糖基化或不包含糖基化。举例来说，在一些实施方案中，蛋白质包含的非糖基化氨基酸残基与总氨基酸残基的比率是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，蛋白质不包含任何糖基化。在一些实施方案中，本公开的蛋白质在它被产生之后或在它被分离之后被去糖基化。可通过本领域中已知的任何方法制备低糖基化或无糖基化蛋白质。举例来说，可使用酶促方法和/或化学方法(biochem.j.(2003)376,第339-350页.)。酶是在研究规模上商业产生以移除n连接和o连接的寡糖。化学方法包括使用三氟甲烷磺酸来选择性断裂n连接和o连接的肽-糖键。这个方法产生的去糖基化常比使用酶促方法达成的去糖基化更完全。在其它实施方案中，本公开的蛋白质是由宿主生物体在低糖基化或无糖基化下产生。大多数细菌和其它原核生物具有极其有限的使蛋白质(尤其是异源性蛋白质)糖基化的能力。因此，在本公开的一些实施方案中，蛋白质是在微生物中重组制备以使重组蛋白的糖基化水平较低或无糖基化。在一些实施方案中，重组蛋白的糖基化水平低于如它所源于的生物体中存在的蛋白质的糖基化水平。蛋白质的糖基化可基于宿主生物体而变化，换句话说，一些宿主相对于一种或多种其它宿主将产生更大程度的糖基化；而其它宿主相对于一种或多种其它宿主将产生更小程度的糖基化。可基于例如存在的糖基化质量和/或存在的糖基化位点总数测量糖基化在量方面的差异。毒性和抗营养性测定对于大多数实施方案，优选的是蛋白质不展现不适当较高的毒性。因此，在一些实施方案中，评估蛋白质的潜在毒性。这可通过本领域中已知的任何适合方法进行。在一些实施方案中，毒性评分是通过确定蛋白质与各数据库的已知毒性蛋白质(例如从uniprot数据库鉴定的毒性蛋白质)的同一性百分比来计算。目标蛋白质相对于数据库的已知毒素的整体-整体比对是使用采用blosum50取代矩阵、空位开放罚分10和空位延伸罚分2的fasta算法来进行。在蛋白质的一些实施方案中，蛋白质与已知毒素小于35％同源。在一些实施方案中，使用小于35％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用30％至35％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用25％至35％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用20％至35％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用15％至35％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用10％至35％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用5％至35％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用0％至35％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用大于35％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用35％至40％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用35％至45％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用35％至50％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用35％至55％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用35％至60％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用35％至70％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用35％至75％同源性的截断值。在一些实施方案中，使用35％至80％同源性的截断值。熟练技术人员能够出于这个目的鉴定和使用已知毒素的适合数据库，例如通过搜索uniprot数据库(uniprot.org)。在一些实施方案中，数据库是通过从一个以上数据库来源选择鉴定为毒素的蛋白质加以定制。在一些实施方案中，数据库包含一小组已知毒性蛋白质；也就是说数据库是一小组定制选择的已知毒性蛋白质。在一些实施方案中，毒性蛋白质的数据库包含至少10种蛋白质、至少20种蛋白质、至少30种蛋白质、至少40种蛋白质、至少50种蛋白质、至少100,种蛋白质、至少200种蛋白质、至少300种蛋白质、至少400种蛋白质、至少500种蛋白质、至少600种蛋白质、至少700种蛋白质、至少800种蛋白质、至少900种蛋白质、至少1,000种蛋白质、至少2,000种蛋白质、至少3,000种蛋白质、至少4,000种蛋白质、至少5,000种蛋白质、至少6,000种蛋白质、至少7,000种蛋白质、至少8,000种蛋白质、至少9,000种蛋白质或至少10,000种蛋白质。在一些实施方案中，数据库包含100至500种蛋白质、200至1,000种蛋白质、500至1,000种蛋白质、500至1,000种蛋白质、1,000至2,000种蛋白质、1,000至5,000种蛋白质、或5,000至10,000种蛋白质。抗营养性和抗营养物对于一些实施方案，优选的是蛋白质不展现抗营养活性(“抗营养性”)，即蛋白质具有阻止从食物吸收营养物的潜力。导致所述抗营养性的抗营养性序列的实例包括蛋白酶抑制剂，其抑制肠中胰蛋白酶、胃蛋白酶和其它蛋白酶的作用，从而阻止蛋白质的消化和随后吸收。本文公开含有大致上不含抗营养性序列的分离的营养性多肽的制剂。在一些实施方案中，营养性多肽具有的抗营养性类似性评分低于约1，低于约0.5，或低于约0.1。营养性多肽以大于约10g的量存在于制剂中，并且制剂大致上不含抗营养性因子。制剂以不大于约500ml的体积以液体、半液体或凝胶形式，或以不大于约200g的质量以固体或半固体形式存在。营养性多肽可与蛋白酶抑制剂(诸如丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)多肽家族的成员)具有低同源性，例如小于90％同一，或小于85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或小于5％同一。因此，在一些实施方案中，评估蛋白质的潜在抗营养性。这可通过本领域中已知的任何适合方法进行。在一些实施方案中，抗营养性评分是通过确定蛋白质与各数据库的已知蛋白酶抑制剂(例如从uniprot数据库鉴定的蛋白酶抑制剂)的同一性百分比来计算。目标蛋白质相对于数据库的已知蛋白酶抑制剂的整体-整体比对是使用采用blosum50取代矩阵、空位开放罚分10和空位延伸罚分2的fasta算法来进行，以鉴定蛋白质是否与已知抗蛋白质同源。在蛋白质的一些实施方案中，蛋白质与用于分析的数据库中任何已知抗蛋白质(例如任何已知蛋白酶抑制剂)具有小于35％整体同源性。在一些实施方案中，使用小于35％同一性的截断值。在一些实施方案中，使用30％至35％的截断值。在一些实施方案中，使用25％至35％的截断值。在一些实施方案中，使用20％至35％的截断值。在一些实施方案中，使用15％至35％的截断值。在一些实施方案中，使用10％至35％的截断值。在一些实施方案中，使用5％至35％的截断值。在一些实施方案中，使用0％至35％的截断值。在一些实施方案中，使用大于35％同一性的截断值。在一些实施方案中，使用35％至40％的截断值。在一些实施方案中，使用35％至45％的截断值。在一些实施方案中，使用35％至50％的截断值。在一些实施方案中，使用35％至55％的截断值。在一些实施方案中，使用35％至60％的截断值。在一些实施方案中，使用35％至70％的截断值。在一些实施方案中，使用35％至75％的截断值。在一些实施方案中，使用35％至80％的截断值。熟练技术人员能够出于这个目的鉴定和使用已知蛋白酶抑制剂的适合数据库，例如通过搜索uniprot数据库(uniprot.org)。在一些实施方案中，数据库是通过从一个以上数据库来源选择鉴定为蛋白酶抑制剂的蛋白质加以定制。在一些实施方案中，数据库包含可在数据库中获得的一小组已知蛋白酶抑制剂；也就是说数据库是一小组定制选择的已知蛋白酶抑制剂蛋白质。在一些实施方案中，已知蛋白酶抑制剂蛋白质的数据库包含至少10种蛋白质、至少20种蛋白质、至少30种蛋白质、至少40种蛋白质、至少50种蛋白质、至少100种蛋白质、至少200种蛋白质、至少300种蛋白质、至少400种蛋白质、至少500种蛋白质、至少600种蛋白质、至少700种蛋白质、至少800种蛋白质、至少900种蛋白质、至少1,000种蛋白质、至少1,100种蛋白质、至少1,200种蛋白质、至少1,300种蛋白质、至少1,400种蛋白质、至少1,500种蛋白质、至少1,600种蛋白质、至少1,700种蛋白质、至少1,800种蛋白质、至少1,900种蛋白质或至少2,000种蛋白质。在一些实施方案中，已知蛋白酶抑制剂蛋白质的数据库包含100至500种蛋白质、200至1,000种蛋白质、500至1,000种蛋白质、500至1,000种蛋白质、或1,000至2,000种蛋白质、或2,000至3,000种蛋白质。在其它实施方案中，使用展现某一程度的蛋白酶抑制剂活性的蛋白质。举例来说，在一些实施方案中，这种蛋白质可为适用的，因为当营养性蛋白质被消耗时，它延迟蛋白酶消化以使蛋白质在被消化之前在胃肠道内穿过较大距离，由此延迟吸收。举例来说，在一些实施方案中，蛋白质抑制胃消化而非肠消化。delaneyb.等(evaluationofproteinsafetyinthecontextofagriculturalbiotechnology.food.chem.toxicol.46(2008:s71-s97))建议当评估可能的食物蛋白质的安全性时，应避免已知毒性蛋白质与抗蛋白质两者。在蛋白质的一些实施方案中，蛋白质与某一数据库的已知毒性蛋白质具有有利较低水平的整体同源性和/或与某一数据库的已知抗营养性蛋白质(例如蛋白酶抑制剂)具有有利较低水平的整体同源性，如本文所定义。抗营养物。提供缺乏抗营养物(anti-nutrient/antinutrient)的营养性组合物。抗营养物是通常除蛋白质以外的化合物，其通常见于植物性食物中，并且已被发现具有不利作用与在一些情况下某些健康益处两者。举例来说，已显示植酸(phyticacid)、凝集素、酚类化合物、皂素(saponin)和酶抑制剂会降低营养物的可用性，并且导致生长抑制，并且植物雌激素和木酚素(lignan)已与不育问题相关联。另一方面，已显示植酸、凝集素、酚类化合物、淀粉酶抑制剂和皂素会降低对淀粉食物的血糖和胰岛素应答和/或血浆胆固醇和甘油三酯。此外，植酸、酚类物质、皂素、蛋白酶抑制剂、植物雌激素和木酚素已与癌症风险降低相关联。提供用于通过以下方式来降低食物产品中的抗营养性因子的量的方法：以包括温度大于约90℃的蒸汽或热空气的热处理来处理所述食物产品至少1分钟，使处理的食物产品与含有分离的营养性多肽的组合物组合。任选地，热处理步骤使至少一种抗营养性因子(诸如皂素、凝集素和谷醇溶蛋白、蛋白酶抑制剂或植酸)降解。如下在蛋白质组合物中检测抗营养性因子。植酸：wheeler和ferrel(wheeler,e.l.,ferrel,r.e.,cerealchem.1971,48,312)的程序用于测定于3％三氯乙酸中提取的植酸。棉子糖家族寡糖：蛋白质样品用70％乙醇，使用soxhlet装置提取6-8小时，并且薄层色谱法用于根据tanaka等(tanaka,m.,thananunkul,d.,lee,t.c.,chichester,c.o.,j.foodsci.1975,40,1087-1088)的程序来定量测定提取物中的棉子糖和水苏糖。胰蛋白酶抑制剂：kakade等(kakade,m.l.,rackis,j.j.,mcghee,j.e.,puski,g.,cerealchem.1974,51,376-82)的方法用于测定原始样品和处理样品中的胰蛋白酶抑制剂活性。一个胰蛋白酶抑制剂单位(tiu)定义为在10分钟内在410nm下的吸光度降低0.01，并且数据表示为tiu*mg-1。淀粉酶抑制剂：根据baker等(baker,j.e.,woo,s.m.,throne,j.e.,finny,p.l.,environm.entomol.1991,20,53±60)的程序于0.15mnacl中提取抑制剂，并且通过huesing等(huesing,j.e.,shade,r.e.,chrispeels,m.j.,murdok,l.l.,plantphysiol.1991,96,993±996)的方法来测定。一个淀粉酶抑制剂单位(aiu)定义为对每分钟产生1mg麦芽糖单水合物的淀粉酶部分产生50％抑制的量。凝集素：paredes-lopez等(paredes-lopez,o.,schevenin,m.l.,guevara-lara,f.,foodchem.1989,31,129-137)的程序应用于使用磷酸盐缓冲盐水(pbs)提取凝集素。根据kortt(kortt,a.a.(编),eur.j.biochem.1984,138,519)测定样品提取物中的凝集素的血凝素活性(ha)。根据lis和sharon(lis,h.,sharon,n.,methodsenzymol.1972,28,360±368)制备用胰蛋白酶处理的人红血细胞(a、b和o)混悬液。ha被表示为产生阳性凝集的最高稀释度的倒数。丹宁：根据aoac(helrich,k.(编),aoac,officialmethodsofanalysis,associationofofficialanalyticalchemists,arlington,va1990)的程序，通过folin-denis试剂将丹宁含量测定为丹宁酸。电荷测定和溶合评分可增强蛋白质的效用的一个特征是它的电荷(或每个氨基酸电荷)。在一些实施方案中，电荷较高的蛋白质可展现合乎需要的特征，诸如增加的溶解度、增加的稳定性、抗聚集性和合乎需要的味道分布。举例来说，展现溶解度增强的带电荷蛋白质可被配制成呈相对较低体积的溶液形式的包括高浓度蛋白质的饮料或液体制剂，由此递送每单位体积较大剂量的蛋白质营养。展现溶解度增强的带电荷蛋白质可例如适用于其中使用者(例如运动员)想要在身体活动之前、期间或之后摄取蛋白质的运动饮料或恢复饮料中。展现溶解度增强的带电荷蛋白质也可特别适用于其中受试者(例如患者或年长人士)需要蛋白质营养，但不能摄取固体食物或大体积的液体的临床环境中。举例来说，多肽在ph7下的净电荷(电荷p)可使用下式来计算：电荷p＝-0.002–(c)(0.045)–(d)(0.999)–(e)(0.998)+(h)(0.091)+(k)(1.0)+(r)(1.0)–(y)(-0.001)其中c是所述多肽中的半胱氨酸残基的数目，d是天冬氨酸残基的数目，e是谷氨酸残基的数目，h是组氨酸残基的数目，k是赖氨酸残基的数目，r是精氨酸残基的数目，并且y是酪氨酸残基的数目。多肽的每个氨基酸电荷(电荷a)可通过用净电荷(电荷p)除以氨基酸残基的数目(n)来计算，即电荷a＝电荷p/n。(参见bassis(2007),“aprimeronpythonforlifescienceresearchers.”ploscomputbiol3(11):e199.doi:10.1371/journal.pcbi.0030199)。一种用于评估给定蛋白质的亲水性和潜在溶解度的量度是溶合评分。如果各残基都独立地溶合，那么溶合评分定义为所有氨基酸侧链的用序列中的残基总数加以标准化的总溶合自由能(即与从气相转移至稀释溶液相关的自由能变化)。侧链溶合自由能是通过计算真空介电常数1与水介电常数80之间的静电能量差异(通过解析poisson-boltzmann等式)，以及使用线性溶剂可及表面积模型计算非极性vanderwaals能量来计算得到(d.sitkoff,k.a.sharp,b.honig.“accuratecalculationofhydrationfreeenergiesusingmacroscopicsolventmodels”.j.phys.chem.98,1994)。对于具有可离子化侧链的氨基酸(arg、asp、cys、glu、his、lys和tyr)，平均溶合自由能是基于在指定ph下各离子化状态的相对概率加以使用。溶合评分开始于0并继续以变为负值，并且溶合评分负性越大，预测蛋白质的亲水性和潜在可溶性越大。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在ph7下具有溶合评分-10或小于-10。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在ph7下具有溶合评分-15或小于-15。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在ph7下具有溶合评分-20或小于-20。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在ph7下具有溶合评分-25或小于-25。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在ph7下具有溶合评分-30或小于-30。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在ph7下具有溶合评分-35或小于-35。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在ph7下具有溶合评分-40或小于-40。由于如由henderson-hasselbalch等式所定义，ph依赖于未解离弱酸([ha])与共轭碱([a-])的摩尔比，所以溶合评分随ph而变：所有弱酸相较于它们的共轭碱都具有不同溶合自由能，并且当计算给定ph下的溶合评分时用于给定残基的溶合自由能是那两个值的加权平均值。因此，在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在酸性ph下具有溶合评分-10或小于-10。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在酸性ph下具有溶合评分-15或小于-15。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在酸性ph下具有溶合评分-20或小于-20。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在酸性ph下具有溶合评分-25或小于-25。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在酸性ph下具有溶合评分-30或小于-30。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在酸性ph下具有溶合评分-35或小于-35。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在酸性ph下具有溶合评分-40或小于-40。因此，在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在碱性ph下具有溶合评分-10或小于-10。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在碱性ph下具有溶合评分-15或小于-15。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在碱性ph下具有溶合评分-20或小于-20。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在碱性ph下具有溶合评分-25或小于-25。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在碱性ph下具有溶合评分-30或小于-30。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在碱性ph下具有溶合评分-35或小于-35。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在碱性ph下具有溶合评分-40或小于-40。因此，在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在选自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范围下具有溶合评分-10或小于-10。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在选自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范围下具有溶合评分-15或小于-15。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在选自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范围下具有溶合评分-20或小于-20。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在选自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范围下具有溶合评分-25或小于-25。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在选自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范围下具有溶合评分-30或小于-30。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在选自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范围下具有溶合评分-35或小于-35。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质在选自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范围下具有溶合评分-40或小于-40。聚集测定和聚集评分在一些实施方案中，本公开的蛋白质显示抗聚集性，展现例如在高温(例如50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃或95℃)下小于80％聚集、10％聚集，或不展现可检测聚集。如本文公开的稳定蛋白质的一个益处是它们在使用之前可能够储存延长时期，在一些情况下无需冷藏或冷却。在一些实施方案中，蛋白质被加工成干燥形式(例如通过冻干)。在一些实施方案中，蛋白质在冻干后是稳定的。在一些实施方案中，所述冻干的蛋白质在复原(例如液体制剂)后维持它们的稳定性。聚集评分是用于评估给定蛋白质的疏水性和聚集可能性的基于一级序列的量度。使用赋予疏水性残基正值并赋予亲水性残基负值的kyte和doolittle疏水性量表(kytej,doolittlerf(1982年5月)“asimplemethodfordisplayingthehydropathiccharacterofaprotein”.j.mol.biol.157(1):105-32)，利用五个残基的移动平均值计算蛋白质序列的平均疏水性。聚集评分是通过确定大于零的数值的曲线下面积以及通过蛋白质的总长度进行标准化来从所得绘图获取。潜伏观点是聚集是两个或更多个疏水性片块集合以排除水并降低表面暴露的结果，并且蛋白质将聚集的可能性随它的疏水性(即聚集倾向性)残基被密集压紧程度而变。聚集评分开始于0并继续以变为正值，并且聚集评分越小，预测蛋白质的疏水性越小，并且聚集倾向潜在越小。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分2或小于2。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分1.5或小于1.5。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分1或小于1。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分0.9或小于0.9。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分0.8或小于0.8。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分0.7或小于0.7。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分0.6或小于0.6。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分0.5或小于0.5。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分0.4或小于0.4。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分0.3或小于0.3。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分0.2或小于0.2。在蛋白质的一些实施方案中，所述蛋白质具有聚集评分0.1或小于0.1。在一些情况下，可溶性表达是合乎需要的，因为它可增加蛋白质的量和/或产率，并且有助于蛋白质的分离和纯化中的一个或多个。在一些实施方案中，本公开的蛋白质在宿主生物体中可溶性表达。溶合评分和聚集评分可用于预测重组蛋白在宿主生物体中的可溶性表达。如实施例8中所示，本公开提供证据表明溶合评分≤-20，并且聚集评分≤0.75的蛋白质更可能在特定大肠杆菌表达系统中重组表达。此外，数据也表明溶合评分≤-20，并且聚集评分≤0.5的蛋白质更可能在这个系统中可溶性表达。因此，在一些实施方案中，本公开的蛋白质具有溶合评分-20或小于-20。在一些实施方案中，营养性蛋白质具有聚集评分0.75或小于0.75。在一些实施方案中，营养性蛋白质具有聚集评分0.5或小于0.5。在一些实施方案中，蛋白质具有溶合评分-20或小于-20和聚集评分0.75或小于0.75。在一些实施方案中，蛋白质具有溶合评分-20或小于-20和聚集评分0.5或小于0.5。味道和口腔特征已知某些游离氨基酸和游离氨基酸的混合物具有苦味或另外不合意味道。此外，常见蛋白质(例如乳清和大豆)的水解产物常具有苦味或不合意味道。在一些实施方案中，本文公开和所述的蛋白质不具有苦味或另外不合意味道。在一些实施方案中，本文公开和所述的蛋白质相较于游离氨基酸、游离氨基酸的混合物和/或蛋白质水解产物中的至少一个具有更可接受的味道。在一些实施方案中，本文公开和所述的蛋白质具有的味道等于或超过至少一种乳清蛋白质。已知蛋白质具有涵盖以下五种确定味道形式的味道：甜味、酸味、苦味、咸味和鲜味。脂肪可被视为第六味道。特定蛋白质的味道(或所述蛋白质缺乏所述味道)可归因于若干因素，包括一级结构、存在带电荷侧链、以及蛋白质的电子和构象特征。在一些实施方案中，本文公开和所述的蛋白质被设计以具有所需味道(例如甜味、咸味、鲜味)和/或不具有非所需味道(例如苦味、酸味)。在这个情形下，“设计”包括例如选择体现实现所需味道性质的特征的可食用物种蛋白质，以及产生可食用物种多肽的具有所需味道性质的突变蛋白。举例来说，蛋白质可被设计以与特定味道受体，诸如甜味受体(t1r2-t1r3异二聚体)或鲜味受体(t1r1-t1r3异二聚体、mglur4和/或mglur1)相互作用。此外，蛋白质可被设计以不与其它味道受体(诸如苦味受体(t2r受体))相互作用或与其它味道受体具有减弱的相互作用。本文公开和所述的蛋白质在被摄取时也可在口腔中引发不同体感，有时称为“口感”。蛋白质的口感可归因于一种或多种因素，包括一级结构、存在带电荷侧链、以及蛋白质的电子和构象特征。在一些实施方案中，蛋白质在被摄取时引发黄油或脂肪样口感。营养性组合物和制剂至少一种本文公开的蛋白质可与至少一种第二组分组合以形成组合物。在一些实施方案中，组合物中唯一氨基酸来源是至少一种本文公开的蛋白质。在所述实施方案中，组合物的氨基酸组成将与至少一种本文公开的蛋白质的氨基酸组成相同。在一些实施方案中，组合物包含至少一种本文公开的蛋白质和至少一种第二蛋白质。在一些实施方案中，至少一种第二蛋白质是本文公开的第二蛋白质，而在其它实施方案中，至少一种第二蛋白质不是本文公开的蛋白质。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或大于20种本文公开的蛋白质。在一些实施方案中，组合物包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或大于20种不是本文公开的蛋白质的蛋白质。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或大于20种蛋白质，并且组合物包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或大于20种不是本文公开的蛋白质的蛋白质。也提供含有本文所述的营养性多肽的制剂。在一个方面，提供一种含有单细胞生物体分泌多肽营养性结构域的制剂。举例来说，多肽营养性结构域含有n末端氨基酸不对应于构成含有多肽营养性结构域的单细胞生物体分泌多肽的氨基酸序列的n末端氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，构成单细胞生物体分泌多肽的氨基酸序列是可食用物种多肽序列，并且n末端氨基酸是常见可食用物种氨基酸。此外或在替代方案中，多肽营养性结构域含有c末端氨基酸不对应于构成含有多肽营养性结构域的单细胞生物体分泌多肽的氨基酸序列的c末端氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，构成单细胞生物体分泌多肽的氨基酸序列是可食用物种多肽序列，并且c末端氨基酸是常见可食用物种氨基酸。因此，在一些实施方案中，分泌多肽营养性结构域比同源性可食用物种多肽短至少一个氨基酸。营养性结构域可为同源性可食用物种肽的长度的约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或小于5％。在其它实施方案中，多肽营养性结构域由含有多肽营养性结构域的单细胞生物体分泌多肽的约1％至约99％组成。如本文所述，多肽营养性结构域相对于含有多肽营养性结构域的较大多肽通常是优选的。多肽营养性结构域基于质量可含有比包括多肽的较大物更多的营养。在一些实施方案中，当相较于包括多肽的较大物时，多肽营养性结构域可提供合乎需要的特征，诸如增加的溶解度和更好储存期限稳定性。在一些实施方案中，如先前段落中所述的组合物进一步包含至少一种多肽、至少一种肽和至少一种游离氨基酸中的至少一个。在一些实施方案中，组合物包含至少一种多肽和至少一种肽。在一些实施方案中，组合物包含至少一种多肽和至少一种游离氨基酸。在一些实施方案中，组合物包含至少一种肽和至少一种游离氨基酸。在一些实施方案中，至少一种多肽、至少一种肽和/或至少一种游离氨基酸包含选自1)支链氨基酸，2)亮氨酸，和3)必需氨基酸的氨基酸。在一些实施方案中，至少一种多肽、至少一种肽和/或至少一种游离氨基酸由选自1)支链氨基酸，2)亮氨酸，和3)必需氨基酸的氨基酸组成。在一些实施方案中，组合物包含至少一种修饰的氨基酸或非标准氨基酸。修饰的氨基酸包括具有对羧基末端、氨基末端和/或侧链中的一个或多个的修饰的氨基酸。非标准氨基酸可选自通过翻译后修饰蛋白质所形成的那些，例如羧化谷氨酸、羟基脯氨酸或尾下素(hypusine)。其它非标准氨基酸不见于蛋白质中。实例包括羊毛硫氨酸(lanthionine)、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸和瓜氨酸。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种d-氨基酸。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种l-氨基酸。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种d-氨基酸和一种或多种l-氨基酸的混合物。通过添加多肽、肽和游离氨基酸中的至少一个至组合物中，组合物中存在的支链氨基酸、亮氨酸和必需氨基酸中的至少一个与总氨基酸的比例可得以增加。在一些实施方案中，组合物包含至少一种碳水化合物。“碳水化合物”是指糖或糖的聚合物。术语“糖”、“多糖”、“碳水化合物”和“寡糖”可互换使用。大多数碳水化合物是具有许多羟基的醛或酮，通常在分子的各碳原子上具有一个羟基。碳水化合物通常具有分子式cnh2non。碳水化合物可为单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。大多数基础碳水化合物是单糖，诸如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖和果糖。二糖是两个接合的单糖。示例性二糖包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和乳糖。通常，寡糖包括三个与六个之间的单糖单元(例如棉子糖、水苏糖)，而多糖包括六个或大于六个单糖单元。示例性多糖包括淀粉、糖原和纤维素。碳水化合物可含有修饰的糖单元，诸如2’-脱氧核糖(其中羟基被移除)、2’-氟代核糖(其中羟基被氟置换)、或n-乙酰基葡萄糖胺、含氮形式的葡萄糖(例如2’-氟代核糖、脱氧核糖和己糖)。碳水化合物可以许多不同形式存在，例如构象异构体、环状形式、无环形式、立体异构体、互变异构体、端基异构体和异构体。在一些实施方案中，组合物包含至少一种脂质。如本文所用，“脂质”包括脂肪、油、甘油三酯、胆固醇、磷脂、呈任何形式的脂肪酸，包括游离脂肪酸。脂肪、油和脂肪酸可为饱和的、不饱和的(顺式或反式)或部分不饱和的(顺式或反式)。在一些实施方案中，脂质包含至少一种选自以下的脂肪酸：月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、十七酸(17:0)、十七碳烯酸(17:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚麻油酸(linoleicacid)、次亚麻油酸(18:3)、十八碳四烯酸(18:4)、花生酸(20:0)、二十烯酸(20:1)、二十碳二烯酸(20:2)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5)(epa)、二十二酸(22:0)、二十二烯酸(22:1)、二十二碳五烯酸(22:5)、二十二碳六烯酸(22:6)(dha)和二十四酸(24:0)。在一些实施方案中，组合物包含至少一种修饰的脂质，例如已通过烹调来修饰的脂质。在一些实施方案中，组合物包含至少一种补充性矿物质或矿物质来源。矿物质的实例包括不限于：氯化物、钠、钙、铁、铬、铜、碘、锌、镁、锰、钼、磷、钾和硒。任何前述矿物质的适合形式包括可溶性矿物盐、微溶性矿物盐、不溶性矿物盐、螯合矿物质、矿物质复合物、非反应性矿物质(诸如羰基矿物质)和还原的矿物质及其组合。在一些实施方案中，组合物包含至少一种补充性维生素。至少一种维生素可为脂溶性或水溶性维生素。适合维生素包括但不限于维生素c、维生素a、维生素e、维生素b12、维生素k、核黄素、烟酸、维生素d、维生素b6、叶酸、吡哆辛(pyridoxine)、硫胺、泛酸和生物素。任何前述维生素的适合形式是维生素的盐、维生素的衍生物、具有维生素的相同或类似活性的化合物、和维生素的代谢物。在一些实施方案中，组合物包含至少一种生物体。适合实例在本领域中是熟知的，并且包括益生菌(例如乳酸杆菌属(lactobacillus)或双歧杆菌属(bifidobacterium)的物种)、螺旋藻属(spirulina)、小球藻属(chlorella)和紫菜属(porphyra)。在一些实施方案中，组合物包含至少一种膳食补充剂。适合实例在本领域中是熟知的，并且包括草本制剂、植物制剂和某些激素。非限制性实例包括银杏、人参和褪黑素(melatonin)。在一些实施方案中，组合物包含赋形剂。适合赋形剂的非限制性实例包括促味剂、香料、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压紧剂、润滑剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂。适合缓冲剂的非限制性实例包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。在一些实施方案中，赋形剂包括防腐剂。适合防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂，如α-生育酚和抗坏血酸；以及抗微生物剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。在一些实施方案中，组合物包含粘合剂作为赋形剂。适合粘合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶凝淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、c12-c18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、寡糖及其组合。在一些实施方案中，组合物包含润滑剂作为赋形剂。适合润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁和轻质矿物油。在一些实施方案中，组合物包含分散增强剂作为赋形剂。适合分散剂的非限制性实例包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶(guargum)、高岭土、膨润土、纯化木纤维素、淀粉乙醇酸钠、同形硅酸盐和微晶纤维素作为高hlb乳化剂表面活性剂。在一些实施方案中，组合物包含崩解剂作为赋形剂。在一些实施方案中，崩解剂是非泡腾性崩解剂。适合非泡腾性崩解剂的非限制性实例包括淀粉(诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预凝胶化和改性淀粉)、甜味剂、粘土(诸如膨润土)、微晶纤维素、海藻酸盐、淀粉乙醇酸钠、胶状物(诸如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶和黄蓍胶)。在一些实施方案中，崩解剂是泡腾性崩解剂。适合泡腾性崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸组合、以及碳酸氢钠与酒石酸组合。在一些实施方案中，赋形剂包括调味剂。并入外层中的调味剂可选自合成调味油和调味香料；天然油；来自植物、叶、花和果实的提取物；及其组合。在一些实施方案中，调味剂选自肉桂油；冬青油；胡椒薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉树；香草；柑桔油，诸如柠檬油、橙油、葡萄和葡萄柚油；以及水果香精，包括苹果、桃子、梨、草莓、树莓、樱桃、李子、菠萝和杏。在一些实施方案中，赋形剂包括甜味剂。适合甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载体时)；糖精和它的各种盐，诸如钠盐；二肽甜味剂，诸如阿斯巴甜；二氢查耳酮(dihydrochalcone)化合物、甘草甜(glycyrrhizin)；甜菊(steviarebaudiana)(甜菊苷(stevioside))；蔗糖的氯代衍生物，诸如蔗糖素(sucralose)；以及糖醇，诸如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等。也涵盖氢化淀粉水解产物和合成甜味剂3,6-二氢-6-甲基-1,2,3-噁噻嗪-4-酮-2,2-二氧化物，特别是其钾盐(安赛蜜(acesulfame-k))以及钠盐和钙盐。在一些实施方案中，组合物包含着色剂。适合着色剂的非限制性实例包括食物、药物和化妆品着色剂(fd和c)、药物和化妆品着色剂(d和c)、以及外部药物和化妆品着色剂(ext.d和c)。着色剂可用作染料或它们的相应色淀。制剂中的赋形剂或赋形剂的组合的重量分数通常是组合物中的氨基酸的总重量的约50％或小于50％、约45％或小于45％、约40％或小于40％、约35％或小于35％、约30％或小于30％、约25％或小于25％、约20％或小于20％、约15％或小于15％、约10％或小于10％、约5％或小于5％、约2％或小于2％、或约1％或小于1％。本文公开的蛋白质和组合物可被配制成多种形式，并且通过许多不同手段来施用。组合物可以根据需要含有常规可接受的载体、佐剂和媒介物的制剂形式口服、经直肠或胃肠外施用。如本文所用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内或胸骨内注射和输注技术。在一示例性实施方案中，口服施用蛋白质或组合物。用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、囊片、丸剂、锭剂、糖锭、粉末和颗粒剂。胶囊通常包含包括蛋白质或组合物的核心材料和囊封所述核心材料的壳壁。在一些实施方案中，核心材料包括固体、液体和乳液中的至少一个。在一些实施方案中，壳壁材料包括软质明胶、硬质明胶和聚合物中的至少一个。适合聚合物包括但不限于：纤维素聚合物，诸如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、乙酸偏苯三甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、丁二酸羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，诸如由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸铵、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯形成的那些(例如在商标名“eudragit”下销售的那些共聚物)；乙烯基聚合物和共聚物，诸如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯、乙酸乙烯酯巴豆酸共聚物、和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；以及虫胶(纯化紫胶)。在一些实施方案中，至少一种聚合物充当味道掩蔽剂。片剂、丸剂等可被压制、多重压制、多重层化、和/或包覆。包覆可为单一的或多重的。在一个实施方案中，包覆材料包括从植物、真菌和微生物中的至少一个提取的糖、多糖和糖蛋白中的至少一个。非限制性实例包括玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、纤维素、半纤维素、右旋糖苷、麦芽糖糊精、环糊精、菊糖、果胶、甘露聚糖、阿拉伯胶、刺槐豆胶、牧豆树胶、瓜尔胶、刺梧桐胶、印度胶、黄蓍胶、海萝、卡拉胶、琼脂、海藻酸盐、壳聚糖或结冷胶。在一些实施方案中，包覆材料包括蛋白质。在一些实施方案中，包覆材料包括脂肪和油中的至少一个。在一些实施方案中，脂肪和油中的至少一个具有高温熔化性。在一些实施方案中，脂肪和油中的至少一个被氢化或部分氢化。在一些实施方案中，脂肪和油中的至少一个源于植物。在一些实施方案中，脂肪和油中的至少一个包括甘油酯、游离脂肪酸和脂肪酸酯中的至少一个。在一些实施方案中，包覆材料包括至少一种可食用蜡。可食用蜡可源于动物、昆虫或植物。非限制性实例包括蜂蜡、羊毛脂、杨梅蜡、巴西棕榈蜡和米糠蜡。可另外制备具有肠溶包衣的片剂和丸剂。或者，可将包含本文公开的蛋白质和组合物的粉末或颗粒并入食物产品中。在一些实施方案中，食物产品是用于口服施用的饮料。适合饮料的非限制性实例包括果汁、果汁饮料、人工调味饮料、人工增甜饮料、碳酸饮料、运动饮料、液体乳制品、搅合饮料、含酒精饮料、含咖啡因饮料、婴儿配方饮料等。用于口服施用的其它适合手段包括水性和非水性溶液、乳膏剂、糊剂、乳液、混悬液和浆液，其各自可任选也含有适合溶剂、防腐剂、乳化剂、混悬剂、稀释剂、甜味剂、着色剂、促味剂、香料和调味剂中的至少一个。在一些实施方案中，食物产品是固体食料。固体食料的适合实例包括不限于成块食物、成块点心、曲奇饼、核仁巧克力饼、松饼、脆饼、饼干、奶油或面团、成块冰淇淋、成块冷冻酸奶等。在一些实施方案中，将本文公开的蛋白质和组合物并入治疗性食物中。在一些实施方案中，治疗性食物是任选含有一些或全部必需大量营养物和微量营养物的备用食物。在一些实施方案中，将本文公开的蛋白质和组合物并入被设计以掺合至现存餐食中的补充性食物中。在一些实施方案中，补充性食物含有一些或全部必需大量营养物和微量营养物。在一些实施方案中，将本文公开的蛋白质和组合物与现存食物掺合或添加至现存食物中以加强所述食物的蛋白质营养。实例包括食物主要成分(谷物、盐、糖、烹调油、人造黄油)、饮料(咖啡、茶、苏打水、啤酒、蒸馏酒、运动饮料)、点心、甜食和其它食物。本文公开的组合物可在方法中用于增加例如肌肉质量、强度和身体功能、产热、代谢消耗、饱腹感、线粒体生物发生、重量或脂肪损失、以及瘦性身体组成中的至少一个。制剂可在所述制剂中含有多达约每100千卡25g(25g/100kcal)的营养性多肽，此意味着存在于所述制剂中的所有或基本上所有能量都呈所述营养性多肽的形式。更通常地，存在于制剂中的能量的约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或小于5％呈营养性多肽形式。在其它制剂中，营养性多肽以足以提供等于或大于参照每日多肽摄取值的至少约0.1％的营养性益处的量存在。蛋白质的适合参照每日摄取值在本领域中是熟知的。参见例如dietaryreferenceintakesforenergy,carbohydrate,fiber,fat,fattyacids,cholesterol,proteinandaminoacids,instituteofmedicineofthenationalacademies,2005,nationalacademiespress,washingtondc。蛋白质的参照每日摄取值是这样的范围，其中10-35％的每日卡路里由蛋白质和分离的氨基酸提供。以每天的蛋白质克数的形式提供基于年龄的另一参照每日摄取值：年龄1-3岁的儿童：13g，年龄4-8岁的儿童：19g，年龄9-13岁的儿童：34g，年龄14-18岁的女孩：46，年龄14-18岁的男孩：52，年龄19-70+岁的妇女：46，以及年龄19-70+岁的男子：56。在其它制剂中，营养性多肽以足以向罹患蛋白质营养不良或特征在于蛋白质营养不良的疾病、病症或病状的人受试者提供营养性益处的量存在。蛋白质营养不良通常是一种出生前或儿童期病状。能量摄取足够的蛋白质营养不良称为夸休可尔或低白蛋白血症性营养不良，而呈包括蛋白质摄取不足的所有形式的能量摄取不足称为消瘦。营养充足的个体可由于消耗太少蛋白质或消耗的蛋白质缺乏营养性氨基酸而显现肌肉减少症。出生前蛋白质营养不良可通过向妊娠母亲施用本文所述的营养性多肽来预防、治疗或减轻，而新生儿蛋白质营养不良可通过向泌乳母亲施用本文所述的营养性多肽来预防、治疗或减轻。在成人中，蛋白质营养不良通常继发于癌症、慢性肾病，并且发生在年长者中。另外，蛋白质营养不良可为慢性的或急性的。急性蛋白质营养不良的实例发生在诸如败血症的急性病或疾病期间，或在从诸如手术的创伤性损伤、诸如灼烧的热损伤、或导致实质性组织重塑的类似事件恢复期间。可通过本文所述的方法和组合物治疗的其它急性疾病包括肌肉减少症、恶病质、糖尿病、胰岛素抗性和肥胖症。制剂可以当由人受试者消耗时足以提供饱腹感的量含有营养性多肽，此意味着所述受试者感觉饥饿感减轻或不存在饥饿或进食意愿。基于相等卡路里，这种制剂通常比富含碳水化合物的食物具有更高饱腹感指数。制剂可以基于营养性多肽的浓度(例如基于重量对重量)的某一量含有营养性多肽，以使所述营养性多肽占所述制剂的重量的多达100％，此意味着存在于所述制剂中的所有或基本上所有物质都呈所述营养性多肽的形式。更通常地，存在于制剂中的重量的约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或小于5％呈营养性多肽形式。在一些实施方案中，制剂含有10mg、100mg、500mg、750mg、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9、10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g、60g、70g、80g、90g、100g或超过100g营养性多肽。优选地，本文提供的制剂大致上不含非可食产品。非可食产品常见于先前技术的由酵母、细菌、藻类、昆虫、哺乳动物或其它表达系统产生的重组蛋白的制剂中。示例性非可食产品包括表面活性剂、聚乙烯醇、丙二醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、非可食多元酸或多元醇、脂肪醇、烷基苯甲基磺酸盐、烷基糖苷或对羟基苯甲酸甲酯。在各个方面，提供的制剂含有其它物质，诸如促味剂、营养性碳水化合物和/或营养性脂质。此外，制剂可包括增积剂、质地成构剂和填充剂。在优选实施方案中，本文提供的营养性多肽是分离的和/或大致上纯化的。本文提供的营养性多肽以及组合物和制剂大致上不含非蛋白质组分。所述非蛋白质组分通常存在于含有大量与多肽复合，并且导致蛋白质在胃肠道中的消化延迟和不完全的碳水化合物和脂质的的蛋白质制剂，诸如乳清、酪蛋白、蛋和大豆制剂中。所述非蛋白质组分也可包括dna。因此，营养性多肽、组合物和制剂的特征在于相较于食物源性多肽和多肽混合物，可消化性改进，并且过敏原性降低。此外，这些制剂和组合物的特征在于根据某一时间的可消化性和/或以给定单位时间为基础的消化产物更可重现。在某些实施方案中，相对于参照多肽或参照多肽混合物，营养性多肽在脂质和/或碳水化合物以及任选一种或多种降低可消化性和/或增加过敏原性的其它物质方面降低至少10％，例如降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％。在某些实施方案中，营养性制剂含有可由于可消化性和/或降低的过敏原性而选择的营养性碳水化合物和/或营养性脂质。使用方法在一些实施方案中，向患者或使用者(有时总称为“受试者”)施用本文公开的蛋白质和组合物。如本文所用，“施用(administer/administration)”涵盖其中一个人指导另一人以某一方式和/或出于某一目的消耗蛋白质或组合物的实施方案，并且也涵盖其中使用者不依赖于从第二人接收的任何指导或以所述任何指导的变化形式，以某一方式和/或出于某一目的使用蛋白质或组合物的情况。其中一个人指导另一人以某一方式和/或出于某一目的消耗蛋白质或组合物的实施方案的非限制性实例包括当医师对患者指定执行和/或治疗过程时，当教练员建议使用者(诸如运动员)遵循特定执行和/或治疗过程时，以及当制造商、分销商或商人向终端使用者推荐使用条件时，例如通过广告或在包装上或在与产品的出售或销售相伴提供的其它材料上进行标记。在一些实施方案中，以某一剂型提供蛋白质或组合物。在一些实施方案中，设计用于施用至少一种本文公开的蛋白质的剂型，其中施用的蛋白质的总量选自0.1g至1g、1g至5g、2g至10g、5g至15g、10g至20g、15g至25g、20g至40g、25-50g、以及30-60g。在一些实施方案中，设计用于施用至少一种本文公开的蛋白质的剂型，其中施用的蛋白质的总量选自约0.1g、0.1g-1g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g、55g、60g、65g、70g、75g、80g、85g、90g、95g和100g。在一些实施方案中，设计用于施用至少一种本文公开的蛋白质的剂型，其中施用的必需氨基酸的总量选自0.1g至1g、1g至5g、2g至10g、5g至15g、10g至20g、以及1-30g。在一些实施方案中，设计用于施用至少一种本文公开的蛋白质的剂型，其中施用的蛋白质的总量选自约0.1g、0.1-1g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g、55g、60g、65g、70g、75g、80g、85g、90g、95g和100g。在一些实施方案中，蛋白质或组合物是在1天0.1g至1g、1天1g至5g、1天2g至10g、1天5g至15g、1天10g至20g、1天15g至30g、1天20g至40g、1天25g至50g、1天40g至80g、1天50g至100g、或大于1天100g的速率下被消耗。在一些实施方案中，在由受试者达成的总蛋白质摄取量中，由受试者在膳食时期内达成的总蛋白质摄取量的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或约100％由至少一种本公开的蛋白质组成。在一些实施方案中，在由受试者达成的总蛋白质摄取量中，在膳食时期内，由受试者达成的总蛋白质摄取量的5％至100％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的5％至90％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的5％至80％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的5％至70％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的5％至60％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的5％至50％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的5％至40％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的5％至30％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的5％至20％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的5％至10％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的10％至100％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的10％至100％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的20％至100％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的30％至100％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的40％至100％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的50％至100％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的60％至100％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的70％至100％、由受试者达成的总蛋白质摄取量的80％至100％、或由受试者达成的总蛋白质摄取量的90％至100％由至少一种本公开的蛋白质组成。在一些实施方案中，至少一种本公开的蛋白质占受试者在膳食时期内的卡路里摄取量的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。在一些实施方案中，至少一种本公开的蛋白质包含至少2种本公开的蛋白质、至少3种本公开的蛋白质、至少4种本公开的蛋白质、至少5种本公开的蛋白质、至少6种本公开的蛋白质、至少7种本公开的蛋白质、至少8种本公开的蛋白质、至少9种本公开的蛋白质、至少10种本公开的蛋白质、或大于10种本公开的蛋白质。在一些实施方案中，膳食时期是1餐、2餐、3餐、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年。在一些实施方案中，膳食时期是1天至1周、1周至4周、1个月至3个月、3个月至6个月、或6个月至1年。临床研究提供证据表明蛋白质会防止归因于衰老或废用(诸如由于不活动或长期卧床休息)的肌肉损失。特定来说，研究已显示蛋白质补充会增加长期卧床休息期间的肌肉分数合成速率(fsr)，维持长期卧床休息期间的腿部质量和强度，增加瘦性身体质量，改进步态和平衡的功能性量度，并且可充当用于由于不活动或长期卧床休息而处于肌肉减少症的风险下的个体的可行性干预。参见例如paddon-jonesd等jclinendocrinolmetab2004,89:4351–4358；ferrando,a等clinicalnutrition20091-6；katsanosc等amjphysiolendocrinolmetab.2006,291:381-387。在运动员中进行的关于增加肌肉蛋白质合成代谢的研究已显示在运动之后提供的蛋白质促进肌肉肥大的程度大于由单独运动实现的肌肉肥大。也已显示在运动之后提供的蛋白质支持蛋白质合成而不使蛋白质分解有任何增加，从而导致净正性蛋白质平衡和肌肉质量堆积。尽管肌肉蛋白质合成似乎以剂量-应答方式对必需氨基酸补充起应答，但并非所有蛋白质在构建肌肉方面都等同。举例来说，氨基酸亮氨酸是刺激肌肉蛋白质合成的重要因素。参见例如borscheime等amjphysiolendocrinolmetab2002,283:e648-e657；borsheime等clinnutr.2008,27:189-95；esmarckb等jphysiol2001,535:301-311；moored等amjclinnutr2009,89:161-8)。在另一方面，本公开提供维持或增加受试者的肌肉质量、肌肉强度和功能性能中的至少一个的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者提供足量的本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物。在一些实施方案中，受试者处于以下至少一种状态下：年长、患有医学上危急疾病、以及罹患蛋白质-能量营养不良。在一些实施方案中，足量的本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者在与进行运动配合下消耗。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者通过口服、经肠或胃肠外途径消耗。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者通过口服途径消耗。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者通过经肠途径消耗。在另一方面，本公开提供维持或实现受试者的合乎需要的身体质量指数的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者提供足量的本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物。在一些实施方案中，受试者处于以下至少一种状态下：年长、患有医学上危急疾病、以及罹患蛋白质-能量营养不良。在一些实施方案中，足量的本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者在与进行运动配合下消耗。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者通过口服、经肠或胃肠外途径消耗。在另一方面，本公开提供向患有蛋白质-能量营养不良的受试者提供蛋白质的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者提供足量的本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者通过口服、经肠或胃肠外途径消耗。已建议需要在癌症患者和罹患肌肉损耗和恶病质的其它患者中补充必需氨基酸。在小鼠中进行的膳食研究已显示通过用必需氨基酸进行膳食性干预，对恶病质癌症携带小鼠具有存活性和功能性益处。除癌症之外，必需氨基酸补充也已在具有运动困难，并且因此遭受肌肉衰退的罹患其它疾病(诸如慢性阻塞性肺病、慢性心脏衰竭、hiv和其它疾病状态)的患者中显示各种益处，诸如肌肉功能和肌肉增加得以改进。研究已显示特定氨基酸有利于管理恶病质。膳食中的bcaa和leu的含量相对较高被认为通过发出使翻译增加的信号，增强胰岛素释放以及抑制蛋白质降解来促进总蛋白质合成而在恶病质中具有积极作用。因此，消耗的膳食性bcaa(一般来说)和/或leu(特定来说)增加将积极促进降低或逆转恶病质的影响。因为氮平衡在对抗恶病质的潜伏病因方面是重要的，所以认为消耗的膳食性谷氨酰胺和/或精氨酸增加将积极促进降低或逆转恶病质的影响。参见例如opdenkampc,langenr,haegensa,scholsa.“muscleatrophyincachexia:candietaryproteintipthebalance？”currentopinioninclinicalnutritionandmetaboliccare2009,12:611–616；poonrt-p,yuw-c,fans-t等“long-termoralbranchedchainaminoacidsinpatientsundergoingchemoembolizationforhepatocellularcarcinoma:arandomizedtrial.”alimentpharmacolther2004；19:779–788；tayekja,bistrianbr,hehirdj,martinr,moldawerll,blackburngl.“improvedproteinkineticsandalbuminsynthesisbybranchedchainaminoacid-enrichedtotalparenteralnutritionincancercachexia.”cancer.1986；58:147–57；xip,jiangz,zhengc,liny,wug“regulationofproteinmetabolismbyglutamine:implicationsfornutritionandhealth.”frontbiosci.2011年1月1日；16:578-97。因此，本文也提供治疗受试者的恶病质的方法。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物足以用于患有恶病质的受试者的量是以下量：由人摄取的所述量的本公开的蛋白质满足或超过代谢需要(所述需要常被提高)。每天每千克体重1.5g或总卡路里摄取量的15-20％的蛋白质摄取量似乎是适于患有恶病质的人士的目标。在一些实施方案中，由受试者消耗的所有蛋白质都是本公开的蛋白质。在一些实施方案中，本公开的蛋白质与其它来源的蛋白质和/或游离氨基酸组合以提供受试者的总蛋白质摄取量。在一些实施方案中，受试者处于以下至少一种状态下：年长、患有医学上危急疾病、以及罹患蛋白质-能量营养不良。在一些实施方案中，受试者罹患使得运动困难，并且因此导致肌肉退化的疾病，诸如慢性阻塞性肺病、慢性心脏衰竭、hiv、癌症和其它疾病状态。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者在与进行运动配合下消耗。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者通过口服、经肠或胃肠外途径消耗。肌肉减少症是骨骼肌质量(通常在25岁之后每年损失0.5-1％)、品质和强度的与衰老相关的退化性损失。肌肉减少症是虚弱综合征的组成部分。欧洲关于年长人的肌肉减少症的工作组(ewgsop)已建立针对年龄相关的肌肉减少症的实际临床规定和统一诊断准则。对于肌肉减少症的诊断，工作组已提出使用存在低肌肉质量与低肌肉功能(强度或性能)两者。肌肉减少症的特征首先在于肌肉萎缩(肌肉尺寸降低)，以及由诸如肌肉纤维被脂肪置换、纤维化增加、肌肉代谢变化、氧化应激和神经肌肉接点退化的因素引起的肌肉组织“品质”降低。这些变化组合在一起导致肌肉功能进行性损失，并且最终导致虚弱。虚弱是一种在年长成人中常见的体现灾难性健康和功能衰退的风险升高的老年综合征。虚弱的因素可包括肌肉减少症、骨质疏松和肌肉衰弱。肌肉衰弱，也称为肌肉疲劳(或“缺乏强度”)，是指不能用骨骼肌施加力量。衰弱常在肌肉萎缩和活动减少之后，诸如在由于疾病的一段长期卧床休息之后。也存在由于肌肉减少症的肌肉衰弱逐渐发作。本公开的蛋白质适用于一旦肌肉减少症或虚弱在受试者中显现时即对它进行治疗或适用于预防作为风险组的成员的受试者的肌肉减少症或虚弱的发作。在一些实施方案中，由受试者消耗的所有蛋白质都是本公开的蛋白质。在一些实施方案中，本公开的蛋白质与其它来源的蛋白质和/或游离氨基酸组合以提供受试者的总蛋白质摄取量。在一些实施方案中，受试者处于以下至少一种状态下：年长、患有医学上危急疾病、以及罹患蛋白质-能量营养不良。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者在与进行运动配合下消耗。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者通过口服、经肠或胃肠外途径消耗。肥胖症是一种与许多共病症相关的多因性病症，所述共病症包括高血压、2型糖尿病、血脂异常、冠心病、中风、癌症(例如子宫内膜癌、乳腺癌和结肠癌)、骨关节炎、睡眠呼吸暂停和呼吸道问题。在美国，定义为身体质量指数>30kg/m2的肥胖症的发病率已从15％(1976–1980)显著增加至33％(2003–2004)，并且它会继续增长。尽管促成肥胖症的机理是复杂的，并且涉及行为组成部分与激素、遗传和代谢过程的相互作用，但肥胖症主要被视为一种取决于生活方式的病状，具有2种主要病因：过度能量摄取和身体活动不足。关于能量摄取，有证据表明适度增加膳食中的蛋白质的比例，同时控制总能量摄取可改进身体组成，促进脂肪损失，并且改进在重量减轻之后的体重维持。与膳食性蛋白质增加相关的积极结果被认为主要归因于与饱腹感增加相关的能量摄取降低、能量效率降低和/或产热增加、对身体组成(具体来说瘦性肌肉质量)的积极作用、以及血糖控制增强。膳食性蛋白质在增加膳后能量消耗方面比等热量摄取的碳水化合物或脂肪更有效(参见例如daunceym,binghams.“dependenceof24henergyexpenditureinmanoncompositionofthenutrientintake.”brjnutr1983,50:1-13；karsth等“diet-inducedthermogenesisinman:thermiceffectsofsingleproteins,carbohydratesandfatsdependingontheirenergyamount.”annnutrmetab.1984,28:245-52；tappyl等“thermiceffectofinfusedaminoacidsinhealthyhumansandinsubjectswithinsulinresistance.”amjclinnutr1993,57(6):912-6)。这个性质以及其它性质(饱腹感诱导；维持瘦性身体质量)使得蛋白质成为在重量管理时所针对的有吸引力的膳食组分。由所述膳食引起的能量消耗增加可部分归因于消化和代谢蛋白质的能量消耗高于其它卡路里来源的事实。包括蛋白质合成的蛋白质转换是一种能量消耗过程。此外，高蛋白质膳食也可上调肝和棕色脂肪中的解偶联蛋白质，此与能量消耗增加正性相关。已推理不同蛋白质可对能量消耗具有独特影响。研究表明摄取蛋白质(特别是eaa和/或bcaa含量较高的蛋白质)会对产热和能量消耗产生不同影响(参见例如mikkelsenp.等“effectoffat-reduceddietson24henergyexpenditure:comparisonsbetweenanimalprotein,vegetableproteinandcarbohydrate.”amjclinnutr2000,72:1135-41；achesonk.等“proteinchoicestargetingthermogenesisandmetabolism.”amjclinnutr2011,93:525-34；alfenasr.等“effectsofproteinqualityonappetiteandenergymetabolisminnormalweightsubjects”argbrasendocrinolmetabol2010,54(1):45-51；lorenzenj.等“theeffectofmilkproteinsonappetiteregulationanddiet-inducedthermogenesis.”jclinnutr201266(5):622-7)。另外，l-酪氨酸已被鉴定为在产热中起作用的氨基酸(参见例如belzaa.等“thebeta-adrenergicantagonistpropranololpartlyabolishesthermogenicresponsetobioactivefoodingredients.”metabolism2009,58(8):1137-44)。进一步研究表明亮氨酸和精氨酸补充似乎通过将底物引向瘦性身体质量而非脂肪组织来改变能量代谢(dullooa.”thesearchforcompoundsthatstimulatethermogenesisinobesitymanagement:frompharmaceuticalstofunctionalfoodingredients.”obesrev201112:866-83)。总之，文献表明不同蛋白质类型对产热产生不同影响。因为富含eaa、bcaa和/或tyr、arg和leu中的至少一个的蛋白质或肽据信对产热具有刺激作用，并且因为刺激产热据信会对重量管理产生积极作用，所以本公开也提供适用于刺激产热和/或一般来说对重量管理产生积极作用的产品和方法。更特定来说，本公开提供增加受试者的产热的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者提供足量的本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物。在一些实施方案中，受试者是肥胖的。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者在与进行运动配合下消耗。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者通过口服、经肠或胃肠外途径消耗。在基本层面上，显现超重病状的原因是归因于能量摄取与能量消耗之间的不平衡。试图减少在任何特定时机(饱足)以及在进食时机之间(饱腹感)的食物已成为新近研究的主要焦点。由于在进餐期间感觉饱足以及在进餐之后感觉饱满而降低的热量摄取由内部信号和外部信号的复杂相互作用所致。各种营养研究已证明改变食物性质(诸如能量密度、内含物、质地和味道)会影响饱足与饱腹感两者。存在递送能量的三种大量营养物：脂肪、碳水化合物和蛋白质。1克蛋白质或碳水化合物提供4卡，而1克脂肪提供9卡。蛋白质使饱腹感增加的程度通常大于碳水化合物或脂肪，并且因此可促进卡路里摄取降低。然而，有可观证据指示蛋白质的类型在诱导饱腹感方面具有重要性(参见例如w.l.hall等“caseinandwheyexertdifferenteffectsonplasmaaminoacidprofiles,gastrointestinalhormonesecretionandappetite.”brjnutr.2003年2月,89(2):239-48；r.abou-samra等“effectofdifferentproteinsourcesonsatiationandshort-termsatietywhenconsumedasastarter.”nutrj.2011年12月23日,10:139；t.akhavan等“effectofpremealconsumptionofwheyproteinanditshydrolysateonfoodintakeandpostmealglycemiaandinsulinresponsesinyoungadults.”amjclinnutr.2010年4月,91(4):966-75,电子出版2010年2月17日；maveldhorst“dose-dependentsatiatingeffectofwheyrelativetocaseinorsoy”physiolbehav.2009年3月23日,96(4-5):675-82)。证据指示富含亮氨酸的蛋白质在诱导饱腹感方面特别有效(参见例如fromenting等“peripheralandcentralmechanismsinvolvedinthecontroloffoodintakebydietaryaminoacidsandproteins.”nutrresrev201225:29-39)。在一些实施方案中，本公开的蛋白质与至少一种药物或生物药物产品同时由受试者消耗。在一些实施方案中，蛋白质和至少一种药物或生物药物产品的有益作用具有累加效应，而在一些实施方案中，蛋白质和至少一种药物或生物药物产品的有益作用具有协同效应。可与本公开的蛋白质一起施用的药物或生物药物产品的实例在本领域中是熟知的。举例来说，当本公开的蛋白质用于维持或增加受试者的肌肉质量、肌肉强度和功能性能中的至少一个时，所述蛋白质可与某一治疗剂量方案的至少一种指示用以维持或增加受试者的肌肉质量、肌肉强度和功能性能中的至少一个的药物或生物药物产品(诸如合成代谢类固醇)同时由受试者消耗。当本公开的蛋白质用于维持或实现受试者的合乎需要的身体质量指数时，所述蛋白质可与某一治疗剂量方案的至少一种指示用以维持或实现受试者的合乎需要的身体质量指数的药物或生物药物产品(诸如奥利斯泰(orlistat)、氯卡色林(lorcaserin)、西布曲明(sibutramine)、利莫那班(rimonabant)、二甲双胍(metformin)、艾塞那肽(exenatide)或普兰林肽(pramlintide))同时由受试者消耗。当本公开的蛋白质用于诱导受试者的饱足反应和饱腹感反应中的至少一个时，所述蛋白质可与某一治疗剂量方案的至少一种指示用以诱导受试者的饱足反应和饱腹感反应中的至少一个的药物或生物药物产品(诸如利莫那班、艾塞那肽或普兰林肽)同时由受试者消耗。当本公开的蛋白质用于治疗受试者的恶病质、肌肉减少症和虚弱中的至少一个时，所述蛋白质可与某一治疗剂量方案的至少一种指示用以治疗恶病质、肌肉减少症和虚弱中的至少一个的药物或生物药物产品(诸如ω-3脂肪酸或合成代谢类固醇)同时由受试者消耗。由于膳食性蛋白质在诱导饱足和饱腹感方面的作用，本文公开的蛋白质和组合物可用于诱导受试者的饱足反应和饱腹感反应中的至少一个。在一些实施方案中，方法包括向受试者提供足量的本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物。在一些实施方案中，受试者是肥胖的。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者在与进行运动配合下消耗。在一些实施方案中，本公开的蛋白质、本公开的组合物或通过本公开的方法制备的组合物由受试者通过口服、经肠或胃肠外途径消耗。在一些实施方案中，将至少一种本公开的蛋白质或组合物并入受试者的膳食中具有至少一种选自以下的作用：诱导餐后饱腹感(包括通过遏制饥饿)、诱导产热、降低血糖应答、积极影响能量消耗、积极影响瘦性身体质量、降低由过度进食引起的重量增加、以及降低能量摄取。在一些实施方案中，将至少一种本公开的蛋白质或组合物并入受试者的膳食中在所述受试者中具有至少一种选自以下的作用：增加身体脂肪损失、降低瘦性组织损失、改进脂质分布、以及改进葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。本文所述的技术和方案的实例可见于remington'spharmaceuticalsciences,第16版,osol,a.(编),1980中。实施例以下是用于进行本发明的特定实施方案的实施例。实施例仅出于说明性目的而提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。已努力确保关于所用数值(例如量、温度等)的准确性，但当然应允许一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则本发明的实施将采用属于本领域的技能的蛋白质化学、生物化学、重组dna技术和药理学的常规方法。所述技术充分说明于文献中。参见例如t.e.creighton,proteins:structuresandmolecularproperties(w.h.freemanandcompany,1993)；a.l.lehninger,biochemistry(worthpublishers,inc.,当前版本)；sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual(第2版,1989)；methodsinenzymology(s.colowick和n.kaplan编,academicpress,inc.)；remington'spharmaceuticalsciences,第18版(easton,pennsylvania:mackpublishingcompany,1990)；carey和sundbergadvancedorganicchemistry第3版(plenumpress)第a和b卷(1992)。实施例1.使用质谱测定分析来鉴定和选择可食用物种的营养性多肽的氨基酸序列。提供一种用于诸如从多肽或核酸文库或从蛋白质序列的相关数据库鉴定一种或多种营养性多肽氨基酸序列的方法。在此处，通过对从可食用物种提取和纯化的蛋白质进行质谱分析来鉴定营养性多肽氨基酸序列。供质谱分析的蛋白质分离。从固体可食用来源提取蛋白质。在分析中包括来自以下物种的样品：美味猕猴桃(actinidiadeliciosa)、双孢蘑菇双孢变种(agaricusbisporusvar.bisporus)、钝顶节旋藻(arthrospiraplatensis)、欧洲牛(bostaurus)、甘蓝(brassicaoleracea)、大麻(cannabis)、昆诺藜(chenopodiumquinoa)、规则小球藻(chlorellaregularis)、多变小球藻(chlorellavariabilis)、鹰嘴豆(cicerarietinum)、笋瓜(cucurbitamaxima)、禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)、鳕(大西洋鳕鱼)、原鸡(gallusgallus)、大豆(glycinemax)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、昆布目(laminariales)、亚麻(linumusitatissimum)、火鸡(meleagrisgallopavo)、维吉尼亚鹿(odocoileusvirginianus)、尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus)、水稻(oryzasativa)、绵羊(ovisaries)、掌叶树(palmariapalmata)、油梨(perseaamericana)、乌梅(prunusmume)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、盐湖鲑鱼(salmosalar)、番茄(solanumlycopesicum)、马铃薯(solanumtuberosum)、野猪(susscrofa)、金枪鱼(thunnusthynnus)、高丛越橘(vacciniumcorymbosum)、葡萄(vitisvinifera)和玉米(zeamays)。首先将各样品冷冻在-80℃下，接着使用研钵和研杵研磨，随后将50mg物质称入微量离心管中。接着将50mg样品再混悬于1ml提取缓冲液(8.3m尿素、2m硫脲、2％w/vchaps、1％w/vdtt)中，并且搅拌30分钟。添加500μl100μm锆珠粒(opsdiagnostics)，继之以再继续搅拌30分钟。在tissuelyserii(qiagen)上在30hz下操作样品3分钟，接着在台式微量离心机(eppendorf)中在21,130g下离心10分钟。将上清液转移至清洁微量离心管中，等分成50μl等分试样，并且储存在-80c下。通过coomassie加强型(bradford)蛋白质测定(thermoscientific)来测量提取的可溶性蛋白质的量。在10％10泳道bistrissds-page凝胶(invitrogen)上操作20ug蛋白质，接着切除以通过lc/ms/ms进行分析。也从以下可食用生物体的液体培养物分离蛋白质：黑曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)。如本文所述培养曲霉属和芽孢杆菌属生物体。通过离心(10,000xg)培养物10分钟，随后使用0.2μm过滤器过滤上清液来分离澄清上清液。通过coomassie加强型(bradford)蛋白质测定(thermoscientific)来测量澄清上清液中可溶性蛋白质的量。根据制造商方案在10％预浇制bistrissds-page凝胶(invitrogen)上操作蛋白质样品(20μg)。质谱分析。对于lc/ms/ms分析，将各凝胶切成五个同等大小的碎片。使用机器人(progest,digilab)用以下方案进行胰蛋白酶消化：依次用25mm碳酸氢铵和乙腈洗涤，在60℃下用10mm二硫苏糖醇还原，随后在室温下用50mm碘乙酰胺进行烷基化，在37℃下用胰蛋白酶(promega)消化4小时，用甲酸淬灭，并且上清液不经进一步处理即直接分析。汇合各样品的凝胶消化物，并且用联接于thermofisherqexactive的watersnanoacquityhplc系统，通过纳米lc/ms/ms来分析。将肽装载于捕集柱上，并且历经75μm分析柱在350nl/min下洗脱；两个柱均填充有jupiterproteo树脂(phenomenex)。以数据依赖性模式操作质谱仪，其中ms和ms/ms分别在70,000fwhm和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中进行。15种最丰富的离子被选择用于ms/ms。使用mascot用以下参数相对于uniprot和/或ncbi蛋白质数据库根据相应生物体搜索所得数据：酶-胰蛋白酶/p，固定修饰-脲基甲基(c)，可变修饰-氧化(m)、乙酰基(蛋白质n末端)、pyro-glu(n末端q)、脱酰胺(nq)，质量值–单同位素，肽质量容差-10ppm，片段质量容差-0.015da，最大遗漏裂解数–2。将mascotdat文件解析至scaffold软件中以进行验证，过滤，并且创建每个样品的非冗余清单。使用90％的最小蛋白质值、50％的最小肽值(prophet评分)以及每种蛋白质要求至少两种独特肽来过滤数据。通过光谱计数来确定所检测蛋白质的相对丰度，所述计数是对于各蛋白质获得的光谱数。光谱计数是一种通常由蛋白质质谱领域使用的无标记定量方法(liu,hongbin等analyticalchemistry76.14(2004):4193-4201)。为计算蛋白质分离物中各蛋白质的相对丰度，用蛋白质光谱计数的数目除以总蛋白质光谱计数。使用这个方法鉴定了seqid894-3415。同源物发现。对于鉴定的营养性多肽序列，如所述，从其它物种鉴定类似序列，通过这个方法鉴定的seqid-00093用于使用如本文所述的计算机程序blast搜索同源物。以这个方式鉴定的来自可食用数据库的示例性营养性多肽同源物显示于表e1a中。以这个方式鉴定的来自表达序列数据库的示例性营养性多肽同源物显示于表e1b中。表e1a.鉴定为seqid-00093的同源物的可食用序列。seqideaa与seqid-00093的同一性百分比seqid-000940.4598.8seqid-000920.4289.9seqid-000750.4667.9seqid-000720.4667.3seqid-037120.4666.0seqid-037630.4450.3seqid-037080.4551.6seqid-037980.4651.6seqid-038600.4550.9seqid-036510.4650.9表e1b.鉴定为seqid-00093的同源物的表达序列seqideaa与seqid-00093的同一性百分比seqid-000740.4291.2seqid-000920.4289.9seqid-000750.4666.9seqid-000780.4665seqid-001060.4650.3seqid-001040.4550.3seqid-008640.4550.3seqid-008700.4543.8seqid-008670.4744.5seqid-001050.4441.1seqid-001030.4540.5seqid-008660.4039.8实施例2.使用cdna文库来鉴定和选择可食用物种的营养性多肽的氨基酸序列。在此处，通过对由从可食用物种提取和纯化的核酸序列产生的蛋白质进行分析来鉴定营养性多肽氨基酸序列。构建cdna文库。构建来自12个可食用物种的cdna的文库。12个可食用物种被分成5个种类以进行rna提取。以各可食用物种50mg使动物组织(包括绞细牛肉、猪肉、羊羔肉、鸡肉、火鸡肉和一部分罗非鱼)组合。研磨来自葡萄和番茄的包括皮和果实的水果组织，并且以各物种2.5g进行组合。以各物种1g使稻和大豆的种子组合，并且研磨成粉末。使12ml酿酒酵母生长过夜，并且短暂离心以获得110mg酵母细胞湿重。研磨1g蘑菇菌丝体，并且使用真菌rna提取方案处理。所有5个种类的样品都以液氮快速冷冻，解冻，并且使用种类特异性rna提取方案进行溶解。提取来自不同食物种类的rna，并且组合成一个汇合样品。使用寡dt作为引物，将rna的合并汇合物逆转录成cdna，从而产生长度在500bp至4kb之间的cdna。使衔接头连接于cdna的各末端，并且用作用于扩增cdna文库的pcr引物，并且也包括用于将文库克隆至表达载体中的sfii限制消化位点。使cdna文库变性并再退火，并且使用凝胶电泳选择单链dna。这个过程从高度丰富rna物质移除额外cdna以获得标准化cdna文库。使用乙醇沉淀法使标准化cdna文库沉淀，随后进行pcr扩增并克隆至表达载体中。表e2a.侧接cdna的引物和适体序列。将cdna文库克隆至大肠杆菌中以进行蛋白质表达。将cdna文库克隆至pet15b骨架载体中，所述载体用具有含有相应sfii限制位点的突出部分(正向引物突出部分：tacgtgtatggccgcctcggcc；反向引物突出部分：tacgtgtatggccgtaatggcc)的引物扩增。pet15b含有pbr322复制起点、lac控制的t7启动子、和赋予对羧苄青霉素(carbenicillin)的抗性的bla基因。cdna文库与pcr扩增骨架两者均用sfii切割，进行pcr纯化，并且连接。将连接反应物转化至10-β高效率感受态细胞(newenglandbiolabs)中，并且将转化的细胞涂铺于4个含有100mg/l羧苄青霉素的lb琼脂板上。将各板在37℃下孵育过夜。在菌落已生长之后，添加2ml液体lb培养基至各板中。将细胞刮入液体中并混合在一起，并且制备混悬液以提取质粒来形成多路cdna质粒文库。大肠杆菌cdna多路表达方法。4种菌株用于表达cdna文库：来自newenglandbiolabs的t7express；以及来自emdmillipore的rosetta2(de3)、rosetta-gamib(de3)和rosetta-gami2(de3)。t7express是一种增强的bl21衍生物，其在lac操纵元中含有t7rna聚合酶，同时缺乏lon和ompt蛋白酶。t7express的基因型是：fhua2lacz::t7gene1[lon]omptgalsula11r(mcr-73::minitn10--tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10--tets)enda1δ(mcrc-mrr)114::is10。rosetta2(de3)是一种供给用于7种稀有密码子(aga、agg、aua、cua、gga、ccc、cgg)的trna的bl21衍生物。菌株是λde3的溶源菌，并且携带处于lacuv5启动子之下的t7rna聚合酶基因。rosetta2(de3)的基因型是：f-ompthsdsb(rb-mb-)galdcm(de3)prare2(camr)。rosetta-gamib(de3)与rosetta2(de3)具有相同性质，但包括增强在细胞质中形成蛋白质二硫键的特征。rosetta-gamib(de3)的基因型是f–ompthsdsb(rb–mb–)galdcmlacy1ahpc(de3)gor522::tn10trxbprare(camr,kanr,tetr)。类似于rosetta-gamib(de3)，rosetta-gami2(de3)缓和密码子偏倚，增强二硫键形成，并且在染色体中具有处于lacuv5启动子之下的t7rna聚合酶基因。rosetta-gami2(de3)的基因型是δ(ara-leu)7697δlacx74δphoapvuiiphorarad139ahpcgalegalkrpsl(de3)f′[lac+laciqpro]gor522::tn10trxbprare2(camr,strr,tetr)。将约200ng制备的cdna文库转化至4种背景菌株中：t7express、rosetta2(de3)、rosetta-gamib(de3)和rosetta-gami2(de3)感受态细胞。在转化之后，将100μl各菌株涂铺于4个含有100mg/l羧苄青霉素的lb(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨和5g/l酵母提取物)1.5％琼脂板上，并且在37℃下孵育16小时。在孵育之后，添加2ml具有100mg/l羧苄青霉素的lb培养基至含有数千个转化体的各板的表面，并且通过用细胞涂布器刮擦以及混合来将细胞混悬于表面培养基中。使来自各背景的4个平行测定板的混悬细胞组合以形成用于表达实验的预接种物培养物。使用板读取器，由再混悬细胞制得的预接种物培养物的od600被测量为在35与40之间(t7、rosetta2(de3))或在15与20之间(rosetta-gamib(de3)和2(de3))。对于4种背景菌株，对125ml含有10ml具有100mg/l羧苄青霉素的lb培养基的挡板振荡烧瓶进行接种以获得od6000.2来形成接种物培养物，并且在37℃下在250rpm下振荡孵育约6小时。测量od600，并且接种物培养物用于在2l含有250ml具有100mg/l羧苄青霉素、600mu/l葡糖淀粉酶和0.01％消泡剂204的biosiltaenbase培养基的挡板振荡烧瓶中接种表达培养物以获得od6000.1。在30℃和250rpm下振荡培养物18小时，并且用1mmiptg诱导，并补充以额外enbase培养基组分和另外600mu/l葡糖淀粉酶。在30℃和250rpm下进行异源性表达24小时，此时终止培养。测量终末细胞密度，并且通过离心(5000xg，10分钟，室温)来收集细胞。将细胞储存在-80℃下，随后根据制造商方案用b-per(pierce)溶解。在细胞溶解之后，对全细胞溶解产物取样以进行分析。在rosetta(de3)菌株中，离心(3000xg，10分钟，室温)全细胞溶解产物，并且收集上清液作为溶解产物的可溶性部分。在sds-page凝胶上操作细胞溶解产物，分离成10个部分，接着使用ms-ms进行分析。将cdna文库克隆至芽孢杆菌属中以进行蛋白质分泌。将cdna文库克隆至pht43载体中以在枯草芽孢杆菌中进行蛋白质分泌测定。来自mobitec的未修饰的pht43载体含有pgrac启动子、samyq信号肽、amp和cm抗性基因、laci区域、repa区域和cole1复制起点。移除samyq信号肽。用具有含有相应sfii限制位点的突出部分(正向引物突出部分：tacgtgtatggccgcctcggcc；反向引物突出部分：tacgtgtatggccgtaatggcc)的引物扩增不具有信号肽的pht43骨架载体以及grac启动子被apre启动子取代并且laci区域被移除的修饰形式。cdna文库与两种pcr扩增骨架两者均用sfii切割并进行pcr纯化。使cdna文库插入物连接至各背景中。将连接反应物转化至10-β高效率感受态细胞(newenglandbiolabs)中，并且将各连接的细胞涂铺于4个含有100mg/l羧苄青霉素的lb琼脂板上。将各板在37℃下孵育过夜。在菌落已生长之后，添加2ml液体lb培养基至各板中。对于各连接，将细胞刮入液体中并混合在一起，并且制备混悬液以提取质粒来形成多路cdna质粒文库(此后被称为多路grac-cdna和apre-cdna文库)。用于这个表达实验中的表达菌株基于wb800n菌株(mobitec)。wb800n菌株具有以下基因型：npreapreeprbprmpr::blenprb::bsrvprwpra::hygcm::neo；neor。菌株cdna-1含有与papre启动子协同的突变，并且除wb800n基因型之外也具有这些改变：pxyla-comk::erm,degu32(hy),sigf::str。菌株cdna-2相对于wb800n具有这些改变：pxyla-comk::erm。将约1μg多路grac-cdna文库转化至菌株cdna-1与菌株cdna-2两者中，并且将1μg多路apre-cdna文库转化至菌株cdna-1中。在转化之后，将100μl各菌株涂铺于4个含有5mg/l氯霉素的lb(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨和5g/l酵母提取物)1.5％琼脂板上，并且在37℃下孵育16小时。在孵育之后，添加2ml具有5mg/l氯霉素的lb培养基至含有数千个转化体的各板的表面，并且通过用细胞涂布器刮擦以及混合来将细胞混悬于表面培养基中。使来自各转化的4个平行测定板的混悬细胞组合以形成用于表达实验的预接种物培养物。使用板读取器，由再混悬细胞制得的预接种物培养物的od600被测量为约20-25。对于3种菌株(菌株cdna-1+多路grac-cdna、菌株cdna-1+多路apre-cdna、菌株cdna-2+grac-cdna)，对500ml含有50ml具有5mg/l氯霉素的2xmal培养基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、75g/ld-麦芽糖)的挡板振荡烧瓶接种以获得od600≈0.2来形成接种物培养物，并且在30℃下在250rpm下振荡孵育约6小时。测量od600，并且接种物培养物用于在2l含有具有5mg/l氯霉素、1xteknova微量金属和0.01％消泡剂204的2xmal培养基的挡板振荡烧瓶中接种表达培养物以获得od6000.1。在30℃和250rpm下振荡菌株cdna-1+多路aprecdna培养物18小时，此时收集培养物。测量终末细胞密度，并且通过离心(5000xg，30分钟，室温)来收集细胞。在37℃和250rpm下振荡菌株cdna-1+多路grac-cdna和菌株cdna-2+多路grac-cdna培养物4小时，并且用1mmiptg诱导。在37℃和250rpm下进行异源性表达4小时，此时收集培养物。再次，测量终末细胞密度，并且通过离心(5000xg，30分钟，室温)来收集细胞。收集上清液并在sds-page凝胶上操作，分离成10个部分，接着使用lc-ms/ms进行分析以鉴定分泌蛋白质。质谱测定法分析。使用lc-ms/ms分析全细胞溶解产物和可溶性溶解产物样品的蛋白质表达。为分析样品，将10μg样品装载于10％sds-page凝胶(invitrogen)上，并且分离约5cm。将凝胶切成10个区段，并且通过依次用25mm碳酸氢铵和乙腈洗涤来处理凝胶切片。凝胶切片接着在60℃下用10mm二硫苏糖醇还原，随后在室温下用50mm碘乙酰胺进行烷基化。最后，样品用胰蛋白酶(promega)在37℃下消化4小时，并且以添加甲酸来使消化淬灭。上清液样品接着用联接于thermofisherqexactive的watersnanoacquityhplc系统，通过纳米lc/ms/ms来分析。将肽装载于捕集柱上，并且历经75μm分析柱在350nl/min下洗脱；两个柱均填充有jupiterproteo树脂(phenomenex)。采用1小时梯度。以数据依赖性模式操作质谱仪，其中ms和ms/ms分别在70,000fwhm分辨率和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中进行。15种最丰富的离子被选择用于ms/ms。使用mascot相对于数据库搜索数据以鉴定肽。通过组合来自包括欧洲牛、原鸡、葡萄、绵羊、野猪、水稻、大豆、尼罗罗非鱼、番茄、双孢蘑菇双孢变种、酿酒酵母和火鸡的全部12个物种的完整蛋白质组序列来构建数据库。将mascotdat文件解析至scaffold软件中以进行验证，过滤，并且创建每个样品的非冗余清单。在1％蛋白质和肽假发现率(fdr)以及每种蛋白质要求至少两种独特肽下过滤数据。鉴定的表达蛋白质。质谱测定法分析鉴定各表达菌株的总计125种蛋白质。报道与蛋白质丰度相关的光谱计数以确认蛋白质表达或分泌。53种蛋白质鉴定于rosetta(de3)菌株的全细胞溶解产物中，46种鉴定于rosetta(de3)菌株的可溶性部分中，36种鉴定于rosetta-gamib(de3)中，10种鉴定于rosetta-gami2(de3)中，并且15种鉴定于枯草芽孢杆菌的分泌上清液中。在枯草芽孢杆菌的分泌上清液中检测的营养性多肽是seqid-00718、seqid-00762、seqid-00763、seqid-00764、seqid-00765、seqid-00766、seqid-00767、seqid-00768、seqid-00769、seqid-00770、seqid-00771、seqid-00772、seqid-00773、seqid-00774、seqid-00775。在大肠杆菌rosetta(de3)菌株的全细胞溶解产物中检测的营养性多肽是seqid-00716、seqid-00718、seqid-00720、seqid-00723、seqid-00724、seqid-00725、seqid-00729、seqid-00732、seqid-00737、seqid-00751、seqid-00776、seqid-00790、seqid-00797、seqid-00798、seqid-00799、seqid-00800、seqid-00801、seqid-00802、seqid-00803、seqid-00804、seqid-00805、seqid-00806、seqid-00807、seqid-00808、seqid-00809、seqid-00810、seqid-00811、seqid-00812、seqid-00813、seqid-00814、seqid-00815、seqid-00816、seqid-00817、seqid-00818、seqid-00819、seqid-00820、seqid-00821、seqid-00822、seqid-00823、seqid-00824、seqid-00825、seqid-00826、seqid-00827、seqid-00828、seqid-00829、seqid-00830、seqid-00831、seqid-00832、seqid-00833、seqid-00834、seqid-00835、seqid-00836、seqid-00837。在大肠杆菌rosetta(de3)菌株的可溶性溶解产物中检测的营养性多肽是seqid-00716、seqid-00717、seqid-00718、seqid-00719、seqid-00720、seqid-00721、seqid-00722、seqid-00724、seqid-00725、seqid-00726、seqid-00727、seqid-00728、seqid-00729、seqid-00730、seqid-00731、seqid-00732、seqid-00733、seqid-00734、seqid-00735、seqid-00736、seqid-00737、seqid-00738、seqid-00739、seqid-00740、seqid-00741、seqid-00742、seqid-00743、seqid-00744、seqid-00745、seqid-00746、seqid-00747、seqid-00748、seqid-00749、seqid-00750、seqid-00751、seqid-00752、seqid-00753、seqid-00754、seqid-00755、seqid-00756、seqid-00757、seqid-00758、seqid-00759、seqid-00760、seqid-00761。在大肠杆菌rosetta-gamib(de3)菌株中检测的营养性多肽是seqid-00003、seqid-00004、seqid-00005、seqid-00716、seqid-00718、seqid-00719、seqid-00720、seqid-00729、seqid-00730、seqid-00731、seqid-00732、seqid-00734、seqid-00736、seqid-00740、seqid-00743、seqid-00752、seqid-00760、seqid-00763、seqid-00764、seqid-00776、seqid-00777、seqid-00778、seqid-00779、seqid-00780、seqid-00781、seqid-00782、seqid-00783、seqid-00784、seqid-00785、seqid-00786、seqid-00787、seqid-00788、seqid-00789、seqid-00790、seqid-00791、seqid-00792。在大肠杆菌rosetta-gami2(de3)菌株中检测的营养性多肽是seqid-00716、seqid-00737、seqid-00747、seqid-00763、seqid-00789、seqid-00790、seqid-00793、seqid-00794、seqid-00795、seqid-00796。实施例3.使用注释蛋白质序列数据库来鉴定和选择可食用物种的营养性多肽的氨基酸序列。构建蛋白质数据库。uniprotkb/swiss-prot(欧洲生物信息学研究所和瑞士生物信息学研究所的合作)是手动策划和复查的蛋白质数据库，并且用作构建蛋白质数据库的起始点。为构建可食用物种的蛋白质数据库，对uniprot数据库进行来自如例如2013年3月15日提交的pct/us2013/032232、2013年3月15日提交的pct/us2013/032180、2013年3月15日提交的pct/us2013/032225、2013年3月15日提交的pct/us2013/032218、2013年3月15日提交的pct/us2013/032212以及2013年3月15日提交的pct/us2013/032206中公开的可食用物种的蛋白质的搜索。为鉴定从微生物分泌的蛋白质，搜索uniprot数据库中来自如本文公开的微生物的物种以及用包括分泌、细胞外、细胞壁和外膜的关键词或注解进行注释的蛋白质。为鉴定在人膳食中丰富的蛋白质，从基因组数据库汇编可食用物种的参照蛋白质组。如本文所提供，对从各可食用物种提取的蛋白质进行质谱测定法。将通过质谱测定法鉴定的肽相对于参照蛋白质组来定位，并且将与参照蛋白质序列相关的肽的光谱计数转换成相应蛋白质在食物中的丰度的量度。以高置信度在高于截断光谱计数下检测的所有蛋白质都被汇编至数据库中。这些数据库用于鉴定源于可食用物种，被分泌，和/或在人膳食中丰富的蛋白质。用于选择氨基酸序列的方法。一种用于挑选一种蛋白质或一组蛋白质的方法可包括鉴定一组对有兴趣发现的蛋白质的类别、用以从其进行搜索的蛋白质的数据库进行限定的约束条件，以及进行实际搜索。蛋白质类别准则可通过营养文献(即先前已被鉴定为有效的蛋白质类别)、所需生理化学性状(例如可表达、可溶、非过敏原性、无毒、可消化等)和其它特征来限定。可用于搜索目的的相关蛋白质数据库可由本文公开的序列产生。可被搜索的蛋白质的一个实例是用于肌肉合成代谢/免疫健康/糖尿病治疗的高度可溶性类别的蛋白质。这些蛋白质通常是可溶性表达的，在纯化/分离后高度可溶，非过敏原性的，无毒的，快速消化的，并且满足一定基本营养准则(例如[eaa]>0.3，[bcaa]>0.15，[亮氨酸或谷氨酰胺或精氨酸]>0.08，eaa全面)。使用基于与蛋白质序列的亲水性和疏水性相关的两种参数：溶合评分和聚集评分的二元分类模型来对可表达、可溶性蛋白质进行搜索(对于所述模型的功效的这两种量度和度量的各种描述，参见以下实施例)。或者，可对具有指示每个氨基酸负电荷或正电荷的净过量的较高(或较低)每个氨基酸净电荷的高度带电荷蛋白质进行搜索(对于其它描述，参见以下实施例)。通过基于一级序列计算所有相关氨基酸的质量分数，营养准则得以满足。对于其中需要匹配已知临床有效氨基酸掺合物的情况，可使用加权euclidean距离方法(参见以下实施例)。如本文所提供，使用基于序列的同源性评估来搜索过敏原性/毒性/非过敏原性/抗营养性准则，其中将各候选序列与已知过敏原、毒素、非过敏原或抗营养性(例如蛋白酶抑制性)蛋白质(参见本文实例)的文库进行比较。一般来说，<50％整体或<35％局部(在任何给定80aa窗口内)同源性(同一性百分比)的截断值可用于过敏原性筛选，并且<35％整体可用于毒性和抗营养性筛选。在所有情况下，较小值都暗示过敏原性/毒性/抗营养性较小。非过敏原性筛选通常较少用作截断，但可使用>62％作为截断值(较大值暗示更具非过敏原性)。这些筛选使清单缩减为符合目标准则的一个较小子组的被富化的蛋白质。接着使用多种聚合目标函数对这个清单分级，并且从这个分级排序清单进行选择。实施例4.选择氨基酸序列以说明营养性多肽的氨基酸药理学。鉴定用于治疗肌肉减少症的富含亮氨酸和必需氨基酸的蛋白质。如本文所述，肌肉减少症是骨骼肌质量(通常在25岁之后每年损失0.5-1％)、品质和强度的与衰老相关的退化性损失。肌肉减少症的特征首先在于肌肉萎缩(肌肉尺寸降低)，以及由诸如肌肉纤维被脂肪置换、纤维化增加、肌肉代谢变化、氧化应激和神经肌肉接点退化的因素引起的肌肉组织“品质”降低。这些变化组合在一起导致肌肉功能进行性损失，并且最终导致虚弱。已显示在年长肌肉减少症个体中补充必需氨基酸可对肌肉质量具有合成代谢作用和/或节约作用。此外，这个补充也可转变成患者强度和肌肉品质的改进。参见例如paddon-jonesd等jclinendocrinolmetab2004,89:4351–4358；ferrando,a等clinicalnutrition20091-6；katsanosc等amjphysiolendocrinolmetab.2006,291:381-387。也已显示必需氨基酸亮氨酸是刺激肌肉蛋白质合成的特别重要因素。参见例如borscheime等amjphysiolendocrinolmetab2002,283:e648-e657；borsheime等clinnutr.2008,27:189-95；esmarckb等jphysiol2001,535:301-311；moored等amjclinnutr2009,89:161-8)。可通过选择以质量计富含亮氨酸和其它必需氨基酸的蛋白质来鉴定有益于罹患肌肉减少症的个体的营养性多肽。使用源于如本文所述的可食用物种的所有蛋白质序列的数据库，鉴定富含亮氨酸(≥15质量％)和必需氨基酸(≥40质量％)的候选序列，并且根据它们的相对于总氨基酸质量的总亮氨酸加必需氨基酸质量来分级排序。为增加这些蛋白质可溶性表达以及在ph7下在聚集倾向降低下高度可溶的概率，应用-20kcal/mol/aa和0.5的溶合评分和聚集评分上界。为降低这些蛋白质将引发过敏原性应答的可能性，整体过敏原同源性和过敏原性评分的上界被分别设置为50％和35％。为降低这些蛋白质将在摄取后具有毒性作用的可能性，毒性评分的上界被设置为35％。为降低这些蛋白质将充当消化性蛋白酶的抑制剂的可能性，抗营养性评分的上界被设置为35％。富含亮氨酸(≥15质量％)和必需氨基酸(≥40质量％)，并且满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上提及的截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e4a中。表e4a.seqideaalseqid-035520.560.21seqid-035810.600.15seqid-035320.580.16seqid-034750.560.17seqid-034990.580.15seqid-034940.540.18seqid-034600.540.17seqid-034850.540.16seqid-035130.540.15seqid-034910.520.17来自表达蛋白质数据库的富含亮氨酸(≥15质量％)和必需氨基酸(≥40质量％)的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e4b中。表e4b.seqideaalseqid-001620.640.34seqid-001320.600.32seqid-001660.650.26seqid-001690.600.25seqid-001370.640.20seqid-001340.580.24seqid-001750.630.19seqid-001940.540.26seqid-001930.530.26seqid-001950.520.26实施例5.选择富含必需氨基酸以及在各种个别目标氨基酸方面增浓或降低的营养性多肽的氨基酸序列。使用源于如本文所述的可食用物种的所有蛋白质序列的数据库，鉴定富含必需氨基酸，各氨基酸的量升高或降低的候选序列。为增加这些蛋白质将可溶性表达以及在ph7下在聚集倾向降低下高度可溶的概率，应用-20kcal/mol/aa和0.5的溶合评分和聚集评分上界。为降低这些蛋白质将引发过敏原性应答的可能性，整体过敏原同源性和过敏原性评分的上界被分别设置为50％和35％。为降低这些蛋白质将在摄取后具有毒性作用的可能性，毒性评分的上界被设置为35％。为降低这些蛋白质将充当消化性蛋白酶的抑制剂的可能性，抗营养性评分的上界被设置为35％。当搜索在给定氨基酸方面增浓或降低的蛋白质时，应用上述截断值，并且根据它们的所需氨基酸的计算氨基酸质量分数，接着根据它们的必需氨基酸含量来将蛋白质分级排序。富含丙氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5a中。丙氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5b中。表e5a.seqideaaaseqid-036780.460.18seqid-036820.440.18seqid-036460.460.18seqid-036530.390.16seqid-037170.380.16seqid-036860.410.15seqid-038070.460.15seqid-038640.440.15seqid-036630.350.15seqid-037770.460.14表e5b.seqideaaaseqid-038740.620.00seqid-035520.560.00seqid-038800.520.00seqid-036730.520.00seqid-036670.500.00seqid-036570.500.00seqid-038420.490.00seqid-036230.490.00seqid-038170.480.00seqid-038750.480.00富含精氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5c中。精氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5d中。表e5c.seqideaarseqid-034730.060.72seqid-038550.090.65seqid-037270.100.63seqid-037670.170.62seqid-037040.170.60seqid-034590.100.60seqid-037310.160.48seqid-036980.470.40seqid-036870.370.38seqid-037320.190.38表e5d.富含天冬酰胺，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5e中。天冬酰胺降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5f中。表e5eseqideaanseqid-037230.390.15seqid-037210.390.15seqid-038030.420.15seqid-038010.380.15seqid-037140.400.14seqid-037420.410.14seqid-037240.380.14seqid-038840.420.14seqid-037780.390.13seqid-037460.410.13表e5fseqideaanseqid-038740.620.00seqid-037930.590.00seqid-037890.570.00seqid-038690.570.00seqid-038090.570.00seqid-036620.560.00seqid-038500.550.00seqid-037830.550.00seqid-037530.540.00seqid-036770.530.00富含天冬氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5g中。天冬氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5h中。表e5gseqideaadseqid-036300.330.28seqid-034250.340.26seqid-035640.330.25seqid-035430.340.25seqid-036070.320.24seqid-036210.350.23seqid-036040.370.21seqid-038270.420.20seqid-035400.370.20seqid-036240.390.19表e5hseqideaadseqid-037950.620.00seqid-034680.620.00seqid-036720.620.00seqid-036560.610.00seqid-035170.600.00seqid-034930.600.00seqid-038160.600.00seqid-037960.590.00seqid-038680.590.00seqid-037400.590.00富含半胱氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5i中。半胱氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5j中。表e5iseqideaacseqid-034950.240.30seqid-035140.240.30seqid-035710.240.28seqid-034300.360.27seqid-034190.370.16seqid-034780.290.16seqid-035230.330.16seqid-035040.350.16seqid-034770.280.16seqid-034590.100.16表e5jseqideaacseqid-036360.650.00seqid-034920.630.00seqid-034840.620.00seqid-034420.610.00seqid-034170.610.00seqid-035630.610.00seqid-035120.610.00seqid-035170.600.00seqid-036060.600.00seqid-034930.600.00富含谷氨酰胺，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5k中。谷氨酰胺降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5l中。表e5k表e5lseqideaaqseqid-036360.650.00seqid-037950.620.00seqid-034680.620.00seqid-034840.620.00seqid-035700.590.00seqid-034220.580.00seqid-034320.580.00seqid-035900.580.00seqid-035150.580.00seqid-034990.580.00富含组氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5m中。组氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5n中。表e5mseqideaahseqid-037440.600.25seqid-035510.480.24seqid-037450.560.19seqid-037930.590.19seqid-034680.620.15seqid-037430.380.13seqid-037110.560.12seqid-038470.580.12seqid-036370.430.12seqid-037390.520.12表e5nseqideaahseqid-037950.620.00seqid-038740.620.00seqid-036560.610.00seqid-035170.600.00seqid-034930.600.00seqid-038160.600.00seqid-037960.590.00seqid-037400.590.00seqid-038140.580.00seqid-038370.570.00富含异亮氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5o中。异亮氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5p中。表e5oseqideaaiseqid-037220.400.15seqid-038050.380.15seqid-034350.400.15seqid-038380.420.15seqid-036550.540.15seqid-038280.490.15seqid-035930.390.15seqid-038180.510.15seqid-038410.490.15seqid-038430.480.14表e5p富含亮氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5q中。亮氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5r中。表e5qseqideaalseqid-035520.560.21seqid-034280.490.18seqid-036230.490.18seqid-037020.470.18seqid-037010.490.18seqid-037030.490.18seqid-035990.510.18seqid-034940.540.18seqid-036320.450.18seqid-034230.440.18表e5rseqideaalseqid-036610.530.00seqid-038490.520.00seqid-036440.420.00seqid-038780.390.00seqid-036520.380.00seqid-034190.370.00seqid-036540.360.00seqid-038040.360.00seqid-035040.350.00seqid-034770.280.00富含赖氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5s中。赖氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5t中。表e5sseqideaakseqid-036480.520.36seqid-037970.560.34seqid-038300.520.31seqid-038290.540.30seqid-035810.600.30seqid-035200.360.30seqid-034570.370.30seqid-034710.360.29seqid-038590.530.29seqid-034560.340.29表e5tseqideaakseqid-035830.420.00seqid-036840.400.00seqid-038130.360.00seqid-037710.280.00seqid-038730.260.00seqid-035850.250.00seqid-037040.170.00seqid-037670.170.00seqid-037310.160.00seqid-034590.100.00富含甲硫氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5u中。精氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5v中。表e5useqideaamseqid-005520.450.16seqid-038700.520.15seqid-036800.490.15seqid-038880.390.13seqid-037380.370.13seqid-036980.470.13seqid-035840.530.12seqid-034870.530.11seqid-038580.490.11seqid-037870.460.11表e5vseqideaamseqid-037010.490.00seqid-038610.490.00seqid-037030.490.00seqid-037020.470.00seqid-037730.460.00seqid-037070.450.00seqid-037260.410.00seqid-037250.390.00seqid-037340.390.00seqid-037000.370.00富含苯丙氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5w中。苯丙氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5x中。表e5w表e5xseqideaafseqid-035810.600.00seqid-034410.570.00seqid-036850.570.00seqid-035730.550.00seqid-036610.530.00seqid-038590.530.00seqid-036880.530.00seqid-036750.530.00seqid-036090.530.00seqid-035840.530.00富含脯氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5y中。脯氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5z中。表e5yseqideaapseqid-038000.330.16seqid-037560.320.14seqid-038390.350.14seqid-038100.330.13seqid-038880.390.13seqid-038450.410.13seqid-038340.390.13seqid-036580.350.13seqid-038560.440.12seqid-037990.370.12表e5zseqideaapseqid-036360.650.00seqid-034680.620.00seqid-037900.570.00seqid-034860.570.00seqid-036650.560.00seqid-038330.560.00seqid-035880.560.00seqid-038080.560.00seqid-037190.560.00seqid-038150.550.00富含丝氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5aa中。丝氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5ab中。表e5aaseqideaasseqid-037470.450.16seqid-038630.270.15seqid-037370.320.15seqid-037590.400.15seqid-038820.390.15seqid-037480.410.14seqid-037920.410.14seqid-038440.370.14seqid-037510.470.14seqid-038220.450.14表e5ab富含苏氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5ac中。苏氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5ad中。表e5acseqideaatseqid-037180.420.16seqid-037770.460.14seqid-037130.420.12seqid-038710.440.12seqid-038670.550.12seqid-038190.480.12seqid-038200.410.11seqid-036530.390.11seqid-037170.380.11seqid-038770.450.11表e5adseqideaatseqid-037440.600.00seqid-037450.560.00seqid-036610.530.00seqid-038300.520.00seqid-038490.520.00seqid-038870.510.00seqid-038860.500.00seqid-036700.480.00seqid-035510.480.00seqid-037800.470.00富含色氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5ae中。色氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5af中。表e5aeseqideaawseqid-035830.420.15seqid-036350.400.13seqid-035550.500.11seqid-036790.480.09seqid-034400.440.09seqid-034390.450.09seqid-034680.620.08seqid-015460.510.08seqid-035760.420.08seqid-038210.440.08表e5afseqideaawseqid-036720.620.00seqid-035120.610.00seqid-036060.600.00seqid-037440.600.00seqid-035810.600.00seqid-038680.590.00seqid-037620.590.00seqid-038570.590.00seqid-037930.590.00seqid-037690.590.00富含酪氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5ag中。酪氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5ah中。表e5agseqideaayseqid-038480.320.16seqid-038310.560.15seqid-038760.260.15seqid-003250.420.14seqid-037940.430.14seqid-038260.380.14seqid-036590.460.14seqid-037860.350.14seqid-037840.380.14seqid-038230.390.14表e5ahseqideaayseqid-034680.620.00seqid-034420.610.00seqid-034170.610.00seqid-035630.610.00seqid-036060.600.00seqid-034690.600.00seqid-034430.600.00seqid-035810.600.00seqid-037960.590.00seqid-037620.590.00富含缬氨酸，满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5ai中。缬氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5aj中。表e5ai表e5ajseqideaavseqid-038790.560.00seqid-035520.560.00seqid-038350.540.00seqid-038510.530.00seqid-037570.530.00seqid-036480.520.00seqid-037660.500.00seqid-037100.460.00seqid-037640.460.00seqid-005520.450.00选择富含必需氨基酸以及在各种个别氨基酸方面增浓或降低的表达蛋白质。使用本文所述的所有表达蛋白质序列的数据库，鉴定富含必需氨基酸，各氨基酸的量升高或降低的候选序列。当搜索在给定氨基酸方面增浓或降低的蛋白质时，根据它们的所需氨基酸的计算氨基酸质量分数，接着根据它们的必需氨基酸含量来将蛋白质分级排序。富含丙氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5ak中。丙氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5al中。表e5ak表e5alseqideaaaseqid-001400.700.00seqid-000570.410.00seqid-006520.280.00seqid-001990.520.00seqid-001980.530.00seqid-001970.520.00seqid-001960.530.00seqid-007220.530.01seqid-002040.510.01seqid-002030.510.01富含精氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5am中。精氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5an中。表e5amseqideaarseqid-005400.410.23seqid-005670.420.22seqid-006360.470.22seqid-005560.330.22seqid-006370.420.22seqid-005750.330.22seqid-004920.420.21seqid-006310.380.21seqid-005510.410.21seqid-003280.450.20表e5an富含天冬酰胺的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5ao中。天冬酰胺降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5ap中。表e5aoseqideaanseqid-001950.520.14seqid-001940.540.14seqid-001930.530.12seqid-038720.470.12seqid-013880.360.12seqid-005520.450.12seqid-001690.600.11seqid-001960.530.10seqid-001970.520.10seqid-036930.340.10表e5apseqideaanseqid-005360.580.00seqid-002840.540.00seqid-002120.510.00seqid-001010.510.00seqid-002190.500.00seqid-006340.500.00seqid-006240.490.00seqid-006390.460.00seqid-005970.450.00seqid-005270.400.00富含天冬氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5aq中。天冬氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5ar中。表e5aqseqideaadseqid-005620.400.19seqid-038530.340.17seqid-001160.320.16seqid-001020.450.16seqid-001150.320.16seqid-004840.380.16seqid-001000.460.15seqid-002200.520.15seqid-000980.500.15seqid-000780.460.14表e5arseqideaadseqid-001660.650.00seqid-000510.590.00seqid-000520.590.00seqid-000530.570.00seqid-000540.550.00seqid-000550.550.00seqid-005230.510.00seqid-006350.460.00seqid-002300.450.00seqid-006370.420.00富含半胱氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5as中。半胱氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5at中。表e5as表e5atseqideaacseqid-001660.650.00seqid-001370.640.00seqid-005250.640.00seqid-001620.640.00seqid-032970.620.00seqid-001690.600.00seqid-001320.600.00seqid-002980.590.00seqid-005360.580.00seqid-002970.580.00富含谷氨酰胺的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5au中。谷氨酰胺降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5av中。表e5au表e5avseqideaaqseqid-001430.650.00seqid-001370.640.00seqid-005250.640.00seqid-001340.580.00seqid-001940.540.00seqid-001930.530.00seqid-001950.520.00seqid-006500.500.00seqid-005630.500.00seqid-005980.490.00富含组氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5aw中。组氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5ax中。表e5awseqideaahseqid-005360.580.23seqid-005600.550.18seqid-011620.480.12seqid-005850.440.10seqid-002980.590.10seqid-006150.400.10seqid-005250.640.10seqid-002970.580.10seqid-007640.560.09seqid-001280.530.08表e5ax富含异亮氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5ay中。异亮氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5az中。表e5ayseqideaaiseqid-005610.680.18seqid-001340.580.14seqid-001750.630.14seqid-001620.640.14seqid-002340.510.13seqid-002330.520.13seqid-001690.600.13seqid-000250.480.13seqid-000430.570.12seqid-005840.500.12表e5azseqideaaiseqid-007620.560.00seqid-007640.560.00seqid-005710.540.00seqid-002120.510.00seqid-002370.480.00seqid-002360.450.00seqid-005510.410.00seqid-005150.250.01seqid-001280.530.01seqid-006510.390.01富含亮氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5ba中。亮氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5bb中。表e5baseqideaalseqid-001620.640.34seqid-001320.600.32seqid-001950.520.26seqid-001940.540.26seqid-001930.530.26seqid-001660.650.26seqid-001690.600.25seqid-001340.580.24seqid-002120.510.23seqid-001390.490.23表e5bbseqideaalseqid-005530.390.00seqid-007430.290.00seqid-005220.400.01seqid-005540.380.01seqid-005850.440.01seqid-005600.550.01seqid-005290.380.01seqid-005520.450.01seqid-005470.490.01seqid-005750.330.01富含赖氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5bc中。赖氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5bd中。表e5bc表e5bdseqideaakseqid-001660.650.00seqid-001750.630.00seqid-001690.600.00seqid-001340.580.00seqid-005350.300.00seqid-005130.330.01seqid-026750.500.01seqid-004900.580.01seqid-005120.440.01seqid-005000.400.01富含甲硫氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5be中。精氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5bf中。表e5beseqideaamseqid-005520.450.16seqid-005130.330.13seqid-005290.380.09seqid-005260.410.09seqid-008680.480.09seqid-005950.440.09seqid-005840.500.09seqid-004860.560.09seqid-000920.420.08seqid-000740.420.08表e5bf富含苯丙氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5bg中。苯丙氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5bh中。表e5bgseqideaafseqid-001500.670.13seqid-005950.440.13seqid-005610.680.13seqid-001180.510.12seqid-005970.450.12seqid-005070.510.12seqid-005940.440.12seqid-005010.500.12seqid-001750.630.11seqid-004850.460.11表e5bhseqideaafseqid-001620.640.00seqid-005600.550.00seqid-002240.530.00seqid-002200.520.00seqid-001950.520.00seqid-002410.520.00seqid-002150.510.00seqid-002130.510.00seqid-002140.510.00seqid-002120.510.00富含脯氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5bi中。脯氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5bj中。表e5biseqideaapseqid-007430.290.28seqid-005530.390.24seqid-036410.240.20seqid-034440.230.16seqid-001690.600.14seqid-000050.480.14seqid-008050.500.13seqid-007370.280.13seqid-034510.400.11seqid-034470.300.10表e5bjseqideaapseqid-001500.670.00seqid-001370.640.00seqid-002870.590.00seqid-005480.590.00seqid-001420.560.00seqid-005600.550.00seqid-002240.530.00seqid-002200.520.00seqid-002410.520.00seqid-002160.520.00富含丝氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5bk中。丝氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5bl中。表e5bk表e5blseqideaasseqid-001750.630.00seqid-000510.590.00seqid-000520.590.00seqid-005360.580.00seqid-000430.570.00seqid-000530.570.00seqid-006430.570.00seqid-000550.550.00seqid-000540.550.00seqid-001120.500.00富含苏氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5bm中。苏氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5bn中。表e5bmseqideaatseqid-004040.490.14seqid-005470.490.13seqid-005220.400.13seqid-005690.560.13seqid-005280.530.11seqid-005040.470.11seqid-037680.420.11seqid-005230.510.11seqid-036490.490.11seqid-001160.320.11表e5bnseqideaatseqid-005600.550.00seqid-000570.410.00seqid-005420.410.00seqid-000590.410.00seqid-000150.300.00seqid-000140.300.00seqid-000130.280.00seqid-000070.280.00seqid-000070.280.00seqid-006210.390.01富含色氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5bm中。色氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5bn中。表e5bmseqideaawseqid-015460.510.08seqid-006420.450.08seqid-036900.430.08seqid-037760.430.08seqid-032970.620.07seqid-032440.460.07seqid-005120.440.07seqid-008140.420.07seqid-001100.490.06seqid-031370.500.06表e5bn富含酪氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5bo中。酪氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5bp中。表e5boseqideaayseqid-000130.280.16seqid-000070.280.15seqid-000070.280.15seqid-000150.300.14seqid-003250.420.14seqid-000140.300.13seqid-005130.330.12seqid-036890.410.11seqid-005210.410.11seqid-006400.470.11表e5bpseqideaayseqid-001400.700.00seqid-001460.670.00seqid-000510.590.00seqid-000520.590.00seqid-005480.590.00seqid-001340.580.00seqid-000430.570.00seqid-000530.570.00seqid-000540.550.00seqid-000550.550.00富含缬氨酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e5bq中。缬氨酸降低的前10名营养性多肽序列显示于表e5br中。表e5bq表e5brseqideaavseqid-002390.480.00seqid-005520.450.00seqid-002400.450.00seqid-006150.400.00seqid-006520.280.00seqid-005150.250.01seqid-005220.400.01seqid-005600.550.01seqid-006450.560.01seqid-006470.420.01实施例6.选择用以提供蛋白质营养以及用于治疗蛋白质营养不良的富含必需氨基酸的营养性多肽的氨基酸序列。已显示人不能内源性合成20种天然存在的氨基酸中的9种：组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、赖氨酸和色氨酸(young,v.r.和tharakan,j.f.nutritionalessentialityofaminoacidsandaminoacidrequirementsinhealthyadults.metabolicandtherapeuticaspectsofaminoacidsinclinicalnutrition.第2版.cynober,l.a.编；crcpress:newyork,2004；第439-470页)。因此，需要摄取足量的这9种必需氨基酸以避免蛋白质营养不良和由这个状态所致的有害健康影响。通过选择以质量计富含必需氨基酸，并且含有非零量的各必需氨基酸(即营养性多肽序列是必需氨基酸全面的)的营养性多肽来鉴定适用于在健康或营养失调个体中满足这些必需氨基酸需求的营养性多肽。使用源于如本文所述的可食用物种的所有蛋白质序列的数据库，鉴定是必需氨基酸全面的，并且富含必需氨基酸的候选序列。为增加这些蛋白质可溶性表达以及在ph7下在聚集倾向降低下高度可溶的概率，应用-20kcal/mol/aa和0.5的溶合评分和聚集评分上界。为降低这些蛋白质将引发过敏原性应答的可能性，整体过敏原同源性和过敏原性评分的上界被分别设置为50％和35％。为降低这些蛋白质将在摄取后具有毒性作用的可能性，毒性评分的上界被设置为35％。为降低这些蛋白质将充当消化性蛋白酶的抑制剂的可能性，抗营养性评分的上界被设置为35％。是必需氨基酸全面的，富含必需氨基酸，并且满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上提及的截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e6a中。表e6aseqideaaceaaseqid-0363610.65seqid-0349210.63seqid-0346810.62seqid-0354410.62seqid-0348410.62seqid-0344210.61seqid-0341710.61seqid-0356310.61seqid-0346910.60seqid-0344310.60来自表达蛋白质数据库的是必需氨基酸全面的，并且富含必需氨基酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e6b中。表e6bseqideaaceaaseqid-0014010.70seqid-0056110.68seqid-0014610.67seqid-0015010.67seqid-0014310.65seqid-0329710.62seqid-0048710.61seqid-0028710.59seqid-0029810.59seqid-0054810.59实施例7.选择用于达成肌肉健康的富含支链氨基酸的营养性多肽的氨基酸序列，以及选择用于治疗糖尿病、心血管疾病、慢性肾病和中风，支链氨基酸降低的营养性多肽的氨基酸序列。鉴定用于治疗肝病和/或肾病的富含支链氨基酸的蛋白质。使用源于如本文所述的可食用物种的所有蛋白质序列的数据库，鉴定在支链氨基酸方面增浓或降低的候选序列。为增加这些蛋白质可溶性表达以及在ph7下在聚集倾向降低下高度可溶的概率，应用-20kcal/mol/aa和0.5的溶合评分和聚集评分上界。为降低这些蛋白质将引发过敏原性应答的可能性，整体过敏原同源性和过敏原性评分的上界被分别设置为50％和35％。为降低这些蛋白质将在摄取后具有毒性作用的可能性，毒性评分的上界被设置为35％。为降低这些蛋白质将充当消化性蛋白酶的抑制剂的可能性，抗营养性评分的上界被设置为35％。富含支链氨基酸，并且满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上提及的截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e7a中。表e7a来自表达蛋白质数据库的富含支链氨基酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e7b中。表e7bseqideaabcaaseqid-001620.640.53seqid-001660.650.46seqid-001340.580.46seqid-001690.600.43seqid-000430.570.41seqid-001320.600.41seqid-001370.640.39seqid-001750.630.38seqid-005500.490.38seqid-002340.510.37支链氨基酸降低，并且满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上提及的截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e7c中。表e7c来自表达蛋白质数据库，支链氨基酸降低的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e7d中。表e7dseqideaabcaaseqid-005520.450.03seqid-005220.400.03seqid-005150.250.05seqid-005530.390.05seqid-005850.440.06seqid-006370.420.07seqid-006520.280.08seqid-006150.400.08seqid-007430.290.08seqid-005470.490.09实施例8.选择用于治疗或预防苯丙酮酸尿症的具有较低或不具有苯丙氨酸，并且富含酪氨酸和所有其它必需氨基酸的营养性多肽的氨基酸序列。常由于肝酶苯丙氨酸羟化酶功能失常，罹患苯丙酮酸尿症(pku)的个体不能处理氨基酸苯丙氨酸并催化它转化成酪氨酸(macleode.l.和neyd.m.nutritionalmanagementofphenylketonuria.annalesnestle.(2010)68:58-69)。在这些个体中，当含有氨基酸苯丙氨酸的蛋白质被摄取时，苯丙氨酸积累在血液中。未治疗的pku具有严重不利健康影响，包括学习表现受损、执行功能受损以及长期智力失能(matalon,r.,michals-matalon,k.,bhatia,g.,grechanina,e.,novikov,p.,mcdonald,j.d.,grady,j.,tyring,s.k.,guttler,f.largeneutralaminoacidsinthetreatmentofphenylketonuria.j.inherit.metab.dis.(2006)29:732-738)。一种可保持苯丙氨酸血液水平较低以避免神经影响的方式在于避免摄取含有苯丙氨酸的蛋白质和/或仅消耗苯丙氨酸较低的蛋白质来源。因为也必须满足所有其它氨基酸的基本蛋白质营养需求，所以需要充足摄取其它必需氨基酸(组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、赖氨酸和色氨酸)和在这些个体中变为条件性必需的酪氨酸。可通过选择含有较低或不含有苯丙氨酸，并且以质量计富含酪氨酸和其它必需氨基酸的蛋白质来鉴定有益于罹患苯丙酮酸尿症的个体的营养性多肽。使用源于如本文所述的可食用物种的所有蛋白质序列的数据库，鉴定以质量计含有较低或不含有苯丙氨酸，是必需氨基酸和酪氨酸全面的(除苯丙氨酸之外)，并且富含酪氨酸和必需氨基酸的候选序列，并且首先根据它们的苯丙氨酸质量分数，接着根据它们的总酪氨酸加必需氨基酸质量分数来分级排序。为增加这些蛋白质可溶性表达以及在ph7下在聚集倾向降低下高度可溶的概率，应用-20kcal/mol/aa和0.5的溶合评分和聚集评分上界。为降低这些蛋白质将引发过敏原性应答的可能性，整体过敏原同源性和过敏原性评分的上界被分别设置为50％和35％。为降低这些蛋白质将在摄取后具有毒性作用的可能性，毒性评分的上界被设置为35％。为降低这些蛋白质将充当消化性蛋白酶的抑制剂的可能性，抗营养性评分的上界被设置为35％。以质量计含有较低或不含有苯丙氨酸，是必需氨基酸和酪氨酸全面的(除苯丙氨酸之外)，富含酪氨酸和必需氨基酸，并且满足溶合评分、聚集评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上提及的截断值的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e8a中。表e8a来自表达蛋白质数据库的以质量计含有较低或不含有苯丙氨酸，是必需氨基酸和酪氨酸全面的(除苯丙氨酸之外)，并且富含酪氨酸和必需氨基酸的前10名营养性多肽序列的示例性清单显示于表e8b中。表e8bseqideaafyseqid-006340.500.000.05seqid-005140.460.010.01seqid-003290.470.010.03seqid-006280.510.010.02seqid-006360.470.010.04seqid-036340.450.010.04seqid-003350.380.010.07seqid-006390.460.010.06seqid-034480.400.010.03seqid-038890.420.020.01实施例9.选择含有天然存在的蛋白质序列的片段或区域的营养性多肽的氨基酸序列：富含亮氨酸和所有必需氨基酸的营养性多肽片段。在一些情况下，鉴于一种或多种由一种或多种重要参数限定的选择要求，从本文所述的数据库鉴定的全长蛋白质并非特别有利，或另外以质量计，相对于营养性多肽的总质量，不提供足够一种或多种特定氨基酸。在这些情况下，在数据库中鉴定的营养性多肽的一个或多个片段(在本文中也称为“区域”)能够满足所需搜索准则。通过获取数据库中各全长序列以及考查其中含有的长度是至少25个氨基酸的所有可能的子序列来产生和搜索含有营养性多肽的可能片段的数据库。举例来说，需要的是发现亮氨酸质量分数大于约0.2，并且高度带电荷以增加可溶性表达的可能性的营养性多肽序列。使用溶合评分截断值小于-30搜索本文所述的蛋白质可食用物种数据库，并且为降低这些蛋白质将引发过敏原性应答的可能性，整体过敏原同源性和过敏原性评分的上界被设置为50％。为降低这些蛋白质将在摄取后具有毒性作用的可能性，毒性评分的上界被设置为35％。为降低这些蛋白质将充当消化性蛋白酶的抑制剂的可能性，抗营养性评分的上界被设置为35％。富含亮氨酸(≥20质量％)，并且满足溶合评分、整体过敏原同源性、过敏原性评分、毒性评分和抗营养性评分的以上提及的截断值的前10名营养性多肽片段的示例性清单显示于表e9a中。表e9adbideaalp587970.470.26a7a1v10.490.24p044670.560.23q9awa50.450.22q2nl140.520.22q60cz80.420.22q10mn80.320.22p502750.470.22q2yde50.450.22q0p5b40.510.22来自表达蛋白质数据库的富含亮氨酸(≥20质量％)的前10名营养性多肽片段的示例性清单显示于表e9b中。表e9b实施例10.营养性多肽的纯化。各种纯化方法已用于从诸如原料食物、细胞、盐、小分子、宿主细胞蛋白质和脂质的其它物质分离营养性多肽或使营养性多肽分离以离开所述其它物质。这些方法包括透滤、沉淀、絮凝、水性两相提取和色谱法。通过抗flag亲和色谱法纯化。抗flag纯化提供一种用以从低滴度表达系统或从类似带电荷的宿主细胞蛋白质纯化营养性多肽的方法。营养性多肽被工程改造来含有附接于蛋白质的c末端的单一flag标签(dykddddk)或三重串联flag标签(dykddddkdykddddkdykddddk)。抗flag亲和纯化提供一种单步纯化方法，其提供非变性工艺条件和洗脱纯度>95％(einhauer等,2001journalofbiochemicalandbiophysicalmethods)。使用抗flagm2亲和琼脂糖凝胶(sigmaaldrich,st.louis,mo)纯化营养性多肽。m2亲和树脂被特定设计来与c末端flag表位一起使用。对于n末端附接的flag表位的纯化，使用m1亲和琼脂糖凝胶。m2亲和琼脂糖凝胶(树脂)具有每ml树脂约0.5mg营养性多肽的宣传静态结合容量(sbc)。使用20-40ml抗flag树脂从黑曲霉分泌培养基和枯草芽孢杆菌分泌培养基进行营养性多肽纯化。在纯化之前，调整分泌培养基以获得150mmnacl和ph7.4。通过用过量1xtris缓冲盐水(tbs)(ph7.4±0.1)冲洗介质，以及通过0.2um聚醚砜(pes)真空过滤器收集它来平衡树脂。接着以批式模式使平衡的树脂与分泌培养基混合，并且使其在室温下混合1小时。通过使整个混合物穿过0.2umpes真空过滤器来从树脂移除未结合物质。树脂被物理收集于过滤器的表面上，并且随后用20树脂体积的tbs(ph7.4±0.1)洗涤以进一步通过0.2umpes真空过滤器移除未结合物质。将洗涤的树脂转移至滴柱(各自10ml)中，并且结合的多肽用2柱体积(cv)的0.1m甘氨酸(ph3.0)洗脱。使洗脱的多肽从滴柱直接流入含有1mtris(ph8.0)的锥形管中；这个策略用于尽快中和洗脱的多肽溶液的ph。使用额外3cv的0.1m甘氨酸(ph3.0)再生树脂。对于短期储存，将树脂在4℃下储存在1xtbs(ph7.4)中；对于长期储存，将树脂在-20℃下储存在0.5xtbs(ph7.4)、50％甘油中。对来自枯草芽孢杆菌的seqid-00105的示例性抗flag纯化产生于4.3ml洗脱物中的4.0mg蛋白质。将样品在3种不同稀释度下装载于聚丙烯酰胺凝胶上以增加灵敏性，并且得知seqid-00105的纯度是95％。根据相同程序对来自黑曲霉的seqid-00298进行示例性抗flag纯化。如所述中和洗脱份，并且通过如本文所述的sds-page和bradford测定来分析。得知洗脱中的主带的纯度是95％。将洗脱中的主带与同一凝胶上的mw阶梯进行比较，并且匹配seqid-00298的预期分子量。40ml抗flag树脂捕集了4.0mg物质，从而产生0.10mg/ml的估计树脂容量。通过5ml固定金属亲和色谱法(imac)纯化。以振荡烧瓶发酵方式使大肠杆菌生长，其中如本文所述靶向表达具有his8标签的个别营养性多肽。通过吊桶离心来从各振荡烧瓶收集细胞。丢弃上清液，并且将细胞在细胞湿重(wcw)浓度20％w/v下混悬于30mm咪唑、50mm磷酸钠、0.5mnacl(ph7.5)中。接着在20,000psi下2次穿过m110-p微射流机(microfluidics,westwood,ma)，通过87um相互作用腔室来使混悬的细胞溶解。在15,000相对离心力(rcf)下使溶解的细胞离心120分钟，接着倾析。丢弃细胞碎片，并且使上清液进行0.2um过滤。这些过滤的蛋白质溶液接着通过固定金属亲和色谱法(imac)在explorer100fplc(gehealthcare,piscataway,nj)上纯化。经5ml(1.6cm直径x2.5cm高度)imac琼脂糖6速流柱(gehealthcare,piscataway,nj)纯化营养性多肽。使用0.2niso4将imac树脂(gehealthcare,imac琼脂糖6速流)装以镍，并且用500mmnacl、200mm咪唑(ph7.5)洗涤，随后于30mm咪唑、50mm磷酸钠、0.5mnacl(ph7.5)中平衡。将50ml各蛋白质装载溶液施加于5mlimac柱上，并且再用另外的平衡溶液洗涤以移除未结合杂质。目标蛋白质接着用15mlimac洗脱溶液(0.25m咪唑、0.5mnacl，ph7.5)洗脱。所有柱阻断都在线性流速150cm/h下进行。通过透析来使各imac洗脱份进行缓冲液交换以进入中性ph配制溶液中。通过毛细管电泳和/或sds-page来分析纯化的蛋白质的浓度和纯度。也如本文所述通过bradford和a280测量来测试浓度。表e9a说明通过imac在5ml规模下纯化的营养性多肽的清单。表e9a.通过imac在5ml下纯化的营养性多肽通过1l固定金属亲和色谱法(imac)纯化。以20l发酵方式使大肠杆菌生长，其中如本文所述靶向表达具有his8标签的个别营养性多肽。从发酵罐收集细胞，并且使用sharplesas-16p离心机离心以收集湿细胞团块。随后将细胞在细胞湿重(wcw)浓度20％w/v下再混悬于30mm咪唑、50mm磷酸钠、0.5mnacl(ph7.5)中。接着利用在操作压力12,500–15,000psi和流速1l/min下4次穿过nirosoavi均质器(nirosoavi,parma,italy)来使细胞混悬物溶解。使用beckmanj2-hc吊桶离心机(beckman-coulter,brea,ca)在13,700xg下使溶解产物澄清1小时。丢弃细胞碎片，并且上清液经sartoporeiixlg0.8/0.2um过滤器(sartoriusstedim,bohemia,ny)在30l/m2/h下过滤。使用填充在0.9l柱(9cm直径x13.8cm高度)中的imac琼脂糖6速流树脂，通过imac纯化过滤的溶解产物。如本文所述在线性流速300cm/h下平衡imac树脂。一旦平衡，使过滤的溶解产物的整体在线性流速150cm/h下穿过管柱。装载体积在6至10柱体积的范围内。在装载之后，从管柱洗除未结合物质，并且洗脱靶标蛋白质。在室温、4℃或冷冻下运送洗脱汇合物。这个决定取决于营养性多肽在洗脱溶液中的稳定性。表e9b概述已通过imac在1l柱规模下纯化的许多营养性多肽。表e9b.已通过imac在1l规模下纯化的营养性多肽seqidimac洗脱质量imac洗脱纯度002409.00克98％0033843.5克100％0034154.3克100％0035219.8克100％0055919.5克89％005878.6克69％营养性多肽经sartoporeiixlg0.8/0.2μm过滤器过滤，并且直接装载至超滤/透滤(uf/df)单元操作中。酌情选择各营养性多肽的膜面积和标称分子量截断值。在交叉流量12l/m2/min和tmp目标25psi下使营养性多肽进行超滤。在hydrosart超滤盒(sartoriusstedim,bohemia,ny)上使营养性多肽浓缩约10倍，并且透滤7透析体积至营养性多肽特异性的配制缓冲液中。丢弃超滤渗透物。收集透滤的浓缩滞留物，经0.22um膜过滤器过滤，并且冷冻在-80℃下。在一些情况下，使用labconco冻干器(labconco,kansascity,mo)使冷冻蛋白质浓缩物冻干。使用karlfisher方法分析饼块的残余水含量。通过10l固定金属亲和色谱法(imac)纯化。以250l发酵方式使大肠杆菌生长，其中如本文所述靶向表达具有his8标签的个别营养性多肽。从250l发酵罐收集细胞，并且使用sharplesas-16p离心机离心以收集湿细胞团块。随后将细胞在wcw浓度20％w/v下再混悬于30mm咪唑、50mm磷酸钠、0.5mnacl(ph7.5)中。接着利用在操作压力12,500–15,000psi和流速1l/min下4次穿过nirosoavi均质器(nirosoavi,parma,italy)来使细胞混悬物溶解。利用在15,000rpm下4次穿过在0.5l/min下操作的sharplesas-16p离心机来产生澄清溶解产物。丢弃细胞碎片，并且上清液经一系列过滤器过滤。使澄清溶解产物依序穿过sartopuregf+0.65um、sartoguardpes1.2/0.2um和sartoporeiixlg0.8/0.2um过滤器(sartoriusstedim,bohemia,ny)。使用填充在8.5柱(20cm直径x27.1cm高度)中的imac琼脂糖6速流树脂，通过imac纯化过滤的溶解产物。如所述在线性流速150cm/h下平衡imac树脂。一旦平衡，使过滤的溶解产物在线性流速150cm/h下穿过管柱。装载体积在3.8至5.0cv的范围内。在装载之后，以再次平衡来从管柱洗除未结合物质。使在10limac规模下制造的营养性多肽经受用2cv的10mm磷酸氢二钠、300mmnacl；3cv的0.5％w/v脱氧胆酸钠、50mm磷酸氢二钠、300mmnacl；以及5cv的10mm磷酸氢二钠、300mmnacl进行的另一组洗涤。在洗涤之后，如所述洗脱靶标多肽。在室温下储存洗脱汇合物。通过imac色谱法在10l柱规模下纯化多种营养性多肽。表e9c概述seqid-00105和seqid-00338的纯化。图1提供对seqid-00105的纯化的示例性sds-page分析。表e9c.通过imac色谱法在10l柱规模下纯化营养性多肽seqid质量纯度00105179g98％00105265g98％00105131g91％00105147g92％00105164g94％00105148g95％00105229g100％00105228g100％00338137g92％00338196g100％00338169g100％在10l柱规模下进行imac纯化之后，营养性多肽经sartoporeiixlg0.8/0.2um过滤器过滤，并且直接装载至超滤/透滤(uf/df)单元操作中。酌情选择各营养性多肽的膜面积和标称分子量截断值。在交叉流量12l/m2/min和tmp目标25psi下使营养性多肽进行超滤。在hydrosart超滤盒(sartoriusstedim,bohemia,ny)上使营养性多肽浓缩约10倍，并且依序透滤至4透析体积的10％磷酸盐缓冲盐水(pbs)(ph8.7)；随后2透析体积的25mm乙二胺四乙酸四钠(na4edta)；随后7透析体积的10％pbs(ph8.7)中。进行向na4edta中的中间透滤以从imac树脂螯合任何浸沥的镍(ii)。丢弃超滤渗透物；透滤的浓缩滞留物经0.2um膜过滤器过滤，并且冷冻在-80℃下。以降低生物负荷为目标，用灭菌级过滤器过滤超滤汇合物。将营养性多肽过滤入用乙醇冲洗的玻璃托盘中。随后将填充的玻璃托盘冷冻在-80℃下。接着使用labconco冻干装置(labconco,kansascity,mo)使冷冻物质冻干成干燥饼块。随时间监测托盘中的蛋白质的质量，直至它到达平稳状态，此被视为完全干燥。用托盘的盖板来密封干燥的蛋白质饼块，并且通过真空密封来过度包装在塑料袋中。将整个包装储存在-80℃下。离子交换色谱法。选择纯化营养性多肽的适当方法牵涉于工艺开发速度、制造成本、最终纯度和纯化强力性。已通过各种色谱方法来分离营养性多肽。选择以供使用的色谱模式取决于靶标营养性多肽的物理化学性质。带电荷的营养性多肽通过静电相互作用结合离子交换色谱树脂。在本申请中，我们已确定两种筛选多肽的文库以关于它们结合离子交换树脂的能力来将它们分级排序的方法。一种方法是如本文所述，基于使用多肽的一级序列，跨越一定范围的ph计算蛋白质净电荷的电子预测。第二方法是如本文所述的体外多路纯化筛选。两种方法已独立于彼此被成功使用，并且它们已一起用于如本文所述的同一组具有支持性数据的168种营养性多肽。电子预测性离子交换纯化分级方法基于根据一级序列在一定ph范围下计算营养性多肽的净电荷。营养性多肽的一级序列用于预测最可能从宿主细胞蛋白质和其它杂质成功分离那个营养性多肽的色谱模式。高度带电荷的营养性多肽可能紧密结合离子交换色谱树脂。具有一种主要电荷(正电荷或负电荷)的营养性多肽实现的结合最紧密。具有正电荷和负电荷的混合物的营养性多肽有可能紧密结合离子交换树脂，但也可能的是那些电荷可彼此相反地起作用。类似地，在它的表面上具有交替正性片块和负性片块的营养性多肽可不与它的表面的占优部分带一种单一电荷的营养性多肽同样紧密结合。类似地，具有强烈正性或负性末端、尾部、标签或接头序列的营养性多肽可有效显示那个高度带电荷的基团，从而允许极其紧密结合。一种或多种某些氨基酸，例如组氨酸、精氨酸和赖氨酸在多肽中盛行会在蛋白质溶剂的ph低于一种或多种氨基酸的pka时，在那个多肽或其一部分中赋予正电荷。多肽电荷包括总蛋白质电荷、净电荷或多肽的一部分的电荷。在其中多肽或其部分带正电荷的实施方案中，使用阳离子交换树脂。一种或多种某些氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸在多肽中盛行会在蛋白质溶剂的ph高于一种或多种氨基酸的pka时，在那个多肽或其一部分中赋予负电荷。多肽电荷包括总蛋白质电荷、净电荷或多肽的一部分的电荷。在其中多肽或其部分带负电荷的实施方案中，使用阴离子交换树脂。多肽的净电荷随蛋白质溶剂的ph而变。可基于多肽的一级序列计算任何ph下的正电荷和负电荷的数目。在任一ph下正电荷和负电荷的总和产生计算净电荷。多肽的等电点(pi)是它的计算净电荷是0所处的ph。为进行比较，通过序列中的氨基酸的数目来使序列的净电荷标准化，并且参数“每个氨基酸净电荷”作为序列之间的新型比较参数而产生，其用于预测色谱性能。已通过计算各多肽在每一ph(1-14)下的每个氨基酸净电荷来评估营养性多肽序列。另外，计算各多肽的pi。根据pi以及根据每个氨基酸净电荷来将营养性多肽分级。预测具有低pi和跨越广泛范围的ph极其负性每个氨基酸净电荷的多肽以高亲和力结合阴离子交换色谱树脂。预测具有高pi和跨越广泛范围的ph极其正性每个氨基酸净电荷的多肽以高亲和力结合阳离子交换色谱树脂。在本文一些实施方案中，仅一部分多肽带电荷(如末端、尾部、标签或接头中)，应认识到pi和净多肽电荷可为可变的，并且其它因素或经验测量可适用于预测这种多肽对色谱树脂的结合亲和力。图2说明基于一级序列被预测结合阴离子或阳离子交换树脂的示例性营养性多肽。预测具有pi<4.0和跨越广泛范围的ph负性每个氨基酸净电荷的营养性多肽以高亲和力结合阴离子交换树脂((1)seqid-00105，(2)seqid-00008，(3)seqid-00009，(4)seqid-00475)。预测具有pi>10.0和跨越广泛范围的ph正性每个氨基酸净电荷的营养性多肽以高亲和力结合阳离子交换树脂((5)seqid-00472，(6)seqid-00640，(7)seqid-00019)。本文呈现的一级序列分析指示seqid-00105和seqid-00009可能以高亲和力结合阴离子交换色谱树脂，并且seqid-00640可能以高亲和力结合阳离子交换色谱树脂。这些预测被测试和证明是真实的，如在微生物细胞培养之后进行的以下4个多肽纯化实例中所证明。在第一实例中，使用阴离子交换色谱法，从溶解的大肠杆菌细胞直接纯化seqid-00009以获得99％纯度。在第二实例中，通过阴离子交换色谱法来从枯草芽孢杆菌上清液分离seqid-00105。在第三实例中，在大肠杆菌中细胞内表达的seqid-00105在它初始已通过imac色谱法纯化之后使用阴离子交换色谱法精制以获得100％纯度。在第四实例中，通过阳离子交换色谱法来从枯草芽孢杆菌上清液分离seqid-00640。如本文所述，在大肠杆菌中细胞内表达seqid-00009。将细胞混悬于溶液中并破裂。测试3种溶液(0.1mna2co3(ph11.4)、0.1mtrishcl(ph4.1)和0.1m磷酸钾(ph7.0))。通过离心来使这些溶解化溶液澄清，并且与阴离子交换树脂混合以进行结合。测试2种树脂(来自emd的emdtmaehicap(m)和来自lifetechnologies的d50μm)。以批式模式执行这6种结合条件，并且树脂用适当溶解缓冲液洗涤以移除任何未结合蛋白质。接着将最大结合的潮湿树脂转移至较小滴柱中。各滴柱接着以多达6次以递增nacl浓度进行的连续洗涤来洗脱(各nacl洗涤溶液用适当溶解缓冲液加以缓冲)。seqid-00009被洗脱在这些洗脱份中，收集，并且通过芯片电泳来分析，如本文所述。seqid-00009被鉴定为处于预期分子量下的洗脱带。在每种情况下，从滴柱洗脱的seqid-00009的纯度都高于装载纯度。这个观察结果指示如所预测，seqid-00009结合阴离子交换树脂，并且实现了纯化。达到的最大纯度是99％。在每种情况下，seqid-00009都在待从树脂洗脱的上一次蛋白质之中，从而指示在一定ph范围下seqid-00009对两种树脂的结合亲和力大体上高于来自大肠杆菌的任何宿主细胞蛋白质的结合亲和力。如本文所述进行枯草芽孢杆菌的微生物细胞培养，从而将seqid-00105表达和分泌至发酵培养基中。通过离心来移除细胞，并且通过膜过滤来使上清液进一步澄清。通过超滤来浓缩澄清上清液以降低在阴离子交换柱上的装载时间，并且将溶液交换成在ph6.0下缓冲的低盐溶液。使这个溶液穿过含有来自lifetechnologies的xq强阴离子交换树脂的色谱柱(1cm直径，20cm高度)。用20mmbistris(ph6.3)从树脂冲洗未结合蛋白质。接着使用30柱体积梯度将结合的蛋白质洗脱至400mmnacl、20mmbistris(ph6.3)中。柱流出物被收集在连续洗脱份中，并且通过芯片电泳来分析，如本文所述。seqid-00105被鉴定为处于预期分子量下的洗脱带。在一个洗脱份中达到的最大纯度是100％。如本文所述，在大肠杆菌中细胞内表达seqid-00105。使细胞破裂，并且根据本文所述的程序，通过imac色谱法纯化seqid-00105。使用阴离子交换色谱法进一步精制imac洗脱汇合物以获得100％纯度。浓缩imac洗脱汇合物，接着稀释至50mmtris(ph8.0)中。接着使这个溶液穿过填充有阴离子交换树脂：来自emd的emdtmaehicap(m)的管柱(1.6cm直径，20cm高度)。结合的蛋白质用平衡溶液冲洗，接着用350mmnacl、50mmtris(ph8.0)洗脱。重复这个程序多次，并且所有样品都通过芯片电泳来分析，如本文所述。洗脱样品的纯度在79％至99％的范围内。如本文所述进行枯草芽孢杆菌的微生物细胞培养，从而将seqid-00640表达和分泌至发酵培养基中。通过离心来移除细胞，并且通过膜过滤来使上清液进一步澄清。澄清上清液用去离子水1:2稀释，并且用1m乙酸滴定至ph5。使所得溶液进行膜过滤，随后装载于填充有来自lifetechnologies的xs强阳离子交换树脂的阳离子交换柱(1.2cm直径10cm高度)上。结合的树脂用50mm乙酸盐、50mmnacl(ph5.0)溶液冲洗。蛋白质接着用20cv梯度洗脱至1.05mnacl(ph5.0)中。收集洗脱份，并且通过sds-page、coomassie蓝染色来分析。峰样品显示100％纯度，并且随后无杂质被洗脱于梯度中，从而指示seqid-00640多肽比任何宿主细胞蛋白质以更大亲和力结合于阳离子交换树脂。通过沉淀来纯化。蛋白质沉淀是一种用于纯化多肽的熟知方法(scopesr.1987.proteinpurification:principlesandpractice.newyork:springer)。许多多肽随着盐浓度增加而沉淀，这是一种称为盐析的现象。各种盐类型已根据它们使蛋白质盐析的不同能力以hofmeister次序分级和组织(f.hofmeisterarch.exp.pathol.pharmacol.24,(1888)247-260.)。蛋白质基于它们的物理化学性质也具有归因于高盐浓度的沉淀的不同倾向，然而，尚未建立用以关于这个特征来将蛋白质分级的通用量度。使用这种分级量度以关于营养性多肽被纯化的能力选择营养性多肽牵涉于工艺开发速度、制造成本、最终纯度和纯化强力性。在通过多肽沉淀进行纯化的大多数工业应用中，选择性沉淀目标多肽，并且接着将杂质冲洗离开固体沉淀。在某些实施方案中，多肽在高盐水平下不沉淀，而是通过使杂质沉淀来实现纯化。在本申请中，我们已确定两种筛选多肽的文库以关于它们在苛刻沉淀条件下保持可溶的能力来将它们分级排序的方法。一种方法是如本文所述，基于使用多肽的一级序列，跨越一定范围的ph计算蛋白质总电荷的电子预测。第二方法是如本文所述的体外多路纯化筛选。两种方法已独立于彼此被成功使用，并且它们已一起用于如本文所述的同一组具有支持性数据的168种营养性多肽。多肽的溶解度与表面电荷的丰度直接相关(jimkling,highlyconcentratedproteinformulations:findingsolutionsforthenextgenerationofparenteralbiologics,bioprocessinternational,2014.)。已确定表面电荷可对多肽赋予物理特征(lawrence,m.s.,phillips,k.j.和liu,d.r.(2007).superchargingproteinscanimpartunusualresilience.journaloftheamericanchemicalsociety,129(33),10110–2.doi:10.1021/ja071641y)。电子预测性溶解度分级方法基于根据一级序列在一定ph范围下计算营养性多肽的电荷总数。一种或多种某些氨基酸，例如组氨酸、精氨酸和赖氨酸在多肽中盛行会在蛋白质溶剂的ph低于一种或多种氨基酸的pka时，在那个多肽或其一部分中赋予正电荷。一种或多种某些氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸在多肽中盛行会在蛋白质溶剂的ph高于一种或多种氨基酸的pka时，在那个多肽或其一部分中赋予负电荷。多肽的电荷总数随蛋白质溶剂的ph而变。如本文所述，可基于多肽的一级序列计算任何ph下的正电荷和负电荷的数目。在任一ph下正电荷和负电荷的总和产生计算净电荷。多肽的等电点(pi)是它的计算净电荷是0所处的ph。为在营养性多肽之间进行比较，将正电荷的总数添加至负电荷的总数(绝对值)中，并且通过序列中的氨基酸的数目来使那个总电荷标准化，并且参数“每个氨基酸总电荷”作为序列之间的新型比较参数而产生，其用于预测多肽的抗沉淀性。多肽的抗性越大，它可通过使杂质沉淀析出来在高程度上被纯化的可能性越高。不同于预测色谱性能，溶解度不受电荷的极性影响。尽管常常真实的是多肽在序列的pi下经历它的最低溶解度，但一些多肽具有高总电荷，并且在它们的pi下仍然极其可溶，如本文所示。已通过计算各多肽在一定ph范围(1-14)下的每个氨基酸总电荷来评估营养性多肽序列。根据每个氨基酸总电荷来将营养性多肽分级。根据这个分级，具有低pi和跨越广泛范围的ph极其负性每个氨基酸净电荷的多肽和具有高pi和跨越广泛范围的ph极其正性每个氨基酸净电荷的多肽都被预期具有同等评分。具有许多两种电荷的多肽评分最佳。图3说明基于一级序列被预测具有极高溶解度的示例性营养性多肽。这组包括具有低pi(<4)和跨越广泛范围极其负性每个氨基酸净电荷的多肽((1)seqid–00475，(2)seqid-00009)。这组包括具有高pi(>10)和跨越广泛范围的ph极其正性每个氨基酸净电荷的多肽((4)seqid-00433，(5)seqid-00472)。这组包括具有中性更大的pi的多肽((3)seqid-00478)。此处显示的许多多肽甚至在诸如<4和>12的极端ph值下也显示高电荷。预期整个组跨越广泛范围的ph极其可溶，并且抵抗沉淀。在这个实证中，通过离心来从振荡烧瓶发酵收集大肠杆菌细胞，并且将全部细胞分配至管中(每管1克细胞)。向各管中，添加4ml溶解溶液，并且通过在75安培下超声处理30秒来溶解细胞。溶解溶液包括：水；8m尿素，0.1mtris，0.1mnacl；0.1m乙酸盐，10％gly，0.1％吐温-80，0.3marg，0.3mnacl，10mmedta；10mm咪唑(ph5.0)；0.1m乙酸盐，10％gly，0.1％吐温-80，0.3marg，0.3mnacl，10mmedta；10mm咪唑(ph7.0)；100nacl，100hepes，10咪唑(ph7.5)；500nacl，100hepes，10咪唑(ph7.5)；100mmphos；150mmnacl；10mm咪唑(ph7.5)；0.1mnacl，0.1mhepes，10mm咪唑，50mmcacl2(ph7.5)；0.1mhepes，3.5m硫酸铵(ph7.5)；0.1mhepes，2m硫酸铵(ph7.5)；0.1mtris；0.1mtris，0.5mnacl；150mmnacl，10mm乙酸盐，15mm咪唑(ph6.04)；和500mmnacl，100mm乙酸盐，15mm咪唑(ph6.04)。通过离心和0.2um过滤来使溶解产物澄清。如本文所述，通过sds-page(蓝色染色)来分析澄清上清液。seqid-00009显示在这些条件中的各个下都可溶。除一种条件之外，大肠杆菌宿主细胞蛋白质通常也显示在这些条件下可溶。在3.5m硫酸铵存在下，大多数宿主细胞蛋白质被有效沉淀，从而在过程的细胞收集阶段之后产生85％纯化的seqid-00009。这个结果指示seqid-00009比大多数大肠杆菌宿主细胞蛋白质更可溶，并且沉淀可被用作低成本分离方法的一部分。这与seqid-00009的高总电荷相关，并且支持预测是准确的。此外，预测电荷大于seqid-00009的多肽将甚至更可溶，其可超过seqid-00009具有多肽产率较高的益处。在随后实验中，以单级硫酸铵沉淀使seqid-00009纯化以获得99％纯度。在这个实证中，通过离心来从振荡烧瓶发酵收集大肠杆菌细胞，并且将全部细胞混悬于0.1m碳酸钠(ph10)中(1克细胞于4ml溶液中)。通过超声处理(80安培持续2分钟)来溶解细胞。通过离心和0.2μm膜过滤来使溶解产物澄清。将澄清上清液分成一系列3ml部分，向其中添加4m硫酸铵的储备溶液(ph9.8)。添加可变量的储备溶液以实现一定范围的硫酸铵浓度。在室温下混合样品10分钟，并且通过离心和0.2um膜过滤来澄清化。如本文所述，通过sds-page(蓝色染色)来分析澄清上清液。图4显示seqid-00009的纯度随硫酸铵浓度而变。多路纯化：离子交换色谱法。在一些情况下，在多路筛选实验平台中测试整个蛋白质文库。在多路表达系统中转染和表达168种营养性多肽，其中单一生长条件用于在单一容器中产生各多肽。这个多路表达系统允许关于广泛范围的可制造性参数来同时测试任一组多肽序列，所述参数各自可用于分级排序所考查的这组多肽。一组可制造性参数包括表达水平、多肽溶解度、多肽通过色谱法被纯化的能力、抵抗热变性的能力、多肽的消化能力、多肽通过抵抗苛刻处理被纯化的能力。关于在大肠杆菌中的细胞内表达来测试这组168种营养性多肽。可溶性表达的多肽作为整体被预处理，接着经受一系列纯化条件以使这组可以它们的通过多种方法进行纯化的容易性加以分级排序。如本文所述，基于一级序列分析(具体来说每个氨基酸净电荷)，预期将从各表达系统鉴定相同子组的蛋白质来联合特定色谱模式。对于大肠杆菌多路纯化，这组营养性多肽序列被his8标签化。如本文所述培养细胞，破裂，并且如本文所述使溶液澄清。这个产生过程产生含有来自这组的表达并可溶的所有多肽的溶液。使那组可溶性多肽穿过5mlimac柱并洗脱，如本文所述。这个imac纯化通过移除大多数大肠杆菌宿主细胞蛋白质来将可溶性表达的营养性多肽作为一组有效分离。浓缩洗脱份，并且进行缓冲液交换以进入接近中性ph加以缓冲的低盐溶液中，随后测试各种纯化方法。测试的方法包括阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法和负性沉淀，其中杂质沉淀，并且保持可溶的多肽分级最高。在这个情况下，杂质已被移除，因此多肽在它们自身之间被分级排序。另外，通过加热来测试这组蛋白质的热稳定性，其中在加热之后保持可溶的多肽比沉淀的那些更加热稳定。多肽的这个混合物关于它们结合阴离子交换和阳离子交换色谱树脂的能力加以分级排序。测试4种色谱树脂。2种阴离子交换树脂：来自gelifesciences的captodeae和来自emd的q树脂。2种阳离子交换树脂：来自lifetechnologies的xs强阳离子交换树脂和来自emd的s树脂。以如下8种不同缓冲条件测试各树脂。用于阴离子交换的缓冲液：水(无缓冲剂)，ph7；15mmna2hpo4，ph8.7；30mmna2hpo4，ph9.0；15mmtris碱，ph9.6；30mmtris碱，ph10.0；30mmna2co3，ph11.2；25mm精氨酸，ph10.1。用于阳离子交换的缓冲液：水(无缓冲剂)，ph7；15mmkh2po4，ph4.2；30mmkh2po4，ph4.5；15mmtris酸，ph4.9；30mmtris酸，ph4.7；15mmmes酸，ph3.9；25mmmes酸，ph4.1。将树脂分配至96孔过滤板(每孔20ul树脂)中，并且各自平衡三次。使蛋白质组(proteinset)与平衡缓冲液混合，并且使其结合树脂。通过使液体离心穿过过滤板以收集在以下96孔板中来使溶液中的未结合蛋白质与树脂分离。以平衡缓冲液洗涤来将剩余未结合蛋白质从树脂进一步冲洗去除。接着依序用三级递增盐浓度(于以上一组适当缓冲液中缓冲的50、250、1500mmnacl)洗脱结合的蛋白质。松散结合的蛋白质首先被移除，并且在最终洗脱条件下移除的蛋白质极其紧密结合于树脂。因此，在大肠杆菌中表达168种蛋白质的文库，并且关于它们对阴离子交换和阳离子交换色谱树脂的结合亲和力加以分级排序。本文所述的实验产生160个样品(4种树脂，8种缓冲液，5种收集物)。5个收集阶段包括：流过部分，洗涤部分，50mmnacl洗脱，250mmnacl洗脱和1500mmnacl洗脱。所有160个样品都通过280nm下的紫外-可见吸光度，通过bradford总蛋白质测定，通过芯片电泳来分析，并且通过lc/ms/ms来分析所选样品。本文描述所有分析测定。测定证明一些蛋白质流过树脂，并且未被结合。在大多数情况下，洗涤部分不洗脱大量蛋白质，从而指示待洗脱的任何其它蛋白质实际上结合于树脂。随着nacl浓度增加，所移除的总蛋白质也增加，从而证明在几乎每种条件下都成功结合和洗脱。在1500mmnacl洗脱条件下通过电泳检测的蛋白质在250mmnacl洗涤条件下保持结合，从而指示强烈结合。所选条件被选择用于lc/ms/ms分析。用在30mmtris碱缓冲条件下来自阴离子交换色谱树脂(captodeae)的1500mmnacl洗脱样品进行lc/ms/ms分析。相对于文库中最初表达的所有168种营养性多肽的序列搜索lc/ms/ms结果。被鉴定为在这个条件下对这个阴离子交换树脂具有高结合亲和力的8种独特多肽是seqid-00341、seqid-00346、seqid-00497、seqid-00525、seqid-00555、seqid-00605、seqid-00606、seqid-00610。对于这个组中的各多肽序列，基于一级序列跨越测试的ph范围计算每个氨基酸净电荷。如本文所述，预期紧密结合阴离子交换树脂的多肽跨越ph范围具有低于0的每个氨基酸净电荷，并且除单一多肽之外，这被证明是真实的。预期任何例外都归因于以下事实：跨越序列的长度存在电荷异质性，并且如所述，每个氨基酸净电荷并非始终体现那个电荷异质性。这个多路筛选基于一组多肽结合阴离子交换树脂的亲和力来从较大文库鉴定它们，并且这个结果可如本文所述基于一级序列分析加以预测。用在15mmtris酸缓冲条件下来自阳离子交换色谱树脂(porosxs)的1500mmnacl洗脱样品进行lc/ms/ms分析。相对于文库中最初表达的所有168种营养性多肽的序列搜索lc/ms/ms结果。被鉴定为在这个条件下对这个阳离子交换树脂具有高结合亲和力的8种独特多肽是seqid-00302、seqid-495、seqid-00522、seqid-00537、seqid-00546、seqid-00547、seqid-00560、seqid-00598。对于这个组中的各多肽序列，基于一级序列跨越测试的ph范围计算每个氨基酸净电荷。如本文所述，预期紧密结合阳离子交换树脂的多肽跨越ph范围具有高于0的每个氨基酸净电荷，并且除少数之外，这被证明是真实的。预期任何例外都归因于以下事实：跨越序列的长度存在电荷异质性，并且如所述，每个氨基酸净电荷并非始终体现那个电荷异质性。这个多路筛选基于一组多肽结合阳离子交换树脂的亲和力来从较大文库鉴定它们，并且这个结果可如本文所述基于一级序列分析加以预测。在多路纯化的枯草芽孢杆菌实例中，在无任何类型的纯化标签下表达这组多肽序列。如本文所述在烧瓶中培养细胞，并且所述细胞将多肽表达和分泌至生长培养基中。通过离心来移除细胞，并且通过膜过滤来使溶液进一步澄清，如本文所述。这个产生过程产生含有来自这组的表达并可溶性分泌的所有多肽的溶液。浓缩那组可溶性多肽，并且进行缓冲液交换以进入磷酸盐溶液(ph7.0)中，随后测试各种纯化方法。测试的方法包括阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法和负性沉淀，其中杂质沉淀，并且保持可溶的多肽分级最高。在这些多路纯化研究中，多肽被从彼此和从宿主细胞蛋白质纯化离开以在它们自身之间被分级排序。多肽的这个混合物关于它们结合阴离子交换和阳离子交换色谱树脂的能力加以分级排序。测试4种色谱树脂。2种阴离子交换树脂：来自gelifesciences的captodeae和来自emd的q树脂。2种阳离子交换树脂：来自lifetechnologies的xs强阳离子交换树脂和来自emd的s树脂。以8种不同缓冲条件测试各树脂。用于阴离子交换的缓冲液：18mmbis-tris，ph6.5；13mmhepes，ph7.0；18mmhepes，ph7.5；16mmtris，ph8.0；32mmtris，ph8.5；88mmtris，ph9.0；13mmna2co3，ph9.5；20mmna2co3，ph10.0。用于阳离子交换的缓冲液：19mm柠檬酸盐，ph3.0；13mm柠檬酸盐，ph3.5；49mm乙酸盐，ph4.0；22mm乙酸盐，ph4.5；14mm乙酸盐，ph5.0；10mm乙酸盐，ph5.5；24mmmes，ph6.0；15mmmes，ph6.5。将树脂分配至96孔过滤板(每孔50μl树脂)中，并且各自平衡三次。使蛋白质组与平衡缓冲液混合，并且使其结合树脂。通过使液体离心穿过过滤板以收集在以下96孔板中来使溶液中的未结合蛋白质与树脂分离。以平衡缓冲液进行两个洗涤循环来将剩余未结合蛋白质从树脂进一步冲洗去除。接着依序用递增盐浓度(250、500、1000mm、2000mmnacl)洗脱结合的蛋白质。各盐溶液在适当平衡缓冲液中缓冲，例外之处是2000mmnacl溶液，其用mes在ph6.0下(用于阴离子交换树脂)以及用tris在ph8.0下(用于阳离子交换树脂)缓冲。松散结合的蛋白质首先被移除，并且在最终洗脱条件下移除的蛋白质极其紧密结合于树脂。因此，在枯草芽孢杆菌中表达蛋白质的文库，并且关于它们对阴离子交换和阳离子交换色谱树脂的结合亲和力加以分级排序。本文所述的实验产生192个样品(4种树脂，8种缓冲液，6种收集物)。6个收集阶段包括：流过部分，洗涤部分，250mmnacl洗脱，500mmnacl洗脱，1000mmnacl洗脱和2000mmnacl洗脱。所有192个样品都通过芯片电泳来分析。通过sds-page来分析所选样品。通过lc/ms/ms来分析所选样品。本文描述所有分析测定。通过芯片电泳、sds-page和lc/ms/ms的组合来对强烈结合的蛋白质进行鉴定。sds-page结果证明大多数多肽不结合这些树脂，实际上它们见于流过部分中。因此，结合树脂的多肽在它们能够从大多数其它多肽被纯化方面是独特的。各种洗脱份中的这组多肽已基于它们的性质以某一纯化方法从较大组分离，所述纯化方法牵涉制造、成本、开发时间和这些多肽的最终纯度。此外，在结合树脂的多肽之中，这些多肽可根据它们在以递增浓度的nacl达成的严格洗涤条件下保持结合于树脂的能力来分级排序。见于2000mmnacl样品中的那些多肽已能够在1000mmnacl洗涤条件下保持结合。广泛接受的是可在高于500mmnacl下保持结合于离子交换树脂的任何多肽都被视为对那个树脂具有极高亲和力。在两种阳离子交换树脂之间，条带样式是类似的，从而支持提出的机理。同样，在两种阴离子交换树脂之间，条带样式是类似的，并且代表与通过阳离子交换鉴定的样品组不同的样品组。为分级排序鉴定于任何子组中的个别多肽，利用lc/ms/ms。作为示例性数据集，lc/ms/ms结果将以下多肽鉴定为在ph7.5下结合captodeae阴离子交换树脂：p39645、p37869、p80698、p80868、p21880、p80239、p50849、p12425、o34669、p39138、p37871、p19669、p29727、p80643、o34981、p80879、p54716、p37477。作为示例性数据集，lc/ms/ms结果将以下多肽鉴定为在ph4.0下结合porosxs阳离子交换树脂：o34669、p19405、o31803、o05411、o31973、o31643、p80239、p26901、p08821、p80240、p49814、o34310、p0ci78、o31925、p71014、p42111。基于鉴定为具有高结合亲和力的这些多肽的一级序列来分析它们的物理化学性质。基于一级序列跨越测试的ph范围计算每个氨基酸净电荷。如本文所述，预期紧密结合阴离子交换树脂的多肽跨越ph范围具有低于0的每个氨基酸净电荷，并且这通常被证明是真实的。如本文所述，预期紧密结合阳离子交换树脂的多肽跨越ph范围具有高于0的每个氨基酸净电荷，并且这通常被证明是真实的。预期任何例外都归因于以下事实：跨越序列的长度存在电荷异质性，并且如所述，每个氨基酸净电荷并非始终体现那个电荷异质性。这个多路筛选基于一组多肽结合阴离子交换树脂的亲和力来从较大文库鉴定它们，并且这个结果可如本文所述基于一级序列分析加以预测。在多路纯化的枯草芽孢杆菌实例中，在无任何类型的纯化标签下表达这组168种营养性多肽序列。如本文所述在烧瓶中培养细胞，并且所述细胞将多肽表达和分泌至生长培养基中。测试的方法包括负性絮凝/沉淀，其中杂质沉淀，并且保持可溶的多肽分级最高。在这些多路纯化研究中，杂质以可溶性杂质(例如宿主细胞蛋白质、dna、磷脂和产物相关杂质，诸如亚型或聚集物质)、不溶性杂质、细胞或细胞碎片(例如膜片段)的形式存在。在离心移除不溶性杂质、细胞和细胞碎片以及通过膜过滤来进一步澄清化之前和之后进行负性沉淀。细胞混悬液(在离心和膜过滤之前)和澄清上清液(在离心和膜过滤之后)中的这组可溶性表达和分泌的多肽关于它们与絮凝剂缔合的能力加以分级排序。此外，絮凝剂关于它们与杂质缔合的能力加以分级排序。在两种不同浓度下测试48种絮凝剂，如下所示：碳酸氢铵(100mm，200mm)；氯化锰(100mm，200mm)；硫酸镍(100mm，200mm)；柠檬酸钠(100mm，200mm)；乙酸锂(100mm，200mm)；丙二醇(10％v/v，20％v/v)；硝酸铵(100mm，200mm)；氯化钾(100mm，200mm)；硫酸钠(100mm，200mm)；钼酸钠(100mm，200mm)；乙酸(100mm，200mm)；壳聚糖mmw(0.1％w/v，0.2％w/v)；硫酸铵(100mm，200mm)；氯化钠(0.5m，1.0m)；硫酸锌(100mm，200mm)；硝酸钠(100mm，200mm)；柠檬酸(100mm，200mm)；盐酸胍(0.6m，1.2m)；氯化铵(100mm，200mm)；氯化锌(100mm，200mm)；碳酸钾(100mm，200mm)；磷酸钠(100mm，200mm)；盐酸(100mm，200mm)；peg1000(5％w/v，10％w/v)；氯化钙(100mm，200mm)；柠檬酸铁(100mm，200mm)；硝酸钾(100mm，200mm)；丙酸钠(100mm，200mm)；氢氧化钾(100mm，200mm)；peg4000(5％w/v，10％w/v)；氯化胆碱(100mm，200mm)；硫酸铜(100mm，200mm)；磷酸钾(100mm，200mm)；丁二酸钠(100mm，200mm)；氢氧化钠(100mm，200mm)；tritonx-100(0.5％w/v，1.0％w/v)；氯化铁(100mm，200mm)；硫酸铁(100mm，200mm)；脱氧胆酸(0.5％w/v，1.0％w/v)；硫氰酸钠(100mm，200mm)；乙醇(10％v/v，20％v/v)；吐温80(0.5％w/v，1.0％w/v)；氯化镁(100mm，200mm)；硫酸镁(100mm，200mm)；碳酸钠(100mm，200mm)；硫代硫酸钠(100mm，200mm)；异丙醇(10％v/v，20％v/v)；尿素(0.8m，1.6m)。将细胞混悬液(在离心和膜过滤之前)和澄清上清液(在离心和膜过滤之后)分配至96孔过滤板中(每孔300μl(用于低絮凝剂浓度)和267μl(用于高絮凝剂浓度))。通过分别添加33μl或67μl的浓缩絮凝剂溶液来将这些装载物稀释0.1倍或0.2倍。在室温下混合所得溶液1小时。在混合之后，通过使液体离心穿过过滤板以收集在以下96孔板中来使剩余可溶性物质与不溶性物质分离。所有192个样品都通过芯片电泳来分析。通过sds-page来分析所选样品。通过lc/ms/ms来分析所选样品。本文描述所有分析测定。sds-page结果证明一些条件使许多多肽有效沉淀，从而指示在那些条件下可溶性多肽相当可溶，并且可在这些条件下被分离。在各种沉淀条件下可溶的多肽基于它们的性质以某一纯化方法从较大组分离，所述纯化方法牵涉制造、成本、开发时间和这些多肽的最终纯度。根据本文所述的机理，一些多肽由于它们的高电荷而跨越一定范围的条件是广泛可溶的。为分级排序鉴定于任何子组中的个别多肽，利用lc/ms/ms。作为示例性数据集，lc/ms/ms结果证明以下多肽由于它们在100mm乙酸(ph5.18)中持续可溶而被分离：o34669、p54423、p21879、p10475、p28598、o31803、p40767、p17889、o34918、q08352、p24327、p37871、o31973、p81101、p50849、p26901、p80700、o34385、p70960、p42111、p21880、p27876、p80868、p54716、o34313、o07603、o05411、p54531、o05497、p12425、o07921、p19405、q06797、p02394、p24141、p09339、p37965、p07343、p37809、p0ci78、p39824、p49814、p39632、p39773、p51777、p21883、o06989、p25152、p70961、o07593、o34310、p80860、p37437、p80698、p13243、p38494、p39645、p39148、o31398、p08821、p08877、o05268、p04957、p28366、p31103、p94421、p14949、p80864、p37869、p80240、p80859、o06993、o34666、o34714、p37546、q9kwu4、o31605、p16616、p80239、o34788、p71014、p37571、p09124、p42971、o31925、p39793、p17865、p16263、p18429、p05653、p26908、p33166、o34499、p08750、p54602、q45071、p12047、p42919、o34334、o34358、p39120、p39126、p00691、p14192、p22250、p37870、p39116、p54484、p54488、p54547、p56849、o31579、o34629、p30949、p54422、p54530、p54542、p96739。作为示例性数据集，lc/ms/ms结果证明以下多肽由于它们在100mm碳酸钾(ph9.66)中持续可溶而被分离：o34669、p54423、p21879、p24327、p40767、p17889、o31973、p10475、p28598、p80700、p37871、p80868、o31803、p81101、p70960、p27876、p19405、p28366、p71014、p26901、o34385、p21880、q06797、p24141、p07343、p80698、p13243、p42971、p39793、o31643、p39071、o32210、p21468、p42199、p54531、p37965、p37809、p21883、p38494、p39148、p08877、p09124、p17865、p16263、p54602、p46906、o34918、q08352、p42111、o05411、o05497、o07921、p02394、p09339、p49814、p39632、p37437、p39645、p08821、p04957、p31103、q9kwu4、p80239、o34788、p18429、p05653、p26908、o34499、p08750、p12047、p37870、p54547、q06796、q45477、p25144、p46898、p40871、o31501、p21464、p21465、p40409。作为示例性数据集，lc/ms/ms结果证明以下多肽由于它们在100mm氯化钙(ph7.50)中持续可溶而被分离：o34669、p54423、p21879、o34918、o31803、p10475、p28598、p24327、p40767、p80700、p27876、p37871、o34385、p13243、q08352、o07921、p17889、o31973、p80868、p26901、p24141、p80698、p02394、q06797、p39148、p19405、p54531、p37965、p09339、p39645、o34788、p37571、o07909、p70960、p21880、p42971、p37809、p80239、q45477、p94421、p81101、p07343、p39793、p39071、p38494、p17865、p42111、p12425、p39773、o06989、p80864、o05411、o05497、p25144、p0ci78、p39824、p25152、p70961、o31398、o05268、p37869、p80859、o32150、p39138、o31643、p21468、p42199、p21883、p09124、p49814、p05653、q06796、o34313、p51777、o34310、o06993、o34666、o31925、p33166、p39634、p37808、p39779、p28366、p08877、p16263、p39632、p08821、p04957、o34499、p08750、p46898、p50849、p54716、p80860、p14949、p80240、q45071、o34334、o34358、p39120、p39126、p20278、p53001、p54375、o06006、o06988、o34667、o34981、p08164、p19669、p30950、p37487、p45694、p81102、p71014、p54602、p46906、p31103、p18429、p26908、p12047、p40871、o07603、o34714、p37546、p42919、p00691、p22250、p39116、p54488、p40924、c0sp93、o31760、o32023、o32106、o32167、o34962、p12048、p25995、p28015、p28599、p34957、p35137、p37253、p37477、p37812、p37940、p46354、p49778、p54169、p54418、p54550、p54941、p80885、p94576、q04796、q06004、q07868、q9r9i1。作为示例性数据集，lc/ms/ms结果证明以下多肽由于它们在100mm氯化铁(ph4.54)中持续可溶而被分离：p26901、o34669、o34918、p54423、o31803、p96657、o31973、p37871、o07921、o31643、q06796、p17889、p80698、p80239、o05411、o07909、o31925、p20278、p71014、p21879、p10475、p80700、p27876、q08352、p81101、p42111、p0ci78、p39824、o32210、p28598、p24327、o34385、q06797、p19405、p37571、p38494、o31398、p09124、p51777、p08821、p18429、o07593、p80868、p09339、p39645、o34788、o05268、p49814、p08877、p39632、p04957、p14949、p31103、o06746、o07555、p40767、p02394、p54531、p37965、p70960、p37809、p07343、p39773、p33166、p39634、p16263、p46898、p50849、p54716、p80240、q45071、p53001、p54375、p26908、p42919、p40924、p14192、p54484、p56849、o06748、p12878、p21477、p32081、p46899、p50620、p54464。基于鉴定为具有高溶解度的这些多肽的一级序列来分析它们的物理化学性质。基于一级序列跨越测试的ph范围计算每个氨基酸总电荷。如本文所述，预期最可溶的多肽具有较高每个氨基酸总电荷，并且这通常被证明是真实的。这个多路筛选基于一组多肽结合阴离子交换树脂的亲和力来从较大文库鉴定它们，并且这个结果可如本文所述基于一级序列分析加以预测。多路纯化：沉淀和絮凝。用于移除细胞和细胞碎片的常规生物药物蛋白质纯化方法包括离心、微滤和深度过滤器。诸如硅藻土的助滤剂可用于增强这些步骤的性能，但它们并非始终有效，并且有时会显著结合目标产物。它们的使用也可要求添加固体或均质混悬液作为大规模生物药物操作的一部分，所述添加可具有挑战性。聚合絮凝剂可用于帮助使哺乳动物细胞培养工艺物流澄清化，但它们可具有局限性。举例来说，由于担忧使目标蛋白质失活或归因于沉淀的产物损失，通常用作加工助剂的硫酸鱼精蛋白制剂在应用方面受限(scopes,proteinpurificationprinciplesandpractice第3版,cantor编22-43；171(1994))。高品质试剂，诸如销售供医学使用的试剂，可为昂贵的。在某些情况下，需要在极低程度上进行移除以确保在患者中不存在不利影响。举例来说，壳聚糖不是充分确定的试剂，并且存在关于它在澄清化应用中常规使用时的一致性能的担忧。多种带电荷聚合物，诸如deae右旋糖苷、基于丙烯酰胺的聚合物，常用于废水处理中(nalcowaterhandbook,第2.1章节:applications—impurityremoval,第3版,mcgraw-hill,2009)，并且聚乙烯胺(pei)已被考虑用于澄清化应用中。关于后两种类型的聚合物，丙烯酰胺试剂有可能被毒性试剂污染，而聚乙烯胺尽管是高度有效的澄清化试剂，但常被不同量的乙烯亚胺单体(一种怀疑致癌剂)污染(scawen等,handbookofenzymebiotechnology第2版,wiseman编:15-53(1985))。此外，这些聚合物中的许多(包括pei)倾向于几乎不可逆结合许多色谱树脂，由此限制下游加工选项。与这些聚合物相关的规章性和原材料再使用顾虑已从根本上限制它们用于学术研究。诸如明矾和铁盐的基于非聚合物的絮凝剂已用于废水处理行业中(nalcowaterhandbook,第2.1章节:applications—impurityremoval,第3版,mcgraw-hill,2009)。这些物质可似乎不适用于处理蛋白质产物，因为它们可结合蛋白质产物，或可催化化学反应，从而导致对蛋白质的可影响安全性或功效的修饰。在一些情况下，在多路筛选实验平台中测试整个蛋白质文库。在多路表达系统中转染和表达168种营养性多肽的文库，其中单一生长条件用于在单一容器中产生各多肽。这个多路表达系统允许关于广泛范围的可制造性参数来同时测试任一组多肽序列，所述参数各自可用于分级排序所考查的这组多肽。一组可制造性参数包括表达水平、多肽溶解度、多肽通过色谱法被纯化的能力、抵抗热变性的能力、多肽的消化能力、多肽通过抵抗苛刻处理被纯化的能力。对于通过沉淀达成的大肠杆菌多路纯化，这组168种营养性多肽序列被his8标签化。如本文所述培养细胞，破裂，并且如本文所述使溶液澄清。这个产生过程产生含有来自这组的表达并可溶的所有多肽的溶液。使那组可溶性多肽穿过imac柱并洗脱，如本文所述。这个imac纯化通过移除大多数大肠杆菌宿主细胞蛋白质来将可溶性表达的营养性多肽作为一组有效分离。浓缩洗脱份，并且进行缓冲液交换以进入接近中性ph加以缓冲的低盐溶液中，随后测试各种纯化方法。测试的方法包括阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法和负性沉淀，其中杂质沉淀，并且保持可溶的多肽分级最高。在这个情况下，杂质已被移除，因此多肽在它们自身之间被分级排序。另外，通过加热来测试这组蛋白质的热稳定性，其中在加热之后保持可溶的多肽比沉淀的那些更加热稳定。将由大肠杆菌表达的一组预处理多肽分配至96孔板的32个孔中(每孔4.7ul蛋白质储备物，在43g/l的总蛋白质浓度下)。添加储备溶液至各孔中以产生以下条件：对照(无添加剂)；42mm柠檬酸盐/磷酸盐，ph7.1；42mm柠檬酸盐/磷酸盐，ph6.5；42mm柠檬酸盐/磷酸盐，ph6.0；42mm柠檬酸盐/磷酸盐，ph5.6；42mm柠檬酸盐/磷酸盐，ph5.0；42mm柠檬酸盐/磷酸盐，ph4.6；42mm柠檬酸盐/磷酸盐，ph4.3；42mm柠檬酸盐/磷酸盐，ph3.9；42mm柠檬酸盐/磷酸盐，ph3.7；42mm柠檬酸盐/磷酸盐，ph2.8；75mmtris碱；50mmna2co3；50mm哌嗪碱；100mm磷酸氢二钠；50mm乙醇胺；100mm磷酸二氢钠；100mmmes酸；100mm乙酸钠，ph4.1；100mmmops酸；100mmtrishcl；25mm乙酸；25mm硼酸；25mm柠檬酸；50mmpipes酸；50mm丁二酸；1.2m亚硫酸钠；1.5m亚硫酸钠；2.5m硫酸铵；3.5m硫酸铵；200mmcacl2；60％甲醇。添加水以使各孔含有总计40ul5g/l的溶液。在室温下混合各板30分钟，接着在3,000rcf下离心10分钟以集结任何沉淀蛋白质。从各孔获取样品以进行分析。接着在95℃下加热96孔板2分钟。将板在3,000rcf下再次离心10分钟以集结任何沉淀蛋白质，并且从各孔获取样品以进行分析。所有64个样品都通过bradford测定来分析，并且依次通过芯片电泳和lc/ms/ms来分析所选样品。本文描述所有分析测定。对剩余在溶液中的总蛋白质的测量证明许多条件导致多肽沉淀，从而指示一部分测试条件是严格苛刻条件。以表e9d中所述的4个所选样品进行lc/ms/ms分析。以x指示在可溶性部分中检测到营养性多肽。表e9d.在所选条件的可溶性部分中检测的营养性多肽。以x指示检出。lc/ms/ms数据鉴定在各条件下的许多可溶性多肽。在筛选之中测试的不同条件代表许多不同沉淀机理，并且这些不同条件能够基于不同组多肽的不同物理化学性质来鉴定它们。基于在通过lc/ms/ms考查的条件下保持可溶的多肽的数目，最苛刻条件是在室温下2.5m硫酸铵条件。除少数多肽之外，在那个条件下可溶的多肽通常在所有三种其它测试条件下都可溶。许多多肽被鉴定为在加热至95℃持续2分钟之后可溶。在这个实验中，跨越广泛多种条件关于可溶性来物理筛选营养性多肽的文库，并且在各条件内鉴定各子组的可溶性肽。实施例11.基于溶合评分和聚集评分以及其它基于序列的分析来选择来自氨基酸序列文库的营养性多肽的氨基酸序列。溶合评分。溶合评分是用于评估给定蛋白质的亲水性和潜在可溶性的基于一级序列的量度。假定各残基都独立地溶合，那么溶合评分定义为所有氨基酸侧链的用序列中的残基总数加以标准化的总溶合自由能(即与从气相转移至稀释溶液相关的自由能变化)。侧链溶合自由能是通过计算真空介电常数1与水介电常数80之间的静电能量差异(通过解析poisson-boltzmann等式)，以及使用线性溶剂可及表面积模型计算非极性vanderwaals能量来计算得到(d.sitkoff,k.a.sharp,b.honig.“accuratecalculationofhydrationfreeenergiesusingmacroscopicsolventmodels”.j.phys.chem.98,1994)。这些溶合自由能与实验测量充分相关。对于具有可离子化侧链的氨基酸(arg、asp、cys、glu、his、lys和tyr)，平均溶合自由能基于在指定ph下各离子化状态的相对概率。假定在折叠后所有极性残基暴露于溶剂，而非极性残基排除溶剂，那么溶合评分有效作为溶合自由能的量度。聚集评分。聚集评分是用于评估给定蛋白质的疏水性和聚集可能性的基于一级序列的量度。使用赋予疏水性残基正值并赋予亲水性残基负值的kyte和doolittle疏水性量表(kytej,doolittlerf(1982年5月)."asimplemethodfordisplayingthehydropathiccharacterofaprotein".j.mol.biol.157(1):105–32)，利用以各残基为中心的5个残基的移动平均值计算随序列位置而变的有效疏水性。通过对大于0的所有那些平均疏水性值求和以及通过蛋白质的总长度进行标准化来得到聚集评分。潜伏理解是聚集是两个或更多个疏水性片块集合以排除水并降低表面暴露的结果，并且蛋白质将聚集的可能性随它的疏水性(即聚集倾向性)残基被密集压紧程度而变。电荷含量。每个氨基酸绝对电荷或净电荷是随ph而变并独立于残基在蛋白质内的位置加以计算。鉴于ph值和可滴定残基的pka，解析henderson-hasselbalch等式以确定各滴定状态的相对浓度(例如对于酸性残基谷氨酸，-1或0)。henderson-hasselbalch等式通过使这些相对浓度转换成带电荷的有效概率以及乘以那个氨基酸的电荷和实例数目来得到那个可滴定残基的平均电荷。由这个程序得到的净电荷或绝对电荷接着除以氨基酸的数目以得到每个氨基酸值。以下显示于表e11a中的残基类型在相应pka值和相关滴定状态下使用。这些pka值来自提供于欧洲分子生物学开放软件套件(europeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)(rice,p.longden,i.和bleasby,a.emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite.trendsingenetics,16,2000)中的pka表。加权euclidean距离。为鉴定与已知临床有效掺合物具有类似氨基酸分解的候选蛋白质，使用基于加权euclidean距离的搜索策略。大体上，这意味着相对于靶标氨基酸分布计算各氨基酸的加权差异百分比，如由以下等式所定义：其中aa是靶标分布中的一组所有氨基酸，xi是候选蛋白质序列中的氨基酸i的权重分数，是靶标氨基酸分布中的氨基酸i的权重分数，并且αi是与氨基酸i相关的相对权重。相对权重用于确保与最重要氨基酸靶标的大偏差被适当处罚。举例来说，对于治疗肌肉减少症，支持运动，以及刺激产热，使用氨基酸掺合物(鉴于亮氨酸和其它两种支链氨基酸异亮氨酸和缬氨酸的相对重要性)的亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸相对权重3:2:2。所有其它氨基酸被赋予相对权重1。过敏原性。过敏原性评分是一种基于who推荐(fao.org/ag/agn/food/pdf/allergygm.pdf)的以一级序列为基础的用于评估蛋白质与任何已知过敏原的类似程度的量度，其中主要理解是靶标与已知过敏原之间的高同一性百分比可能指示交叉反应性。对于给定蛋白质，通过一对基于序列同源性的互补测试来评估引发过敏应答的可能性。第一测试通过使用采用blosum50取代矩阵、空位开放罚分10和空位延伸罚分2的fasta算法，与某一数据库的已知过敏原进行整体-局部序列比对来确定蛋白质跨越整个序列的同一性百分比。表明两个序列之间的整体同源性小于50％的蛋白质不可能具有过敏原性(goodmanr.e.等allergenicityassessmentofgeneticallymodifiedcrops—whatmakessense？nat.biotech.26,73-81(2008).；aalberser.c.structuralbiologyofallergens.j.allergyclin.immunol.106,228-238(2000).)。第二测试通过使用采用blosum50取代矩阵、空位开放罚分10和空位延伸罚分2的fasta算法，将各片段与某一数据库的已知过敏原进行整体-局部序列比对以确定所有可能的连续80个氨基酸的片段的局部过敏原性来沿蛋白质序列评估局部过敏原性。任何80个氨基酸的窗口与任何过敏原的最高同一性百分比被取作目标蛋白质的最终评分。who指导方针建议使用35％同一性截断值。定制数据库包含由食物过敏研究和资源程序(allergenonline.org/)、uniprot注释(uniprot.org/docs/allergen)和过敏原性蛋白质的结构数据库(sdap，fermi.utmb.edu/sdap/sdap_lnk.html)收集的汇合过敏原清单。这个数据库包括由国际免疫学联合会(iuis，allergen.org/)当前认可的所有过敏原以及尚末官方命名的许多其它过敏原。毒性/非过敏原性/抗营养性。蛋白质的毒性、非过敏原性和抗营养性都通过分别确定蛋白质与各数据库的已知毒性、非过敏原性和蛋白酶抑制性蛋白质的同一性百分比来类似地评估。假定毒性和抗营养性特性随完整蛋白质而变(即已知毒性蛋白质的片段将不具有毒性)，因为它们的毒性和抑制性作用机理本质上常与结构相关(huntingtonj,readr,carrellr."structureofaserpin-proteasecomplexshowsinhibitionbydeformation".nature407(2000):923–6；vandenbornh.k.等theoreticalanalysisofthestructureofthepeptidefasciculinanditsdockingtoacetylcholinesterase.proteinsci.4(1995):703-715.；以及harelm.crystalstructureofanacetylcholinesterase-fasciculincomplex:interactionofathree-fingeredtoxinfromsnakevenomwithitstarget.structure.3(1995):1355-1366.)。鉴于蛋白质结构随整个蛋白质序列而变，使用采用blosum50取代矩阵、空位开放罚分10和空位延伸罚分2的fasta算法，相对于两个相应数据库进行目标蛋白质的整体-整体比对。可使用截断值35％。尽管参考文献delaneyb.等evaluationofproteinsafetyinthecontextofagriculturalbiotechnology.food.chem.toxicol.46(2008:s71-s97未提供如何避免毒性/抗营养性多肽的具体说明，但它建议当评估可能的食物蛋白质的安全性时，应避免已知毒性多肽与抗营养性多肽两者。蛋白质的非过敏原性与它在暴露后引发过敏原性应答的可能性相关(类似于过敏原性但与过敏原性相对)。具体来说，人免疫系统被定期暴露于众多可能的过敏原性蛋白质，并且具有确定自身与非自身的固有能力。这个能力的精确本质并非总是明确的，并且存在由于身体未能区分自身与非自身而产生的许多疾病(例如关节炎)。尽管如此，理解是看起来非常像非过敏原性(即人)蛋白质(即与其共有较大程度的序列同源性)的蛋白质引发免疫应答的可能性较小。特定来说，已显示对于一些具有已知过敏原性成员的蛋白质家族(原肌凝蛋白、小白蛋白、酪蛋白)，相对于已知过敏原性蛋白质，携带与它们的人对应物的更大序列同源性的那些蛋白质不被认为具有过敏原性(jenkinsj.a.等evolutionarydistancefromhumanhomologsreflectsallergenicityofanimcalfoodproteins.j.allergyclinimmunol.120(2007):1399-1405.)。对于给定蛋白质，非过敏原性评分是通过由使用采用blosum50取代矩阵、空位开放罚分10和空位延伸罚分2的fasta算法进行整体-局部比对以确定所述蛋白质与某一数据库的人蛋白质的最大同一性百分比来测量。截断值可变化。举例来说，jenkinsj.a.等(evolutionarydistancefromhumanhomologsreflectsallergenicityofanimcalfoodproteins.j.allergyclinimmunol.120(2007):1399-1405)主张与人蛋白质的序列同一性高于约62％的蛋白质具有过敏原性的可能性较小。实施例12.营养性多肽的表达。以下清单包括在大肠杆菌、芽孢杆菌属、黑曲霉和哺乳动物细胞中表达的所有营养性蛋白质序列。在大肠杆菌中，检测全细胞溶解产物或细胞溶解产物的可溶性部分中的蛋白质。在芽孢杆菌属中，检测枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的细胞溶解产物或分泌上清液中的表达。在黑曲霉中，蛋白质从真菌分泌，并且在上清液中检测。对于在哺乳动物细胞中表达的蛋白质，在中国仓鼠卵巢-s株系(cho-s)或人胚肾293f株系(hek293f)中表达它们。通过以下量度来衡量表达：针对如上所述的个别蛋白质表达进行的汇合文库中由lc-ms/ms获得的蛋白质表达数据的质谱测定法光谱计数、sds-page、芯片电泳、斑点印迹、蛋白质印迹(westernblot)和elisa。在大肠杆菌的全细胞溶解产物或细胞溶解产物的可溶性部分中检测到以下营养性多肽：seqid-00001、seqid-00002、seqid-00003、seqid-00004、seqid-00005、seqid-00007、seqid-00008、seqid-00009、seqid-00011、seqid-00012、seqid-00013、seqid-00014、seqid-00015、seqid-00016、seqid-00020、seqid-00021、seqid-00024、seqid-00025、seqid-00027、seqid-00028、seqid-00029、seqid-00030、seqid-00031、seqid-00033、seqid-00043、seqid-00049、seqid-00051、seqid-00052、seqid-00053、seqid-00054、seqid-00055、seqid-00057、seqid-00059、seqid-00060、seqid-00061、seqid-00068、seqid-00070、seqid-00071、seqid-00073、seqid-00074、seqid-00075、seqid-00076、seqid-00077、seqid-00078、seqid-00083、seqid-00084、seqid-00085、seqid-00086、seqid-00087、seqid-00088、seqid-00090、seqid-00091、seqid-00092、seqid-00093、seqid-00098、seqid-00099、seqid-00100、seqid-00101、seqid-00102、seqid-00103、seqid-00104、seqid-00105、seqid-00106、seqid-00107、seqid-00108、seqid-00110、seqid-00112、seqid-00113、seqid-00115、seqid-00116、seqid-00117、seqid-00118、seqid-00123、seqid-00124、seqid-00128、seqid-00130、seqid-00131、seqid-00132、seqid-00134、seqid-00137、seqid-00139、seqid-00140、seqid-00141、seqid-00142、seqid-00143、seqid-00145、seqid-00146、seqid-00148、seqid-00150、seqid-00151、seqid-00152、seqid-00153、seqid-00154、seqid-00155、seqid-00157、seqid-00158、seqid-00159、seqid-00162、seqid-00166、seqid-00169、seqid-00175、seqid-00193、seqid-00194、seqid-00195、seqid-00196、seqid-00197、seqid-00198、seqid-00199、seqid-00200、seqid-00201、seqid-00202、seqid-00203、seqid-00204、seqid-00205、seqid-00211、seqid-00212、seqid-00213、seqid-00214、seqid-00215、seqid-00216、seqid-00218、seqid-00219、seqid-00220、seqid-00221、seqid-00223、seqid-00224、seqid-00225、seqid-00226、seqid-00227、seqid-00228、seqid-00230、seqid-00232、seqid-00233、seqid-00234、seqid-00235、seqid-00236、seqid-00237、seqid-00239、seqid-00240、seqid-00241、seqid-00264、seqid-00265、seqid-00266、seqid-00267、seqid-00268、seqid-00269、seqid-00270、seqid-00271、seqid-00273、seqid-00274、seqid-00275、seqid-00276、seqid-00284、seqid-00287、seqid-00297、seqid-00298、seqid-00299、seqid-00302、seqid-00303、seqid-00304、seqid-00305、seqid-00306、seqid-00307、seqid-00309、seqid-00318、seqid-00322、seqid-00325、seqid-00326、seqid-00327、seqid-00328、seqid-00329、seqid-00332、seqid-00335、seqid-00336、seqid-00337、seqid-00338、seqid-00341、seqid-00343、seqid-00344、seqid-00345、seqid-00346、seqid-00349、seqid-00350、seqid-00352、seqid-00353、seqid-00354、seqid-00355、seqid-00356、seqid-00357、seqid-00358、seqid-00359、seqid-00360、seqid-00362、seqid-00363、seqid-00408、seqid-00409、seqid-00415、seqid-00416、seqid-00418、seqid-00424、seqid-00481、seqid-00482、seqid-00483、seqid-00484、seqid-00485、seqid-00486、seqid-00487、seqid-00488、seqid-00489、seqid-00490、seqid-00491、seqid-00492、seqid-00493、seqid-00494、seqid-00495、seqid-00496、seqid-00497、seqid-00498、seqid-00499、seqid-00500、seqid-00501、seqid-00502、seqid-00503、seqid-00504、seqid-00505、seqid-00506、seqid-00507、seqid-00508、seqid-00509、seqid-00510、seqid-00511、seqid-00512、seqid-00513、seqid-00514、seqid-00515、seqid-00516、seqid-00517、seqid-00518、seqid-00519、seqid-00520、seqid-00521、seqid-00522、seqid-00523、seqid-00524、seqid-00525、seqid-00526、seqid-00527、seqid-00528、seqid-00529、seqid-00530、seqid-00531、seqid-00532、seqid-00533、seqid-00534、seqid-00535、seqid-00536、seqid-00537、seqid-00538、seqid-00539、seqid-00540、seqid-00541、seqid-00542、seqid-00543、seqid-00544、seqid-00545、seqid-00546、seqid-00547、seqid-00548、seqid-00549、seqid-00550、seqid-00551、seqid-00552、seqid-00553、seqid-00554、seqid-00555、seqid-00556、seqid-00557、seqid-00558、seqid-00559、seqid-00560、seqid-00561、seqid-00562、seqid-00563、seqid-00564、seqid-00565、seqid-00566、seqid-00567、seqid-00568、seqid-00569、seqid-00570、seqid-00571、seqid-00572、seqid-00573、seqid-00574、seqid-00575、seqid-00576、seqid-00577、seqid-00578、seqid-00579、seqid-00580、seqid-00581、seqid-00582、seqid-00583、seqid-00584、seqid-00585、seqid-00586、seqid-00587、seqid-00588、seqid-00589、seqid-00590、seqid-00591、seqid-00592、seqid-00593、seqid-00594、seqid-00595、seqid-00596、seqid-00597、seqid-00598、seqid-00599、seqid-00600、seqid-00601、seqid-00602、seqid-00603、seqid-00604、seqid-00605、seqid-00606、seqid-00607、seqid-00608、seqid-00609、seqid-00610、seqid-00611、seqid-00612、seqid-00613、seqid-00614、seqid-00615、seqid-00616、seqid-00617、seqid-00618、seqid-00619、seqid-00620、seqid-00621、seqid-00622、seqid-00623、seqid-00624、seqid-00625、seqid-00626、seqid-00627、seqid-00628、seqid-00629、seqid-00630、seqid-00631、seqid-00632、seqid-00633、seqid-00634、seqid-00635、seqid-00636、seqid-00637、seqid-00638、seqid-00639、seqid-00640、seqid-00641、seqid-00642、seqid-00643、seqid-00644、seqid-00645、seqid-00646、seqid-00647、seqid-00648、seqid-00669、seqid-00670、seqid-00671、seqid-00672、seqid-00673、seqid-00674、seqid-00675、seqid-00676、seqid-00677、seqid-00678、seqid-00679、seqid-00680、seqid-00681、seqid-00682、seqid-00716、seqid-00717、seqid-00718、seqid-00719、seqid-00720、seqid-00723、seqid-00724、seqid-00725、seqid-00726、seqid-00727、seqid-00728、seqid-00729、seqid-00730、seqid-00731、seqid-00732、seqid-00734、seqid-00735、seqid-00736、seqid-00737、seqid-00738、seqid-00739、seqid-00740、seqid-00741、seqid-00742、seqid-00743、seqid-00744、seqid-00745、seqid-00746、seqid-00747、seqid-00748、seqid-00749、seqid-00750、seqid-00751、seqid-00752、seqid-00753、seqid-00754、seqid-00755、seqid-00756、seqid-00757、seqid-00758、seqid-00759、seqid-00760、seqid-00761、seqid-00763、seqid-00765、seqid-00766、seqid-00767、seqid-00768、seqid-00769、seqid-00770、seqid-00771、seqid-00772、seqid-00773、seqid-00774、seqid-00775、seqid-00777、seqid-00778、seqid-00780、seqid-00781、seqid-00782、seqid-00783、seqid-00784、seqid-00785、seqid-00786、seqid-00787、seqid-00788、seqid-00789、seqid-00790、seqid-00791、seqid-00792、seqid-00793、seqid-00794、seqid-00795、seqid-00796、seqid-00797、seqid-00798、seqid-00799、seqid-00801、seqid-00802、seqid-00803、seqid-00804、seqid-00805、seqid-00806、seqid-00807、seqid-00808、seqid-00809、seqid-00810、seqid-00811、seqid-00812、seqid-00813、seqid-00814、seqid-00815、seqid-00816、seqid-00817、seqid-00818、seqid-00819、seqid-00820、seqid-00821、seqid-00822、seqid-00823、seqid-00824、seqid-00825、seqid-00826、seqid-00827、seqid-00828、seqid-00829、seqid-00830、seqid-00831、seqid-00832、seqid-00833、seqid-00834、seqid-00835、seqid-00836、seqid-00837。在枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的细胞溶解产物或分泌上清液中检测到以下营养性多肽：seqid-00003、seqid-00004、seqid-00005、seqid-00087、seqid-00099、seqid-00102、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00115、seqid-00218、seqid-00220、seqid-00223、seqid-00226、seqid-00236、seqid-00240、seqid-00267、seqid-00271、seqid-00276、seqid-00297、seqid-00298、seqid-00299、seqid-00302、seqid-00303、seqid-00304、seqid-00305、seqid-00306、seqid-00307、seqid-00309、seqid-00318、seqid-00322、seqid-00325、seqid-00326、seqid-00327、seqid-00328、seqid-00329、seqid-00330、seqid-00332、seqid-00335、seqid-00336、seqid-00337、seqid-00338、seqid-00340、seqid-00341、seqid-00343、seqid-00344、seqid-00345、seqid-00346、seqid-00349、seqid-00350、seqid-00352、seqid-00353、seqid-00354、seqid-00355、seqid-00356、seqid-00357、seqid-00358、seqid-00359、seqid-00360、seqid-00361、seqid-00362、seqid-00363、seqid-00374、seqid-00389、seqid-00398、seqid-00403、seqid-00404、seqid-00405、seqid-00407、seqid-00409、seqid-00415、seqid-00416、seqid-00417、seqid-00418、seqid-00419、seqid-00420、seqid-00421、seqid-00424、seqid-00481、seqid-00482、seqid-00483、seqid-00484、seqid-00485、seqid-00486、seqid-00487、seqid-00488、seqid-00489、seqid-00490、seqid-00491、seqid-00492、seqid-00493、seqid-00494、seqid-00495、seqid-00496、seqid-00497、seqid-00498、seqid-00499、seqid-00500、seqid-00501、seqid-00502、seqid-00503、seqid-00504、seqid-00505、seqid-00506、seqid-00507、seqid-00508、seqid-00509、seqid-00510、seqid-00511、seqid-00512、seqid-00513、seqid-00514、seqid-00515、seqid-00516、seqid-00517、seqid-00518、seqid-00519、seqid-00520、seqid-00521、seqid-00522、seqid-00523、seqid-00524、seqid-00525、seqid-00526、seqid-00527、seqid-00528、seqid-00529、seqid-00530、seqid-00531、seqid-00532、seqid-00533、seqid-00534、seqid-00535、seqid-00536、seqid-00537、seqid-00538、seqid-00539、seqid-00540、seqid-00541、seqid-00542、seqid-00543、seqid-00544、seqid-00545、seqid-00546、seqid-00547、seqid-00548、seqid-00549、seqid-00550、seqid-00551、seqid-00552、seqid-00553、seqid-00554、seqid-00555、seqid-00556、seqid-00557、seqid-00558、seqid-00559、seqid-00560、seqid-00561、seqid-00562、seqid-00563、seqid-00564、seqid-00565、seqid-00566、seqid-00567、seqid-00568、seqid-00569、seqid-00570、seqid-00571、seqid-00572、seqid-00573、seqid-00574、seqid-00575、seqid-00576、seqid-00577、seqid-00578、seqid-00579、seqid-00580、seqid-00581、seqid-00582、seqid-00583、seqid-00584、seqid-00585、seqid-00586、seqid-00587、seqid-00588、seqid-00589、seqid-00590、seqid-00591、seqid-00592、seqid-00593、seqid-00594、seqid-00595、seqid-00596、seqid-00597、seqid-00598、seqid-00599、seqid-00600、seqid-00601、seqid-00602、seqid-00603、seqid-00604、seqid-00605、seqid-00606、seqid-00607、seqid-00608、seqid-00609、seqid-00610、seqid-00611、seqid-00612、seqid-00613、seqid-00614、seqid-00615、seqid-00616、seqid-00617、seqid-00618、seqid-00619、seqid-00620、seqid-00621、seqid-00622、seqid-00623、seqid-00624、seqid-00625、seqid-00626、seqid-00627、seqid-00628、seqid-00629、seqid-00630、seqid-00631、seqid-00632、seqid-00633、seqid-00634、seqid-00635、seqid-00636、seqid-00637、seqid-00638、seqid-00639、seqid-00640、seqid-00641、seqid-00642、seqid-00643、seqid-00644、seqid-00645、seqid-00646、seqid-00647、seqid-00648、seqid-00653、seqid-00654、seqid-00655、seqid-00656、seqid-00657、seqid-00659、seqid-00660、seqid-00664、seqid-00668、seqid-00670、seqid-00671、seqid-00672、seqid-00673、seqid-00674、seqid-00675、seqid-00676、seqid-00678、seqid-00679、seqid-00680、seqid-00681、seqid-00682、seqid-00690、seqid-00710、seqid-00711、seqid-00712、seqid-00713、seqid-00714、seqid-00715、seqid-00716、seqid-00717、seqid-00718、seqid-00719、seqid-00720、seqid-00723、seqid-00724、seqid-00725、seqid-00726、seqid-00727、seqid-00728、seqid-00729、seqid-00730、seqid-00731、seqid-00734、seqid-00735、seqid-00736、seqid-00737、seqid-00738、seqid-00739、seqid-00740、seqid-00741、seqid-00742、seqid-00743、seqid-00744、seqid-00745、seqid-00746、seqid-00747、seqid-00748、seqid-00749、seqid-00750、seqid-00751、seqid-00752、seqid-00753、seqid-00754、seqid-00755、seqid-00756、seqid-00757、seqid-00758、seqid-00759、seqid-00760、seqid-00761、seqid-00763、seqid-00765、seqid-00766、seqid-00767、seqid-00768、seqid-00769、seqid-00770、seqid-00771、seqid-00772、seqid-00773、seqid-00774、seqid-00775、seqid-00777、seqid-00778、seqid-00780、seqid-00781、seqid-00782、seqid-00783、seqid-00784、seqid-00785、seqid-00786、seqid-00787、seqid-00788、seqid-00789、seqid-00790、seqid-00791、seqid-00792、seqid-00793、seqid-00794、seqid-00795、seqid-00796、seqid-00797、seqid-00798、seqid-00799、seqid-00800、seqid-00801、seqid-00802、seqid-00803、seqid-00804、seqid-00805、seqid-00806、seqid-00807、seqid-00808、seqid-00809、seqid-00810、seqid-00811、seqid-00812、seqid-00813、seqid-00814、seqid-00815、seqid-00816、seqid-00817、seqid-00818、seqid-00819、seqid-00820、seqid-00821、seqid-00822、seqid-00823、seqid-00824、seqid-00825、seqid-00826、seqid-00827、seqid-00828、seqid-00829、seqid-00830、seqid-00831、seqid-00832、seqid-00833、seqid-00834、seqid-00835、seqid-00836、seqid-00837。从黑曲霉的分泌上清液检测到以下营养性多肽：seqid-00087、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00112、seqid-00115、seqid-00218、seqid-00298、seqid-00341、seqid-00352、seqid-00354、seqid-00363、seqid-00406、seqid-00409、seqid-00415、seqid-00416、seqid-00417、seqid-00418、seqid-00419、seqid-00420、seqid-00421、seqid-00424、seqid-00552、seqid-00554。以下营养性多肽在哺乳动物细胞系中国仓鼠卵巢-s株系(cho-s)或人胚肾293f株系(hek293f)中表达：seqid-00001、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00298。实施例13.在大肠杆菌细菌中表达营养性多肽。从可食用物种产生营养性多肽序列文库并筛选以论证在大肠杆菌中表达营养性多肽。基因合成和质粒构建。所有基因都由lifetechnologies/geneart或dna2.0合成制备，并且针对在大肠杆菌中表达加以优化。使用多克隆位点内的ndei-bamhi限制位点(因此含有氨基末端mgsshhhhhhssglvprgsh标签)将基因克隆至pet15b(emdmillipore/novagen)中，或使用引物克隆至ncoi-bamhi位点(因此移除质粒上的氨基末端标签)中以包括含有mgshhhhhhhh或mgshhhhhhhhsenlyfqg的氨基末端标签。pet15b含有pbr322复制起点、lac控制的t7启动子、和赋予对羧苄青霉素的抗性的bla基因。对于手动克隆的片段，使用t7启动子引物与t7终止子引物两者，通过sanger测序来验证插入物。对于分泌构建体，将基因在t5终止子的上游克隆至pj444载体(dna2.0,usa)中，具有c末端hhhhhhhh标签和n末端中的dsba信号肽(atgaaaaagatttggctggcgctggctggtttagttttagcgtttagcgcatcggcg)。菌株构建。t7express感受态大肠杆菌购自newenglandbiolabs，并且用作亲本菌株。t7express是一种增强的bl21衍生物，其在lac操纵元中含有t7rna聚合酶，同时仍然缺乏lon和ompt蛋白酶。t7express的基因型是：fhua2lacz::t7gene1[lon]omptgalsula11r(mcr-73::minitn10--tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10--tets)enda1δ(mcrc-mrr)114::is10。对于分泌构建体，cgsc5610(美国耶鲁大肠杆菌遗传储备物中心(yalee.coligeneticstockcenter,usa))用于研究。cgsc5610的基因型是f-,lacy1或δ(cod-laci)6,glnv44(as),galk2(oc),galt22,λ-,e14-,mcra0,rfbc1,metb1,mcrb1,hsdr2。约1ng上述纯化质粒dna用于转化化学感受态t7express，并且在37℃下孵育约16小时之后在含有100mg/l羧苄青霉素的lb琼脂板上选择单一菌落。将单一菌落接种至含有100mg/l羧苄青霉素的液体lb中，并且生长直至细胞密度od600nm≈0.6，此时，将甘油在10％(v/v)下补充至培养基中，并且获取等分试样以在-80℃下储存在冷冻小瓶中。表达测试。使表达培养物在lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨和5g/l酵母提取物)中或在biosiltaenbase培养基中生长，并且用异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)诱导。对于lb培养基中的表达测试，将菌落或来自甘油储备物的穿刺物接种至3ml补充以100mg/l羧苄青霉素的lb中，并且在37℃和250rpm下生长过夜(约16小时)。次日早晨，测量细胞密度(在od600nm下以分光光度方式)，并且于3ml补充以羧苄青霉素的lb培养基中稀释回到od600nm＝0.05并在37℃和250rpm下生长。在od600nm≈0.8±0.2下，用1mmiptg诱导培养物。使异源性表达在37℃和250rpm下进行2小时，此时终止培养。测量终末细胞密度。对于用enbase培养基的表达，将菌落或来自甘油储备物的穿刺物接种至3ml具有100mg/l羧苄青霉素的lb中，并且在od600＝0.1时转移至具有100mg/l羧苄青霉素和600mu/l的葡糖淀粉酶的enbase培养基中，并在37℃和250rpm下生长过夜，并且次日用1mmiptg诱导。使异源性表达在37℃和250rpm下持续24小时，此时终止培养。测量终末细胞密度，并且通过离心(3000rpm，10分钟，室温)来收集细胞。为测定细胞内产量，根据制造商方案用b-per(pierce)溶解细胞，接着测定以测量目标蛋白质(poi)。为测定分泌蛋白质的水平，通过0.22μm过滤器来过滤0.5ml培养上清液等分试样。接着测定滤液以测定分泌目标蛋白质(poi)的水平。发酵。以20和/或250l发酵方式在大肠杆菌宿主细胞nebt7express(newenglandbiolabs)中表达细胞内可溶性蛋白质seqid-00105、seqid-00240、seqid-00338、seqid-00341、seqid-00352、seqid-00363、seqid-00423、seqid-00424、seqid-00425、seqid-00426、seqid-00429、seqid-00559和seqid-00587。发酵发生在含有以下的富含碳和氮的培养基中：酵母提取物、大豆水解产物、甘油、葡萄糖和乳糖。发酵在30℃下发生，并且诱导在存在于培养基中的葡萄糖被耗尽，并且乳糖变为主要碳源糖时发生。发酵过程时间通常持续24–26小时。发酵操作参数被控制在ph6.9、温度30℃和溶氧百分比35％下。在培养持续时间的稍后阶段，培养物被补充以基于甘油的补料。收集发生在细胞进入静止期，并且不再需要补充氧气以维持35％设置点时。营养性多肽文库基因合成和质粒构建。以线性片段形式产生编码168种不同可食用物种多肽序列的基因，并且针对在大肠杆菌中表达加以密码子选择。在一些情况下，单一线性片段含有两种或更多种编码两种或更多种不同多肽序列的具有侧接5’ndei限制位点和3’bamhi限制位点的核酸序列。所有线性片段都以相等摩尔浓度组合。线性片段用ndei和bamhi消化，并且使用引物将消化的混合物克隆至pet15b(emdmillipore/novagen)中以包括含有mgshhhhhhhh的氨基末端标签和ndei-bamhi限制位点。pet15b含有pbr322复制起点、lac控制的t7启动子、和赋予对羧苄青霉素的抗性的bla基因。对于克隆的片段，使用t7启动子引物与t7终止子引物两者，通过sanger测序来验证插入物。168种营养性多肽的文库菌株构建。t7express感受态大肠杆菌(newenglandbiolabs)用作亲本菌株。t7express是一种增强的bl21衍生物，其在lac操纵元中含有t7rna聚合酶，同时缺乏lon和ompt蛋白酶。t7express的基因型是：fhua2lacz::t7gene1[lon]omptgalsula11r(mcr-73::minitn10--tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10--tets)enda1δ(mcrc-mrr)114::is10。对于分泌构建体，使用cgsc5610(美国耶鲁大肠杆菌遗传储备物中心)。cgsc5610的基因型是f-,lacy1或δ(cod-laci)6,glnv44(as),galk2(oc),galt22,λ-,e14-,mcra0,rfbc1,metb1,mcrb1,hsdr2。将约10ng连接的dna混合物转化至化学感受态t7express中，并且在37℃下孵育约16小时之后在含有100mg/l羧苄青霉素的lb琼脂板上选择单一菌落。进行多重转化，并且将约1000个菌落汇合在一起并混悬至lb培养基中。对来自50-100个菌落的dna测序以确定产生的文库的多样性。168种营养性多肽的文库表达测试。使再混悬于lb培养基中的菌落混合物初始在3ml具有100mg/l羧苄青霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨和5g/l酵母提取物)中生长，接着在od600＝0.1时转移至具有100mg/l羧苄青霉素和600mu/l的葡糖淀粉酶的biosiltaenbase培养基中，在37℃和250rpm下生长过夜，并且次日用1mmiptg诱导。使异源性表达在37℃和250rpm下持续24小时，此时终止培养。测量终末细胞密度，并且通过离心(3000rpm，10分钟，室温)来收集细胞。为测定细胞内产量，使用微射流机使细胞溶解，并且根据制造商方案于5ml镍亲和柱中纯化可溶性部分，接着使用lc-ms/ms进行测定以鉴定如下所述表达的蛋白质。基于ms光谱计数，168种不同蛋白质中的114种在大肠杆菌中成功可溶性表达。基于这个结果，个别地克隆某些基因，并且在大肠杆菌中测试细胞内可溶性表达。在大肠杆菌菌株背景中表达真菌营养性多肽。4种菌株用于表达真菌营养性多肽：来自newenglandbiolabs的t7express、shufflet7和shufflet7express；和来自emdmillipore的origamib(de3)。t7express是一种增强的bl21衍生物，其在lac操纵元中含有t7rna聚合酶，同时缺乏lon和ompt蛋白酶。t7express的基因型是：fhua2lacz::t7gene1[lon]omptgalsula11r(mcr-73::minitn10--tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10--tets)enda1δ(mcrc-mrr)114::is10。shufflet7是一种促进细胞质二硫键形成，并且表达t7rnap的染色体拷贝的k12衍生菌株。shufflet7的基因型是f′lac,pro,laciq/δ(ara-leu)7697arad139fhua2lacz::t7gene1δ(phoa)pvuiiphorahpc*gale(或u)galkλatt::pneb3-r1-cdsbc(specr,laciq)δtrxbrpsl150(strr)δgorδ(malf)3。shufflet7express是一种促进细胞质二硫键形成，并且表达t7rnap的染色体拷贝的bl21衍生菌株。shufflet7express的基因型是fhua2lacz::t7gene1[lon]omptahpcgalλatt::pneb3-r1-cdsbc(specr,laciq)δtrxbsula11r(mcr-73::minitn10--tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10--tets)enda1δgorδ(mcrc-mrr)114::is10。origamib(de3)是一种在trxb和gor中含有促进细胞质中二硫键形成的突变的bl21衍生物。origamib(de3)的基因型是f-ompthsdsb(rb-mb-)galdcmlacy1ahpc(de3)gor522::tn10trxb(kanr,tetr)。如对于大肠杆菌所述来完成对这些菌株的表达筛选。实施例14.在枯草芽孢杆菌细菌中表达营养性多肽。基因合成和质粒构建。所有编码目标蛋白质(poi)的基因都通过pcr来克隆。这些基因的pcr扩增模板是对于在大肠杆菌中表达(参见上文)所产生的合成基因或来自来源生物体(例如枯草芽孢杆菌)的基因组dna。合成基因针对在大肠杆菌中表达加以密码子优化。克隆的所有基因都具有在紧靠终止密码子之前同框融合于它们的3’末端的编码1xflag标签(氨基酸＝dykdddk)的序列。对于在枯草芽孢杆菌中表达，根据制造商说明书，使用gibson组装主混合物(newenglandbiolabs,beverly,ma)和克隆宿主大肠杆菌turbo(newenglandbiolabs)将基因克隆于mobitec(germany)表达载体pht43中。以分泌表达构建体(基因与编码来自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶信号肽(samyq)的dna同框融合)形式或以细胞内表达构建体(基因紧靠核糖体结合位点(rbs)的下游插入，从而移除samyq序列)形式将基因克隆至pht43中。在转化至大肠杆菌中之后，在含有100μg/ml羧苄青霉素(cb100)的lb琼脂板上选择含有重组质粒的细胞。从大肠杆菌分离重组质粒，并且在转化至枯草芽孢杆菌表达宿主中之前通过sanger测序来验证它们的dna序列。菌株构建。枯草芽孢杆菌菌株wb800n购自mobitec(germany)，并且用作表达宿主。wb800n是充分研究的菌株(枯草芽孢杆菌168)的衍生物，并且它已通过缺失编码8种细胞外蛋白酶的基因(npre、apre、epr、bpr、mpr、nprb、vpr和wpra)来工程改造以降低分泌蛋白质的蛋白水解降解。根据制造商说明书进行枯草芽孢杆菌转化。将约1μg各表达构建体转化至wb800n中，并且通过涂铺在含有5.0μg/ml氯霉素(cm5)的lb琼脂上来在37℃下选择单一菌落。使个别转化体在含有cm5的lb肉汤中生长直至它们达到对数期。使这些培养物的等分试样与甘油(20％最终浓度)混合，并且冷冻在-80℃下。表达测试。枯草芽孢杆菌表达菌株的冷冻甘油储备物用于接种于深孔块(96方孔)中的1ml具有cm5的2x-mal培养基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨和10g/l酵母提取物、75g/l麦芽糖)。培养块用多孔粘附性板密封物覆盖，并且在微型表达室(glas-col,terrehaute,in)中在37℃和880rpm下孵育过夜。过夜培养物用于接种于深孔块中的新鲜2x-malcm5培养物以获得起始od600＝0.1。在37℃、880rpm下孵育这些表达培养物直至od600＝1.0(约4小时)，此时通过在最终浓度0.1m下添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)以及继续孵育4小时来诱导它们。在4小时之后，测量各培养物的细胞密度(od600)，并且通过离心(3000rpm，10分钟，室温)来收集细胞。在离心之后，小心移除培养上清液，并且转移至新块中，并将细胞集结块冷冻在-80℃下。为测定分泌蛋白质的水平，首先通过0.45μm过滤器，随后通过0.22μm过滤器来过滤0.5ml培养上清液等分试样。接着测定滤液以测定分泌目标蛋白质(poi)的水平。为测定细胞内产生的poi的水平，使冷冻细胞集结块解冻，并且添加0.5g0.1mm锆珠粒至各样品中，随后添加0.5mlpbs。通过在配备有96孔板适配器的qiagentissuelyserii(qiagen,hilden,germany)中进行珠粒敲打5分钟来在冷室(4℃)中使细胞溶解。在3000rpm下离心细胞溶解产物10分钟，并且移除上清液并如下所述分析poi浓度。为测定分泌蛋白质的水平，通过0.22μm过滤器来过滤0.5ml培养上清液等分试样。接着测定滤液以测定分泌目标蛋白质(poi)的水平。振荡烧瓶表达。从各seqid的琼脂板挑选单一菌落，并且接种至5ml2xmal培养基中。使这些振荡烧瓶接种物在30℃振荡孵育器中生长过夜。5ml的这个过夜培养物用于接种250ml2xmal。使培养物在30℃下生长4小时，接着在30℃下诱导4小时。通过离心来收集培养物。无菌过滤各seqid的离心上清液，并且冷冻在-80℃下。发酵表达。已使seqid-00105的可溶性蛋白质从含有游离性质粒或整合质粒的工程改造的枯草芽孢杆菌菌株分泌。发酵以4l体积发生在含有植物蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖的富含碳和氮的培养基中。使发酵培养物在30℃下，在ph7.0和溶氧百分比40％下生长。通过添加iptg进行的诱导发生在od600nm是5.0(+/-1.0)时。在诱导后，培养物被补充以基于葡萄糖的补料。在诱导后5–8小时收集培养物。接着通过离心移除生物质，并且通过过滤使上清液澄清并储存在4℃下直至处理。168种营养性多肽的文库基因合成和质粒构建。对于在枯草芽孢杆菌中表达，所用载体源于不具有信号肽的pht43骨架载体(mobitecgermany)，并且grac启动子被apre启动子取代，并移除laci表达盒。168种编码以上鉴定的168种不同蛋白质序列的基因由lifetechnologies/geneart以线性片段(基因串列)形式合成制备，并且被选择用于在大肠杆菌中表达。在大多数情况下，两种基因以具有侧接5’ndei限制位点和3’bamhi限制位点的单一线性片段形式合成在一起。所有线性片段都以相等摩尔浓度混合在一起。接着用ndei和bamhi消化线性片段混合物。以分泌表达构建体(基因与编码来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶信号肽(lipasp)的dna同框融合)形式或以细胞内表达构建体(基因紧靠核糖体结合位点(rbs)的下游插入，具有以及不具有含有mgshhhhhhh的n末端标签)形式将消化的混合物克隆至载体中。使用t4dna连接酶(newenglandbiolabs,beverly,ma)使文库基因连接于载体pcr产物。根据制造商说明书将连接产物转化至克隆宿主大肠杆菌turbo(newenglandbiolabs)中。对50-100个菌落测序以确定前导肽文库的多样性。接着将琼脂板上的菌落混悬于lb培养基中，并且收集以进行质粒纯化。168种营养性多肽的文库菌株构建。wb800n是充分研究的菌株(枯草芽孢杆菌168)的衍生物，并且它已通过缺失编码8种细胞外蛋白酶的基因(npre、apre、epr、bpr、mpr、nprb、vpr和wpra)来工程改造以降低分泌蛋白质的蛋白水解降解。枯草芽孢杆菌菌株wb800n购自mobitec(germany)，并且被修饰以具有以下突变wb800n:pxyla-comk::erm,degu32(hy),△sigf。这个新菌株用作表达宿主。将约1μg从大肠杆菌细胞纯化的质粒混合物转化至表达菌株中。在转化之后，将100μl培养物涂铺于4个含有5mg/l氯霉素的lb1.5％琼脂板上，并且在37℃下孵育16小时。在孵育之后，添加2ml具有5mg/l氯霉素的lb培养基至含有数千个转化体的各板的表面，并且通过用细胞涂布器刮擦以及混合来将细胞混悬于表面培养基中。将来自4个平行测定的混悬细胞汇合在一起以形成用于表达实验的预接种物培养物。168种营养性多肽表达测试。使用板读取器，由再混悬细胞制得的预接种物培养物的od600被测量为约20-25。对500ml含有50ml具有5mg/l氯霉素的2xmal培养基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、75g/ld-麦芽糖)的挡板振荡烧瓶接种以获得od600≈0.2来形成接种物培养物，并且在30℃下在250rpm下振荡孵育约6小时。测量od600，并且接种物培养物用于在2l含有250ml具有5mg/l氯霉素、1xteknova微量金属和0.01％消泡剂204的2xmal培养基的挡板振荡烧瓶中接种表达培养物以获得od6000.1。在30℃和250rpm下振荡培养物18小时，此时收集培养物。对于分泌蛋白质文库构建体，测量终末细胞密度，并且通过离心(5000xg，30分钟，室温)来收集上清液并使用0.22um过滤器过滤。对于细胞内蛋白质文库构建体，测量终末细胞密度，并且通过离心(5000xg，30分钟，室温)来收集细胞。接着使用微射流机使细胞溶解，并且如果构建体文库具有n末端his标签，那么使用镍亲和柱纯化可溶性部分。否则可溶性部分用于进一步分析。在sds-page凝胶上操作所有样品，分离成10个部分，接着如下所述使用lc-ms/ms进行分析。168种蛋白质中的40种被成功分泌，168种蛋白质中的10种在无his标签下被成功细胞内产生，并且168种蛋白质中的28种在有5’8xhis标签下在枯草芽孢杆菌中被成功细胞内产生。基于结果，个别地克隆某些基因，并且在枯草芽孢杆菌中测试个别分泌。分泌营养性多肽质粒构建。对于这个研究，通过以下方式来修饰不具有信号肽的pht43骨架载体：移除samyq信号肽以允许天然信号肽来引导分泌，用apre启动子取代grac启动子，移除laci区域，以及在终止子区域之前添加1xflag标签(dykddddk)。来自mobitec的未修饰的pht43载体含有pgrac启动子、samyq信号肽、amp和cm抗性基因、laci区域、repa区域和cole1复制起点。为扩增目标基因，从野生型芽孢杆菌属菌株制备基因组dna制备物。使用尾部含有与pht43骨架的25bp同源区的pcr引物来pcr扩增包括它们的天然信号肽编码区的分泌营养性多肽基因，并且在1％琼脂糖tae凝胶上操作以检查正确插入物大小。将来自各pcr的10μl一起汇合成单一插入物文库，并且使混合物gibson连接于pht43骨架载体。将连接物转化至10-β电感受态细胞(newenglandbiolabs)中，并且将转化的细胞在10-1稀释度下涂铺于4个具有100mg/l羧苄青霉素的lb琼脂板上。使用在启动子区域中进行结合的正向引物和在终止子区域中进行结合的反向引物对1个板测序。添加2ml具有100mg/l羧苄青霉素的lb培养基至剩余3个板中。将细胞刮擦并混悬至lb培养基中，并且从细胞混悬物提取质粒以形成待转化至表达菌株中的多路质粒混合物。类似于168种营养性多肽的文库菌株构建和表达测试来进行分泌多肽文库菌株构建和表达。分泌前导肽文库构建。分泌信号肽文库促进任何给定目标蛋白质的分泌。一种用以增强分泌的方法在于使文库信号肽序列融合于目标蛋白质，并且筛选导致分泌水平最高的那些。此处所述的信号肽文库由鉴定为与枯草芽孢杆菌中天然sec介导的分泌蛋白质相关的173种信号肽组成(brockmeier等molecularbiology,2006)。以seqid-43136融合于来自解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽(samyq)的质粒pes1207起始，产生用于seqid-43136的信号肽文库。pes1207用作以扩增除samyq序列之外的整个质粒的引物pfwd和prev进行的pcr反应的模板。pfwd和prev拥有具有aari限制位点的尾部，并且纯化pcr产物并用aari切割。接着使用antarctic磷酸酶(newenglandbiolabs,beverly,ma)使片段脱磷酸。通过使构成各信号肽序列的正向链和反向链的单链寡核苷酸双链化来构建编码个别信号肽的dna。设计寡核苷酸以使在双链体分子的5’末端形成单链尾部。这些尾部互补于通过aari消化载体pcr片段产生的突出部分。为使寡核苷酸双链化，将先导链和反向链寡核苷酸混合在一起，使用t4多核苷酸激酶(newenglandbiolabs,beverly,ma)来磷酸化并退火。在退火后，在单个管中以相等比例混合信号肽dna序列。使用t4dna连接酶(newenglandbiolabs,beverly,ma)使文库信号肽连接于载体pcr产物。根据制造商说明书将连接产物转化至克隆宿主大肠杆菌turbo(newenglandbiolabs)中。对50-100个菌落测序以确定用于seqid-00298和seqid-00338的前导肽文库的多样性。接着将琼脂板上的菌落混悬于lb培养基中，并且收集以进行质粒纯化。分泌前导肽文库菌株构建。枯草芽孢杆菌菌株wb800n(mobitec,germany)用作表达宿主。将约10μg特定蛋白质构建体的信号肽文库转化至wb800n中，并且通过涂铺在含有5.0μg/ml氯霉素(cm5)的lb琼脂上来在37℃下选择单一菌落。在已被修饰来在sigf孢子形成因子中具有突变，并且细胞内丝氨酸蛋白酶(ispa)也被抗生素标记破坏的枯草芽孢杆菌wb800n中对用于seqid-00105、seqid-00352、seqid-00341、seqid-00103的前导肽文库进行筛选。所述菌株也具有整合至染色体中以达成较高转化效率的诱导性comk(感受态起始转录因子)。分泌前导肽文库表达筛选。枯草芽孢杆菌信号肽文库的400-500个个别转化体用于接种于深孔块(96方孔)中的具有cm5的2x-mal培养基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨和10g/l酵母提取物、75g/l麦芽糖)的个别1ml培养物。除信号肽文库菌株之外，接种含有具有目标蛋白质和samyq前导肽的质粒的菌株作为对照。培养块用多孔粘附性板密封物覆盖，并且在微型表达室(glas-col,terrehaute,in)中在37℃和800rpm下孵育过夜。过夜培养物用于接种于深孔块中的新鲜2x-malcm5培养物以获得起始od600＝0.15。在37℃、880rpm下孵育表达培养物直至od600＝1.0(约4小时)，此时通过在最终浓度1mm下添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)以及继续孵育4小时来诱导它们。在4小时之后，测量各培养物的细胞密度(od600)，并且通过离心(3000rpm，10分钟，室温)来收集细胞。在离心之后，小心移除培养上清液，并且转移至新块中，并将细胞集结块冷冻在-80℃下。为测定分泌蛋白质的水平，首先通过0.45μm过滤器，随后通过0.22μm过滤器来过滤0.5ml培养上清液等分试样。接着如本文所述通过芯片电泳来测定滤液以测定分泌目标蛋白质(poi)的水平，并且与基础构建体的分泌水平进行比较。稀释的过夜培养物用作含有cm5的lb肉汤培养物的接种物。使这些培养物在37℃下生长直至它们达到对数期。使这些培养物的等分试样与甘油(20％最终浓度)混合，并且冷冻在-80℃下。接着使用instagene基质(biorad,usa)纯化前10-15名命中物，并且围绕信号肽进行扩增并送去测序以鉴定信号肽序列。表e14a.枯草芽孢杆菌前导肽文库筛选的示例性结果。实施例15.在黑曲霉真菌中表达营养性多肽。基因合成和质粒构建。使用根据黑曲霉cbs513.88的基因组序列设计的引物，pcr扩增来自黑曲霉atcc64974的编码天然分泌蛋白质的基因。在一个实例中，基因包括天然5’分泌序列，并且在直接受控于来自构巢曲霉的gpda启动子下，在添加c末端3xflag标签(dykdhdgdykdhdidykddddk)下克隆至表达载体pan56-1(genbank：z32700.1)中。在另一实例中，基因仅包括添加有异源性5’分泌信号的成熟肽。使用gibson组装试剂盒(newenglandbiolabs,beverly,ma)构建质粒。在转化至曲霉属宿主中之前，对重组质粒进行序列验证。从bccm/lmbp(ghent,netherlands)获得pfglahil6t。使用gibson组装试剂盒(newenglandbiolabs,beverly,ma)构建质粒。在转化至曲霉属宿主中之前，对重组质粒进行序列验证。使用根据黑曲霉atcc1015的基因组序列设计的引物，pcr扩增来自黑曲霉atcc64974的pyra营养性标记。pyrapcr片段用xbai消化，并且连接至pcsn44(staben等,1989)的xbai片段中以构建pes1947。从bccm/lmbp(ghent,netherlands)获得pcsn44。在转化至曲霉属宿主中之前，对重组质粒进行序列验证。菌株构建。黑曲霉的蛋白酶缺乏性衍生物atcc62590用作表达宿主。使用如punt等,1992,methodsinenzymology,216,447-457中所述的原生质体方法，使表达载体与pes1947共同转化。将约5ug各质粒转化至黑曲霉原生质体中。在补充以1.2m山梨糖醇和1.5％细菌琼脂的基本培养基(10g/l葡萄糖、4g/l硝酸钠、20ml/l盐溶液(含有26.2g/l氯化钾和74.8g/l磷酸二氢钾，在ph5.5下)、1ml/l维生素溶液(含有100mg/l盐酸吡哆辛、150mg/l盐酸硫胺、750mg/l4-氨基苯甲酸、2.5g/l烟酸、2.5g/l核黄素、20g/l氯化胆碱和30mg/l生物素)和1ml/l金属溶液(含有20g/l硫酸锌七水合物(znso4-7h2o)、11g/l硼酸(h3bo3)、5g/l氯化锰(ii)四水合物(mncl2-4h2o)、5g/l硫酸铁(ii)七水合物(feso4-7h2o)、1.7g/l氯化钴(ii)六水合物(cocl2-6h2o)、1.6g/l硫酸铜(ii)五水合物(cuso4-5h2o)、1.5g/l钼酸钠二水合物(namoo4-2h2o)和5.0g/ledta二钠盐二水合物(na2edta-2h2o)，在ph6.5下))上选择转化体。在基本培养基板上分离个别转化体，并且使其在30℃下生长直至它们形成孢子。将孢子收集于水中，并且储存在4℃下。表达测试。将黑曲霉菌株的孢子储备物在106个孢子/毫升下接种至于24孔方底深孔块中的2ml用40mmmes调整至ph7的cm(mm加5.0g/l酵母提取物、2.0g/l酪蛋白氨基酸)和sigmafast蛋白酶抑制剂混合物(1片/100ml，sigmaaldrich)中。培养块用多孔粘附性板密封物覆盖，并且在微型表达室(glas-col,terrehaute,in)中在30℃下在600rpm下孵育48小时。在生长时期之后，首先通过25μm/0.45μm双级过滤器，随后通过0.22μm过滤器来过滤0.5ml培养上清液等分试样。接着测定滤液以测定分泌目标蛋白质(poi)的水平。表e15a.曲霉属前导肽文库筛选的示例性结果。黑曲霉信号肽文库构建。难以预测哪种分泌信号肽将最佳促进任何给定目标蛋白质的分泌。因此，一种用以优化分泌的方法在于使文库信号肽序列融合于蛋白质，并且筛选导致分泌水平最高的那些。我们构建了用于seqid-00409和seqid-00420的信号肽文库。表e15a显示与seqid-00409和seqid-00420融合的信号肽。通过使构成各信号肽序列的正向链和反向链的单链寡核苷酸双链化来构建编码个别信号肽的dna。设计寡核苷酸以使在双链体分子的5’末端形成单链尾部。使用根据黑曲霉cbs513.88的基因组序列设计的引物，pcr扩增来自黑曲霉atcc64974的编码天然分泌蛋白质seqid-00409和seqid-00420的基因。基因包括天然5’分泌序列，并且在直接受控于来自构巢曲霉的gpda启动子下，在添加c末端3xflag标签(dykdhdgdykdhdidykddddk)下克隆至表达载体pan56-1(genbank：z32700.1)中。接着在无天然信号肽下扩增载体，并且使用gibson组装试剂盒(newenglandbiolabs,beverly,ma)以双链体信号肽序列重建具有不同信号肽的质粒。在转化至曲霉属宿主中之前，对重组质粒进行序列验证。使用根据黑曲霉atcc1015的基因组序列设计的引物，pcr扩增来自黑曲霉atcc64974的pyra营养性标记。pyrapcr片段用xbai消化，并且连接至pcsn44(staben等,1989)的xbai片段中以构建pes1947。从bccm/lmbp(ghent,netherlands)获得pcsn44。在转化至曲霉属宿主中之前，对重组质粒进行序列验证。黑曲霉信号肽文库菌株构建。黑曲霉的蛋白酶缺乏性衍生物atcc62590用作表达宿主。使用如punt等,1992中所述的原生质体方法，使各信号肽-基因组合载体与含有营养性标记pyrg的质粒个别地共同转化。将约5ug各质粒转化至黑曲霉原生质体中。在补充以1.2m山梨糖醇和1.5％细菌琼脂的基本培养基(10g/l葡萄糖、4g/l硝酸钠、20ml/l盐溶液(含有26.2g/l氯化钾和74.8g/l磷酸二氢钾，在ph5.5下)、1ml/l维生素溶液(含有100mg/l盐酸吡哆辛、150mg/l盐酸硫胺、750mg/l4-氨基苯甲酸、2.5g/l烟酸、2.5g/l核黄素、20g/l氯化胆碱和30mg/l生物素)和1ml/l金属溶液(含有20g/l硫酸锌七水合物(znso4-7h2o)、11g/l硼酸(h3bo3)、5g/l氯化锰(ii)四水合物(mncl2-4h2o)、5g/l硫酸铁(ii)七水合物(feso4-7h2o)、1.7g/l氯化钴(ii)六水合物(cocl2-6h2o)、1.6g/l硫酸铜(ii)五水合物(cuso4-5h2o)、1.5g/l钼酸钠二水合物(namoo4-2h2o)和5.0g/ledta二钠盐二水合物(na2edta-2h2o)，在ph6.5下))上选择转化体。在基本培养基板上分离个别转化体，并且使其在30c下生长直至它们形成孢子。黑曲霉信号肽文库表达测试。将由各构建体获得的6个不同原代转化体接种至于96深孔培养块中的用160mmmes调整至ph7的补充以5.0g/l酵母提取物、2.0g/l酪蛋白氨基酸的如上定义的1ml基本培养基中。培养块用多孔粘附性板密封物覆盖，并且在微型表达室(glas-col,terrehaute,in)中在33℃下在800rpm下孵育48小时。在生长时期之后，首先通过25μm/0.45μm双级过滤器，随后通过0.22μm过滤器来过滤0.5ml培养上清液等分试样。接着使用如下所述的芯片电泳或如下所述的抗flag斑点印迹和sds-page分析过滤的上清液。基于这些结果，在基本培养基板上分离显示分泌高于天然信号肽的原代转化体，并且使其在30℃下生长直至它们形成孢子。将以上黑曲霉菌株的孢子储备物以及含有具有pgpda启动子以及seqid-00409和seqid-00424的天然信号肽的表达构建体的对照黑曲霉菌株在106个孢子/毫升下接种至于125ml塑料瓶中的用160mmmes调整至ph7的补充以5.0g/l酵母提取物、2.0g/l酪蛋白氨基酸的如上定义的10ml基本培养基中。接着使曲霉属孢子在30℃下在150rpm下生长2天。在生长时期之后，首先通过25μm/0.45μm双级过滤器，随后通过0.22μm过滤器来过滤培养上清液等分试样。接着如本文所述使用sds-page来分析滤液。图5说明相较于天然信号肽，在新信号肽下，seqid-00409(左)和seqid-00420(右)的分泌。黑曲霉异源性营养性多肽基因合成和质粒构建。合成编码营养性多肽的基因(geneart,lifetechnologies)。基因针对在黑曲霉中表达加以密码子优化。pcr扩增合成基因，并且在受控于来自构巢曲霉的gpda启动子下，在添加c末端3xflag标签(dykdhdgdykdhdidykddddk)和在葡糖淀粉酶基因与目标基因之间的克欣蛋白酶(kexinprotease)位点(nviskr)下克隆至融合于具有它的天然前导序列的葡糖淀粉酶的表达载体pan56-1(genbank：z32700.1)中。使用gibson组装试剂盒(newenglandbiolabs,beverly,ma)构建质粒。在转化至曲霉属宿主中之前，对重组质粒进行序列验证。利用seqid-00087、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00115、seqid-00218、seqid-00298、seqid-00302、seqid-00341、seqid-00352、seqid-00354基因。黑曲霉异源性营养性多肽菌株构建。黑曲霉的蛋白酶缺乏性衍生物d15#26(e.karnaukhova等,microbialcellfactories,6:34)用作表达宿主。使用punt等,1992,methodsinenzymology,216,447-457中所述的原生质体方法，使10ug表达载体与1ug含有pyrg选择标记的质粒共同转化。在含有10g/l葡萄糖、6g/l硝酸钠、20ml/l盐溶液(含有26g/l氯化钾和76g/l磷酸二氢钾，在ph5.5下)、2mm硫酸镁、1ml/l维生素溶液(含有100mg/l盐酸吡哆辛、150mg/l盐酸硫胺、750mg/l4-氨基苯甲酸、2.5g/l烟酸、2.5g/l核黄素、20g/l氯化胆碱和30mg/l生物素)和1ml/l金属溶液(含有20g/l硫酸锌七水合物(znso4-7h2o)、11g/l硼酸(h3bo3)、5g/l氯化锰(ii)四水合物(mncl2-4h2o)、5g/l硫酸铁(ii)七水合物(feso4-7h2o)、1.7g/l氯化钴(ii)六水合物(cocl2-6h2o)、1.6g/l硫酸铜(ii)五水合物(cuso4-5h2o)、1.5g/l钼酸钠二水合物(namoo4-2h2o)和5.0g/ledta二钠盐二水合物(na2edta-2h2o)，在ph6.5下)，并且补充以1.2m山梨糖醇和1.5％细菌琼脂的基本培养基上选择转化体。在基本培养基板上分离个别转化体，并且使其在30c下生长直至它们形成孢子。将孢子收集于水中，储存在4c下。黑曲霉异源性营养性多肽表达测试。将由各构建体获得的90个不同原代转化体接种至于96深孔培养块中的补充以1g/l酪蛋白氨基酸的如上定义的1ml基本培养基中(第1mtp)。培养块用多孔粘附性板密封物覆盖，并且在微型表达室(glas-col,terrehaute,in)中在33℃下在800rpm下孵育72小时。在生长时期之后，首先通过25μm/0.45μm双级过滤器，随后通过0.22μm过滤器来过滤0.5ml培养上清液等分试样。如本文所述使用抗flagelisa方法测定滤液以测定分泌目标蛋白质(poi)的水平。由排除seqid-00302的9个表达构建体获得的至少5个菌落在抗flagelisa中产生阳性信号，如表e15b中所报道。也将来自9个表达菌株中的各个的在抗flagelisa测定中显示阳性信号的至少5个原代转化体划线于新鲜基本培养基琼脂板上以达成单一孢子纯化，并且再测试以进行确认(第2mtp)。从板收集孢子，并且用新鲜孢子收获物以约1e9个孢子/毫升的密度进行接种。添加10ul这些孢子收获物至10ml基本培养基中，从而产生1e6个孢子/毫升的起始密度。接着使曲霉属孢子在33c下在150rpm下生长3天。在生长时期之后，首先通过25μm/0.45μm双级过滤器，随后通过0.22μm过滤器来过滤培养上清液等分试样。接着使用下述抗flagelisa、抗flag蛋白质印迹和sds-page分析滤液。使用新鲜孢子收获物，以最终密度约1e6个孢子/毫升，使由不同表达构建体获得的某些克隆在1升基本培养基中生长。接着使曲霉属孢子在33c下在150rpm下生长3天。在生长时期之后，首先通过25μm/0.45μm双级过滤器，随后通过0.22μm过滤器来过滤培养上清液等分试样。接着使用下述抗flagelisa、抗flag蛋白质印迹和sds-page分析滤液。来自1升振荡烧瓶的在抗flagelisa中高于39mg/l的任何分泌蛋白质都被抗flag蛋白质印迹和sds-page检测到。表e15b.说明黑曲霉中不同蛋白质分泌的抗flagelisa结果和抗flag蛋白质印迹结果实施例16.在培养的哺乳动物细胞中表达营养性多肽。基因合成和质粒构建。合成制备(geneart,lifetechnologies)所有基因，并且针对在智人中表达加以优化。选择编码seqid-00001、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00298和seqid-00363的基因用于在哺乳动物细胞中分泌。使所有基因都与来自ig-κ蛋白质的5’信号肽序列(metdtlllwvlllwvpgstgd)和3’末端的hhhhhhhh标签融合。将所有基因构建体都在pcmv启动子的下游，在多克隆位点nhei和bamhi中克隆至pcdna3.1(+)载体(lifetechnologies)中。所有基因序列都在起始密码子的上游含有gcc序列以产生gccatggkozak序列。将所有质粒都转化于大肠杆菌中，进行序列验证，并且纯化10mg各质粒以用于向哺乳动物细胞中转染。菌株构建。选择用于实验的细胞系是2个来自invitrogen的短暂株系freestyletmcho-s细胞(pn51-4448)和freestyletm293f细胞(pn51-0029)。细胞系从invitrogen接收，并且储存在液氮中直至启始亚培养。对于在转染之前的亚培养，使细胞解冻至特定培养基中：使cho-s细胞解冻至30ml补充以8mmglutamax(invitrogenpn35050-061)和1xht(invitrogenpn11067-030)的freestyletmcho表达培养基(invitrogenpn12651-014)中。使293f细胞解冻至30mlfreestyletm293表达培养基(invitrogenpn12338-018)中。使细胞在80％湿度、8％二氧化碳、36.5℃下，在每分钟110转振荡下混悬恢复72小时。使细胞的活细胞密度(vcd)从不超过2.0x106个细胞/毫升转变为0.2x106个细胞/毫升。在转染之前持续亚培养5代。在转染之前26小时，使培养物于60ml的体积中转变回0.6x106个活细胞/毫升。一式两份转染各营养性多肽，其中对于各细胞系进行2个模拟转染作为对照。在转染当天，对细胞计数，并且测定为在1.1x106个细胞/毫升下，其中活力大于98％。转染程序。制备用于120ml总体积(60ml/250ml振荡烧瓶)转染的dna-脂质复合物。在层流通风橱中进行以下程序。将150μg质粒dna稀释至optiprotmsfm降血清培养基(invitrogenpn：12307-050)中以获得总体积2.4ml。温和混合这个溶液，并且进行0.2μm过滤灭菌。将150ulfreestyletmmax试剂(invitrogenpn16447-100)于optiprotmsfm降血清培养基中稀释至总体积2.4ml，温和混合，并且在室温下孵育5分钟。在孵育5分钟之后，添加2.4ml稀释的dna至2.4ml稀释的试剂中，温和混合，并且在室温下孵育20分钟以形成dna-脂质复合物。在孵育20分钟之后，添加2.4ml复合物至各一式两份烧瓶中。对照烧瓶接收2.4mloptiprotmsfm降血清培养基。将转染的烧瓶放置回在80％湿度、8％二氧化碳、36.5℃下，在每分钟110转振荡下的孵育振荡器中。监测培养物的活力％和vcd。在第3天所有烧瓶都补充以在各细胞系特异性的培养基中制备的20％植物蛋白胨补料。烧瓶中的植物蛋白胨的最终浓度等于2％。在第4天通过离心来收集培养物，并且对上清液进行0.2um过滤。在非还原性sds-page12％bis-tris凝胶上操作上清液以确认营养性多肽在各分子量下表达。seqid-00001、seqid-00103、seqid-00105和seqid-00298被确认为由293f细胞表达，但在任何cho-s培养物中都不可检测到可见条带。在凝胶上不可观察到来自293f或cho-s培养物的seqid-00363。通过imac纯化来自293f培养物的seqid-00001、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00298和seqid-00363上清液以及cho-sseqid-00103和seqid-00105上清液。使用293f细胞，于1l振荡烧瓶中，将seqid-00103、seqid-00105和seqid-00298按比例扩大至190ml转染体积。也相应调节转染程序。操作seqid-00103与seqid-00105两者的4x190ml培养物以及seqid-00298的2x190ml培养物。在第2天，这些培养物以用以在培养物中获得2％的最终浓度的20％植物蛋白胨补料来补料，并且在第5天进行收集。实施例17:营养性多肽表达分析。使用多种方法检测细胞内表达和/或分泌的营养性多肽。这些方法包括电泳、蛋白质印迹、斑点印迹、elisa和定量lc/ms/ms。电泳分析。通过芯片电泳(labchipgxii)或sds-page分析来分析细胞外和/或细胞内表达的蛋白质以评估表达水平。对于sds-page，将于与5％β-巯基乙醇混合的invitrogenlds样品缓冲液中的10μl样品煮沸，并且装载于：1)12％bis-tris凝胶(lifetechnologies)，或2)16％三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶(lifetechnologies)上，并使用标准制造商方案进行操作。使用标准制造商方案，利用simplybluetmsafestain(lifetechnologies)将凝胶染色，并且使用moleculargeldoctxr+系统(bio-rad)进行成像。通过相对于分子量标记和对照培养物进行比较来鉴定过度表达的异源性蛋白质。对于芯片电泳(labchipgxii)，使用ht低分子量蛋白质表达试剂盒(遵循制造商方案)，通过添加2μl样品至7μl样品缓冲液中来分析样品。对于分子量测定和定量(分子量以kda计)，每12个样品装载1个蛋白质阶梯。lc-ms/ms分析。可使用lc-ms/ms分析全细胞、细胞溶解产物和分泌样品的蛋白质表达。为分析样品，将10μg样品装载于10％sds-page凝胶(invitrogen)上，并且分离约2cm。将凝胶切成10个区段，并且通过依次用25mm碳酸氢铵和乙腈洗涤来处理凝胶切片。凝胶切片接着在60℃下用10mm二硫苏糖醇还原，随后在室温下用50mm碘乙酰胺进行烷基化。最后，样品用胰蛋白酶(promega)在37℃下消化4小时，并且以添加甲酸来使消化淬灭。上清液样品接着用联接于thermofisherqexactive的watersnanoacquityhplc系统，通过纳米lc/ms/ms来分析。将肽装载于捕集柱上，并且历经75μm分析柱在350nl/min下洗脱；两个柱均填充有jupiterproteo树脂(phenomenex)。采用1小时梯度。以数据依赖性模式操作质谱仪，其中ms和ms/ms分别在70,000fwhm分辨率和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中进行。15种最丰富的离子被选择用于ms/ms。使用mascot相对于适当数据库搜索数据以鉴定肽。将mascotdat文件解析至scaffold软件中以进行验证，过滤，并且创建每个样品的非冗余清单。在1％蛋白质和肽假发现率(fdr)以及每种蛋白质要求至少两种独特肽下过滤数据。抗flag蛋白质印迹。使用蛋白质印迹分析细胞外和/或细胞内蛋白质以评估表达水平。对于sds-page，将于与5％β-巯基乙醇混合的invitrogenlds样品缓冲液中的10μl样品煮沸，并且装载于12％bis-tris凝胶(lifetechnologies)上。对于标准物，0.5μg至2μg氨基末端flag-baptm融合蛋白(sigma)被装载作为阳性对照。根据制造商方案进行凝胶电泳。一旦操作，即根据制造商方案将凝胶转移于小型转移堆积层硝化纤维素0.2μm孔径膜(lifetechnologies)上。接着，从堆积层移除硝化纤维素膜，并且汇集至milliporesnapi.d.2.0蛋白质检测装置中。将30mlmilliporeblokch消噪试剂放置至装配的储集器托盘中，并且使真空穿过。通过将2μlsigma单克隆抗m2-过氧化物酶(hrp)抗体稀释至3mlmilliporeblokch消噪试剂中来制备3ml抗体溶液。添加抗体溶液至储集器托盘中，并且使其在无真空下孵育10分钟。在孵育之后，储集器托盘用90ml1xpbs+0.1％吐温20填充，并且使真空穿过来作为最终洗涤步骤。在洗涤之后，移除硝化纤维素膜，并且放置至试剂托盘中。添加20mlmilliporeluminataclassicowesternhrp底物，并且使其孵育1分钟。在孵育之后，将膜放置至geldoctmxr+系统(bio-rad)的成像托盘中，并且使用化学发光方案来成像。抗flag斑点印迹。使用斑点印迹分析细胞外和/或细胞内蛋白质以评估表达水平。使110μl0.2μm过滤的样品与110μl8.0m盐酸胍、0.1m磷酸钠(变性缓冲液)混合以允许达成均匀蛋白质结合。于与样品相同的基质中，以2μg起始，连续2倍稀释至0.0313μg来制取氨基末端flag-baptm融合蛋白(sigma)的标准曲线。使invitrogen0.45μm硝化纤维素膜于1xpbs缓冲液中预湿润5分钟，接着装载于bio-rad斑点印迹装置上。使真空穿过300μlpbs以使膜进一步湿润。接着，将200μl1:1样品:变性缓冲液混合物装载至各孔中，并且使其靠重力穿过斑点印迹装置排放30分钟。接着，通过真空对所有孔进行300μlpbs洗涤，随后装载300μlmilliporeblokch消噪试剂并孵育60分钟。在阻断之后，用300μl1xpbs+0.1％吐温20洗涤膜。接着，通过将2.4μlsigma单克隆抗m2-过氧化物酶(hrp)抗体添加至12mlmilliporeblokch消噪试剂中(1:5000稀释)来制备抗体溶液。添加100μl所得抗体溶液至各孔中，并且使其靠重力孵育30分钟。在抗体孵育之后，通过真空用300μl1xpbs+0.1％吐温20进行3次最终洗涤。在洗涤之后，移除硝化纤维素膜，并且放置至试剂托盘中。添加20mlmilliporeluminataclassicowesternhrp底物，并且使其孵育1分钟。在孵育之后，将膜放置至geldoctmxr+系统(bio-rad)的成像托盘中，并且使用化学发光方案来成像。抗flagelisa。使用抗flag抗体，通过直接elisa来检测蛋白质表达。简要来说，于0.1mnahco3(ph9.5)中制备一系列稀释(0.005-10μg/ml)flag融合蛋白(sigma)。也于由空真菌培养获得的用过的培养基中制备一系列稀释(0.01-20μg/ml)flag融合蛋白，所述培养基于0.1mnahco3(ph9.5)中稀释10倍。实验培养基样品于0.1mnahco3(ph9.5)中稀释10倍。接着将flag融合蛋白稀释系列和实验样品转移(0.2ml)至nunc-immunotmmaxisorptm(thermo)96孔板的各孔中，并且在2-8℃下孵育过夜以促进蛋白质吸附。次日早晨，用含有0.05％吐温80的tris缓冲盐水(tbs)(tbst)冲洗各板3次。通过与0.2ml溶解于tbst中的1％脱脂奶粉一起在室温下孵育1小时来阻断各孔免遭非特异性蛋白质结合。各板用tbst再冲洗3次，接着在室温下与0.2ml于阻断缓冲液中1:2000稀释的单克隆抗体抗flagm2-hrp(sigma)一起孵育1小时。各板再次用tbst再冲洗3次，随后与0.2ml/孔的sigmafasttm二盐酸邻苯二胺(opd)(sigma)一起在室温下孵育30分钟。以添加0.05ml/孔的1mhcl终止反应，并且在配备有板读取器的分光光度计上在492nm下测量样品的吸光度。实施例18.营养性多肽的治疗性液体制剂。出于治疗目的以多种液体制剂形式施用营养性多肽序列。举例来说，所用制剂的差异在于蛋白质浓度、溶液ph、存在或不存在颗粒、矿物质、促味剂和/或赋形剂添加剂。在治疗性液体制剂中，蛋白质在溶液中的浓度在0.1％至60％w/w的范围内。在某些情况下，较低浓度是优选的。举例来说，seqid-00105已低至10％来给药。在一些情况下，较高浓度是优选的。举例来说，seqid-00105和seqid-00363以35％溶液形式来给药。在一些情况下，营养性多肽序列在它的最大溶解度下给药，所述最大溶解度随蛋白质而变化，并且通常在0.1％至60％w/w的范围内。在50％w/w下，在溶液中，seqid-00105与seqid-00363两者均显示为可溶性液体。在治疗性液体制剂中，溶液ph通常在2至11的范围内。已知蛋白质溶解度随溶液ph强烈变化((c.tanford,physicalchemistryofmacromolecules,第242页,wiley,newyork,1961.)。在大多数情况下，营养性多肽序列在它们的等电点(pi)下的溶解度最小，并且因此溶液ph常被调整至高于或低于营养性多肽序列的pi。这个ph调节允许控制蛋白质溶解度。举例来说，seqid-00105和seqid-00363具有接近4的等电点。这些营养性多肽序列被故意配制在ph8-9下，因此它们将处于高于它们的pi。举例来说，seqid-00587具有pi9.7，并且被故意配制在ph7下，以使它将处于低于它的pi。在它们的pi下可溶的营养性多肽可被配制在它们的pi下以使液体制剂不需要额外缓冲物质来维持溶液ph。在这个情况下，蛋白质自身起使溶液ph缓冲的作用，因为它的自身氨基酸被质子化和去除质子化。当添加酸或碱时，在蛋白质的pi下配制的蛋白质溶液显示对ph变化具有抗性，从而指示溶液实际上通过蛋白质自身来缓冲。在一些治疗性液体制剂中，营养性多肽包括颗粒物质。颗粒物质为眼睛可见，和/或它含有显微可见颗粒(实例是可溶性聚集体)。颗粒物质与产品相关，和/或它是外来的。颗粒物质混悬存在，以浆液形式存在，和/或沉降在溶液底部。在一些实施方案中，颗粒物质是合乎需要的，因为其中它在胃中不可消化或可缓慢消化，它充当向肠递送营养性多肽的载体。在一些实施方案中，颗粒物质在液体制剂中是合乎需要的，因为它允许以高于营养性多肽的溶解度限度来用营养性多肽给药。在seqid-00105的情况下，不存在可见颗粒物质。seqid-00424在混悬有颗粒物质下给药。在治疗性液体制剂中，营养性多肽序列通常与一种或多种溶解于制剂中的赋形剂一起配制。出于特定目的包括各赋形剂。添加缓冲剂(实例：tris、磷酸盐、碳酸氢铵、碳酸钠、乙酸盐、柠檬酸盐、精氨酸)以控制溶液ph。添加糖以控制聚集和溶解度(实例：海藻糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇)。添加去污剂以控制溶解度和聚集(实例是吐温、triton、chaps和脱氧胆酸盐)。添加多元醇以控制溶解度和聚集(甘油、peg)。添加离液剂以增加蛋白质溶解度(实例是硫氰酸盐和尿素)。添加抗氧化剂以防止蛋白质氧化(实例是抗坏血酸和甲硫氨酸)。添加盐以增加蛋白质溶解度和/或实现所需重量摩尔渗透浓度(实例是氯化钠)。seqid-00105、seqid-00363、seqid-00426被配制于磷酸钠和氯化钠中，并且口服给药。seqid-00587和seqid-00559被配制于碳酸氢铵中，并且口服给药。seqid-00240被配制于碳酸钠中，并且口服给药。添加促味剂至营养性多肽中以增强使用者的味觉感受，获得成功结果。根据tang等(tangje,mooredr,kujbidagw,tarnopolskyma,phillipssm.japplphysiol(1985).2009年9月；107(3):987-92)与三氯蔗糖组合添加香草提取物。增强调味剂的定性益处由使用者记载为“相当愉快”。两个表表e18a和表e18b概述向人和向大鼠的许多营养性多肽施用。表e18a.用于人施用的营养性多肽的治疗性液体制剂。表e18b.用于人施用的营养性多肽的治疗性液体制剂。实施例19.营养性多肽的治疗性制剂。作为可溶性均质液体制剂的替代方案，可替代地制备营养性多肽。这个实施例描述替代性营养性多肽制剂，诸如浆液、凝胶剂、片剂和食物成分。浆液制剂。浆液是含有可溶性物质与通常在溶液中显现为精细颗粒的不溶性物质两者的半液体混合物。当营养性多肽在高于它的最大溶解度下浓缩时，或当营养性多肽的冻干或冷冻干燥制剂在高于它的最大溶解度下再混悬时，制备营养性多肽浆液。任选地，在0.1–1％之间的浓度下添加诸如大豆卵磷脂的乳化剂的添加物以稳定浆液的均质性(vannieuwenhuyzen等,1999eur.journaloflipidsci.andtech.)。凝胶制剂。或者，将营养性多肽配制成凝胶剂。凝胶剂是通常通过分子交联形成的固体胶质样制剂。通过用转谷氨酰胺酶(ec编号2.3.2.13)处理来将营养性多肽配制成凝胶剂。转谷氨酰胺酶可催化营养性多肽在肽结合的谷氨酰胺残基的g-羧酰胺基团与营养性多肽结合的赖氨酸残基的e-氨基之间交联。这个g-谷氨酰基-e-赖氨酸形成使蛋白质在溶液中交联；由此促进凝胶形成。人转谷氨酰胺酶是一种钙(ca2+)依赖性酶，对钙的kd在0.3-3um的范围内(ahvazi等,2003journalofbiologicalchemistry)。由于钙在营养性多肽的制剂中的沉淀作用，已鉴定转谷氨酰胺酶的微生物(茂原链霉菌(streptomycesmobaraensis))直系同源物，其以钙非依赖性方式起作用(ando等,1989agricbiolchem)。为制备营养性多肽的凝胶状制剂，在中性ph下在250g/l下可溶性配制营养性多肽。在每g营养性多肽10eu下将转谷氨酰胺酶外加至制剂中，并且使其在35℃下反应直至已发生足够凝胶形成(chen等,2003biomaterials)。片剂制剂。根据sakarkar等2009(internationaljournalofappliedpharmaceutics)来实现对营养性多肽的固体片剂的制备。将片剂配制成营养性多肽、赋形剂和粘合剂的混合物。片剂由50％w/w营养性多肽、26％w/w微晶纤维素、7.5w/w碳酸氢钠-柠檬酸混合物(70:30)、6.5％w/w乳糖、5.5％w/w硬脂酸镁组成，并且由4.5％w/w聚乙烯吡咯烷酮异丙醇溶液结合。在压制成100mg片剂之前，将片剂去湿并粒化。片剂用12.5％w/w乙基纤维素的二氯甲烷和邻苯二甲酸二乙酯(作为塑化剂)溶液包覆。可吸入干燥粉末。如lucas等,1998pharmres中所述配制营养性多肽来以可吸入干燥粉末形式施用。通过喷雾干燥来将营养性蛋白质与麦芽糖糊精一起共同加工以产生模型蛋白质粒子。接着通过翻转混合蛋白质粉末与α-乳糖单水合物(63-90μm)或含有2.5与10％w/w之间的细粒乳糖(fpl)或微粒化聚乙二醇6000的改进乳糖来制备气雾剂制剂。接着在粒度分布、形态和粉末流动方面表征粉末掺合物。常规食物制剂。将营养性多肽作为食物成分配制成干燥固体制剂。举例来说，通过将干燥营养性多肽制剂混入水、硬质粗粒小麦粉、阿拉伯胶、甘油单酯和甘油二酯、纤维、酵母和柠檬酸中来将营养性多肽并入意大利面食面团中。将面团切割成形，干燥并包装。实施例20:体外筛选用于glp-1产生的氨基酸和营养性多肽。升糖素样肽-1(glp-1)是一种由肠的l细胞应答于多种营养物刺激物而产生的肽激素。glp-1是一种通过增加胰岛素从胰腺释放来降低血糖水平的肠促胰岛素。glp-1作用于其它外周组织，从而增加骨骼肌和脂肪组织中的葡萄糖摄取和储存，降低胃排空速率，以及降低肝葡萄糖产生(baggioll和djdrucker.2007.biologyofincretins:glp-1andgip.gastroenterology.132:2131-2157)。glp-1是升糖素原(proglucagon)的翻译后裂解产物以产生活性glp-1(7-36)，这个活性glp-1在分泌之后由二肽基肽酶iv(dppiv)快速降解成glp-1(9-36)。若干哺乳动物胃肠细胞系用作l细胞分泌glp-1的模型(iec-6来自大鼠，nci-h716和fhs74int来自人，并且stc-1和glutag来自小鼠)。这些实验的目的在于确定哪些氨基酸组合、营养性蛋白质消化物和/或全长营养性蛋白质诱导体外glp-1分泌。nci-h716细胞系从美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(目录号ccl-251tm，manassas,va)获得。rpmi-1640、杜贝卡氏改良依格培养基(dulbecco’smodifiedeaglemedium，dmem)和杜贝卡氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)从lifetechnologies(目录号分别是11875、11965和14190；carlsbad,ca)获得。青霉素-链霉素溶液从atcc(目录号30-2300，manassas,va)获得。抗生素-抗霉菌素溶液(100x)从sigma-aldrich(目录号a5955，st.louis,mo)获得。胎牛血清从gehealthcare(目录号sh3007103hi，wilmington,ma)获得。牛血清白蛋白从fisherscientific(目录号bp1600-100，pittsburgh,pa)获得。无脂肪酸牛血清白蛋白从sigma-aldrich(目录号a7030，st.louis,mo)获得。作为蛋白酶抑制剂的苯基甲基磺酰氟(pmsf)从thermoscientific(目录号36978，waltham,ma)获得。作为dppiv抑制剂的抑二肽素a(diprotina)从sigma-aldrich(目录号i9759，st.louis,mo)获得。组织蛋白质提取试剂(t-per)从thermoscientific(目录号78510，waltham,ma)获得。使用alphalisaglp-1(7-36酰胺)免疫测定研究试剂盒(目录号al215，perkinelmer,waltham,ma)测定活性glp-1浓度，并且在enspirealpha板读取器(perkinelmer,waltham,ma)上读取。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析数据。制备克雷布斯林格缓冲液(krebsringerbuffer，krb)，并且alphalisaglp-1(7-36酰胺)免疫测定研究试剂盒从perkinelmer(目录号al215，waltham,ma)获得。96孔板用基质胶预涂布。添加80μl基质胶至5ml无葡萄糖的杜贝卡氏改良依格培养基(dmem)中。每孔添加50μl，并且将板在37℃、5％co2下孵育30分钟。在添加细胞之前吸出基质胶溶液。在补充以10％胎牛血清(fbs)和1％抗生素-抗霉菌素溶液的rpmi-1640培养基中维持nci-h716细胞，并且在37℃、5％co2下在t-75组织培养烧瓶中孵育。每2至3天以1:3或1:6使细胞传代。用0.25％胰蛋白酶-edta使细胞脱离，在37℃、5％co2下孵育，并且在750rpm下离心10分钟以集结细胞。细胞集结块用补充以1％fbs的1x杜贝卡氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)洗涤2次，并且在750rpm下离心10分钟以集结细胞。将细胞再混悬于补充以10％fbs和1％青霉素/链霉素的杜贝卡氏改良依格培养基(dmem)中，并且在血球计上计数。将细胞稀释至1.8×106个细胞/毫升，并且添加200μl至用基质胶预涂布的96孔板的各孔中。在37℃、5％co2下孵育细胞2天。在nci-h716细胞中筛选针对氨基酸处理的glp-1分泌在孵育2天之后，吸出培养基并用200μl饥饿缓冲液[即含有50μg/mlpmsf、34μg/ml抑二肽素a和0.2％无脂肪酸牛血清白蛋白(bsa)的克雷布斯-林格缓冲液(krb)]替换，并且在37℃、5％co2下孵育30分钟。接着吸出饥饿缓冲液并用100μl/孔的含处理物品的饥饿缓冲液替换。用处理物品刺激细胞2小时，接着移除培养基并冷冻在-80℃下。处理物品包括个别氨基酸、氨基酸掺合物、营养性蛋白质消化物和/或全长营养性蛋白质。测定来自上清液的活性glp-1浓度。根据制造商说明书，使用alphalisaglp-1(7-36酰胺)免疫测定研究试剂盒(perkinelmer,al215)测定上清液中活性形式的glp-1(7-36)nh2。于被补充成等效浓度的饥饿缓冲液的测定缓冲液中测定标准物。或者，如本文所述使用酶联免疫吸附测定(elisa)来测量活性形式的glp-1。在microsoftexcel和graphpadprism上分析来自alphalisaglp-1(7-36酰胺)免疫测定或glp-1elisa的发光数据。在graphpadprism6中对活性glp-1浓度进行x＝log(x)变换之后，使用标准物的4参数逻辑模型，通过非线性回归来确定一式两份样品浓度。在graphpadprism6上进行anova和多重比较检验。在测试物品处理之后收集的样品与在媒介物对照处理之后收集的样品的glp-1含量比较描述随时间的归因于测试物品的glp-1分泌的程度。在各处理之间进行的这个差异的比较描述各氨基酸、氨基酸掺合物、营养性蛋白质消化物和营养性蛋白质处理相对于其它氨基酸、氨基酸掺合物、营养性蛋白质消化物和营养性蛋白质处理的差异性影响，并且提供一种将它们的功效分级的手段。由氨基酸达成的glp-1分泌如本文所述使细胞经受氨基酸饥饿，并且用单独刺激缓冲液、19种氨基酸、17种氨基酸(无亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸)、20种氨基酸或单独亮氨酸在它们于dme/f12培养基中的浓度(看见表e20c)下刺激2小时。收集上清液并冷冻在-80℃下。随后测定glp-1(7-36)酰胺浓度。图6显示在刺激之后在上清液中检测的glp-1(7-36)的上清液浓度，误差棒是技术平行测定的标准偏差。14种组合物使glp-1的浓度增加比在仅较大程度缓冲液刺激下观察到的浓度大10％以上(缺乏asn、met、gln、tyr、his、gly、cys、phe、trp、ala、glu、leu、ile和val中的任一个的那些)。2种组合物(缺乏arg的氨基酸和仅leu处理)显示glp-1(7-36)的浓度降低低于仅较低程度缓冲液刺激以下10％。表e20a.氨基酸μm氨基酸μm甘氨酸250l-亮氨酸451l-丙氨酸50l-赖氨酸500l-精氨酸700l-甲硫氨酸116l-天冬酰胺57l-苯丙氨酸215l-天冬氨酸50l-脯氨酸150l-半胱氨酸100l-丝氨酸250l-谷氨酸100l-苏氨酸449l-谷氨酰胺2500l-色氨酸44l-组氨酸150l-酪氨酸214l-异亮氨酸416l-缬氨酸452实施例21.使用营养性多肽来改进健康禁食大鼠的血糖控制。葡萄糖耐受性测试是一种在临床环境与临床前环境两者中衡量血糖控制的常见方法。在测试期间，给与大剂量的葡萄糖，并且在随后时间点获取血液样品以测定血糖水平再正常化的快速程度。在口服葡萄糖耐受性测试(ogtt)中，通过口腔来摄取一定剂量的葡萄糖。所述测试在临床上用于鉴定葡萄糖控制不良的个体(cobelli等,2014)，并且在临床前用于评估抗糖尿病药物的治疗功效(wagman和nuss,2001)(moller,2001)。葡萄糖水平由直接和间接调节葡萄糖水平的许多不同胃肠激素调节，所述激素包括胰岛素、升糖素、生长激素抑制素、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip)和升糖素样肽1(glp-1)。组合测量葡萄糖和胃肠激素用于评估葡萄糖不耐受性、胰岛素抗性和代谢疾病的严重性(ferrannini和mari,2014)。对25只伴有置留性颈静脉导管(jvc)的健康禁食雄性sprague-dawley大鼠进行ogtt以评估营养性多肽给药对血糖控制以及胰岛素和glp-1水平的急性影响。口服葡萄糖耐受性测试。所有啮齿动物都约10-12周龄，称重平均约350g，并且在测试之前驯化4天。动物在研究之前以垫料单独舍饲，并且喂食常规啮齿动物食物膳食(labdiet5001)。舍饲温度保持在22±2℃下，湿度在50±20％下，并且实施12小时光照/12小时黑暗循环。空气循环是用100％新鲜空气达成的每小时10次或大于10次空气变换。在处理之前，使所有大鼠禁食过夜14小时。通过口服管饲来用营养性多肽溶解于水中的制剂处理禁食动物(参见表e21a)，并且在处理剂管饲之后15分钟，接着以口服管饲葡萄糖(2g/kg)来激发。测量血糖，并且在7个时间点(相对于葡萄糖激发，-15、0、15、30、60、90、120分钟)收集血液。将血液收集于含有血浆稳定剂(dpp4抑制剂和蛋白酶混合物抑制剂)的edta收集管中。处死另一只大鼠，并且放血以提供用于分析标准物的未处理血液。使用通过jvc收集的小滴血液，利用血糖仪(alphatrak2,abbott)测量葡萄糖。表e21a.在组1-4中，在6个时间点(-15、0、15、30、60和120分钟)从所有大鼠的jvc收集约300μl血液。定时进行葡萄糖管饲和血液收集以获取每个动物相同时间量以使各动物的样品时间都是准确的。所有时间点都在靶标时间的5％内收集。将血液收集至预冷(0-4℃)k2edta血液收集管中，所述管含有在收集之前在1:100下添加至管中的蛋白酶抑制剂混合物(目录号d8340，sigma-aldrich,st.louis,mo)和dppiv抑制剂(millipore,billerica,ma)。在血液收集之后，维持血液样品冷却(2-6℃)，并且在30分钟内离心。将收集的血浆放置在样品管中并立刻储存在-80℃下。在免疫测定之前，使分析样品在冰上解冻1小时，通过吸移器来彻底混合，再排列至96孔微板中。制备用于胰岛素免疫测定和glp-1免疫测定的单独等分试样。将主板和等分试样冷冻储存在-80℃下。图7显示在本文所述的ogtt期间的平均血糖值。显示的误差棒是平均值标准误差。在葡萄糖激发之后的时间t＝15和t＝30分钟，所有组都显示与空腹的显著血糖差异(p<0.05，dunnett多重比较检验)。在葡萄糖激发之后的时间t＝15和t＝30，接受seqid-00105和seqid-00338的组相对于媒介物显示显著血糖差异(p<0.05，tukey-kramer多重比较检验，在各时间点彼此比较处理组)。这些数据指示在远系杂交雄性sprague-dawley大鼠中，在葡萄糖激发之后，急性摄取seqid-00105和seqid-00338可显著改进血糖控制。在microsoftexcel中使用线性-对数梯形法计算血糖曲线下面积，并且在graphpadprism6上进行统计分析。从0至120分钟以及从0至60分钟积分的血糖曲线下面积(图8)显示在口服葡萄糖耐受性测试的情形下，急性seqid-00105和seqid-00338给药通过降低血糖漂移来改进血糖控制。在0与60分钟之间，seqid-00105与seqid-00338两者相较于媒介物均具有显著较小血糖变化(p<0.05，dunnett氏多重比较检验)。大鼠胰岛素酶联免疫吸附测定(elisa)。超灵敏大鼠胰岛素elisa试剂盒从crystalchem,inc.(目录号90060，downersgrove,il)获得。使用biotekelx50微板条带洗涤器(biotek,winooski,vt)洗涤各板。在synergymx基于单色器的微板读取器(biotek,winooski,vt)上读取吸光度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析数据。在开始测定设置之前，使elisa试剂盒预升温至室温，持续30分钟。根据制造商说明书制备标准曲线稀释物以用广泛范围形式操作测定。使来自未处理组的血浆基质和样品血浆在冰上解冻，接着在4℃下在约1000xrcf下离心10分钟以集结任何不溶性物质。使用来自未处理组的血浆基质制备用于操作胰岛素标准物的基质测定缓冲液以获得于95μl中5.26％浓度。添加95μl测定缓冲液至所有样品孔中，并且添加95μl基质测定缓冲液至所有标准物孔中。一式两份添加5μl各样品和标准物。将各板在4℃下孵育2小时。接着用300μl/孔1x洗涤缓冲液洗涤各板5次。将各板在纸巾上急剧敲打数次以移除任何残余洗涤缓冲液。通过组合2体积抗胰岛素酶缀合物储备物与1体积酶缀合物稀释剂，以及通过上下吸移和温和涡旋进行混合来制备抗胰岛素酶缀合物工作溶液。添加100μl/孔的抗胰岛素酶缀合物工作溶液至所有孔中。密封各板，并且在室温下孵育30分钟，接着用300μl/孔1x洗涤缓冲液洗涤7次。将各板在纸巾上急剧敲打数次以移除任何残余洗涤缓冲液。接着添加100μl/孔酶底物溶液至各孔中，并且在室温下在黑暗中孵育40分钟。添加100μl/孔终止溶液至所有孔中。在synergymx板读取器上在450nm和630nm下读取吸光度。所得终值是a450nm-a630nm值。通过在excel中从各标准物孔a450nm-a630nm值减去0ng/ml胰岛素标准物的平均值来关于胰岛素的基质浓度修正胰岛素标准曲线。在graphpadprism6中对胰岛素浓度进行x＝log(x)变换之后，使用背景修正的标准物的4参数逻辑模型，通过非线性回归来确定一式两份样品浓度。在graphpadprism6上进行anova和多重比较检验。在microsoftexcel上使用线性-对数梯形法将曲线下面积积分，其中在graphpad中进行事后检验。图9显示每个处理组n＝6只大鼠在实验过程中的平均血浆胰岛素浓度。误差棒显示平均值标准误差。在葡萄糖激发之后15、30和60分钟，所有处理组相对于它们的处理剂或媒介物管饲在血浆胰岛素方面都具有统计显著增加(dunnett氏多重比较检验)。仅seqid-00105在葡萄糖激发时(0)的血浆胰岛素浓度相对于在处理剂管饲时的血浆胰岛素具有统计显著增加(p<0.0001，dunnett氏多重比较检验)。在葡萄糖激发之后120分钟，seqid-00105与seqid-00338两者均具有统计显著更大胰岛素浓度(分别p<0.05和p<0.01；dunnett氏多重比较检验)。相较于媒介物，在葡萄糖激发时，仅seqid-00105显示血浆胰岛素浓度统计显著更大增加(p<0.001，dunnett氏多重比较检验)。这些数据指示急性摄取seqid-00105可在摄取的15分钟内在远系杂交雄性sprague-dawley大鼠中刺激胰岛素释放。图10显示所有处理组的在0-240和0-60分钟之间积分的曲线下面积。无处理组统计显著大于媒介物。总glp-1酶联免疫吸附测定(elisa)。大鼠glp-1elisa试剂盒从crystalchem,inc.(目录号81507，downersgrove,il)获得。使用biotekelx50微板条带洗涤器(biotek,winooski,vt)洗涤各板。在synergymx基于单色器的微板读取器(biotek,winooski,vt)上读取吸光度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析数据。在开始测定设置之前，使elisa试剂盒预升温至室温，持续30分钟。根据制造商说明书制备标准曲线稀释物。使来自组5的血浆基质和样品血浆在冰上解冻，接着在4℃下在约1000xrcf下离心10分钟以集结任何不溶性物质。使用来自未处理组的血浆基质制备用于操作glp-1标准物的基质测定缓冲液以获得于100μl中25％浓度。elisa微板用350μl/孔1x洗涤缓冲液洗涤3次，并且在纸巾上急剧敲打以移除残余洗涤缓冲液。添加100μl测定缓冲液至所有样品孔中，并且添加100μl基质测定缓冲液至所有标准物孔中。一式两份添加25μl各样品和标准物。通过吸移来混合各孔。各板用粘附性箔覆盖，并且在水平板振荡器上在室温下在100rpm下孵育18小时。各板接着用350μl/孔1x洗涤缓冲液洗涤3次，接着在纸巾上急剧敲打数次以移除任何残余洗涤缓冲液。添加100μl/孔的生物素标记的抗体溶液至所有孔中。接着密封各板，并且在水平板振荡器上在室温下在100rpm下孵育1小时。各板接着用350μl/孔1x洗涤缓冲液洗涤3次，接着在纸巾上急剧敲打数次以移除任何残余洗涤缓冲液。添加100μl/孔sa-hrp溶液至所有孔中。接着密封各板，并且在水平板振荡器上在室温下在100rpm下孵育30分钟。各板接着用350μl/孔1x洗涤缓冲液洗涤3次，接着在纸巾上急剧敲打数次以移除任何残余洗涤缓冲液。添加100μl/孔酶底物溶液至所有孔中。接着密封各板，并且在室温下在黑暗中在不振荡下孵育30分钟。在底物孵育之后，添加100μl终止溶液至所有孔中。在synergymx板读取器上在450nm和630nm下读取吸光度值。所得终值是a450nm-a630nm值。通过在excel中从各标准物孔a450nm-a630nm值减去0pmglp-1标准物的平均值来关于总glp-1的基质浓度修正标准曲线。在对glp-1浓度进行x＝log(x)变换之后，使用背景修正的标准物的4参数逻辑模型，通过非线性回归来确定一式两份样品浓度。使用graphpadprism6进行anova和多重比较检验。在microsoftexcel上使用线性-对数梯形法将曲线下面积积分，其中在graphpad中进行事后检验。图11显示每个处理组n＝6只大鼠在实验过程中的平均血浆glp-1浓度。此处显示的误差棒对应于平均值标准误差。在葡萄糖激发时，seqid-00338处理组显示统计显著大于媒介物的glp-1浓度(p<0.0005，dunnett氏多重比较检验)。实施例22：使用营养性多肽来改进zucker肥胖(fa/fa)大鼠的血糖控制在18只伴有置留性颈静脉导管(jvc)的禁食雄性zucker肥胖大鼠中进行ogtt以评估营养性多肽给药对血糖控制以及胰岛素和glp-1水平的急性影响。口服葡萄糖耐受性测试。所有啮齿动物都约10-11周龄，称重平均约450g，并且在测试之前驯化4天。动物在研究之前以垫料单独舍饲，并且喂食常规啮齿动物食物膳食(labdiet5001)。舍饲温度保持在22±2℃下，湿度在50±20％下，并且实施12小时光照/12小时黑暗循环。空气循环是用100％新鲜空气达成的每小时10次或大于10次空气变换。在治疗之前，使所有大鼠禁食过夜14小时。通过口服管饲来用营养性多肽溶解于水中的制剂治疗禁食动物(参见表e22a)，并且在治疗剂管饲之后15分钟，接着以口服管饲葡萄糖(5g/kg)来激发。测量血糖，并且在7个时间点(相对于葡萄糖激发，-15、0、15、30、60、90、120分钟)收集血液。将血液收集于含有血浆稳定剂(dpp4抑制剂和蛋白酶混合物抑制剂)的edta收集管中。处死另一只大鼠，并且放血以提供用于分析标准物的未处理血液。使用通过jvc收集的小滴血液，利用血糖仪(alphatrak2,abbott)测量葡萄糖。表e22a.在组1-3中，在6个时间点(-15、0、15、30、60、90和120分钟)从所有大鼠的jvc收集约300μl血液。定时进行葡萄糖管饲和血液收集以获取每个动物相同时间量以使各动物的样品时间都是准确的。所有时间点都在靶标时间的5％内收集。将血液收集至预冷(0-4℃)k2edta血液收集管中，所述管含有在收集之前在1:100下添加至管中的蛋白酶抑制剂混合物(目录号d8340，sigma-aldrich,st.louis,mo)和dppiv抑制剂(millipore,billerica,ma)。在血液收集之后，维持血液样品冷却(2-6℃)，并且在30分钟内离心。将收集的血浆放置在样品管中并立刻储存在-80℃下。在免疫测定之前，使分析样品在冰上解冻1小时，通过吸移器来彻底混合，再排列至96孔微板中。制备用于胰岛素免疫测定和glp-1免疫测定的单独等分试样。将主板和等分试样冷冻储存在-80℃下。图12显示在本文所述的ogtt期间的平均血糖值。显示的误差棒是平均值标准误差。在microsoftexcel上使用线性-对数梯形法计算积分曲线下面积(auc)，并且在graphpadprism6.03上进行统计测试。图13显示各治疗组在葡萄糖激发时间(0分钟)与60分钟之间以及在时间0与120分钟之间的积分auc。在时间0与60分钟之间，无治疗剂显示与媒介物的统计显著差异。在时间0与120分钟之间，seqid-00105而非seqid-00338相较于媒介物显示积分曲线下面积统计显著降低(p<0.005，dunnett氏多重比较检验)。这些数据显示在zucker肥胖(fa/fa)模型啮齿动物模型中，急性seqid-00105给药可使归因于口服葡萄糖激发的葡萄糖漂移降低。大鼠胰岛素酶联免疫吸附测定(elisa)。超灵敏大鼠胰岛素elisa试剂盒从crystalchem,inc.(目录号90060，downersgrove,il)获得。使用biotekelx50微板条带洗涤器(biotek,winooski,vt)洗涤各板。在synergymx基于单色器的微板读取器(biotek,winooski,vt)上读取吸光度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析数据。在开始测定设置之前，使elisa试剂盒预升温至室温，持续30分钟。根据制造商说明书制备标准曲线稀释物以用广泛范围形式操作测定。使来自未处理组的血浆基质和样品血浆在冰上解冻，接着在4℃下在约1000xrcf下离心10分钟以集结任何不溶性物质。使用来自未处理组的血浆基质制备用于操作胰岛素标准物的基质测定缓冲液以获得于95μl中5.26％浓度。添加95μl测定缓冲液至所有样品孔中，并且添加95μl基质测定缓冲液至所有标准物孔中。一式两份添加5μl各样品和标准物。将各板在4℃下孵育2小时。接着用300μl/孔1x洗涤缓冲液洗涤各板5次。将各板在纸巾上急剧敲打数次以移除任何残余洗涤缓冲液。通过组合2体积抗胰岛素酶缀合物储备物与1体积酶缀合物稀释剂，以及通过上下吸移和温和涡旋进行混合来制备抗胰岛素酶缀合物工作溶液。添加100μl/孔的抗胰岛素酶缀合物工作溶液至所有孔中。密封各板，并且在室温下孵育30分钟，接着用300μl/孔1x洗涤缓冲液洗涤7次。将各板在纸巾上急剧敲打数次以移除任何残余洗涤缓冲液。接着添加100μl/孔酶底物溶液至各孔中，并且在室温下在黑暗中孵育40分钟。添加100μl/孔终止溶液至所有孔中。在synergymx板读取器上在450nm和630nm下读取吸光度。所得终值是a450nm-a630nm值。相对于2.5％基质标准物，在1:1稀释度下再操作其中值超过标准曲线的样品。通过在excel中从各标准物孔a450nm-a630nm值减去0ng/ml胰岛素标准物的平均值来关于胰岛素的基质浓度修正胰岛素标准曲线。在graphpadprism6中对胰岛素浓度进行x＝log(x)变换之后，使用背景修正的标准物的4参数逻辑模型，通过非线性回归来确定一式两份样品浓度。在graphpadprism6上进行anova和多重比较检验。在microsoftexcel上使用线性-对数梯形法将曲线下面积积分，其中在graphpad中进行事后检验。图14显示在媒介物和seqid-00105的情况下每个治疗组n＝6只大鼠以及在seqid-00338的情况下每个治疗组n＝5只大鼠在实验过程中的平均血浆胰岛素浓度。单因素anova与dunnett氏多重比较检验一起用于在各治疗剂内与时间0进行比较，以及在治疗剂之间在相同时间点与媒介物进行比较。相较于媒介物管饲的时间，媒介物在血浆胰岛素方面不具有统计显著变化。在葡萄糖激发(时间0)时以及在葡萄糖激发之后15分钟和90分钟，相较于治疗剂管饲的时间(时间-15)，seqid-00105具有统计显著更大血浆胰岛素(分别p＝0.0002、p<0.05和p<0.05)。相较于治疗剂管饲的时间，在所有随后取样时间点，seqid-00338都具有统计显著更大血浆胰岛素浓度(分别p<0.0001、p<0.05、p<0.005、p<0.005和p＝0.0005)。在治疗剂之间比较时，在治疗剂或媒介物管饲时，seqid-00105和seqid-00338都不显著不同于媒介物。在葡萄糖激发和所有随后取样时间点(0、15、30、60和90分钟)时，seqid-00105与seqid-00338两者均比媒介物具有显著更大血浆胰岛素浓度。这显示在zucker肥胖(fa/fa)模型中，两种治疗剂均刺激胰岛素分泌。图15显示各组的积分曲线下面积。仅seqid-00338治疗剂在0与90分钟之间积分时统计显著大于媒介物(p<0.005)。活性glp-1酶联免疫吸附测定(elisa)。大鼠活性glp-1elisa试剂盒从eaglebiosciences(目录号gp121-k01，nashua,nh)获得。使用biotekelx50微板条带洗涤器(biotek,winooski,vt)洗涤各板。在synergymx基于单色器的微板读取器(biotek,winooski,vt)上读取吸光度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析数据。在开始测定设置之前，使elisa试剂盒预升温至室温，持续至少30分钟。根据制造商说明书制备标准曲线稀释物。使来自组5的血浆基质和样品血浆在冰上解冻，接着在4℃下在约1000xrcf下离心10分钟以集结任何不溶性物质。使用来自未处理组的血浆基质制备用于操作活性glp-1标准物的基质测定缓冲液以获得于100μl中10％(针对在1:1稀释度下测试的样品)或于100μl中20％(针对未稀释测试的样品)浓度。添加20μl标准物和样品至预涂布的微板中，并且添加100μl适当测定缓冲液至标准物和样品孔中。各板用粘附性箔覆盖，并且在4℃下避光孵育24小时。各板接着用350μl/孔1x洗涤缓冲液洗涤5次，接着在纸巾上急剧敲打数次以移除任何残余洗涤缓冲液。添加100μl/孔的elisahrp底物至所有孔中。接着密封各板，并且在室温下避光孵育20分钟。添加100μl/孔elisa终止溶液至所有孔中，并且温和混合。在synergymx板读取器上在450nm和620nm下读取吸光度值。所得终值是a450nm-a620nm值。通过在excel中从各标准物孔a450nm-a620nm值减去0pmglp-1标准物的平均值来关于活性glp-1的基质浓度修正标准曲线。在对glp-1浓度进行x＝log(x)变换之后，使用背景修正的标准物的4参数逻辑模型，通过非线性回归来确定一式两份样品浓度。使用graphpadprism6进行anova和多重比较检验。在microsoftexcel上使用线性-对数梯形法将曲线下面积积分，其中在graphpad中进行事后检验。图16显示每个媒介物和seqid-00105治疗组n＝6只大鼠以及每个seqid-00338治疗组n＝5只大鼠在实验过程中的平均血浆glp-1浓度。单因素anova与dunnett氏多重比较检验一起用于在各治疗剂内与时间0进行比较，以及在治疗剂之间在相同时间点与媒介物进行比较。在媒介物管饲之后在任何时间点，媒介物都显示在glp-1(7-36)浓度方面无显著差异。在葡萄糖激发之后在15分钟和30分钟，seqid-00105显示显著更大glp-1(7-36)浓度(分别p<0.0001和p<0.05)。在葡萄糖激发之后在15分钟，seqid-00338具有显著更大glp-1浓度(p<0.005)。当在各时间点相较于媒介物时，仅seqid-00105在葡萄糖激发之后在15分钟比媒介物具有显著更大glp-1(7-36)浓度(p<0.005)。图17显示各治疗组的对于0-90和0-60分钟积分的glp-1(7-36)曲线下面积。相较于媒介物，在0-90或0-60分钟，无治疗剂具有显著不同glp-1(7-36)积分auc。在另一实验中，在24只伴有置留性颈静脉导管(jvc)的禁食雄性zucker肥胖大鼠中进行ogtt以评估营养性蛋白质给药对血糖控制以及胰岛素和glp-1水平的急性影响。通过在口服葡萄糖耐受性测试的情形下比较seqid-00105相对于阿格列汀(alogliptin)相对于seqid-00105+阿格列汀相对于媒介物的血糖漂移来测试seqid-00105改进葡萄糖控制的能力。所有啮齿动物都约10-11周龄，称重平均约430g，并且在测试之前驯化4-5天。在治疗之前，使所有大鼠禁食过夜14小时。通过口服管饲来用营养性蛋白质溶解于水中的制剂治疗禁食动物(参见表e22b)，并且在治疗剂管饲之后15分钟，接着以口服管饲葡萄糖(2g/kg)来激发。测量血糖，并且在9个时间点(相对于葡萄糖激发，-15、0、15、30、60、90、120、180和240分钟)收集血液。表e22b图18显示在本文所述的ogtt期间的平均血糖值。每个治疗组，n＝6只大鼠。显示的误差棒是平均值标准误差。在graphpadprism6上将各组进行事后比较，其中两因素anova、dunnett氏多重比较检验首先在各组内与空腹葡萄糖浓度进行比较，随后与媒介物进行各时间点比较。在葡萄糖激发时，无治疗组血糖显著不同于禁食。在各组与媒介物之间，空腹葡萄糖和在葡萄糖激发时的血糖不显著不同。在葡萄糖激发之后在15分钟，仅seqid-00105以及seqid-00105+阿格列汀相较于媒介物具有显著更低血糖(分别p＝0.0003和p<0.0001)。在葡萄糖激发之后在30分钟，单独阿格列汀以及seqid-00105+阿格列汀比媒介物具有显著更低血糖(分别p＝0.0424和p＝0.0021)。在葡萄糖激发之后在60分钟，仅单独阿格列汀显著低于媒介物(p<0.0001)。在60分钟之后，无群组与媒介物具有显著不同血糖。在microsoftexcel上使用线性-对数梯形法计算积分曲线下面积(auc)，并且在graphpadprism6.03上进行两因素anova和dunnett氏多重比较检验。在时间0与60分钟之间，无治疗剂显示与媒介物在葡萄糖auc方面的统计显著差异。在时间0与120分钟之间以及在时间0与240分钟之间，仅单独阿格列汀治疗显著小于媒介物(分别p＝0.0051和p＝0.0054)。实施例23：使用营养性多肽来改进膳食诱发肥胖小鼠的血糖控制和空腹葡萄糖通过在膳食诱发肥胖(dio)小鼠中进行口服葡萄糖耐受性测试来评估本文所述的治疗性营养性多肽的慢性给药的影响。特定来说，在代谢疾病的这个动物模型中慢性给药可影响血糖控制、胰岛素抗性、空腹葡萄糖和胰岛素水平，并且比较在一段时期的每日给药之前和之后的空腹水平以及在ogtt期间的葡萄糖曲线下面积(auc)提供化合物功效的量度。持续14周对四组各10只雄性c57bl/6小鼠喂食高脂肪膳食以确保它们显现空腹葡萄糖水平升高(高血糖症)、空腹胰岛素水平升高(高胰岛素血症)和葡萄糖控制受损(xu.h.等chronicinflammationinfatplaysacrucialroleinthedevelopmentofobesity-relatedinsulinresistance.j.clin.invest.(2003)112:1821-1830)。对单组10只雄性c57bl/6小鼠(组1)喂食正常膳食以用于将采用hfd的治疗组别与处于相同龄期、处理和舍饲条件下的正常膳食组别进行比较。所有小鼠在开始研究之前都被舍饲并驯化3天。所有小鼠在ogtt处理之前都被禁食过夜14小时，并且在研究当天早晨在给药之前收集血液样品以分析空腹葡萄糖和激素水平。在葡萄糖激发之前15分钟，通过管饲来用提供的营养性多肽的制剂治疗禁食动物。在时间零时，口服施用葡萄糖(2g/kg)。测量在7个时间点(-15、0、15、30、60、90、120分钟)的血糖。处于常规膳食下的年龄匹配的正常小鼠用作分析的内标。在组2-5中，通过每日管饲或配制至食物中，小鼠持续15-30天接受每日剂量的所提供的治疗性营养性多肽(2.85g/kg)(组4和5)或媒介物对照(组2和3)。将所有血液都收集于含有血浆稳定剂(dpp4抑制剂和蛋白酶混合物抑制剂)的edta收集管中，处理以获得血浆，并且冷冻储存在-80℃下。在研究的最后一天用媒介物(组2和4)或测试物品(组1、3和5)再次进行如上所述的ogtt。在最终测试物品或媒介物剂量之前，收集血液样品以分析空腹葡萄糖和激素水平。在完成最终ogtt时，处死所有小鼠，并且通过心脏穿刺来收集完整血液体积。使用本文所述的elisa方法进行胰岛素水平分析。在组2和4之间进行的研究末尾ogtt葡萄糖auc比较描述慢性测试物品施用的影响而无测试物品施用对ogtt的急性影响。在组3和5之间进行的研究末尾ogtt葡萄糖auc比较描述慢性测试物品施用的影响，并且包括测试物品施用对ogtt的急性影响。在组4内或在组5内进行的研究开始和结束时的空腹葡萄糖和胰岛素水平比较描述慢性给药对空腹葡萄糖和胰岛素水平的影响。实施例24：使用营养性多肽来诱导啮齿动物的胰岛素分泌已显示摄取的氨基酸能够诱导胰岛素分泌(gannonm.c.和f.q.2010.nuttall.aminoacidingestionandglucosemetabolism--areview.iubmblife,62(9):660-668)。蛋白质摄取相较于单独葡萄糖摄取会显著增加血浆胰岛素(nuttall等1984.effectofproteiningestionontheglucoseandinsulinresponsetoastandardizedoralglucoseload.diabetescare.7(5):465-470)。摄取的蛋白质部分地通过在腔性暴露于营养物后由内分泌细胞分泌的肠促胰岛素激素(即升糖素样肽-1(glp-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip))的作用来增加胰岛素分泌(baggioll和djdrucker.2007.biologyofincretins:glp-1andgip.gastroenterology.132:2131-2157)。也已显示诸如亮氨酸和精氨酸的氨基酸会直接刺激胰岛素释放(newsholmep.等newinsightsintoaminoacidmetabolism,b-cellfunctionanddiabetes.clin.sci.(2005)108:185-194)。在这些研究中，测量啮齿动物中在各种营养性蛋白质的急性给药之后的胰岛素应答。处理动物并用各种测试物品急性给药来作为根据本文所述的方法进行的药物动力学啮齿动物实验的一部分。除非另外陈述，否则所有给药都在每kg体重2.85g下进行。除具有n＝5只大鼠的seqid-00240和具有n＝3的seqid-00587之外，所有处理组都含有n＝4只大鼠。使用胰岛素免疫测定来定量血浆胰岛素使血浆样品在冰上解冻，并且在1109xg下离心10分钟以集结不溶性物质。从4℃冷室移除胰岛素免疫测定试剂盒(perkinelmer,al204c)，并且在测定设置期间保持在冰上。通过用milliq水稀释10x测定缓冲液来制备1x测定缓冲液。于1x测定缓冲液中在25.9％禁食大鼠血浆下制备用于稀释胰岛素的标准物缓冲液，并且用于制取16点标准曲线。通过在96孔pcr微板中于1x测定缓冲液中7:20稀释来制备血浆样品。通过于1x测定缓冲液中1/400稀释接受体珠粒和生物素化抗胰岛素抗体来制备接受体珠粒混合物。将接受体珠粒混合物以20μl/孔吸移至白色不透明384孔微板(perkinelmer,optiplate-384)中，向这个混合物中一式两份添加10μl/孔的含胰岛素标准物的禁食大鼠血浆或样品大鼠血浆。将板用箔板密封物密封，并且在水平振荡器上在室温下在约600rpm下孵育60分钟。有必要保护抗生蛋白链菌素涂布的供体珠粒免遭光照；因此，在暗室中，通过于1x测定缓冲液中1/125稀释抗生蛋白链菌素涂布的供体珠粒来制备供体珠粒。在第一孵育步骤之后，添加20μl/孔供体珠粒混合物至标准物和样品中。密封测定板，并且使其返回至水平振荡器中，在室温下在约600rpm下持续30分钟。在供体珠粒孵育之后，在enspirealpha板读取器上读取发光。用microsoftexcel14.0.7128.5000版(32位)和graphpadprism6.03版分析数据。相对于log(胰岛素(μiu))来产生标准曲线。使用s形4参数逻辑等式来内推大鼠血浆胰岛素浓度。相对于时间绘制各大鼠在技术平行测定中的一式两份胰岛素浓度的平均值。在microsoftexcel中使用线性-对数线性法将曲线下面积关于0-240分钟和0-60分钟积分。使用大鼠胰岛素酶联免疫吸附测定(elisa)来定量血浆胰岛素。超灵敏大鼠胰岛素elisa试剂盒从crystalchem,inc.(目录号90060，downersgrove,il)获得。使用biotekelx50微板条带洗涤器(biotek,winooski,vt)洗涤各板。在synergymx基于单色器的微板读取器(biotek,winooski,vt)上读取吸光度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析数据。在开始测定设置之前，使elisa试剂盒预升温至室温，持续30分钟。根据制造商说明书制备标准曲线稀释物以用广泛范围形式操作测定。使来自未处理组的血浆基质和样品血浆在冰上解冻，接着在4℃下在约1000xrcf下离心10分钟以集结任何不溶性物质。使用来自未处理组的血浆基质制备用于操作胰岛素标准物的基质测定缓冲液以获得于95μl中5.26％浓度。添加95μl测定缓冲液至所有样品孔中，并且添加95μl基质测定缓冲液至所有标准物孔中。一式两份添加5μl各样品和标准物。将各板在4℃下孵育2小时。接着用300μl/孔1x洗涤缓冲液洗涤各板5次。将各板在纸巾上急剧敲打数次以移除任何残余洗涤缓冲液。通过组合2体积抗胰岛素酶缀合物储备物与1体积酶缀合物稀释剂，以及通过上下吸移和温和涡旋进行混合来制备抗胰岛素酶缀合物工作溶液。添加100μl/孔的抗胰岛素酶缀合物工作溶液至所有孔中。密封各板，并且在室温下孵育30分钟，接着用300μl/孔1x洗涤缓冲液洗涤7次。将各板在纸巾上急剧敲打数次以移除任何残余洗涤缓冲液。接着添加100μl/孔酶底物溶液至各孔中，并且在室温下在黑暗中孵育40分钟。添加100μl/孔终止溶液至所有孔中。在synergymx板读取器上在450nm和630nm下读取吸光度。所得终值是a450nm-a630nm值。通过在excel中从各标准物孔a450nm-a630nm值减去0ng/ml胰岛素标准物的平均值来关于胰岛素的基质浓度修正胰岛素标准曲线。在graphpadprism6中对胰岛素浓度进行x＝log(x)变换之后，使用背景修正的标准物的4参数逻辑模型，通过非线性回归来确定一式两份样品浓度。在graphpadprism6上进行anova和多重比较检验。在microsoftexcel中使用线性-对数线性法将曲线下面积关于0-240分钟和0-60分钟积分。体内血浆胰岛素浓度图19和20显示用媒介物和在3种不同剂量下施用的seqid-00105以及在1种剂量下施用的seqid-00426、seqid-00338、seqid-00341进行的研究的组合生物平行测定数据，其中使用alphalisa胰岛素试剂盒测量血浆胰岛素。所有误差棒都代表平均值标准误差。单因素anova与dunnett氏多重比较检验一起用于在各处理剂内与时间0进行比较，以及在处理剂之间在相同时间点与媒介物进行比较。在图19中，在管饲之后在15、30和60分钟，在2.85g/kg下的seqid-00105具有统计显著血浆胰岛素浓度增加(分别p<0.0001、p<0.0001和p<0.05)；在管饲之后在15和30分钟，在1.78g/kg下的seqid-00105具有统计显著血浆胰岛素浓度增加(分别p＝0.0005和p<0.05)；在最低seqid-00105剂量下，血浆胰岛素浓度在时间过程中不显著不同于时间0。当在各时间点相较于媒介物对照的血浆胰岛素浓度时，在口服管饲之后在15分钟和30分钟，在2.85g/kg下的seqid-00105显示统计显著大于媒介物的血浆胰岛素(分别p<0.0001和p<0.001)，在口服管饲之后在15分钟，在1.78g/kg下的seqid-00105显示统计显著血浆胰岛素浓度增加(p＝0.0005)。在图20中，仅seqid-00338在口服管饲之后在15和30分钟，具有就0时而言的血浆胰岛素浓度统计显著增加(分别p＝0.005和p<0.05)。当相较于处于各浓度下的媒介物血浆胰岛素浓度时，在口服管饲之后在15分钟，seqid-00338显著大于媒介物(p<0.01)。图21和22显示对媒介物、seqid-00105、seqid-00426、seqid-00338、seqid-00341测量的血浆胰岛素浓度的积分曲线下面积，误差棒是平均值标准误差。单因素anova与dunnett氏多重比较检验一起用于与媒介物比较auc。当从0至240分钟以及0至60分钟积分时，在2.85g/kg下的seqid-00105比媒介物具有统计显著更大血浆胰岛素auc(分别p＝0.0005和p<0.05)。图23和24显示用媒介物以及seqid-00423、seqid-00587、seqid-00105、seqid-00424、seqid-00425和seqid-00429进行的研究的组合生物平行测定数据，其中使用alphalisa胰岛素试剂盒测量血浆胰岛素。所有误差棒都代表平均值标准误差。单因素anova与dunnett氏多重比较检验一起用于在各处理剂内与时间0进行比较，以及在处理剂之间在相同时间点与媒介物进行比较。图25和26显示图23和24中所示的血浆胰岛素浓度的积分曲线下面积。单因素anova与dunnett氏多重比较检验一起用于与媒介物比较auc。当在0-240分钟下积分时，seqid-00587具有显著更大血浆胰岛素auc(p<0.005)。图27显示用媒介物以及seqid-00105、seqid-00240和seqid-00559进行的研究的组合生物平行测定数据，其中使用大鼠胰岛素elisa试剂盒测量血浆胰岛素。所有误差棒都代表平均值标准误差。单因素anova与dunnett氏多重比较检验一起用于在各处理剂内与时间0进行比较。相较于时间0，在管饲后在15分钟，seqid-00105与seqid-00559两者均具有统计显著血浆胰岛素浓度增加(两者均为p<0.05)。相较于时间0，在管饲后在15和30分钟，seqid-00240具有统计显著血浆胰岛素增加(分别p<0.05和p<0.01)。相较于时间0，媒介物不具有统计显著血浆胰岛素浓度变化。图28显示各处理剂在管饲后0至240和0-60分钟的积分曲线下面积，误差棒是平均值标准误差。根据dunnett氏多重比较检验，相较于媒介物，在0-60或0-240分钟，无处理剂显示显著更大auc。实施例25：营养性多肽刺激健康禁食大鼠的升糖素样肽2分泌。升糖素样肽-2(glp-2)是一种通过翻译后裂解升糖素原产生的33个氨基酸的肽。glp-2连同glp-1一起由人和啮齿动物的肠内分泌l细胞应答于暴露于肠腔中的营养物而分泌。先前已显示glp-2通过支持肠生长(liux,muralisg,holstjj,neydm.2008.enteralnutrientspotentiatetheintestinotrophicactionofglucagon-likepeptide-2inassociationwithincreasedinsulin-likegrowthfactor-iresponsesinrats.am.j.physiol.gastrointest.liverphysiol.295(6):r1794-r1802)来改进治疗短肠综合征的结果(brinkmanas,muralisg,hitts,solversonpm,holstjj,neydm.2012.enteralnutrientspotentiateglucagon-likepeptide-2actionandreducedependenceonparenteralnutritioninaratmodelofhumanintestinalfailure.am.j.physiol.gastrointest.liverphysiol.303(5):g610-g622)。处理动物并用测试物品急性给药来作为根据本文所述的方法进行的药物动力学啮齿动物实验的一部分。在这个实验中，分析2种测试物品，即媒介物和在1.54g/kg下给药的seqid-240的营养性制剂。总glp-2酶联免疫吸附测定(elisa)用millipore总glp-2elisa试剂盒(millipore,ezglp2-37k)测量总glp-2。在操作测定之前，使elisa试剂盒平衡至室温，持续至少30分钟。试剂盒glp-2标准物、品质控制物1和品质控制物2用500μlmilliq水复原，倒置5次，并且在室温下孵育5分钟，接着温和涡旋以进行混合。通过于试剂盒测定缓冲液中1:1连续稀释glp-2标准物以产生包括0ng/mlglp-2的8点标准曲线来制取标准曲线。使血浆样品在冰上解冻，并且在约1109xrcf下离心10分钟以集结不溶性物质。制备用于在20％(2x)下一式两份操作标准物和品质控制物的来自未处理禁食大鼠的禁食血浆基质。通过组合50ml10x洗涤缓冲液与450mlmilliq水来在清洁500ml玻璃瓶中制备1x洗涤缓冲液。通过用以30-300μl8通道吸移器施加的300μl1x洗涤缓冲液洗涤3次来制备各条带。在各次洗涤之间，将洗涤缓冲液倾析至废物贮器中，并且将板在一叠纸巾上急剧敲打以移除剩余洗涤缓冲液。在首次洗涤之后，添加90μl测定缓冲液至样品孔中，并且添加50μl含20％基质的测定缓冲液至所有标准物和品质控制物孔中。添加10μl样品至各样品孔中，并且添加50μl标准物和品质控制物至含有基质的孔中。一式两份操作样品、标准物和品质控制物孔，例外之处是一式四份操作的0ng/mlglp-2标准物。将板用塑料板密封物密封，并且在水平板振荡器上在室温下在450rpm下孵育2小时。在首次孵育之后，将板用1x洗涤缓冲液洗涤3次，其中在各次洗涤之后，向废物贮器中倾析，并且在一叠纸巾上急剧敲打倒置的板以移除过量洗涤缓冲液。添加100μl检测抗体至各孔中，并且将板用塑料板密封物密封并在水平板振荡器上在室温下在450rpm下孵育1小时。在第二次孵育之后，将板用1x洗涤缓冲液洗涤3次，其中在各次洗涤之后，向废物贮器中倾析，并且在一叠纸巾上急剧敲打倒置的板以移除过量洗涤缓冲液。添加100μl酶溶液至各孔中，并且将板用塑料板密封物密封并在水平板振荡器上在室温下在450rpm下孵育30分钟。在第三次孵育之后，将板用1x洗涤缓冲液洗涤3次，其中在各次洗涤之后，向废物贮器中倾析，并且在一叠纸巾上急剧敲打倒置的板以移除过量洗涤缓冲液。添加100μl底物至各孔中，并且将板用塑料板密封物和不透明箔密封物密封并在水平板振荡器上在室温下在450rpm下孵育20分钟。在底物反应之后，添加100μl终止溶液至各孔中，并且将板温和振荡以进行混合。在synergymx板读取器上在450nm和590nm下测量吸光度。测量值是450nm吸光度值与590nm吸光度值之间的差异。用graphpadprism6.03分析数据。在减去0ng/ml背景值之后，相对于log(总glp-2(ng/ml))来产生标准曲线。使用s形4参数逻辑等式来内推大鼠血浆glp-2浓度。相对于时间绘制各大鼠在技术平行测定中的一式两份glp-2浓度的平均值。在microsoftexcel上计算积分曲线下面积，其中使用线性-对数梯形法将各生物平行测定的在各时间点之间的面积计算为面积总和。图29显示seqid-00240和媒介物对照的在4小时时间过程中的计算总glp-2浓度。相较于时间0，媒介物glp-2浓度在任何取样时间点都不显著变化，而相对于时间0，在seqid-00240管饲之后在15(p<0.00)、30(p<0.0001)和60分钟(p<0.01)，seqid-00240显示glp-2浓度统计显著增加(dunnett氏多重比较检验)。通过普通单因素anova与dunnett氏多重比较检验事后分析来将seqid-00240与媒介物在各时间点进行比较。在处理剂之间，在时间0时，glp-2浓度不显著不同。在处理之后在15(p<0.001)、30(p<0.0001)、60(p<0.0001)和120分钟(p<0.05)，glp-2浓度统计显著大于媒介物。这些数据显示某一急性剂量的seqid-00240而非媒介物会诱导健康禁食啮齿动物的glp-2分泌。图30显示在第一小时和全部4小时中的积分glp-2曲线下面积。当在0-60分钟内以及在0-240分钟内积分时，相较于媒介物，在seqid-00240处理时的glp-2曲线下面积显著更大(分别p<0.005和p<0.01，未配对双尾student氏t检验)。这个数据指示相较于媒介物，在于健康禁食啮齿动物中急性给药的第一小时内，急性seqid-00240给药显著刺激glp-2分泌。实施例26：口服递送的营养性多肽对人的血浆胰岛素和肠促胰岛素水平的影响对蛋白质摄取的胰岛素和肠促胰岛素应答是以氨基酸的递送为基础。这个研究的目的在于在240分钟的时期内考查应答于seqid-00426和seqid-00105的血浆胰岛素浓度变化。2组各4名年龄在18岁与50岁之间的表观健康的受试者口服接受20克营养性多肽制剂。所有受试者在开始研究之前都禁食过夜(>8小时)。在口服摄取营养性多肽之后在指定时间点(即0、15、30、60、90、120、150、180、210和240分钟)收集静脉血液样品以评估血浆胰岛素和肠促胰岛素浓度变化。图31显示所有受试者对seqid-00105的平均胰岛素应答，而图32显示超过基线(时间0分钟)的平均应答倍数，如本文描述所测量。所有图上的误差棒都对应于平均值标准误差。第一阶段胰岛素应答发生在时间0分钟与90分钟之间。第二阶段胰岛素应答发生在90分钟与210分钟之间。跨越时间的单因素anova比较指示血浆胰岛素随时间存在显著变化(p＝0.003)。dunnett多重比较检验指示在15和30分钟时间点的胰岛素值显著不同于在时间0分钟的胰岛素值(p<0.05)。图33显示所有患者对seqid-00426的平均胰岛素应答，而图34显示超过基线(时间0分钟)的平均应答倍数，如本文描述所测量。所有图上的误差棒都对应于平均值标准误差。图35显示所有患者对seqid-00426的平均总胃抑制性多肽(gip)应答，而图36显示超过基线(时间0分钟)的平均应答倍数，如本文描述所测量。所有图上的误差棒都对应于平均值标准误差。实施例27.使用含有酪氨酸、精氨酸和/或亮氨酸的营养性多肽氨基酸组合物来体外说明骨骼肌细胞生长和信号传导。雷帕霉素的哺乳动物靶标(mtor)是作为细胞生长的关键调控剂的蛋白质激酶，值得注意的是所述调控通过蛋白质合成来达成。mtor充当细胞代谢的主要调控剂，其使具有不同激酶特异性和不同蛋白质配偶体的两种复合物mtorc1和mtorc2成核(引用来自ess-020)。mtor驱动各组织的蛋白质合成。mtorc1介导的对生长信号传导的应答由氨基酸门控。应答定位于溶酶体使mtor活化偶联于肌肉蛋白质分解代谢。mtorc1可由必需氨基酸(eaa)、亮氨酸和谷氨酰胺门控。必须存在用于任何上游信号(包括生长因子)的氨基酸以活化mtorc1(引用来自ess-020)。这些实验通过体外测量应答于由单一氨基酸达成的刺激的核糖体蛋白质s6(rps6)的下游磷酸化来证明精氨酸、酪氨酸以及亮氨酸能够调节mtorc1活化。原代大鼠骨骼肌细胞(rskmc)培养基购自cellapplications(目录号：r150-500，sandiego,ca)。饥饿培养基dmem/f12从sigma(目录号：d9785，st.louis,mo)购买。定制饥饿培养基mod.4购自lifetechnologies(目录号：12500062，grandisland,ny)，其不含有任何氨基酸、酚红或葡萄糖。胎牛血清(fbs)和其它生长因子从cellapplications(目录号：r151-gs，sandiego,ca)获得。组织培养烧瓶和透明底部96孔组织培养板购自corningincorporated(目录号分别是：430641和353072，corning,ny)。胰蛋白酶/edta从lifetechnology(目录号：25200，grandisland,ny)获得。dpbs和hbss也购自lifetechnologies(目录号分别是：14190、14175)。核糖体蛋白质s6测定试剂盒从perkinelmer(目录号：tgrs6p2s10k)获得。原代大鼠骨骼肌细胞(rskmc)培养。使用本文所述的方案分离rskmc，并且冷藏保存在液氮中。也在37℃、5％co2组织培养孵育器(3110型，thermofisherscientific)中，在t75组织烧瓶中，于rskmc培养基(cellapplications)中维持细胞。每3天在细胞达到约90％汇合时将它们拆分。在t75组织烧瓶中于rskmc培养基中培养rskmc细胞直至100％汇合。从培养烧瓶吸出培养基，并且用10mldpbs冲洗一次，接着添加1.5ml0.25％胰蛋白酶/edta至细胞中。在使细胞从烧瓶脱离之后，添加10ml培养基。用10ml吸移器上下吸移培养基以使细胞从烧瓶脱离。接着将细胞在每孔50,000个细胞的密度下接种至透明底部96孔组织培养板中。在37℃、5％co2孵育器中过夜培养之后，在37℃、5％co2组织培养孵育器中用无fbs和亮氨酸的饥饿dme/f12培养基在4小时的时期内使细胞饥饿，接着与hank氏缓冲盐溶液(hbss)一起再孵育1小时来使细胞饥饿。用于饥饿培养基中的不同浓度的亮氨酸刺激细胞15和30分钟。细胞也用5nm雷帕霉素(r0395，sigma)或100nm胰岛素(i9278，sigma)处理15和30分钟。在室温下在725rpm下振荡下使细胞于20μl溶解缓冲液(perkinelmer)中溶解10分钟。将细胞溶解产物储存在-80℃下，并且次日进行测定。根据制造商手册进行核糖体蛋白质s6测定。图37显示在不同亮氨酸浓度下测量的相对alphascreen信号(y轴)，从而证明亮氨酸以剂量依赖性方式刺激原代rskmc的rps6磷酸化。这个刺激由mtor抑制剂雷帕霉素以剂量依赖性方式抑制。图38显示在完全氨基酸培养基(arg、his、lys、asp、glu、ser、thr、asn、gln、cys、gly、pro、ala、val、ile、met、phe、tyr、trp)以及仅在它们的dme/f12浓度(参见表e27b)下含有(arg、his、lys、thr、gln、cys、val、ile、met、phe、tyr和trp)的最低12种氨基酸的混合物两者中，亮氨酸均以剂量依赖性方式刺激原代rskmc的rps6磷酸化。原代骨骼肌细胞从2只sprague-dawley大鼠的比目鱼肌(sol)、腓肠肌(gs)和趾长伸肌(edl)获得。图39、40和41显示使用分离的原代细胞，亮氨酸以剂量依赖性方式刺激mtorrps6路径。精氨酸、酪氨酸和亮氨酸为完全刺激mtor路径所需。如上所述使细胞在无胎牛血清的mod.4培养基中饥饿，接着于缺乏各相应单一氨基酸的mod.4培养基中刺激(对于mod.4培养基的组成和dme/f12氨基酸水平，分别参见表e27a和e27b)。表e27a表e27b使原代肌肉细胞饥饿2小时，接着在37℃、5％co2组织培养孵育器中用0μm或500μm单一氨基酸刺激30分钟。一式三份进行处理。图42证明亮氨酸、精氨酸和酪氨酸的组合为与所有20种氨基酸在它们的dme/f12浓度下的完全补充物在相同程度上活化rmskc的mtor路径所必需和所足够，并且leu、arg或tyr的个别或配对处理剂都不能够具有类似应答。图43、44和45显示各氨基酸(leu、arg、tyr)在所有其它19种氨基酸相对于其它2种氨基酸的背景中的剂量应答(例如arg在tyr和leu的背景中的剂量应答)对rps6磷酸化的影响。这些数据指示leu、arg和tyr之间的协同是剂量依赖性的。将低arg剂量下的20种氨基酸应答与类似高leu和tyr背景中的应答进行比较，存在由其它17种氨基酸引起的刺激程度降低。在高arg剂量下，两种背景中的应答相等。将低leu剂量下的20种氨基酸应答与类似高arg和tyr背景中的应答进行比较，在rps6磷酸化应答方面不存在差异。将低tyr剂量下的20种氨基酸应答与类似高leu和arg背景中的应答进行比较，其它17种氨基酸可进一步增强mtor应答。实施例28.测定富含亮氨酸的营养性多肽在由啮齿动物口服消耗之后的安全性和无毒性。完成急性毒理学研究以确认营养性多肽seqid-00105、seqid-00363和seqid-00426在啮齿动物中的预期安全性。各研究组含有5只雄性大鼠和5只雌性大鼠(10wistar，6-7周龄，雄性220-250g，雌性180-200g)。测试制剂是350g/l营养性多肽，并且水性缓冲液作为对照。动物在到达后被驯化1周，并且给与始终可获得的常规食物膳食。在给药之前，将动物称重，并且进行预放血。通过口服管饲来完成10ml/kg的单次剂量。在第2、6和7天，获取身体和食物重量。在第6天，将动物放血于edta和肝素钠管中。在第7天，获取重量，并且使动物安乐死，随后进行立刻尸检。移除8种器官(心脏、肝、肺、脾、肾、脑、膀胱和小肠)，称重并储存在10％甲醛中。在研究期间，每日对应激、疼痛和异常活动的征象进行临床观察。对于所有3种测试营养性多肽，蛋白质和缓冲液都被良好耐受，因为在动物中未见异常。动物的所有活动都正常，并且未观察到其它疼痛或痛苦征象。实施例29：对营养性多肽可消化性的分析说明通过体外模拟消化测定来分析营养性多肽的消化。体外消化系统用于模拟多肽分解成生物可获取的肽和氨基酸，如在穿过胃和肠时所体内发生(kopf-bolanz,k.a.等,thejournalofnutrition2012；142:245-250；hur,s.j.等,foodchemistry2011；125:1-12)。模拟胃肠消化也预测潜在蛋白质过敏原性，因为消化抗性多肽可被吸收并导致敏化(astwood等,naturebiotechnology1996；14:1269-1273)。营养性多肽在模拟消化期间的半衰期。一种用于定量多肽从完整形式分解成较小肽的量度是完整半衰期。在这个实验中，使营养性多肽暴露于一系列在胃(胃蛋白酶)和肠(胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)中具有活性的蛋白酶，并且随时间测量完整蛋白质的存在。具体来说，营养性多肽首先在2g/l的浓度下在37℃下用模拟胃液(sgf)(0.03mnacl，用hcl滴定至ph1.5，具有1:20w/w的最终胃蛋白酶:多肽比率)处理。在各时间点从反应取样，并且通过添加0.2mna2co3来淬灭。在于sgf中120分钟之后，使剩余反应物与模拟肠液(sif)(18.4mmcacl2，50mmmes，ph6.5，具有1:4:400w/w的最终胰蛋白酶:胰凝乳蛋白酶:底物比率)50:50混合，并且用naoh中和至ph6.5。在各时间点从反应取样，并且通过添加胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂(sigma)溶液来淬灭，直至240分钟。通过芯片电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或蛋白质印迹来分析各时间点样品的完整蛋白质。对于芯片电泳(labchipgxii)，使用ht低分子量蛋白质表达试剂盒(遵循制造商方案)来分析样品。对于分子量测定(kda)和定量，每12个样品装载1个蛋白质阶梯。对于聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据制造商方案在bis-tris预浇制凝胶(lifetechnologies)上分离样品(1μg)。使用simplybluetmsafestain(invitrogen)染色凝胶并使用chemidocxrs+(biorad)成像，或根据制造商方案，使用干印迹系统(lifetechnologies)和western检测试剂盒(lifetechnologies)，转移于硝化纤维素膜上。通过根据制造商方案，使用snapi.d.蛋白质检测系统(millipore)，用于bloktm-po阻断缓冲液中3:5000稀释的抗his[c末端]-hrp抗体进行印迹来检测蛋白质。根据制造商方案，用luminataclassicowesternhrp底物(millipore)处理印迹，并且在moleculargeldoctmxr+系统(bio-rad)上使用化学发光检测来成像。通过使用imagelab(biorad)进行密度计量术来测定对完整蛋白质的定量。对于所有分析方法，随时间绘制在各时间点(如果检测出)的多肽相对浓度，并且相对于指数曲线进行拟合以计算完整半衰期。或者，通过测定在单一时间点剩余的完整蛋白质的百分比来分析样品(例如半衰期小于2分钟)。具体来说，如所述通过芯片电泳、sds-page、蛋白质印迹和/或lc-ms/ms来分析t＝0样品(无酶对照)和由sgf消化获得的t＝2分钟样品的完整蛋白质。测定在各时间点的多肽相对量，并且测定在t＝2时剩余的完整蛋白质的百分比。使用这个方法确定的完整半衰期值被报道为大于或小于2分钟以分别指示大于或小于50％的蛋白质在t＝2分钟时保持完整。通过任一方法确定的完整sgf半衰期的结果报道于表e29a中。表e29a.由在sgf处理期间进行体外完整蛋白质检测所计算的完整半衰期。除非另外指示，否则所有蛋白质都在大肠杆菌中产生。an＝黑曲霉，ao＝米曲霉，bs＝枯草芽孢杆菌，ba＝解淀粉芽孢杆菌，kl＝乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)，tl＝疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)，bl＝地衣芽孢杆菌。如本文所述产生α-甘露糖苷酶处理的seqid-00363和源于ao、ba、kl、tl和bl的蛋白质。营养性多肽在模拟消化期间的氨基酸释放。定量多肽消化的另一方法在于测量在暴露于模拟消化系统之后存在的游离氨基酸的量。在这个方法中，胰酶(酶混合物)用于模拟肠蛋白酶。具体来说，依次通过体外基于胰酶的消化测定和使用反相hplc(rp-hplc)进行的游离氨基酸分析来分析多肽消化成氨基酸。将营养性多肽在最终浓度4g/l下添加至sgf(0.92g/l胃蛋白酶(sigma)、0.03mnacl，用hcl滴定至ph1.5)中，并且在37℃下孵育120分钟。在120分钟之后，添加na2co3以获得最终浓度16mm来淬灭胃蛋白酶反应。使所得反应与2x浓缩sif(0.78mg/ml猪胰酶(sigma)、18.4mmcacl2、50mmmes，ph6.5)50:50混合，并且孵育240分钟。在各时间点从反应取样，并且通过加热至95℃，持续5分钟来淬灭。对照样品不含蛋白酶。如henderson,j.w.等agilenttechnologies(2010)中所述使用rp-hplc氨基酸分析来分析各时间点的游离氨基酸。使用agilent1100系列系统进行分析。在室温下使用邻苯二甲醛(opa)在线将伯氨基酸柱前衍生化。使用zorbaxeclipse-aaa4.6x150mm，3.5μm柱在40℃下分离opa衍生物。在23分钟内，分离梯度从100％40mmna2hpo4(ph7.8)过渡至65％乙腈/甲醇/水混合物(45/45/10)。通过在340nmex/450nmem下的荧光来检测分析物。图46说明在胰酶消化seqid-00105期间，游离leu浓度的代表性时间过程。样品在胰酶消化的120分钟时间点的游离leu浓度概述于表e29b中。表e29b.在胰酶消化营养性多肽的120分钟时间点检测的游离leu。在胰酶消化的120分钟时间点的游离leu(μm)seqid-00076824.3seqid-00103793.8seqid-001051357.6seqid-00298(bs)1030.8seqid-003381181.7seqid-003411143.5seqid-00352906.1seqid-00363511seqid-00363561.5seqid-00423587.1seqid-00424758.7seqid-00425713.1seqid-00426952.3seqid-00426955.2seqid-00429580.7seqid-00485764.9seqid-00605937.1营养性多肽在模拟消化期间的肽释放。通过lc-ms/ms来分析由本文所述的基于胰酶的模拟体外消化获得的样品的肽。为制备用于lc-ms/ms分析的样品，用三氟乙酸(tfa)将样品ph调整至ph3，并且使用亲水-亲脂平衡(hlb)固相提取柱筒(waters)来提取肽。柱筒用2ml乙腈活化，并且用2ml0.1％tfa平衡。装载样品，并且柱筒用2ml0.1％tfa洗涤并用1ml70％乙腈/0.1％tfa洗脱。使洗脱的肽完全干燥，并且于50μl0.1％tfa中复原。将洗脱的肽(4μl)装载上柱，并且用联接于thermofisherorbitrapvelospro的watersnanoacquityhplc系统，通过纳米lc-ms/ms来分析。将肽装载于捕集柱上，并且历经75μm分析柱在350nl/min下洗脱；两个柱均填充有jupiterproteo树脂(phenomenex)。采用1小时梯度。以数据依赖性模式操作质谱仪，其中ms在60,000fwhm分辨率下在orbitrap质量分析器中进行，而ms/ms在ltq线性离子阱质谱仪中进行。15种最丰富的离子被选择用于ms/ms。使用mascot相对于适当数据库搜索数据以鉴定肽。将mascotdat文件解析至scaffold软件中以进行验证，过滤，并且创建每个样品的非冗余清单。使用95％的最小蛋白质值和50％的最小肽值来过滤数据。在体外消化给定seqid之后，通过lc-ms/ms来在胰酶消化的240分钟时间点检测独特肽。对于seqid-00105样品检测的独特肽是：lfdkdnngsis、fdkdnngs、fdkdnngsis/fdkdnngsis、fdkdnngsiss、fdkdnngsisssel、dkdnngsi、dkdnngsis、slglspse、neidvdgn、idvdgnh、idvdgnhq、idvdgnhqie/idvdgnhqie、kvfdkngdg、vfdkngdglis、dkngdgl、kltdaev、lrevsdgsgeiniqqf、revsdgsg、revsdgsge、revsdgsgei、revsdgsgein/revsdgsgein、revsdgsgeiniq、revsdgsgeiniqqf、evsdgsgei、evsdgsgein。对于seqid-00426样品检测的独特肽是：ysfedsgvgdvt、ysfedsgvgdvtg、sfedsgvgdvtg、fedsgvgdv、edsgvgdvt、edsgvgdvtg、edsgvgdvtgf、dsgvgdvt、lrgngyd、lrgngydidv、ithtndivpr、htndivpr、tndivpr、ndivpr、yshsspe、divkiegidatggnnqpnipdipahl、kiegid、kiegidatggnnqpnipdipa、iegidatggnnqpnipdipa、egidatggnnqpnipdipa、gidatggnnqpnipdipa、idatggnnqpnipd、idatggnnqpnipdip、idatggnnqpnipdipa/idatggnnqpnipdipa、idatggnnqpnipdipah、datggnnqpnipdipa/datggnnqpnipdipa、atggnnqpnipd、atggnnqpnipdip、atggnnqpnipdipa/atggnnqpnipdipa、atggnnqpnipdipah、tggnnqpnipdipa、ggnnqpnipdip/ggnnqpnipdip、ggnnqpnipdipa/ggnnqpnipdipa/ggnnqpnipdipa、gnnqpnipdipa/gnnqpnipdipa、nnqpnipdipa、nqpnipdipa、pnipdipa。复杂混合物中的营养性多肽完整半衰期确定。使用上述模拟胃体外消化来确定复杂混合物中的多种多肽的体外完整半衰期。简要来说，如本文所述通过克隆、转化以及表达编码168种蛋白质的基因文库来以单一混合物形式产生168种营养性多肽的文库。如本文所述通过imac纯化来从宿主细胞蛋白质纯化重组表达的蛋白质。如上所述用sgf处理168种蛋白质的文库，并且通过lc-ms/ms来分析t＝0和t＝10分钟样品的完整蛋白质。为开始分析，将10μg样品装载于10％sds-page凝胶(invitrogen)上，并且在凝胶中操作约5cm。将凝胶从100kd至染料前部切成10个部分，并且通过依次用25mm碳酸氢铵和乙腈洗涤来处理凝胶切片。凝胶部分接着在60℃下用10mm二硫苏糖醇还原，随后在室温下用50mm碘乙酰胺进行烷基化。最后，样品用胰蛋白酶(promega)在37℃下消化4小时，并且以添加甲酸来使消化淬灭。样品接着使用联接于thermofisherqexactive的easynlc1000hplc系统，通过纳米lc/ms/ms来分析。将肽装载于捕集柱上，并且历经75μm分析柱在350nl/min下洗脱；两个柱均填充有pepmapc183μm树脂(themofisher)。采用1小时梯度。以数据依赖性模式操作质谱仪，其中ms和ms/ms分别在70,000fwhm分辨率和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中进行。15种最丰富的离子被选择用于ms/ms。使用mascot相对于适当数据库搜索数据以鉴定肽。将mascotdat文件解析至scaffold软件中以进行验证，过滤，并且创建每个样品的非冗余清单。在1％蛋白质和肽假发现率(fdr)以及每种蛋白质要求至少两种独特肽下过滤数据。产生检测的蛋白质和它们的光谱计数(spc)的完全清单，并且随各收集的胶凝部分而变加以报道。spc是对于给定蛋白质鉴定的光谱数的计数，并且用作相对蛋白质丰度的量度(liu,h.等,analyticalchemistry2004,76:4193-4201)。为计算在sgf消化的10分钟时间点剩余的完整蛋白质的百分比，用代表t＝10分钟样品中的完整肽的spc数目除以代表t＝0分钟样品中的完整肽的spc数目。代表完整肽的spc数目定义为t＝0分钟样品中对那个蛋白质指定的spc数目最高的部分和两个侧接部分中的spc的总和。在10分钟时的完整蛋白质％的结果显示于表e20c中。在表e20d中比较14种多肽的纯化蛋白质的完整半衰期值(通过芯片电泳确定)和在168种seqid的文库中检测的蛋白质在10分钟时剩余的完整肽的百分比(通过lc-ms/ms分析确定)。分析在t＝10分钟时保持完整的蛋白质的百分比与半衰期之间的线性关系，并且r2值被确定为0.72。表e20c.在168种营养性多肽的文库sgf消化的10分钟时间点剩余的完整蛋白质百分比。表e20d.纯化蛋白质的完整半衰期值(通过芯片电泳确定)和在168种营养性多肽的文库中检测的蛋白质在10分钟时剩余的完整肽的百分比(通过lc-ms/ms分析确定)的比较。蛋白质半衰期(分钟)在10分钟时剩余％seqid-003380.23.9seqid-006010.21.1seqid-006050.20seqid-006470.212seqid-005100.313.4seqid-005110.34.3seqid-006060.30seqid-006100.43.3seqid-005590.53.1seqid-004850.50seqid-005980.524.3seqid-005020.69.7seqid-005872.421.7seqid-006226.643.6实施例30：营养性多肽的粘度已证明存在强烈吸引性自缔合相互作用会产生较高粘度溶液(yadav,sandeep等journalofpharmaceuticalsciences99.12(2010):4812-4829.)。具体来说，带相反电荷残基的静电相互作用产生高粘度溶液(liu,jun等journalofpharmaceuticalsciences94.9(2005):1928-1940.)。可使用本文所述的每个氨基酸净电荷或电荷计算结果，以及选择具有高度正性电荷或高度负性电荷的蛋白质来选择具有低粘度的营养性多肽。以这个方式选择的蛋白质将缺乏互补性静电相互作用，并且将代之以具有限制自缔合能力，由此降低溶液的粘度的总体排斥力。测量营养性多肽(seqid-00105)和乳清的溶液的相对粘度。两种蛋白质均用水再混悬以获得为分析所需的浓度。使用具有cpe-40转轴的brookfieldlvdv-ii+pro锥/板来测量粘度。所有测试都在4c和25c下进行。样品体积是0.5ml。用brookfieldtc-550ap-115可编程温度浴维持温度。所有样品都在4c下平衡至少2分钟，以及在25c下平衡1分钟。所有读数都在10％与100％扭矩之间获取。图47显示seqid-00105在4c(闭合圆圈)和25c(空心圆圈)下以及乳清在4c(闭合方块)和25c(空心方块)下以厘泊计量的粘度。本文已显示seqid-00105跨越一定范围的ph具有负性净电荷，并且目前显示在多种温度和多肽浓度下，seqid-00105的粘度小于是无主要单一电荷的分散蛋白质混合物的乳清。为产生粘度增加的溶液，转谷氨酰胺酶可用于产生由酶诱导的在营养性多肽之间的永久共价交联组成的网状结构，由此产生另外粘稠溶液。这个酶处理也可继之以热处理以制备含有营养性多肽的粘稠溶液。为产生含有使粘度增加的交联的营养性多肽样品，使样品与转谷氨酰胺酶溶液在ph7.0下混合以给出酶与蛋白质重量比1:25。在大多数实验中，在40℃下进行酶催化的交联反应。实施例31：对营养性多肽溶解度和热稳定性的分析说明。溶解度。通过测定复原冻干粉末离心过滤和/或超滤溶液的蛋白质浓度来评估蛋白质的溶解度(carpenter等(2002)rationaldesignofstablelyopholizedproteinformulations:theortyandpractice,kluweracademic/plenumpublishers,newyork,第109-133页；milliporepublication,amiconultra:centrifugalfilterdevicesfortheconcentrationandpurificationofbiologicalsamples(2001)；oss等(1969)amembranefortherapidconcentrationofdiluteproteinsamplesinanultrafilter,clinicalchemistry,15(8):699-707)。通过使用制造商标准方案在freezone冷冻干燥系统(labconco)上冻干来干燥蛋白质样品，接着于缓冲液中再混悬以获得所需浓度。离心和切向超滤用于从蛋白质样品选择性移除缓冲液直至达到所需浓度。通过视蛋白质大小而定，以分子量截断值3kda、10kda或30kda在amicon离心过滤器(millipore)中离心(10,000xg)10mg蛋白质来对蛋白质溶液进行离心超滤，直至达到所需浓度。视蛋白质大小而定，以分子量截断值3kda、10kda或30kda，在交叉流速12l/m2/min下在hydrosart超滤盒(sartoriusstedim,bohemia,ny)上对蛋白质溶液进行超滤。对于大多数过程，跨膜压力维持在20psi下，并且执行直至达到所需浓度。通过以下方法中的一个或组合来测量以上样品的蛋白质浓度：coomassie加强型蛋白质测定、在280nm下的吸光度(a280)和总氨基酸分析。根据制造商方案进行coomassie加强型蛋白质测定(pierce)。在nanodrop2000紫外-可见分光光度计上测量在280nm下的吸光度。使用a280值和使用protparam根据一级氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度(gasteiger,elisabeth等theproteomicsprotocolshandbook.humanapress,2005.571-607.)。如henderson,j.w.等agilenttechnologies(2010)中所述在酸水解之后通过hplc来分析总氨基酸。表e31a.蛋白质的溶解度。除非另外指示，否则所有蛋白质都在大肠杆菌中产生。an＝黑曲霉，ao＝米曲霉，bs＝枯草芽孢杆菌，ba＝解淀粉芽孢杆菌，kl＝乳酸克鲁维酵母，tl＝疏绵状嗜热丝孢菌，bl＝地衣芽孢杆菌。如本文所述产生α-甘露糖苷酶处理的seqid-00363和源于ao、ba、kl、tl和bl的蛋白质。ph可溶性。于柠檬酸和磷酸氢二钠的缓冲液混合物中在2.8至7.1的ph范围内测定蛋白质的ph可溶性。如表e31b中所概述来制备ph溶液。使蛋白质冻干，接着于缓冲液混合物中再混悬，或使蛋白质浓缩，接着在最终蛋白质浓度5至30mg/ml下外加至缓冲液混合物中。作为对照，也将蛋白质溶解于8m尿素溶液中。在室温下振荡蛋白质溶液10分钟。通过在650nm下测量蛋白质溶液的吸光度来测定蛋白质的浊度。接着在1100xg下离心蛋白质溶液10分钟以集结未溶解或沉淀的蛋白质。对可溶性蛋白质部分(上清液)取样，并且通过一种或多种以下方法来测量蛋白质浓度：coomassie加强型蛋白质测定(pierce)、芯片电泳、凝胶电泳和/或在280nm下的吸光度。如通过bradford和a650值所测定，所选蛋白质保持大于80％可溶所处的ph范围列于表e31c中。表e31b.用于ph可溶性筛选的缓冲液组成。表e31c.蛋白质在ph范围内的溶解度。n/a：不适用。热稳定性。根据制造商标准方案，使用热漂移稳定性试剂盒(enzolifesciences)测定蛋白质于柠檬酸和磷酸氢二钠的在2.8至7.1的ph范围内的缓冲液混合物(以上在表e31b中所述的制剂)中的热稳定性。简要来说，使用配备有板读取器(synergymx,biotek)，同时用德克萨斯红(texasred)滤光片监测荧光的实时pcr(rtpcr)热循环仪(biorad)，在每30秒0.5℃的速率下将含有1xproteostatts检测试剂的蛋白质溶液(约10mg/ml)从25℃加热至95℃。聚集温度(tagg)鉴定为在荧光强度随温度而变的迹线中观察到最陡峭斜率所处的温度。一子组蛋白质在ph7.1下的聚集温度列于表e31d中。一子组蛋白质在一定ph范围内的聚集温度列于表e31e中。表e31d.在ph7.1下的聚集温度(tagg)蛋白质tagg(ph7.1)seqid-00008>95seqid-0000956seqid-00087>95seqid-0009964seqid-00102>95seqid-00220>95seqid-00226>95seqid-0023745seqid-00240>95seqid-00241>95seqid-00265>95seqid-00269>95seqid-0030246seqid-0030548seqid-0051057.5seqid-0060695seqid-0061054.5表e31e.随ph而变的聚集温度(tagg)。ns＝热稳定性测定的其中蛋白质不可溶的条件。热展开。在appliedphotophysicscs/2chirascan分光光度计上通过圆二色性来监测蛋白质的热展开。使用0.1cm光程长度槽，从20至90℃每5℃记录于缓冲液(20mm磷酸钾，ph7.5)中的蛋白质溶液(0.5至1.0mg/ml)的远紫外测量结果(200–260nm)。在90℃下收集光谱之后，使蛋白质样品立刻冷却至20℃，并且记录最终光谱。将熔解温度(tmelt)计算为斜率最强烈的温度，并且将最终光谱与初始20℃光谱进行比较以确定蛋白质展开是否可逆或是否已发生永久结构变化。图48显示seqid-00105的代表性cd光谱，从而证明营养性多肽在甚至90c下也未完全展开，并且当冷却至20c时返回成它的原始折叠。实施例32：营养性多肽糖基化。存在于蛋白质上的聚糖常影响诸如溶解度、活性和稳定性的性质。改变营养性肽的糖基化样式也可影响它们的生物可用度、营养品质和产品配制属性。此外，基于氨基酸吸收的动力学与在人蛋白质产生期间并入外源性聚糖两者，营养性食物肽的特定糖样式会加强对摄取分离的营养性食物肽的代谢应答。用于达成糖基化状态的宿主选择。如本文所述，在多种宿主中产生营养性多肽。宿主的选择对营养性多肽的具有生物物理学、消化和免疫原性牵涉的糖基化状态具有影响。举例来说，表达宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、构巢曲霉、人胚肾(hek)和中国仓鼠卵巢细胞(cho)。相较于诸如曲霉属、酿酒酵母和毕赤酵母属(pichia)的真核宿主，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌由于它们能够产生具有未糖化(或最低限度糖化)骨架的多肽而用作表达宿主。归因于黑曲霉的驱动向多肽骨架添加富含甘露糖的聚糖的独特糖基化机构，选择它作为蛋白质分泌宿主。归因于先前证明的能够替代广泛寡甘露糖多糖来朝向聚糖结构复杂性降低对宿主糖基化机构进行工程改造(kainz等n-glycanmodificationinaspergillusspecies,appl.environ.microbiol.,2008)，选择构巢曲霉作为蛋白质分泌宿主。中国仓鼠卵巢(cho)细胞因它们能够以类似于人细胞的样式使蛋白质糖基化而被选作表达宿主。差异包括galα1-3gal表位与n-羟乙酰基神经氨酸(neu5gc)两者均已见于由cho细胞产生的糖蛋白上，但不见于正常人聚糖中(galili,uri等journalofbiologicalchemistry263.33(1988):17755-17762)。此外，在cho细胞中产生的某些蛋白质具有更酸性亚型，从而表明唾液酸的含量较高。人胚肾293(hek293)细胞因它们能够具有人糖基化蛋白质而被选作表达宿主。凝胶电泳和蛋白质转移。为分析糖基化，用识别特定聚糖抗原的抗体或凝集素进行蛋白质印迹分析以评估和比较在真核生物和原核生物中产生的蛋白质的糖基化分布。首先，根据制造商方案，使用bis-tris预浇制凝胶(lifetechnologies)，通过凝胶电泳来进行蛋白质分离。根据制造商方案，使用干印迹系统(lifetechnologies)和western检测试剂盒(lifetechnologies)，将蛋白质从凝胶转移至硝化纤维素膜。通过根据制造商方案，用g-250染色剂simplybluetmsafestain(lifetechnologies)染色聚丙烯酰胺凝胶来观察蛋白质条带，并且使用moleculargeldoctmxr+系统(bio-rad)来成像。在大肠杆菌和黑曲霉中表达的seqid-00363的糖基化分布。根据制造商标准方案，使用糖蛋白检测试剂盒(dig聚糖辨别试剂盒，roche)来考查蛋白质的甘露糖含量。为开始考察，将来自用编码seqid-00363的基因的表达载体(如本文所述)转化的大肠杆菌的全细胞提取物(5μg)和可溶性细胞溶解产物(5μg)、在黑曲霉中表达的seqid-00363(5μg)、以及dig聚糖辨别试剂盒阳性对照羧肽酶y(5μg)装载于10％bis-tris凝胶(lifetechnologies)上。如本文所述进行蛋白质分离和转移。简要来说，使硝化纤维素膜与地高辛(dig)标记的雪花莲(galanthusnivalis)凝集素(gna)一起孵育，所述凝集素是一种结合末端甘露糖的凝集素。接着使膜与抗地高辛-碱性磷酸酶(ap)一起孵育，随后与ap底物溶液(nbt/bcip)一起孵育。通过裸眼来定性观察ap染色的强度，并且为膜拍照。图49显示从黑曲霉分离的seqid-00363和在大肠杆菌中重组表达的seqid-00363的代表性coomassie染色凝胶(图版a)和gna探测的蛋白质印迹膜(图版b)。在泳道2中，约120kd的突出条带代表糖基化seqid-00363。在泳道3中，约80kd的条带代表非糖基化seqid-00363。这些结果证明在黑曲霉中表达的seqid-00363(图49b，泳道2)是末端甘露糖基化蛋白质(图49b，泳道3)，而在大肠杆菌中表达的seqid-00363在它的聚糖上不含有末端甘露糖残基。从食物提取蛋白质以进行聚糖分析。亚麻籽(有机棕色亚麻籽，farmersdirectcoop)、鹰嘴豆(埃及豆(garbanzobeans)，365everydayvalueorganic)、玉米(冷冻超甜双色玉米，365everydayvalueorganic)、马铃薯(常规黄色马铃薯)、蘑菇(有机白蘑菇)、花椰菜(冷冻绿花菜(broccoliflortes)，365everydayvalue)、番茄(常规罗马番茄(romatomato))、蓝莓(有机蓝莓，littlebuckorganics)、葡萄(有机红色无籽葡萄，anthony’sorganic)、牛肉(85％瘦性绞细牛肉)、鸡肉(绞细鸡大腿，无骨，无皮，airchilled)、羊羔肉(绞细新西兰羊羔肉)、火鸡肉(绞细火鸡大腿)、鳕鱼(野生鳕鱼片)和猪肉(绞细猪肉)购自wholefoods。提供鹿肉。将各食物来源的等分试样(50-2,500mg)冷冻在-80℃下。通过用研钵和研杵研磨样品，随后添加1.0ml提取缓冲液(8.3m尿素、2m硫脲、2％w/vchaps、1％w/vdtt)并用研杵再研磨来从食物来源提取蛋白质。将样品转移至微量离心管中，并且在室温下搅拌30分钟，随后添加500μl100μm锆珠粒(opsdiagnostics)，并且再进一步搅拌30分钟。接着在tissuelyserii(qiagen)上在30hz下使样品溶解3分钟，在21,130xg下离心10分钟，并且收集上清液。通过溶解于提取缓冲液中来制备酵母(营养酵母，wholefoods)、大豆蛋白质分离物(大豆蛋白质粉，wholefoods)和稻米蛋白质分离物(有机稻米蛋白质，growingnaturals)。根据制造商标准方案，通过coomassie加强型蛋白质测定(pierce)来测定样品的总蛋白质浓度。通过蛋白质印迹分析来检测n-羟乙酰基神经氨酸(neu5gc)。n-羟乙酰基神经氨酸(neu5gc)是见于大多数哺乳动物聚糖上的唾液酸，但不存在于人蛋白质糖蛋白上。人生物化学路径不将neu5gc唾液酸识别为外来的，从而导致在摄取至高尔基体中以及并于新合成的蛋白质上之后有痕量见于人糖蛋白中。尽管以生物化学方式整合，然而，免疫系统将含有外部源性唾液酸的经调整表面构象识别为外来的，从而增加许多疾病的风险。已在人血浆中检测到的抗neu5gc抗体应答于摄取含有neu5gc的蛋白质来源而导致慢性炎症(varki等“uniquelyhumanevolutionof唾液酸geneticsandbiology”,pnas2011)。neu5gc的主要来源包括羊羔肉、牛肉、猪肉以及甚至乳制品，其中痕量也见于鱼中(tangvoranuntakul等,2003,pnas,100(21):12045-12050)。用抗neu5gc抗体进行蛋白质印迹分析以表征从食物提取的蛋白质以及由细菌宿主重组表达的蛋白质的neu5gc含量。从如本文所述的肉类来源提取蛋白质。此外，通过如本文所述用个别表达载体转化，或通过如本文所述用某一文库的表达载体转化来在大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌中重组表达蛋白质。如本文所述通过imac纯化来纯化源于个别表达载体的蛋白质，以及在一些情况下源于某一文库的表达载体的蛋白质。制备在大肠杆菌中重组表达的纯化蛋白质的混合物(蛋白质混合物1)以在最终浓度约1mg/ml下含有各蛋白质。这个混合物中包括的蛋白质以及它们天然产生于其中的物种是seqid-00076(母牛)、seqid-00240(母牛)、seqid-00298(母牛)、seqid-00359(绵羊)和seqid-00510(火鸡)。将各肉类提取物(牛肉、猪肉、鹿肉、羊羔肉、火鸡肉、鸡肉和鳕鱼)的样品、蛋白质混合物1、在大肠杆菌(imac纯化的溶解产物)和枯草芽孢杆菌(imac纯化的溶解产物和未纯化的上清液和溶解产物)中表达的168种营养性多肽的文库、以及在大肠杆菌(rosetta、gamib和gami2可溶性溶解产物和rosetta全细胞)和枯草芽孢杆菌(ph951grac溶解产物)中表达的cdna文库装载于10％bis-tris凝胶(lifetechnologies)上。如本文所述进行蛋白质分离和转移。根据标准制造商方案，使用snapi.d.蛋白质检测系统(millipore)，用两者均于bloktm-po阻断缓冲液中3:5,000稀释的鸡抗neu5gc(igy)初级抗体(biolegend)和山羊抗鸡igy辣根过氧化物酶(hrp)二级抗体检测neu5gc。根据制造商方案，用luminataclassicowesternhrp底物(millipore)处理印迹，并且在moleculargeldoctmxr+系统(bio-rad)上使用化学发光检测来成像。图50显示代表性coomassie染色凝胶(图版a)和抗neu5gc探测蛋白质印迹膜(图版b)。这些结果证明尽管neu5gc存在于从母牛肉、猪肉、绵羊肉、火鸡肉和鸡肉提取的蛋白质中，但它不存在于来自这些动物的已在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中重组表达的蛋白质中。通过蛋白质印迹分析来检测木糖和海藻糖。木糖和海藻糖是常存在于植物糖蛋白上，并且可对人具有免疫原性的糖(bardor等,2003,glycobiology,13(6):427-434)。使用抗木糖和抗海藻糖抗体，通过蛋白质印迹分析来考查从食物来源提取的蛋白质和由细菌宿主重组表达的蛋白质的木糖和海藻糖含量。如本文所述，通过从食物来源提取或通过复原购买的蛋白质分离物来制备蛋白质样品。如本文所述在大肠杆菌中重组表达蛋白质，并且通过imac纯化来纯化。制备在大肠杆菌中重组表达的纯化蛋白质的混合物(蛋白质混合物2)以在最终浓度约1mg/ml下含有各蛋白质。这个混合物中包括的蛋白质以及它们天然产生于其中的物种是seqid-00103(稻米)、seqid-00104(玉米)、seqid-00352(玉米)、seqid-00485(鹰嘴豆)、seqid-00559(稻米)、seqid-00598(亚麻籽)和seqid-00605(蘑菇)。将各植物和真菌提取物(酵母、亚麻籽、鹰嘴豆、玉米、马铃薯、蘑菇、大豆、稻米、花椰菜、番茄、蓝莓和葡萄)的样品、蛋白质混合物2、辣根过氧化物酶(阳性对照)和胎球蛋白(fetuin)(阴性对照)装载于10％bis-tris凝胶(lifetechnologies)上。如本文所述进行蛋白质分离和转移。根据标准制造商方案，使用snapi.d.蛋白质检测系统(millipore)进行蛋白质印迹分析。通过用分别于bloktm-po阻断缓冲液中3:5,000和3:2,500稀释的兔抗木糖初级抗体(agrisera)和驴抗兔igg-hrp二级抗体(abcam)进行印迹来检测木糖。通过用分别于bloktm-po阻断缓冲液中3:10,000和3:3,000稀释的兔抗海藻糖初级抗体(agrisera)和驴抗兔igg-hrp二级抗体(abcam)进行印迹来检测海藻糖。根据制造商方案，用luminataclassicowesternhrp底物(millipore)处理印迹，并且在moleculargeldoctmxr+系统(bio-rad)上使用化学发光检测来成像。图51说明代表性coomassie染色凝胶、抗木糖探测蛋白质印迹膜和抗海藻糖探测蛋白质印迹膜。这些结果证明尽管木糖与海藻糖两者均存在于从亚麻籽、鹰嘴豆、玉米、马铃薯、大豆、稻米、花椰菜、番茄、蓝莓和葡萄提取的植物蛋白质中，但它们不存在于来自植物和真菌来源的已在大肠杆菌中重组表达的蛋白质中。选择具有高天冬酰胺、丝氨酸和/或苏氨酸质量组成的蛋白质以降低营养性多肽糖基化。可通过选择糖基化位点数较低的序列来降低营养性多肽的糖基化状态。这些位点包括用于n连接的糖基化的天冬酰胺以及用于o连接的糖基化的丝氨酸和苏氨酸。由于沿多肽结合的多糖组成水平降低，所以这些分离的多肽含有较高氨基酸质量百分比，从而允许每克营养性多肽有较高可消化氨基酸剂量，并且在消耗后具有降低的免疫活性。沿营养性多肽骨架可用的聚糖接受体位点的n连接的糖基化主要发生在天冬酰胺氨基酸残基处。表达由于它们的天冬酰胺水平较低而选择的异源性多肽允许分离聚糖结构降低的多肽。沿营养性多肽骨架可用的聚糖接受体位点的o连接的糖基化主要发生在丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基处。表达由于它们的丝氨酸或苏氨酸水平较低而选择的异源性多肽允许分离聚糖结构降低的多肽。选择具有高天冬酰胺、丝氨酸和/或苏氨酸质量组成的蛋白质以增加营养性多肽糖基化。可通过选择富含糖基化位点的序列来增加营养性多肽的糖基化状态。这些位点包括用于n连接的糖基化的天冬酰胺以及用于o连接的糖基化的丝氨酸和苏氨酸。糖基化增加可使得能够增加营养性多肽的溶解度和热稳定性。沿营养性多肽骨架可用的聚糖接受体位点的n连接的糖基化主要发生在天冬酰胺氨基酸残基处。表达由于它们的天冬酰胺水平较高而选择的异源性多肽允许分离聚糖结构增加的多肽。沿营养性多肽骨架可用的聚糖接受体位点的o连接的糖基化主要发生在丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基处。表达由于它们的丝氨酸或苏氨酸水平较高而选择的异源性多肽允许分离聚糖结构增加的多肽。从分离的营养性多肽移除聚糖。营养性多肽的糖基化状态可对结构和物理性质具有影响。如本文所述，在重组宿主中表达的营养性多肽具有的糖基化可不同于天然存在。如果产生具有糖基化的营养性多肽，那么可使用化学或酶促方法使聚糖释放以改变结构和物理性质。聚糖释放的常见化学方法是肼解和碱性/还原性条件(β-消除)(takasaki,seiichi等methodsinenzymology83(1981):263-268.)。可使用内切糖苷酶，诸如png酶f、endo-h、endof2、png酶a或o-聚糖酶，或使用外切糖苷酶，诸如唾液酸酶、α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、己糖胺酶、半乳糖胺酶、α甘露糖苷酶、β甘露糖苷酶、α海藻糖苷酶，使聚糖从蛋白质释放，精确酶是基于寡糖组成和键联加以选择(merry,tony等capillaryelectrophoresisofcarbohydrates.humanapress,2003.27-40.)。png酶f是一种极其有效用于从糖蛋白移除几乎所有n连接的寡糖的酶促方法。png酶f消化使天冬酰胺残基脱氨基成为天冬氨酸，并且保持寡糖完整。为使用内切糖苷酶使蛋白质去除糖基化，将500ug糖蛋白再混悬于50ul50mm磷酸钠(ph7.5)中。在0.1u/ml下添加png酶f，并且在37c下孵育溶液24小时。通过sds-page来监测反应的完成。筛选ige介导的归因于聚糖的过敏应答。对营养性多肽的聚糖修饰的变化会影响ige结合相互作用。约20％或大于20％的过敏患者产生特异性抗聚糖ige，其常伴有igg(altmann,f.theroleofproteinglycosylationinallergy,intarchallergyimmunol.2007)。对于诱导ige介导的免疫应答的多肽(过敏原就是这样的情况)，相较于在多肽的天然组成的情况下，如本文所述的聚糖修饰可降低分离的多肽的过敏原性。在这个实施例中，筛选在体外血清测定中进行ige结合以及根据皮肤点刺测试(如mari,a等igetocross-reactivecarbohydratedeterminants:analysisofthedistributionandappraisaloftheinvivoandinvitroreactivity,2002中所述)具有反应性的多肽。可通过比较皮肤点刺测试与ige血清结合测定的结果来确定归因于聚糖(称为交叉反应性碳水化合物决定簇)的过敏原性应答。招募未经选择的呈现暗示过敏性疾病的呼吸症状，并且提交给过敏室的连串受试者。记录各患者的人口统计和临床数据。从研究排除具有临床过敏史的患者。不排除先前尚未接受特定免疫疗法(sit)过程的那些患者。所有处理患者都接受呈分离形式与呈天然组成形式两者的营养性多肽的明矾吸附提取物。出于统计目的，仅评估花粉处理的患者。患者经受使用上述过敏原性提取物，以标准化程序和记录(mari,a.等specificigetocross-reactivecarbohydratedeterminantsstronglyaffecttheinvitrodiagnosisofallergicdiseases.jallergyclinimmunol1999)进行的皮肤点刺测试(spt)。在spt之后，从同意采血的患者获得血清以进行体外诊断程序。将血清储存在–20℃下直至需要。在过敏咨询期间通过患者或护理者来获得皮肤测试和采血的知情同意书。测定所有血清中的总ige(radim,pomezia,italy)。遵循制造商说明书(pharmacia,uppsala,sweden)，通过cap系统来检测过敏原特异性ige。值60.4kua/l被视为阳性。因为不存在单一测试来检测ccd-ige，所以对携带由ige识别的碳水化合物部分的营养性多肽的阳性体外测试与对相同糖蛋白的阴性spt之间的结果偏差被假定指示存在ccd-ige。对在对相同过敏原性提取物的spt中记录为阴性的大量随机血清样品进行ige检测。介导与ige的结合的聚糖结构的修饰是通过在分离营养性多肽以及确认聚糖结构改变后检测到ccd-ige的患者中的分布转变来观察。实施例33.于动物中说明营养性多肽氨基酸药物动力学。可进行药物动力学(pk)研究以评估在口服施用营养性多肽制剂之后，氨基酸的血浆浓度。所述分析提供关于蛋白质在胃肠道中的消化速率和程度以及在消化期间释放的游离氨基酸和/或肽的生物可用度的信息。小肠转送速率类似于成人(3-4小时)的生长中的大鼠被接受为一种适于以口服施用进行的药物动力学研究的模型(desesso和jacobson(2001)anatomicalandphysiologicalparametersaffectinggastrointestinalabsorptioninhumansandrats,foodandchemicaltoxicology39:209-228)。大鼠药物动力学研究。伴有置留性颈静脉导管(jvc)的雄性spraguedawley大鼠购自harlanlaboratories，并且在研究启始之前使其适应于测试设施(agiluxlaboratories)至少2天。在剂量施用之前，使动物禁食过夜(11–13小时)，并且保持禁食直至完成研究。通过连接于注射器的球部尖端18规格不锈钢管饲针来口服施用测试物品。在给药之前和之后记录所有给药注射器的重量以更准确测定给药溶液的量。在时间0(给药前)以及给药后0.25、0.5、1、2和4小时从jvc收集连续血液样品(约300μl)。将血液样品收集至含有抗凝剂k2edta(一般性蛋白酶抑制剂混合物)(sigmap8340，于全血中1:100稀释)和dppiv抑制剂(milliporedpp4，于全血中1:100稀释)的管中。在血液收集之后立刻将管涡旋并储存在湿冰上直至在收集的1小时内通过离心(3,500rpm，在5℃下)来处理成血浆。接着将血浆样品转移至新管中，并且储存在-80℃下。在一些情况下，在终末血液收集之后，使动物安乐死，并且收集末端回肠和它的内含物并如本文所述加以分析。如本文所述通过hplc氨基酸分析来测定血浆样品中的glu、ser、his、gly、thr、arg、ala、tyr、val、met、phe、ile、leu和lys的浓度。在hplc氨基酸分析之前，通过离心(1100xg，在4℃下)10分钟来从血浆样品移除不溶性粒子。接着将25μl可溶性部分的样品转移至96孔板中，对于一些样品，将内标(正缬氨酸，agilent)在最终浓度0.5mm下添加至各血浆样品中。通过使用包括提供于补充氨基酸试剂盒(agilent)中的个别标准物储备物的标准混合物，以及将样品的色谱分布与组合的标准物的色谱分布进行比较来分析在当前hplc氨基酸分析中未测出的氨基酸，包括gln、asn、trp、羟基脯氨酸(hyp)和肌氨酸(sar)。因为含有补充标准物的溶液在室温下不稳定，所以补充性氨基酸标准物是在使用之前立刻制备，并且不长于24小时加以使用。图52显示在表e33a中所列的剂量下口服施用指示的营养性多肽之后，在4小时内从大鼠收集的血液样品中测量的血浆氨基酸浓度的平均曲线下面积(auc)(±sd)(μm·h)的变化。图53显示seqid-00105作为口服施用营养性多肽，从而改变大鼠血浆中的氨基酸浓度的一实例。在口服施用之后在大鼠血浆中检测的氨基酸的分布取决于营养性多肽的氨基酸序列。举例来说，口服施用多肽seqid-00240、seqid-00338和seqid-00352使血浆lys的auc0-4h的变化增加，而施用多肽seqid-00363、seqid-00424和seqid-00426不改变血浆lys的auc0-4h的变化(图52)。另外，营养性多肽seqid-00240充当能够递送必需氨基酸(eaa)，同时不导致血浆phe浓度波动的多肽的一实例。图54说明向大鼠口服施用seqid-00105(2.85g/kg)的代表性血浆氨基酸浓度时间曲线。图54说明在表e33a中指示的剂量下口服施用seqid-00105之后对血浆leu浓度的剂量-应答效应。总之，这些结果证明口服施用营养性多肽可用于在大鼠中向全身性循环递送特定氨基酸分布。表e33a.用于大鼠药物动力学研究中的营养性多肽和剂量的清单。na：不适用。实施例34：调节营养性多肽可消化性。多种蛋白质修饰方法用于改变模型营养性多肽seqid-00363的结构。执行这些方法以评估特定结构特征关于蛋白质可消化性和生物可用度的相关性。这些修饰包括降低聚糖、水解蛋白质、还原/烷基化二硫键以及热变性蛋白质结构。使用体外消化测定以及在一些情况下体内测定评估由这些修饰获得的物质的消化改进。这些方法或产生类似结构变化结局的其它手段可应用于其它营养性多肽。酶促去糖基化。预测seqid-00363含有高甘露糖o连接的糖基化(goto等,2007biosci.biotechnol.biochem.)。为评估糖基化对seqid-00363消化的影响，以酶促方式显著降低甘露糖聚糖。非特异性α甘露糖苷酶(m7257，批号slbc4303v，sigmaaldrich,st.louis,mo)用于裂解o-聚糖内的所有1-3、1-4和1-6糖苷键联。这个α甘露糖苷酶不裂解任何非甘露糖糖苷键联；预测这个酶针对n连接的聚糖释放是无效的。去糖基化反应从jafari-aghdam等,2005biochimicaetbiophysicaacta改适。seqid-00363的蛋白质储备物由冻干粉末于以下去糖基化反应缓冲液中再混悬以获得酶浓度100g/l：20mm乙酸钠、2mm氯化锌、0.01％2-巯基乙醇，ph4.3。将试剂储备物稀释至去糖基化反应物中以获得最终体积0.5l。在10g/l的seqid-00363浓度和每mgseqid-003630.5eu的α甘露糖苷酶浓度下进行反应。将反应物于20l去糖基化反应缓冲液中经0.2um过滤器无菌过滤直接进入7x70ml3.5kd透析盒中。以透析进行反应以降低所提出的由释放的(单/多)糖对α甘露糖苷酶的反馈抑制。接着将反应物在37℃下储存6天。在整个反应过程期间，约10％的seqid-00363由于不溶性聚集体形成而损失。在终末(6天)时间点，从透析收集反应物，无菌过滤，浓缩，并且透滤至10％磷酸盐缓冲盐水(ph7.4)中。通过根据如本文所述的sds-page和抗gna蛋白质印迹的大小降低来监测甘露糖聚糖的成功降低。为产生去糖基化seqid-00363的高蛋白质浓度制剂，在amicon旋转浓缩器(emdmillipore,billerica,ma)中浓缩剩余汇合物直至最终浓度接近250g/l。高浓度制剂在4℃下保持可溶，并且被保持在那个温度下以进行长期储存。蛋白质水解。用以相对于天然蛋白质的制剂来增加生物可用度的另一方法是水解成短肽。通过枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)介导的蛋白水解来酶促产生诸如乳清(perea等,1993enzymemicrob.technol.)和大豆(kong等,2008bioresourcetechnology)的商品蛋白质的蛋白质水解产物。枯草杆菌蛋白酶在ph8.5和55℃下最具活性(alder-nissen,1986)。出于这个实验的意图，将模型蛋白质酶的冻干制剂再混悬于100mm碳酸钠中以获得275g/l来使所得蛋白质溶液的ph达到约ph8。将枯草杆菌蛋白酶(碱性蛋白酶(alcalase)2.4l，sigmaaldrich,st.louis,mo)在每mg模型蛋白质酶5.93x10-4u的浓度下添加至蛋白质溶液中。接着将反应物稀释以获得250g/l模型蛋白质酶，并且转移至55℃，持续24小时。一旦完成，即将水解物质储存在4℃下。通过使用superdex75(5x150mm)柱(gehealthcare,uppsala,sweden)进行尺寸排阻色谱法(sec)，并且也通过sds-page分析来监测反应进展。蛋白质还原和烷基化。可使含有二硫化物的蛋白质还原和烷基化以破坏二硫键并使游离硫醇稳定。这个修饰破坏所有二硫桥键结构，并且此外防止二硫桥键在分子内或分子外再形成。seqid-00363含有10个半胱氨酸和4个二硫键，如通过scratch蛋白质预测器所预测(cheng等,2005nucleicacidsres.)。使用bio-radreadyprep还原/烷基化试剂盒(bio-rad,hercules,ca)在最终浓度6g/l下使seqid-00363还原和烷基化。如由制造商说明书所推荐来进行还原/烷基化反应。在50mm磷酸盐(ph8.0)中使seqid-00363还原和烷基化。通过非还原性sds-page分析来分析样品。热诱导的蛋白质去稳定化。蛋白质变性涉及破坏分子的有序结构；即使所有四级、三级和二级结构减为一级结构。变性破坏所有非共价分子内相互作用；即氢键合、离子相互作用、vanderwaals相互作用和疏水性相互作用。热可用于破坏这些相互作用，并且使天然蛋白质减为它的一级结构(除二硫键之外)。将seqid-00363于10％pbs(ph7.4)中稀释至30g/l，并且快速加热至95℃。在煮沸后，从热处理移除蛋白质并且立刻转移至如本文所述的体外消化分析。seqid-00363的修饰形式的体外可消化性。使用本文所述的方法评估天然seqid-00363和seqid-00363的修饰形式(即去糖基化、还原和烷基化、以及热变性)的可消化性。简要来说，seqid-00363的天然和修饰形式用模拟胃液(sgf)处理，并且如本文所述通过凝胶电泳来分析在各种时间点剩余的完整蛋白质的存在性。另外，如本文所述通过反相hplc氨基酸分析来分析在暴露于基于胰酶的模拟消化系统之后存在的游离氨基酸的量。由sgf消化seqid-00363的天然和修饰形式获得的结果证明通过去糖基化、还原和烷基化、以及热变性对seqid-00363的修饰会在不同程度上增强蛋白质的可消化性。由胰酶消化seqid-00363的天然和修饰形式获得的结果证明通过去糖基化和热变性而非还原和烷基化对seqid-00363的修饰使消化期间游离leu的释放增强。表e34a列出由指数衰减曲线计算的半衰期值和在120分钟时间点的游离leu(μm)。表e34a.以分钟计的sgf半衰期(t1/2)和在胰酶消化修饰的营养性多肽的120分钟时间点的游离leu(μm)seqid-00363的修饰形式的生物可用度。使用本文所述的方法评估seqid-00363的天然和修饰形式(即去糖基化和水解)的生物可用度。简要来说，向插有颈静脉内导管的大鼠口服施用seqid-00363的天然和修饰形式，并且通过hplc氨基酸分析来测定在4小时时期内收集的血浆样品中的游离氨基酸的浓度。对在seqid-00363的天然和修饰形式的大鼠药物动力学研究中收集的血浆样品的氨基酸分析显示于图55中。这些结果证明水解seqid-00363使亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及一般来说必需氨基酸(eaa)的生物可用度增加。尽管seqid-00363的去糖基化不增加亮氨酸或eaa的生物可用度，但它使丝氨酸和苏氨酸的生物可用度增加。seqid-00363的修饰形式的回肠可消化性。蛋白质品质随氨基酸组成、可消化性和生物可用度而变。回肠可消化性测定可用于测量蛋白质的内含物(即氨基酸、氮、干物质重量)与在摄取蛋白质之后末端回肠中的消化物的内含物之间的差异。由回肠可消化性测定获得的结果可用于计算氨基酸、氮和干物质回肠可消化性系数，并且提供关于蛋白质的可消化性和氨基酸生物可用度的认识(darragh和hodgkinson,2000,journalofnutrition,130(7):1850s-1856s)。由于大肠中的微生物代谢，所以历经整个消化道确定的粪便可消化性系数倾向于过高估计氨基酸可消化性和生物可用度。因为蛋白质消化和氨基酸吸收主要发生在上部小肠中，并且截至回肠末端有效完成，所以回肠可消化性测定现时被接受为用于确定单胃哺乳动物中的蛋白质和氨基酸可消化性的所选方法。小肠转送速率类似于成人(3-4小时)的生长中的大鼠被接受为一种适于回肠可消化性测定的模型(amidon等,1986,thejournalofpharmacyandpharmacology,38(5):363-368)。如本文所述以口服施用seqid-00363的天然和修饰形式来进行大鼠药物动力学研究。将不可消化标志物edta钴在50mg/l下配制于给药蛋白质溶液中以监测处理组与个别大鼠之间的肠转送速率差异。在最终血液收集(在t＝4小时)之后，使大鼠安乐死，并且将末端回肠(在盲肠之前的20cm小肠)和它的内含物(消化物)收集至预称重管中。回肠用盐水冲洗，并且与消化物汇合。用hcl将消化物的ph调整至约3.0以使所有酶失活。将回肠样品放置至单独预称重15ml锥形管中。所有样品都快速冷冻在液氮中，并且储存在-80℃下直至进一步分析。计算并记录各样品的个别回肠和回肠内含物重量。以含有不溶性粒子的异质溶液形式存在的消化物的样品如本文所述在coomassie加强型蛋白质测定中用于测定蛋白质浓度。从施用媒介物、天然seqid-00363、去糖基化的seqid-00363和水解的seqid-00363的大鼠收集的消化物样品中的平均总蛋白质浓度分别是0.1、0.9、0.9和0.3mg/ml。基于收集的消化物的体积，从施用媒介物、天然seqid-00363、去糖基化的seqid-00363和水解的seqid-00363的大鼠收集的消化物样品中的总蛋白质质量分别是1.2、6.9、7.7和2.2mg。这些结果证明施用天然和去糖基化的seqid-00363的大鼠的消化物中的蛋白质的浓度和总质量高于施用媒介物或水解的seqid-00363的大鼠中。总之，这些结果表明在大鼠胃肠系统中，水解的seqid-00363比天然或去糖基化的seqid-00363更完全被消化。为确定回肠可消化性系数，分析给药样品的等分试样和回肠消化物样品的总氨基酸含量(通过反相hplc氨基酸分析)(lookhart和jones,1985,cerealchemistry,62(2):97-102)、总氮含量(通过kjeldhal分析)(lynch和barbano,1999,journalofaoacinternational,82(6):1389-1398)和钴含量(通过电感耦合等离子体质谱测定法(icp-ms))(taylor,h.e.,inductivelycoupledplasma-massspectrometry:practicesandtechniques,academicpress,2001)以确定回肠氨基酸和氮可消化性系数。实施例35.处理营养性多肽以达成活性降低修饰酶活性营养性多肽可改变蛋白质的酶活性与结构稳定性两者。对于口服施用的营养性多肽，可为有利的是缺乏不为递送氨基酸营养物所需的活性。此外，去活化指示可比它的天然对应物更可消化和生物可用的去稳定化。通过化学或热处理来实现酶修饰。通过体外测定来测量酶活性。活性测定。通过葡糖淀粉酶活性测定来测试seqid-00363的失活。葡糖淀粉酶起将对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷水解成对硝基苯酚(pnp)和葡萄糖的作用。通过在400nm下测量释放的pnp的吸光度(方法从葡糖淀粉酶活性测定(u.s.pharmacopeia.foodchemicalscodex,第8版；2012:1314-1315.)改适)来测定以每ml的单位数(u)计的酶活性。于0.3m碳酸钠中在0.12、0.06、0.03、0.015和0.0075μmol/ml下的pnp标准物用于使用以下等式确定毫摩尔消光系数(ε)：ε＝a400nm/c，其中考虑的是平均值，其中a400nm是在400nm下使用分光光度计在10mm光程下测量的吸光度，并且c是以μmol/ml计的标准浓度。于0.1m乙酸钠(ph4.5)中在属于标准物的吸光度范围内的稀释度下制备样品。使100μl样品在50℃下孵育5分钟，随后添加100μl已在50℃下平衡至少15分钟的pnpg溶液(100mgpnpg于0.1m乙酸钠(ph4.5)中稀释至100ml)。接着在50℃下孵育样品，并且在pnpg添加之后10分钟添加100μl0.3m碳酸钠以终止反应。接着测量在400nm下的吸光度，并且如下计算以u/ml计的活性：活性＝[(a样品–a空白)x0.3mlx稀释因数]/εx10分钟x0.10μmol/min/单位x0.1ml，其中a样品是样品吸光度，并且a空白是400nm下的空白吸光度，0.3ml是反应体积，10分钟是反应时间，0.10μmol/min是每单位酶裂解的pnp的量，并且0.1ml是样品等分试样。1:1:10.1m乙酸钠(ph4.5):0.3m碳酸钠:pnpg溶液用作空白。活性被报道为比活性(u/ml或u/mg)或相对活性(即相较于对照蛋白质)。用于去活化的蛋白质修饰。可通过化学诱导的使分子的酶活性位点去稳定化来使蛋白质酶去活化。进行筛选包括以下的一子组代表不同化学类别和作用机理的试剂的实验：氧化(漂白剂、h2o2、氧化乙烯)；还原(dtt、bme、tcep)；离液剂(cacl2、尿素、gndhcl、nascn)；高ph(na2co3、tris碱、na2hpo4)；低ph(柠檬酸三钠、trishcl、乙酸、硼酸)；中性ph(柠檬酸钠、mops酸、mes酸、乙酸钠)；去污剂(吐温80、triton-x-100、chaps、sds、mpd)；螯合(edta、柠檬酸盐)。于水中配制seqid-00363以获得300g/l，并且10倍稀释以获得一系列化学去活化条件(最终浓度＝30g/l)。随后在10分钟去活化和4天去活化之后测定seqid-00363的酶活性(表e35a)。表e35a.对seqid-00363的化学去活化。在4天时间点的酶活性测定结果。所有酶活性都相对于阴性对照(水)加以标准化。相对于水去活化阴性对照，seqid-00363在强离液剂，诸如6mgnd·hcl和4m尿素；高ph碳酸钠制剂；和强氧化剂次氯酸钠(家用漂白剂)中显示最大去活化。在t＝4天时，这些条件都显示在4天处理之后的相对酶活性小于20％。由于与消耗剧烈氧化剂和强离液剂相关的健康风险，在高ph下处理seqid-00363被鉴定为用于使酶去活化的最佳条件。相对于10分钟时间点，在4天时间点获取的样品表明在室温下进行化学去活化不是快速起效过程。在许多测定条件下，去活化的动力学可能不是极其快速的。测试在多种缓冲条件下由热量对seqid-00363的实验测量去活化。将seqid-00363于20mm磷酸钠(ph7)、20mm磷酸钠(ph9)、20mm碳酸钠(ph11)和水中稀释至3g/l。接着在pcr热循环仪中在环境温度、60℃、70℃、80℃和90℃下处理各缓冲液的100μl样品5分钟。通过葡糖淀粉酶活性测定来测试各酶的活性，并且各活性相对于在环境温度下于水中的活性(对照)加以标准化。结果以下显示于表e35b中。表e35b.对seqid-00363的化学去活化。在4天时间点的酶活性测定结果。所有酶活性都相对于阴性对照(水)加以标准化。进行测定温度和ph在不同暴露时间下对seqid-00363的酶活性的影响的另一多因素实验。将seqid-00363配制成100g/l，并且在0小时至24小时的时间过程内，相对于跨越25℃至70℃的温度梯度来测试高ph外加或向高ph缓冲液中透滤的影响。在分析后，使用外加1m乙酸钠缓冲液来使样品中和至约ph7。seqid-00363实验概述和设计如下。将seqid-00363再混悬成100g/l，并且外加以0.25m碳酸钠(ph10)，透滤至50mm碳酸钠(ph10)中，或透滤至10％磷酸盐缓冲盐水(ph9.0)中。跨越包括在t＝0、1、2、4和24小时的取样点的时间过程，在40、50、60或70℃下孵育样品。如本文所述使用活性测定来测定seqid-00363的失活。通过比活性(u/mg)和目视可溶性来将样品分析为凝胶、粘液或流体。这个研究发现温度与ph两者均使seqid-00363在酶性方面去活化。一些处理导致营养性多肽的不可逆聚集和凝胶形成；不分析这些样品的酶活性。这个实验的结果表明可在25℃下在ph10下使seqid-00363可溶性去活化。当反应温度增加时，蛋白质保持去活化，但变得不可溶。因此，ph被确定为关于seqid-00363去活化的关键过程变量。进行随后研究以探究在室温下随ph而变的seqid-00363去活化。可在室温下进行的过程比加热过程花费更少以及更易于按比例扩大。将seqid-00363在ph3.6下配制成100g/l，并且使用超滤膜，使缓冲液交换成一系列碳酸钠缓冲液。在缓冲液交换的过程期间，seqid-00363溶液ph从3.6增加至11.0。在缓冲液交换的过程期间，从超滤系统有序获取蛋白质的样品，从而产生一组跨越所述ph范围的样品。将这些样品保持在室温下，并且将各样品一分为二。在2-5小时之后，使各样品的一半中和至乙酸钠缓冲液中。接着如所述测定中和样品的酶活性，并且结果在表e35c中。表e35c.在ph范围内的2-5小时孵育对活性的影响。ph相对活性(％)3.61004915836827898869569.754103710.913也通过葡糖淀粉酶活性测定来测试由水解seqid-00363达成的去活化。本文描述蛋白质水解的程序。发现相对于对照，水解使活性降低至7％。也测试其它淀粉酶营养性多肽去活化。如本文所述通过葡糖淀粉酶活性测定，但代之以利用ph5.0乙酸盐缓冲液(推荐用于米曲霉源性酶)来测试seqid-00424的去活化。如本文所述通过水解或通过煮沸来使样品去活化。相对于对照，煮沸使活性降低至0％，而水解使活性降低至51％。实施例36：破坏营养性多肽酶活性。构建突变蛋白质。测试多种突变以确定可对已知具有酶活性的模型蛋白质(seqid-00338，uniprotid：p07170)实现的酶失活程度。在这个蛋白质中，底物结合位点包括位置42、134、167和178。此外，在位置91处存在镁离子结合位点。在若干底物结合位置处进行单一氨基酸突变。表达突变体并测试酶活性。通过pcr扩增两段来构建单一氨基酸突变蛋白质。使用具有可与his标签相容的突出部分的结合基因的5’末端的正向引物(atcaccaccatcaccatcatagcagcagcgaaagcattcgtatg)和含有大肠杆菌中用于靶标氨基酸的最常见密码子和在突变的上游和下游的20bp侧接区的反向引物(表e36a)来扩增第一段。第二段在使用对突变位置具有特异性的正向引物(表e36a)和结合基因的3’末端的反向引物(tgttagcagccggatccttaatctttgcccagtttattcagaatatc)下紧接在突变位点之后扩增蛋白质的3’末端。标准pcr反应条件用于所有段，所述反应条件含有0.5um正向引物、0.5um反向引物、1xphusion聚合酶主混合物(newenglandbiolabs)和1-100ng模板dna，于50ul最终体积中。热循环条件是在98℃下初始变性30秒，以在98℃下的变性温度持续10秒、在55-60℃下的退火温度持续15秒、在72℃下的延伸温度每kb产物持续15秒来循环30次。通过添加1uldpni(newenglandbiolabs)和5ul10xcutsmart缓冲液，以及在37℃下孵育1小时来从最终产物移除模板dna。遵循凝胶回收试剂盒(zymoresearch)来使各pcr产物清洁和浓缩，并且洗脱于20ul无菌水中，随后继续前进至下一组装步骤。表e36a.用于扩增突变体的pcr段1的反向引物的清单。突变通过呈它的单字母缩写形式的原始氨基酸继之以位置和呈它的单字母缩写形式的最终氨基酸来指定。通过gibson组装将各pcr扩增段插入表达质粒中，并且转化至t7express(newenglandbiolabs)细胞中以用于表达。使用引物ggatccggctgctaacaaagcc和atgatggtgatggtggtgatgatgac，通过pcr来扩增含有t7启动子、8xhis标签和终止密码子的表达质粒pet15b，以使在各pcr段之间将存在20bp重叠，以便它们将通过gibson组装来被适当组装。在gibson组装中，使1ul各pcr段与1xgibson组装主混合物(newenglandbiolabs)一起组合成10ul最终体积，并且在50℃下孵育1小时。通过添加20ul水来将组装反应混合物稀释3倍。将3ul稀释混合物转化至30ult7express(newenglandbiolabs)细胞中。挑选单一菌落，并且提取质粒并确认序列，随后继续移动至表达研究。表达和纯化突变蛋白质。单一菌落用于接种于各孔中具有1ml含100mg/l羧苄青霉素的lb培养基的2ml深孔块。将培养物在深孔块振荡器中在37℃和900rpm下振荡过夜。深孔块用于接种具有1ml含600mu/l葡糖淀粉酶的biosiltaenbase培养基的另一深孔块以获得od6000.1。在37℃和900rpm下振荡培养物16小时，此时添加1mmiptg以诱导培养物，并且添加额外enbase补充培养基和另外600mu/l葡糖淀粉酶以对培养物进行补充。在37℃和900rpm下再进行表达6小时。通过在室温下在3,000xg下旋转深孔块10分钟来收集培养物。在离心之后，小心移除上清液，将细胞集结块冷冻在-20℃下。使冷冻细胞集结块解冻，并且添加0.3g0.1mm锆珠粒至各样品中，随后添加0.5mlpbs。通过在配备有96孔板适配器的qiagentissuelyserii(qiagen,hilden,germany)中进行珠粒敲打5分钟来在冷室(4℃)中使细胞溶解。在3000rpm下离心细胞溶解产物10分钟，并且移除上清液，取样并通过芯片电泳来分析蛋白质浓度。通过添加2μl样品至7μl样品缓冲液中，在95℃下加热5分钟，接着添加35μl水来制备样品。使用ht低分子量蛋白质表达试剂盒或ht蛋白质表达试剂盒(遵循制造商方案)来完成分析。对于分子量测定(kda)和定量(ng/μl)，每12个样品操作1个蛋白质阶梯。根据制造商方案，使用hismultitraphp(gehealthcare)系统来纯化突变蛋白质。通过用coomasie蓝染色的sds-page和在280nm下的吸光度来测量蛋白质的浓度。将蛋白质于40mmtris缓冲液中稀释以进行激酶活性测定。测定seqid-00338的激酶活性。adp-glotmmax测定从promega(目录号v7001，madison,wi)获得。单磷酸腺苷从sigma-aldrich(目录号a1752，st.louis,mo)获得。用1.211gtris碱(目录号bp152-2，fisherbioreagents,pittsburgh,pa)、692μl12％盐酸溶液(目录号bdh3026-500mlp，vwr,radnor,pa)、10.0ml500mm氯化镁(目录号bp214-500，fisherbioreagents,pittsburgh,pa)制备5x激酶缓冲液，并且用milliq水使体积达到50ml并经0.22μmpes过滤器(目录号scgp00525，millipore,billerica,ma)过滤至无菌50ml管中。将于tris缓冲液中在35μg/ml下的12种his标签纯化突变蛋白质和野生型蛋白质连续稀释至7.0和1.4μg/ml。通过用适当体积的含10mmamp和10mmatp的milliq水稀释5x激酶缓冲液来在0.5mmamp/0.5mmatp下制备激酶反应混合物以测试活性，以及在0mmamp/0mmatp下制备激酶反应混合物以测定背景活性。通过混合9μl反应混合物与6μl稀释seqid-00338，通过上下吸移进行混合，以及将5μl分配至384孔白色optiplate(perkinelmer,waltham,ma)中来制备一式两份反应物。通过于milliq水中连续稀释4mmadp，以及添加激酶缓冲液直至1x来制取关于在0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3和4mmadp下的标准物的adp标准曲线。将板用箔板密封物覆盖，并且在30℃下孵育30分钟。在激酶反应之后，添加5μladp-glotm试剂至各孔中。将板用箔板密封物密封，并且在室温下在450rpm下于水平板振荡器上放置2分钟。从板振荡器移除板，并且在室温下孵育40分钟。接着在1109xrcf下将板离心15秒，并且添加10μladp-glotmmax检测试剂。将板用箔板密封物密封，并且在室温下在450rpm下在水平板振荡器上振荡2分钟。接着从板振荡器移除板，并且在室温下孵育60分钟。在1109xrcf下将板离心15秒，并且在enspirealpha板读取器(perkinelmer,waltham,ma)上读取发光。adp标准曲线用于确定在存在或不存在底物下，样品孔中的adp浓度。通过对x＝log(x)变换的adp标准物发光值进行非线性4参数逻辑回归来确定浓度。发现在大多数样品中，背景adp低于检测限。当在不存在底物下的adp背景浓度可计算时，从底物孵育孔中的计算adp浓度中减去那些值的平均值。通过在相同浓度下相对于纯化野生型蛋白质的活性百分比来计算活性剔除。表e36b列出变体相对于纯化野生型蛋白质的平均活性百分比。所有变体相较于野生型蛋白质都具有降低的活性。在7μg/ml下，激酶变体展现活性差异。表e36b.活性比例计算为在30℃下在30分钟反应期间由seqid-00338在7μg/ml下转化的amp+atp→2adp百分比。激酶avgsdn野生型100.0％11.2％2d91f0.9％0.60％2d91i0.4％0.20％2r134m0.3％0.09％2r134y0.2％0.08％2r42a0.9％0.08％2r42c1.8％0.14％2r42g1.2％0.06％2r42i1.5％0.07％2r42k2.2％0.14％2r42l1.7％0.08％2r42q1.2％0.05％2r42t1.9％0.06％2实施例37.工程改造分泌多肽以达成酶活性降低构建突变蛋白质以降低营养性多肽的酶活性。预测seqid-00407的活性位点是残基d217和e249，其是处于催化结构域的中心的酸性残基。为产生不含酶活性，以及富含对营养和健康重要的氨基酸的多肽，我们使那两个位点突变以破坏seqid-00407的催化活性。seqid-00407中的d217和e249可充当亲核试剂和质子供体或接受体以与它们的配体形成氢键。为从seqid-00407移除酶活性，我们以在e249处的使它从谷氨酸变为苯丙氨酸的单一氨基酸突变来工程改造蛋白质。通过组装两个pcr片段来构建突变体。第一片段含有酶的在突变位点的下游多达20bp的5’末端。第二片段含有酶的紧接在突变位点之后起始的3’末端。在第一pcr片段中，特定pcr引物被设计以结合靶向突变位点，并且并入所需突变氨基酸密码子。选择ttt密码子，因为它是枯草芽孢杆菌中最常用于苯丙氨酸的密码子。使用gibson组装方法(nebgibson组装主混合物)在50℃下持续1小时将两个pcr片段组装并插入质粒载体中。在大肠杆菌中构筑构建体，并且通过dna测序来确认，随后转化至枯草芽孢杆菌中以用于分泌和酶活性测定。营养性多肽从枯草芽孢杆菌分泌。枯草芽孢杆菌表达菌株的三个单独菌落用于接种于深孔块(96方孔)中的1ml具有cm5的2xl-mal培养基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨和10g/l酵母提取物、75g/l麦芽糖)。培养块用多孔粘附性板密封物覆盖，并且在微型表达室(glas-col,terrehaute,in)中在37℃和880rpm下孵育过夜。过夜培养物用于接种于深孔块中的新鲜2xl-malcm5培养物以获得起始od600＝0.1。在37℃、880rpm下孵育这些表达培养物直至od600＝1.0(约4小时)，此时通过在最终浓度0.1m下添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)以及继续孵育4小时来诱导它们。在4小时之后，测量各培养物的细胞密度(od600)，并且通过离心(3000rpm，10分钟，室温)来收集细胞。在离心之后，小心移除培养上清液，并且转移至新块中，并将细胞集结块冷冻在-80℃下。为测定分泌蛋白质的水平，通过芯片电泳来测定上清液以测定分泌目标蛋白质(poi)的水平。简要来说，通过添加2μl样品至7μl样品缓冲液中，在95℃下加热5分钟，接着添加35μl水来制备样品。使用ht低分子量蛋白质表达试剂盒或ht蛋白质表达试剂盒(遵循制造商方案)来完成分析。对于分子量测定(kda)和定量(ng/μl)，每12个样品操作1个蛋白质阶梯。淀粉酶活性测定。seqid-00407是枯草芽孢杆菌中具有将多糖(诸如淀粉)分解成单糖或二糖的活性的α-淀粉酶。为证明特定突变体已移除酶活性，将分泌酶的枯草芽孢杆菌涂铺于含有淀粉的琼脂板上。如果存在酶活性，那么分泌的酶将分解淀粉，并且在用碘染色后，将存在围绕枯草芽孢杆菌菌落的晕圈。通过组合25gluria肉汤-miller、10g淀粉、15g细菌琼脂和1l水来制备1％淀粉板。在琼脂已固化之后，添加10mmiptg至淀粉板中。将表达突变多肽的枯草芽孢杆菌菌株的单一菌落接种在5mllb中，在37℃下持续4小时，并且将50μl液体培养物点样在淀粉板的中心处。在20小时的生长和诱导分泌之后，添加10％碘至淀粉板中以染色淀粉。当分泌野生型酶时，它在细胞周围产生大晕圈。然而，当分泌工程改造的酶时，晕圈的面积降低，这类似于表达无酶空载体的阴性对照菌株。表e37a相对于细胞面积定量晕圈面积。显示的是对于野生型来说，晕圈与细胞之间的面积差异大于工程改造的突变体。根据显示的数据，我们说明了酶活性降低的分泌营养性多肽的工程改造。表e37a.以in2计量的定量细胞、晕圈面积和它们的差异。蛋白质细胞面积(in2)晕圈面积(in2)晕圈/细胞无蛋白质对照0.4130.61.45野生型1.272.2461.77e249f样品10.3310.4961.50e249f样品21.3351.9361.45实施例38：工程改造营养性多肽氨基酸含量以调节多肽活性以及增浓必需氨基酸含量。为说明氨基酸含量增浓的分泌多肽的工程改造，我们选择已知在高水平下分泌蛋白质的微生物枯草芽孢杆菌。seqid-00407被鉴定为枯草芽孢杆菌中的主要分泌蛋白质。使用seqid-00407的序列保守性和晶体结构数据，我们鉴定各蛋白质内被预测会耐受突变，而不负面影响蛋白质的结构稳定性和/或宿主生物体分泌蛋白质的能力的连续区域。我们分析以结构蛋白质数据库条目1ua7报道的seqid-00407的二级结构。我们鉴定蛋白质序列内不为α螺旋或β折叠的一部分的19个环区域。这些环区域由以下氨基酸残基界定：73-76、130-133、147-152、157-161、189-192、222-227、239-244、283-286、291-298、305-308、318-323、336-340、356-360、365-368、387-392、417-421、428-432、437-442和464-466。长度小于4个氨基酸的环区域不考虑用于突变。历经进化空间的序列保守性也被考虑用于鉴定可经受工程改造，同时维持结构稳定性和分泌胜任性的位置。在同源性序列的家族内保守性较小的位置是固有可变的，并且可能更可经受突变而不影响固有地与结构相关联的活性。为发现保守性较小的位置，我们从ncbi保守结构域数据库下载pfam00128的比对结果，所述数据库含有31种包括seqid-00407催化结构域的蛋白质序列(marchler-bauera.,zhengc.,chitsazf.,derbyshirem.k.,geerl.y.,geerr.c.,gonzalesn.r.,gwadzm.,hurwitzd.i.,lanczyckic.j.,luf.,lus.,marchlerg.h.,songj.s.,thankin.,yamashitar.a.,zhangd.和s.h.bryant.nucleicacidsres.(2013)41:d348-52)。我们也使用seqid-00407进行ncbi蛋白质参照序列数据库的psi-blast搜索(pruittk.d.,tatusovat.和d.r.maglott.nucleicacidsres.(2005)33:d501-504)，并且获得500种与seqid-00407同源的序列。在两种情况下，使用blosum62位置特异性评分矩阵、空位罚分-11、空位延伸罚分-1和比对纳入e值截断值0.005进行单次迭代(altschuls.f.,nucleicacidsres.(1997)25:3389-3402)。所有蛋白质序列比对都用于产生对各查询序列具有特异性的位置特异性评分矩阵(pssm)作为psi-blast搜索的一部分。根据pssm，我们通过计数在各环内的各位置处与正性pssm评分相关的不同氨基酸的数目以及对在各位置处进行必需氨基酸取代的pssm评分的总和和平均值来鉴定被预测会耐受突变的区域。此外，根据从各psi-blast搜索获得的多重序列比对结果，我们计算在各位置处的氨基酸熵，如由sj＝-σi∈aapilnpi所确定，其中sj是在位置j处的熵，并且pi是在位置j处观察到氨基酸i的概率。使用突变耐受性的这些量度，我们鉴定四个被预期会耐受突变成必需氨基酸的环区域。为在必需氨基酸方面增浓鉴定的区域，我们使用组合密码子文库，其中任何所选位置可为f、i、l、v或m(表示为z)或r、k、t、i或m(表示为x)。在选择用于突变成必需氨基酸的各环区域中，各可变位置视它的相对疏水性残基耐受性(基于它们的相应pssm值)而定被指定为z或x。耐受疏水性残基的位置被指定为z，并且使用密码子ntn进行遗传编码。更耐受亲水性残基的位置被指定为x，并且使用密码子anr进行遗传编码。我们指示在seqid-00407的一个鉴定的可变区(147-153)中，甘氨酸残基被插入环的中心中以试图增强这个区域的构象可挠性。对于seqid-00407，鉴定的区域的序列概述于表e38a中。表e38a.起始残基编号原始简并148yaaixxgxx240ntsazxxz291shyasdxzyxxz389qpeexpzzx＝ntn，编码f、l、i、m、vz＝anr，编码i、m、t、k、r文库设计和构建。基于对可变区的鉴定，我们设计可扩增如本文说明的各可变区的引物。举例来说，如果存在四个可变区，那么我们需要四对引物来产生四个可变片段。在步骤1中，我们使用pes1205作为模板，其含有与n末端amyq信号肽和pgrac启动子的下游融合的seqid-00407。pes1205是载体pht43(mobitec)的衍生物，含有编码来自枯草芽孢杆菌的amye基因(减去编码amye信号肽的初始93bp)加c末端1xflag标签的1905bpdna片段。与pht43上编码的samyq序列同框克隆amye::1xfl:ag序列。对于片段1、2、3、4，正向引物id-45053、引物id-45054、引物id-45055和引物id-45056含有在可变区之前的恒定序列继之以用以代表可变区的简并序列的25个碱基和在可变区的下游的恒定序列的25个碱基。对于片段1、2、3，反向引物：引物id-45061、引物id-45062和引物id-45063分别含有在下一可变区的上游的反向互补序列的25个碱基。对于片段4，反向引物：引物id-45064含有离可变区4任意距离的反向互补序列的25个碱基。使用phusiondna聚合酶(newenglandbiolabs,beverly,ma)和由制造商推荐的反应参数来操作四个单独pcr扩增。关于单独反应，分别使用作为模板的pes1205以及引物对引物id-45057和引物id-45061、引物id-45058和引物id45062、引物id-45059和引物id-45063、以及引物id-45060和引物id-45064来产生四个野生型片段wt-frag-1、wt-frag-2、wt-frag-3和wt-frag-4。凝胶纯化所有pcr片段。在步骤2中，设置两个单独pcr反应。第一pcr反应含有等摩尔比率的片段1和2作为模板，以及引物id-45057和引物id-45062作为引物。第二pcr反应含有等摩尔比率的片段3和4，以及引物id-45059和引物id-45064作为引物。在两个反应中，以存在于各可变片段中的文库成员的摩尔比添加相应野生型片段。凝胶纯化片段5和6，并且以等摩尔比率用作步骤3中的模板。用于pcr反应中的引物包括引物id-45057和引物id-45064。使用pes1205和引物对引物id-45065和引物id-45066产生载体pcr产物。凝胶纯化片段7与载体pcr产物两者，并且使用gibson组装主混合物(newenglandbiolabs,beverly,ma)一起克隆并根据制造商说明书转化至克隆宿主大肠杆菌turbo(newenglandbiolabs)中。对50个菌落测序以确定文库的多样性。接着将琼脂板上的菌落混悬于lb培养基中，并且收集以进行质粒纯化。以类似方式，我们产生seqid-00407的9种特定变体，其在突变体设计中鉴定的每个可变位置处以9种特定氨基酸f、l、i、m、v、t、k、r、w加以改变。特定变异引物在列举时通过单字母氨基酸缩写来表示。所有引物都列于表e38b中。表e38b.枯草芽孢杆菌菌株构建。枯草芽孢杆菌菌株wb800n(mobitec,germany)用作表达宿主。wb800n是充分研究的菌株(枯草芽孢杆菌168)的衍生物，并且它已通过缺失编码8种细胞外蛋白酶的基因(npre、apre、epr、bpr、mpr、nprb、vpr和wpra)来工程改造以降低分泌蛋白质的蛋白酶降解。根据制造商说明书进行枯草芽孢杆菌转化。将约5μgseqid-00407变异构建体的文库转化至wb800n中，并且通过涂铺在含有5.0μg/ml氯霉素(cm5)的lb琼脂上来在37℃下选择单一菌落。对于9种特定变体，将约1μg特定seqid-00407变体转化至wb800n中，并且通过涂铺在含有5.0μg/ml氯霉素(cm5)的lb琼脂上来在37℃下选择单一菌落。枯草芽孢杆菌文库筛选。枯草芽孢杆菌seqid-00407文库的约800个个别转化体用于接种于深孔块(96方孔)中的具有cm5的2x-mal培养基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨和10g/l酵母提取物、75g/l麦芽糖)的个别1ml培养物。除文库菌株之外，接种含有具有amye和samyq前导肽的质粒的菌株作为阳性对照，并且接种含有不具有目标基因的质粒的菌株作为阴性对照。培养块用多孔粘附性板密封物覆盖，并且在微型表达室(glas-col,terrehaute,in)中在37℃和880rpm下孵育过夜。过夜培养物用于接种于深孔块中的新鲜2x-malcm5培养物以获得起始od600＝0.1。在37℃、880rpm下孵育表达培养物直至od600＝1.0(约4小时)，此时通过在最终浓度1mm下添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)以及继续孵育4小时来诱导它们。在4小时之后，测量各培养物的细胞密度(od600)，并且通过离心(3000rpm，10分钟，室温)来收集细胞。在离心之后，小心移除培养上清液，并且转移至新块中，并将细胞集结块冷冻在-80℃下。为测定分泌蛋白质的水平，首先通过0.45μm过滤器，随后通过0.22μm过滤器来过滤0.5ml培养上清液等分试样。接着通过芯片电泳系统来测定滤液以测定分泌目标蛋白质(poi)的水平，并且与基础构建体的分泌水平进行比较。简要来说，通过添加2μl样品至7μl样品缓冲液中，在95℃下加热5分钟，接着添加35μl水来制备样品。使用ht低分子量蛋白质表达试剂盒或ht蛋白质表达试剂盒(遵循制造商方案)来完成分析。对于分子量测定(kda)和定量(ng/μl)，每12个样品操作1个蛋白质阶梯。通过对目标凝胶条带的lc/ms/ms来确认seqid-00690和seqid-00702。使所选命中物与含有5％β-巯基乙醇的invitrogenlds样品缓冲液混合，煮沸，并且装载于10％bis-tris凝胶(lifetechnologies)上。在操作之后，使用simplybluetmsafestain(lifetechnologies)来染色凝胶，并且切除所需条带并提交以进行分析。洗涤凝胶条带，还原并烷基化，接着用胰蛋白酶消化4小时，随后用甲酸淬灭。消化物接着用联接于thermofisherqexactive的watersnanoacquityhplc系统，通过纳米lc/ms/ms来分析。将肽装载于捕集柱上，并且历经75μm分析柱在350nl/min下洗脱；两个柱均填充有jupiterproteo树脂(phenomenex)。以数据依赖性模式操作质谱仪，其中ms和ms/ms分别在70,000fwhm分辨率和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中进行。15种最丰富的离子被选择用于ms/ms。使用mascot相对于附有相关变异蛋白质序列的相关宿主数据库搜索所得肽数据。稀释的过夜培养物用作含有cm5的lb肉汤培养物的接种物。使这些培养物在37℃下生长直至它们达到对数期。使这些培养物的等分试样与甘油(20％最终浓度)混合，并且冷冻在-80℃下。接着使用instagene基质(biorad,usa)纯化前30名命中物，并且使用cttgaaattggaagggagattc和gtataaacttttcagttgcagac进行扩增，并使用相同引物进行测序以鉴定seqid-00407变异序列。枯草芽孢杆菌分泌文库分析。分析seqid-00407的所有分泌变体(seqid45002-45028)以确定相对于存在于初始遗传文库中的预期位置特异性偏倚，是否有任何位置特异性氨基酸偏倚存在于分泌变体中。为此，对各氨基酸在各位置处进行精确二项检验以确定各氨基酸的观察数目显著(p<0.05)大于或小于机会预期的可能性。表e38c显示这个单尾检验的p值，其中那些突显组成部分具有p值<0.05。应注意除全都显著高于预期的野生型值之外，所有其它显著不同氨基酸频率都小于预期。预期位置特异性氨基酸偏倚显示于表e38d中，并且通过在文库已被构建并转化至大肠杆菌中之后对47种随机选择的变体测序来发现。假定被设计为x的所有位置都从l、i、v、f和m密码子的相同分布(即对于所有x位置，不存在位置特异性氨基酸偏倚)有效取样。因此，跨越各位置聚集各氨基酸的观察计数以确定所有x位置的预期氨基酸可能性。对被设计为z的所有位置都进行类似假定。如可在表e38c中所见，除在各位置处朝向野生型序列的强烈偏倚之外，存在许多不同氨基酸被观察到显著小于预期，从而指示在分泌文库中在那个位置处存在与那些氨基酸的偏离。这个数据提供用于设计在各位置处具有特定突变的特定合理设计变体的其它信息。举例来说，为在亮氨酸方面增浓分泌变体，位置241和291可为合乎需要性较小的选择。或者，为在缬氨酸方面增浓分泌变体，位置149、241、242、291、294、295和389可为合乎需要性较小的选择。表e38c：评估seqid-450001的分泌变体中的位置特异性氨基酸偏倚的单尾二项检验p值表e38d：构建的seqid-450001文库中的位置特异性预期氨基酸可能性特定变体的枯草芽孢杆菌表达测试。枯草芽孢杆菌表达菌株的三个单独菌落用于接种于深孔块(96方孔)中的1ml具有cm5的2x-mal培养基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨和10g/l酵母提取物、75g/l麦芽糖)。培养块用多孔粘附性板密封物覆盖，并且在微型表达室(glas-col,terrehaute,in)中在37℃和880rpm下孵育过夜。过夜培养物用于接种于深孔块中的新鲜2x-malcm5培养物以获得起始od600＝0.1。在37℃、880rpm下孵育这些表达培养物直至od600＝1.0(约4小时)，此时通过在最终浓度0.1m下添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)以及继续孵育4小时来诱导它们。在4小时之后，测量各培养物的细胞密度(od600)，并且通过离心(3000rpm，10分钟，室温)来收集细胞。在离心之后，小心移除培养上清液，并且转移至新块中，并将细胞集结块冷冻在-80℃下。为测定分泌蛋白质的水平，首先通过0.45μm过滤器，随后通过0.22μm过滤器来过滤0.5ml培养上清液等分试样。接着通过芯片电泳来测定滤液以测定分泌目标蛋白质(poi)的水平。简要来说，通过添加2μl样品至7μl样品缓冲液中，在95c下加热5分钟，接着添加35μl水来制备样品。使用ht低分子量蛋白质表达试剂盒或ht蛋白质表达试剂盒(遵循制造商方案)来完成分析。对于分子量测定(kda)和定量(ng/μl)，每12个样品操作1个蛋白质阶梯。通过对目标凝胶条带的lc/ms/ms来确认seqid-45025、seqid-45026、seqid-45027和seqid-45028。使所选命中物与含有5％β-巯基乙醇的invitrogenlds样品缓冲液混合，煮沸，并且装载于10％bis-tris凝胶(lifetechnologies)上。在操作之后，使用simplybluetmsafestain(lifetechnologies)来染色凝胶，并且切除所需条带并提交以进行分析。洗涤凝胶条带，还原并烷基化，接着用胰蛋白酶消化4小时，随后用甲酸淬灭。消化物接着用联接于thermofisherqexactive的watersnanoacquityhplc系统，通过纳米lc/ms/ms来分析。将肽装载于捕集柱上，并且历经75μm分析柱在350nl/min下洗脱；两个柱均填充有jupiterproteo树脂(phenomenex)。以数据依赖性模式操作质谱仪，其中ms和ms/ms分别在70,000fwhm分辨率和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中进行。15种最丰富的离子被选择用于ms/ms。使用mascot相对于附有相关变异蛋白质序列的相关宿主数据库搜索所得肽数据。工程改造的多肽的淀粉酶活性测定。测试一种工程改造的多肽以证明酶活性。seqid-00407是枯草芽孢杆菌中具有将多糖(诸如淀粉)分解成单糖或二糖的活性的α-淀粉酶。为证明seqid-00690已保留酶活性，将分泌酶的枯草芽孢杆菌涂铺于含有淀粉的琼脂板上。如果存在酶活性，那么分泌的酶将分解淀粉，并且在用碘染色后，将存在围绕枯草芽孢杆菌菌落的晕圈。通过组合25gluria肉汤-miller、10g淀粉、15g细菌琼脂和1l水来制备1％淀粉板。在琼脂已固化之后，添加10mmiptg至淀粉板中。将表达突变多肽的枯草芽孢杆菌菌株的单一菌落接种在5mllb中，在37℃下持续4小时，并且将50μl液体培养物点样在淀粉板的中心处。在20小时的生长和诱导分泌之后，添加10％碘至淀粉板中以染色淀粉。当seqid-00690被涂铺在淀粉板上时，酶被分泌，并且在细胞周围产生大晕圈，其类似于野生型菌株，并且比表达无酶空载体的阴性对照菌株大得多。表e38e相对于细胞面积定量晕圈面积。根据显示的数据，我们说明了保留酶活性的富含必需氨基酸的分泌营养性多肽的工程改造。表e38e.以in2计量的定量细胞、晕圈面积和它们的差异。实施例39：测定在口服消耗富含亮氨酸的营养性多肽之后人受试者的肌肉蛋白质分数合成速率。口服摄取亮氨酸或含有亮氨酸的蛋白质会刺激肌肉蛋白质合成(layman和walker,2006,thejournalofnutrition:136:319–323)。许多本文所述的富含亮氨酸的营养性多肽是高度水溶性的，并且在人受试者中易于消化和吸收。此处描述如通过营养性多肽递送的氨基酸的药物动力学以及它们对肌肉蛋白质合成的影响。在表观健康的受试者中测量富含亮氨酸的营养性多肽对肌肉蛋白质合成的影响。以单盲方式将十二(12)名年龄在50岁与70岁之间的表观健康的受试者(平均高度：1.7m，重量：78.5kg，年龄：56.2以及bmi：26.8)随机指定于一连串处理剂。一组6名受试者接受seqid-105的制剂和90％乳清蛋白质分离物(wpi)对照，而另一组接受seqid-363和90％乳清蛋白质分离物对照。交错进行处理以使各个体在单独日子(相隔2-3天)接受35克各营养性多肽制剂以允许洗脱初始制剂。在受试者内交叉比较中，各受试者充当他们自身的对照。如果受试者满足任何以下排除准则，那么将他们从研究排除：糖尿病史。在先前6个月中恶性肿瘤史。先前胃肠旁路手术(束带等)。慢性炎症性病状或疾病(狼疮、hiv/aids等)。已知对乳清蛋白质、霉菌孢子或真菌敏感或过敏。在他们参与这个研究期间未节制进食动物性蛋白质。在他们参与这个研究期间不能节制消耗蛋白质或氨基酸补充剂。在研究时期期间不能节制抗阻训练。当前参与用探究性产品进行的另一研究调查。在筛选就诊时血红蛋白小于9.5mg/dl。相伴使用皮质类固醇或睾固酮补充疗法(摄取、注射或经皮)。根据医务人员的判断，如果他们参与，那么将会将受试者置于增加的损害风险下的任何其它疾病或病状。所有受试者都被要求维持他们的当前膳食习惯，维持他们的每日生活活动，以及在研究期间不参与任何抗阻运动。使用肌肉蛋白质合成的分数速率(fsr)来衡量各营养性制剂的合成代谢作用(smith,villareal和mittendorfer,2007,americanjournalofphysiology-endocrinologyandmetabolism:293:e666–e671)。研究程序包括在灌注恒定输注l-[环-d5]-苯丙氨酸(cambridgeisotopelaboratories,tewksbury,ma)期间进行静脉血液抽取和股外侧肌活检。通过在灌注恒定输注l-[环-d5]-苯丙氨酸期间进行肌肉活检来测量肌肉蛋白质合成的分数速率(fsr)。具体来说，在过夜禁食(>8小时)之后，使用稳定同位素示踪剂并入技术，由在启始稳定同位素示踪剂输注之后2、4和7小时进行的股外侧肌活检来在禁食人受试者中测量肌肉蛋白质合成的分数速率(fsr)。也在开始稳定同位素示踪剂输注之后在指定时间点(即2、3、4、4+30、5、5+30、6、6+30和7小时)收集血液样品以评估氨基酸浓度变化。对于各受试者，在研究的早晨以及在过夜禁食(8小时)之后，将18-22规格聚乙烯导管插入各臂中。将一个导管插入远端静脉中以进行加热采血来获得背景血液样品(5ml)，并且另一导管插入前臂中以输注稳定同位素示踪剂。在插入外周导管之后，开始灌注(5.04μmol/kg)恒定(0.084μmol/kg/min)输注稳定同位素(gras物质)环-d5-苯丙氨酸。稳定同位素从cambridgeisotopelaboratories(tewksbury,ma)获得，并且测试无菌性和致热原性(通过cil和配制性药房-pharmacare)。在输注之前，用无菌盐水复原示踪剂。在输注期间，稳定同位素经放置在输注管线中的无菌0.22微米(millipore)过滤器过滤。在开始同位素输注之后在指定时间点(2、3、4、4+30、5、5+30、6、6+30和7小时)将血液样品(5ml)收集于血清分离管中。在整个研究期间抽取约60ml血液，并且这个体积用与稳定同位素示踪剂一起输注的盐水替换。在示踪剂输注的2、4和7小时进行股外侧肌的肌肉活检。在4小时时的活检之后，口服施用营养性蛋白质制剂。所有肌肉活检都在局部麻醉(使用无菌1％利多卡因，无肾上腺素)下进行以达成正常疼痛管理和严格无菌程序。在各肌肉活检之前，使用无菌皮肤制备试剂盒(必妥碘(betadine))清洁皮肤，并且皮肤和以下组织用局部麻醉剂(利多卡因)注射以使疼痛最小。通过小切口(约1cm)，将5mm针“o”推进至肌肉中，并且施加抽吸。接着用针移除一块肌肉(约50–100mg)。接着洗净皮肤，用1/4英寸x1.5英寸粘附性steri条带使边缘接近，并且将透明透气薄膜敷料(tegaderm)施加于部位。维持稳固压力直至在部位处的流血停止。为使感染和瘀伤的风险最小，在将受试者解脱之前由医务人员分别施加抗生素软膏剂和压力敷料(具有自粘性弹性绷带)。如下计算以(％/h)计量的fsr：其中增浓(ep1、ep2和em)表示为摩尔百分比过量(mpe)，并且计算为一旦示踪剂浓度已平稳，标记的苯丙氨酸示踪剂与未标记的苯丙氨酸示踪剂的比率(ttr)。ep1和ep2分别是在第一和第二活检(或第二和第三)中结合的环-2h5-苯丙氨酸的增浓，并且em是细胞内池中环-2h5-苯丙氨酸的增浓的平均值。“t”是在以分钟计的第1肌肉活检与第2肌肉活检之间(或在第二与第三之间)消逝的以分钟计的时间。60min/h和100的恒定换算因数用于以每小时百分比表示fsr。通过配对t检验来分析结果变量(肌肉蛋白质合成和血液氨基酸浓度)。将统计显著性先验确定在p<0.05下，并且趋势被接受为0.051<p<0.10。表e39a-c显示在急性口服剂量的各营养性蛋白质制剂之前和之后对各受试者计算的fsr数据，并且图56显示平均fsr的变化。显示的数据是平均值+/-平均值标准误差。应注意来自wpi组中的受试者3的禁食fsr值具有极其升高的fsr，这与正常禁食值不一致，其中z值是2.85。双尾grubbs异常值检验指示它是显著(p<0.05)异常值，并且在计算如图56中所示的平均值和标准误差时将它移除。表e39a表e39b表e39c当移除受试者3时，配对t检验比较各组的禁食和供食应答指示wpi处理的受试者的供食应答显著不同于禁食应答。(p＝0.007)，与考查对wpi的fsr应答的先前研究(paddon-jones,d.,sheffield-moore,m.,katsanosc.s.,xiao-junz.,wolfe,r.r.differentialstimulationofmuscleproteinsynthesisinelderlyhumansfollowingisocaloricingestioninaminoacidsorwheyprotein.exp.gerontol.(2006)41:215-219)一致。如果包括受试者3，那么差异丧失显著性(p＝0.45)。seqid-105供食组中的禁食和供食fsr应答显著不同(p＝0.04)，但seqid-363供食组中的禁食和供食fsr应答不显著不同(p＝0.68)。实施例40：含有营养性多肽的制剂的口服药物动力学对蛋白质摄取的合成代谢应答是以必需氨基酸的递送为基础。这个研究的目的在于在240分钟的时期内考查应答于各种蛋白质的血浆氨基酸浓度变化。以双盲方式将4名年龄在18岁与50岁之间的表观健康的受试者随机指定于一连串处理剂，以170ml的体积口服接受20克乳清蛋白质分离物或seqid-105。受试者在口服药物动力学研究之前被禁食过夜(>8小时)。在口服摄取营养性多肽之后在指定时间点(即0、15、30、60、90、120、150、180、210和240分钟)收集静脉血液样品以评估血浆氨基酸浓度变化。通过questdiagnostics或laboratorycorporationofamerica来定量血浆氨基酸浓度。图57-60显示关于wpi和seqid-105的各测量氨基酸以及各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的血浆时间过程。使用单因素anova检验以评估关于wpi的在测量时间点之间的血浆氨基酸水平的显著差异，这些数据指示asn、ile、leu、lys、met、phe、pro、trp、tyr、eaa、bcaa和taa随时间存在显著差异(p<0.05)。使用单因素anova检验以评估关于seqid-105的营养性制剂的在测量时间点之间的血浆氨基酸水平的显著差异，这些数据指示arg、asn、asp、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、ser、tyr、val、eaa、bcaa和taa随时间存在显著差异(p<0.05)。图61-63显示关于wpi和seqid-105的各测量氨基酸以及各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的积分曲线下面积(auc)。使用t检验以比较wpi与seqid-105之间各氨基酸或氨基酸组的auc，在asp(p＝0.01)、his(p＝0.04)、leu(0.023)、met(0.002)、phe(0.04)、pro(p<0.01)、ser(p＝0.03)和trp(p＝0.002)应答方面存在显著差异。在另一研究中，分别以100ml和1151ml向6名年龄在18岁与50岁之间的表观健康的受试者口服给与35克剂量的seqid-105和wpi。图64-67显示关于wpi和seqid-105的各测量氨基酸以及各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的血浆时间过程。使用单因素anova检验以评估关于wpi的在测量时间点之间的血浆氨基酸水平的显著差异，这些数据指示arg、asn、asp、gln、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr、val、eaa、bcaa和taa随时间存在显著差异(p<0.05)。使用单因素anova检验以评估关于seqid-105的营养性制剂的在测量时间点之间的血浆氨基酸水平的显著差异，这些数据指示arg、asn、asp、glu、his、ile、ley、lys、met、phe、ser、thr、trp、val、eaa、bcaa和taa随时间存在显著差异(p<0.05)。图68-70显示关于在35g下给药的wpi和seqid-105的各测量氨基酸以及各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的积分曲线下面积(auc)。使用双尾不等方差t检验以比较wpi与seqid-105之间各氨基酸或氨基酸组的auc，在asn(p＝0.006)、his(p＝0.01)、ile(p＝0.03)、lys(p＝0.02)、met(p<0.001)、phe(p<0.001)、pro(p＝0.002)、ser(p＝0.005)、thr(p＝0.004)、trp(p<0.001)、tyr(p＝0.003)和val(p＝0.012)应答方面存在显著差异。在考查通过营养性多肽进行氨基酸递送的药物动力学的另一研究中，以双盲方式将3名年龄在18岁与50岁之间的表观健康的受试者随机指定于一连串处理剂，口服接受20克乳清蛋白质分离物或seqid-363。受试者在口服药物动力学研究之前被禁食过夜(>8小时)。在口服摄取营养性多肽之后在指定时间点(即0、15、30、60、90、120、150、180、210和240分钟)收集静脉血液样品以评估血浆氨基酸浓度变化。通过questdiagnostics或laboratorycorporationofamerica来定量血浆氨基酸浓度。图71-74显示关于wpi和seqid-363的各测量氨基酸以及各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的血浆时间过程。使用单因素anova检验以评估关于wpi的在测量时间点之间的血浆氨基酸水平的显著差异，这些数据指示gln、ile、leu、lys、phe、ser、tyr、val、eaa、bcaa和taa随时间存在显著差异(p<0.05)。使用单因素anova检验以评估关于seqid-363的在测量时间点之间的血浆氨基酸水平的显著差异，这些数据指示随时间不存在显著差异(p<0.05)。实施例41：使用营养性多肽慢性治疗年长虚弱受试者的肌肉减少症和身体功能丧失补充含有亮氨酸或亮氨酸的蛋白质会改进运动之后的肌肉质量积累，并且维持长期废用期间的骨骼肌质量(layman和walker,2006,thejournalofnutrition:136:319–323)。本文描述富含亮氨酸和必需氨基酸的营养性多肽。以双盲方式将年长虚弱受试者随机指定于特定治疗组：对照组接受等热量对照或3剂分类中的一个，治疗组别持续30天每日3次接受15、30或40克剂量的营养性多肽制剂。在整个试验时期期间，基于个体的身体质量指数(bmi)和身体活动向招募的受试者提供以对照膳食。记录食物和卡路里摄取。招募的受试者维持他们的常规每日活动。通过身体活动跟踪器(fitbitflex腕带)来测量每日身体活动和卡路里消耗。在第1天(在营养性多肽给药之前)以及在治疗已结束之后第31天通过mri(müller,m.j.等"assessmentanddefinitionofleanbodymassdeficiencyintheelderly."europeanjournalofclinicalnutrition(2014))或双能x射线吸光测定术(dexa；nielsen,pallekjrerulff,jorgenladefoged和klausolgaard."leanbodymassbydualenergyx-rayabsorptiometry(dexa)andbyurineanddialysatecreatininerecoveryincapdandpre-dialysispatientscomparedtonormalsubjects."advperitdial10(1994):99-103.)来测量瘦性身体质量以评估骨骼肌质量的变化。也在治疗时期开始和结束时使用简短身体性能连串评分(volpato,stefano等"predictivevalueoftheshortphysicalperformancebatteryfollowinghospitalizationinolderpatients."thejournalsofgerontologyseriesa:biologicalsciencesandmedicalsciences66.1(2011):89-96.)、步态速度的量度、6分钟行走测试(6mwt)和定时起立并行走测试(tugs；podsiadlo,d；richardson,s."thetimed'up&go':atestofbasicfunctionalmobilityforfrailelderlypersons".journaloftheamericangeriatricssociety(1991)39:142–8)来评估身体功能。在治疗组别之间以及相对于对照来比较瘦性身体质量以及sppb评分、步态速度、6mwt和tugs从基线的绝对变化和变化百分比以评估治疗功效。实施例42：含有缺乏甲硫氨酸的营养性多肽的制剂的口服药物动力学这个研究的目的在于在240分钟的时期内考查应答于缺乏甲硫氨酸的营养性蛋白质的血浆氨基酸浓度变化。以双盲方式将4名年龄在18岁与50岁之间的表观健康的受试者随机指定于一连串处理剂，以170ml的体积口服接受20克seqid-426。使受试者禁食过夜(>8小时)，并且次日早晨在口服摄取营养性多肽之后在指定时间点(即0、15、30、60、90、120、150、180、210和240分钟)收集静脉血液样品以评估血浆氨基酸浓度变化。通过questdiagnostics或laboratorycorporationofamerica来定量血浆氨基酸浓度。图75-78显示关于seqid-426的各测量氨基酸以及各聚集组，即必需氨基酸(eaa)、支链氨基酸(bcaa)和总氨基酸(taa)的血浆时间过程。使用单因素anova检验以评估关于seqid-426的在测量时间点之间的血浆氨基酸水平的显著差异，这些数据指示glu和eaa随时间存在显著差异(p<0.05)。考查血浆eaa时间过程的dunnett多重比较检验进一步指示在30和60分钟时间点的血浆eaa水平显著不同于在时间0分钟的基础水平。甲硫氨酸显示随时间无显著变化。实施例43：体外评估来自c2c12肌管的鸢尾素分泌和pgc-1a已显示成人中的棕色脂肪沉积物由棕色脂肪细胞和米色脂肪细胞的组合组成(wu,jun等"beigeadipocytesareadistincttypeofthermogenicfatcellinmouseandhuman."cell150.2(2012):366-376)。棕色脂肪通过线粒体解偶联蛋白ucp1来产热，从而防御低温和肥胖。米色脂肪细胞是在特定刺激(寒冷和运动)下转换成棕色脂肪样细胞的白色脂肪细胞。白色脂肪“棕色化”现象是白色脂肪组织储库获得产热性脂肪燃烧性质所依的过程，并且特征在于解偶联蛋白ucp1的基因表达显著增加。最初，类似于白色脂肪细胞，米色脂肪细胞具有极低ucp1基础表达，但它们以高ucp1表达和呼吸速率应答于环amp刺激，这类似于棕色脂肪细胞(wu,jun等"beigeadipocytesareadistincttypeofthermogenicfatcellinmouseandhuman."cell150.2(2012):366-376)。ucp1是一种位于线粒体的内膜中的在耗散呈热量而非atp形式的能量方面起主要作用的跨膜蛋白。局限于棕色或米色脂肪细胞，它提供用以通过非战栗产热作用来产热的独特机理。在体内，长期寒冷暴露或运动(肾上腺素能刺激)会开启高水平的ucp1表达。在体外，冷处理、电脉冲、β3-肾上腺素能药剂(肾上腺素和去甲肾上腺素)或维生素a的活性代谢物视黄酸刺激ucp1表达。当肌肉收缩时，pgc-1α(过氧化物酶体增殖物活化的受体γ共活化子1-α)(即一种调控线粒体生物发生和呼吸的转录活化子)被活化。肌肉细胞中增加水平的pgc-1α通过结合核受体和转录因子来控制一组广泛代谢程序。举例来说，pgc-1α诱导i型膜蛋白fndc5，其被裂解以形成肌因子激素鸢尾素。一旦处于循环中，鸢尾素即作用于wa，并且诱导ucp1和其它棕色脂肪相关的基因的表达。鸢尾素与作为从骨骼肌分泌的缬氨酸的代谢物的α-氨基异丁酸(baiba)两者均已被鉴定为白色脂肪细胞(wa)向米色脂肪细胞(bea)的转化中涉及的试剂，并且两者均由骨骼肌纤维在身体活动期间表达和释放(pontus等"apgc1-[agr]-dependentmyokinethatdrivesbrown-fat-likedevelopmentofwhitefatandthermogenesis."nature481.7382(2012):463-468.；robertsl.d.等b-aminoisobutyricacidinducesbrowningofwhitefatandhepaticb-oxidationandisinverselycorrelatedwithjcardiometabolicriskfactors.cellmetab.(2014)19:96-108)。已显示在亮氨酸处理之后c2c12细胞中的pgc1-α基因表达被诱导(sun,xiaocun和michaelb.zemel."leucinemodulationofmitochondrialmassandoxygenconsumptioninskeletalmusclecellsandadipocytes."nutrmetab(lond)6(2009):26.)。本文描述富含亮氨酸的营养性多肽。单一氨基酸、对应于营养性多肽中所见的摩尔比的氨基酸掺合物、营养性多肽消化物和/或营养性多肽用于处理本文所述的鼠类成肌细胞细胞系c2c12的培养物。测量上清液中的分泌鸢尾素和/或baiba(β-氨基异丁酸)，并且与其它处理组以及基础氨基酸混合物或媒介物进行比较以评估功效。通过lc-ms(液相色谱法-质谱测定法)分析从处理的细胞培养物的上清液分离的baiba，并且elisa测定用于定量鸢尾素分泌(adipogen；sandiego,ca)。通过以下方式来定量处理的c2c12或大鼠骨骼肌细胞中的pgc-1α的表达水平：提取mrna，随后合成cdna，并且使用pgc-1α的实时pcr和组成性表达的持家基因进行定量。将pgc-1α增加与如上对照进行比较以确定相对于其它处理的路径活化程度。实施例44：体外评估对处理的c2c12肌管的脂肪细胞应答从已用单一氨基酸、对应于营养性多肽中所见的摩尔比的氨基酸掺合物、营养性多肽消化物和/或营养性多肽处理的c2c12肌管分泌的分子可用于刺激白色脂肪组织向米色脂肪细胞转化。收集处理的c2c12或原代肌肉细胞的上清液，并且施加于脂肪细胞培养物(3t3-l1)。在设定的处理时期之后，使3t3-l1细胞溶解，并且提取mrna，扩增cdna并相对于包括foxc2(在米色脂肪细胞中过度表达的转录因子)、ucp-1(为米色脂肪细胞所特有的线粒体蛋白质)、cidea(为米色脂肪细胞所特有的细胞死亡诱导性dffa样效应子)、prdm16(控制棕色脂肪细胞的发育的转录共调控子)和ppar-γ(过氧化物酶体增殖物活化的受体γ)的组来测定相对基因表达，以确定与棕色/米色脂肪细胞的基因表达样式类似的基因表达样式是否被刺激。或者，共培养c2c12和3t3-l1细胞，同时用pn(掺合物或消化物)或肽处理c2c12。可通过rt-pcr或elisa测量3t3-l1中的ucp1和cidea的表达。实施例45：体外评估在氨基酸和营养性蛋白质处理之后的脂肪细胞脂肪生成鼠类3t3-l1脂肪细胞细胞系充当适用于研究细胞从前脂肪细胞分化成成熟脂肪细胞的模型。通过以下方式来测定单一氨基酸、对应于营养性多肽中所见的摩尔比的氨基酸掺合物、营养性多肽消化物和/或营养性多肽对前脂肪细胞直至末端脂肪细胞的分化和脂质积累的作用：在确定的氨基酸培养基中培养3t3-l1细胞，其中在两天之后在汇合时改变培养基的组成以诱导分化。通过rt-pcr测量应答于在脂肪细胞分化的不同阶段期间进行急性氨基酸、pn掺合物和pn消化物给药的脂肪酸合成酶(fas)和乙酰辅酶a羧化酶(acc)(即导致脂肪酸合成和激素敏感性三酰基甘油酯酶(hstl)表达的两种酶)，相对于稳定脂肪细胞参照基因nono加以标准化(arsenijevic等2012.murine3t3-l1adipocytecelldifferentiationmodel:validatedreferencegenesforqpcrgeneexpressionanalysis.plosone.7(5):e37517)。实施例46：小鼠膳食诱发肥胖症模型中的体重控制亮氨酸适用于控制体重增加(cota,daniela等"hypothalamicmtorsignalingregulatesfoodintake."science312.5775(2006):927-930.)(westerterp-plantenga,margriets.等"dietaryprotein,weightloss,andweightmaintenance."annualreviewofnutrition29(2009):21-41.)，并且本文描述富含亮氨酸的营养性多肽。在如本文所述的dio小鼠中考查提供的营养性多肽对体重控制的作用。膳食诱发肥胖症(dio)啮齿动物模型密切模拟在采用高脂肪西方膳食的情况下普遍的肥胖症的显现(c.wang和liao,2012,methodsmolbiol:821:421-433)。在6周龄时开始在采用具有60kcal脂肪的高脂肪膳食(hfd)(researchdiets,newbrunswick,nj)的雄性c57bl/6小鼠中诱发dio(c.wang&liao,2012,methodsmolbiol:821:421-433)。在这个研究中，在6周龄时开始用hfd喂养雄性c57bl/6小鼠12周。在18周龄时开始通过持续4周口服管饲每日剂量2.85-5.7g/kg来施用营养性多肽制剂或媒介物。每天记录体重和食物摄取。通过单因素anova检验来比较组内体重随时间变化，同样通过单因素anova检验来比较营养性多肽和/或媒介物之间的重量和/或食物摄取净变化。p<0.05被视为显著。实施例47：肥胖受试者中通过营养性多肽达成的体重控制一般成年男性或女性需要每日蛋白质摄取量0.66-0.80g/kg(dietaryreferenceintakesforenergy,carbohydrate,fiber,fat,fattyacids,cholesterol,proteinandaminoacids,nationalacademyofsciences,instituteofmedicine,foodandnutritionboard,2005)。每日总蛋白质摄取量>1.5g/kg的膳食有效用于治疗成人受试者的肥胖症(layman和walker,2006,thejournalofnutrition:136:319-323)。膳食性补充氨基酸会遏制dio小鼠的体重增加、食物摄取和脂肪组织质量(hisaminekobayashi,hirabayashi和ueda,2009,kawasaki,japan)(w.wang等,2013,aminoacids:45:463-77)。理想体重控制计划导致以骨骼肌(瘦性)质量增加来修正身体组成。消耗富含蛋白质的膳食不仅有助于体重减轻，而且也更有效在重量减轻期间修正身体组成(layman和walker,2006,thejournalofnutrition:136:319-323)。在作为蛋白质的构筑嵌段的氨基酸之中，亮氨酸在调控能量代谢方面具有独特作用。在膳食诱发肥胖症小鼠模型中，膳食性亮氨酸降低与高脂肪膳食相关的体重增加，并且改进葡萄糖和胆固醇代谢(zhang等,2007,56:1647-1654)。此外，亮氨酸刺激肌肉蛋白质合成(layman和walker,2006,thejournalofnutrition:136:319-323)。本文所述的富含亮氨酸的营养性多肽是高度水溶性的，并且在人受试者中易于消化和吸收。单次口服剂量的所述营养性多肽使如本文所述的表观健康的人受试者中的肌肉蛋白质合成的分数速率增加。将肥胖人受试者(bmi>30)招募至营养性多肽对体重控制的作用的30天研究中。对受试者提供测试膳食，并且基于体重、bmi和每日活动来计算卡路里需求。在整个试验时期期间，受试者维持常规每日活动。以双盲方式随机指定受试者，从而开始持续30天的媒介物或营养性多肽制剂治疗。每日记录体重。在30天洗脱之后，以转向如本文所述的持续30天的另一治疗方案来重复给药。将体重变化计算为第1天与第30天的差异。通过mri或dexa来测量骨骼肌质量和脂肪组织的身体组成(mitsiopoulos等,2014,journalofappliedphysiology:85:115-122)。实施例48：用于改进2型糖尿病患者的血糖控制的营养性多肽已显示氨基酸亮氨酸和精氨酸会直接作用于胰腺b细胞以促进胰岛素分泌，并且改进葡萄糖体内平衡(newsholmep.等newinsightsintoaminoacidmetabolism,b-cellfunctionanddiabetes.clin.sci.(2005)108:185-194)。在食品数据库中鉴定的富含亮氨酸和精氨酸的营养性多肽显示于表e48a中。表e48aseqideaalrseqid-035510.480.130.36seqid-036230.490.180.16seqid-034240.360.150.26seqid-035520.560.210.06seqid-035030.470.180.15seqid-036170.310.140.27seqid-034330.310.170.15seqid-034720.350.160.17seqid-036320.450.180.10seqid-034730.060.000.72在表达的营养性多肽数据库中鉴定的富含亮氨酸和精氨酸的营养性多肽显示于表e48b中。表e48bseqideaalrseqid-005510.410.110.21seqid-005400.410.080.23seqid-001480.470.210.14seqid-006360.470.080.22seqid-006470.420.180.15seqid-001320.600.320.05seqid-005670.420.070.22seqid-005970.450.120.19seqid-003350.380.110.19seqid-001950.520.260.08通过口服葡萄糖耐受性测试(ogtt)评估营养性多肽对血糖控制的功效，其中给与葡萄糖，并且此后获取血液样品以测定它从血液清除的快速程度。ogtt用于测量身体可处理大量葡萄糖的良好程度，以诊断糖尿病(dm)以及评估胰岛素不耐受性(drouin等,2009,diabetescare:32增刊1:s62-7)。以双盲方式将年龄在18岁与50岁之间，并且体重在50与70kg之间的t2dm患者随机指定于一连串治疗剂，在ogtt测试的葡萄糖摄取之前45分钟口服接受25克所研究的各营养性多肽制剂。在研究当天早晨，在过夜禁食(>8小时)之后进行ogtt测试。年龄在18岁与50岁之间，并且体重在50与70kg之间的人受试者接受50克葡萄糖(葡萄糖可乐(glucola)或等效物)。在相对于葡萄糖给药的以下时间通过血糖仪来测量血糖水平：-45、-30、-15分钟、0分钟(在葡萄糖给药之前)、15、30、60、90、120、150和180分钟。在相对于葡萄糖给药的以下时间收集用于获得血浆的静脉血液：-45、-30、-15分钟、0分钟(在葡萄糖给药之前)、15、30、60、90、120、150和180分钟。在各时间点将5ml全血取样，等分至已用50uldppiv抑制剂(millipore,dppiv)和50ul蛋白酶抑制剂混合物(sigma,p8340)预填充的k2edta管中。将血液样品在5℃±3℃下在2200xg下旋转10分钟。将血浆等分至样品管中，并且储存在-70℃下。测定胰岛素、gip、glp-1、pyy、cck、胰淀素(amylin)、升糖素(glucagon)、igf、饥饿素(ghrelin)、瘦素、胰多肽、分泌素的血液激素水平。比较血糖和激素的水平和曲线下面积(0-180分钟(血糖)或0-60分钟(激素)的auc)。相对于在时间0时的葡萄糖和激素基线水平使auc标准化。通过ancova分析结果变量(血糖和激素浓度)，验证以满足回归假设的齐性(并行性)，并且基线评分和性别将用作共变量。也对血浆氨基酸浓度相对于时间的图进行曲线下面积分析。将显著性设置在p<0.05下，并且趋势被确定为0.051<p<0.10。在7天洗脱时期之后，所有受试者都从一种治疗剂“交换(crossed-over)”至另一治疗剂，并且重复ogtt测试/血液取样方案。在受试者内交叉比较中，各受试者充当他们自身的对照。尽管本发明已参照优选实施方案和各种替代性实施方案加以特定显示和描述，但相关领域技术人员将了解可在不脱离本发明的精神和范围下在其中进行各种形式和细节变化。在本说明书的主体内引用的所有参考文献、授予的专利和专利申请都出于所有目的据此以引用的方式整体并入本文。表1权利要求书(按照条约第19条的修改)1.一种用于治疗或预防罹患糖尿病、糖尿病前期病状或肥胖症的人受试者的肌肉损耗疾病、病症或病状的营养性制剂，其包含分离的营养性多肽，所述分离的营养性多肽包含在至少约50个氨基酸上与选自由seqid00001-03909组成的组的多肽序列至少约90％同一的氨基酸序列；其中所述营养性多肽以足以向蛋白质吸收能力降低的人受试者提供营养性益处的量存在；其中所述分离的营养性多肽在ph7下具有至少12.5g/l的水溶解度，并且其中所述分离的营养性多肽具有小于30分钟的模拟胃消化半衰期。2.如权利要求1所述的制剂，其中所述多肽序列包含至少34％的必需氨基酸残基与总氨基酸残基的比率，并且其中所述多肽序列是营养全面的。3.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述营养性多肽包含与长度是至少50个氨基酸的可食用物种多肽或其片段至少约90％同一的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在至少25个氨基酸上与已知过敏原具有小于约50％同一性。4.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述氨基酸序列编码具有主要活性的酶，并且其中所述营养性多肽实质上缺乏所述主要活性。5.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其进一步包含选自以下的组分：促味剂、蛋白质混合物、多肽、肽、游离氨基酸、碳水化合物、脂质、矿物质或矿物质来源、维生素、补充剂、生物体、药物和赋形剂。6.如权利要求1至5中任一项所述的制剂，其中所述营养性多肽被配制在药学上可接受的载体中。7.如权利要求1至5中任一项所述的制剂，其中所述营养性多肽被配制在食物或食物成分中或被配制成食物或食物成分，或被配制成饮料或饮料成分。8.如权利要求1至5中任一项所述的制剂，其中所述制剂以不大于约500ml的体积以液体、半液体或凝胶形式，或以不大于约200g的总质量以固体或半固体形式存在。9.根据前述权利要求中任一项所述的营养性制剂，其用于预防或降低人受试者的肌肉质量和/或肌肉功能的损失的方法中；所述方法包括以下步骤：i)鉴定罹患糖尿病或糖尿病前期病状或处于糖尿病或糖尿病前期病状的风险下的人受试者或罹患肥胖症或处于肥胖症的风险下的人受试者，以及ii)以足以预防或降低肌肉质量和/或肌肉功能的损失的量向所述人受试者施用所述营养性制剂。10.根据权利要求9所述的供使用的营养性制剂，其中所述人受试者已接受一个或多个剂量的药物组合物，其中i)所述疾病、病症或病状或ii)施用所述药物组合物或i)与ii)两者使肌肉质量和/或肌肉功能的损失的风险增加。11.根据权利要求1至8中任一项所述的营养性制剂，其用于降低人受试者显现特征在于蛋白质营养失调或因蛋白质营养失调而加剧的肌肉损耗疾病、病症或病状的风险的方法中，所述方法包括以下步骤：(i)将所述人受试者鉴定为处于显现糖尿病或糖尿病前期病状或肥胖症的风险下；以及(ii)以一个或多个剂量施用所述营养性制剂。12.根据权利要求11所述的供使用的营养性制剂，其中所述人受试者展现肌肉减少症和/或恶病质；或患有炎症性反应或自体免疫病症；或患有心血管疾病；或已经受手术程序和/或其中所述受试者在所述手术程序之后被固定或活动性受损；或已遭受创伤性损伤；或患有骨质疏松或处于显现骨质疏松的风险下。13.根据权利要求11至12中任一项所述的供使用的营养性制剂，其中所述营养性制剂与运动方案联合施用；或作为用以施用药物剂和/或手术程序的辅助物来施用。当前第1页12当前第1页12