本发明涉及生物治疗领域，特别涉及一种治疗糖尿病的制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起的。为了有效控制血糖、防止糖尿病并发症的发生和提高糖尿病患者的生存质量，替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞—胰岛细胞移植蓬勃兴起。遗憾的是胰岛细胞的移植仍面临着两大难题：①、供体来源不足；②、免疫抑制药物的长期使用。糖尿病的原因在于就是胰岛功能受损，胰岛B细胞的数量减少或分泌胰岛素的能力下降，以致不足以维持血糖的平衡。胰岛B细胞是胰岛细胞的一种，属内分泌细胞，约占胰岛细胞总数的70％，主要位于胰岛中央部，且胰岛B细胞只能由胰岛分化而来。胰岛功能的受损会导致胰岛B细胞越来越少，药物治疗的效果越来越差，所以糖尿病治疗的关键还是在于胰岛B细胞。胰高血糖素样肽一1(glucagon-likepeptide1，GLP-1)是由人胰高血糖素基因编码，由肠道L细胞分泌的一种肽类激素，具有以下生理作用：以葡萄糖依赖方式作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录，增加胰岛素的生物合成和分泌；刺激β细胞的增殖和分化，抑制β细胞凋亡，从而增加胰岛β细胞数量，抑制胰高血糖素的分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空等。这些功能都有利于降低餐后血糖并使血糖维持在恒定水平。DPP-Ⅳ是一种细胞表面的丝氨酸蛋白酶。DPP-Ⅳ是一种体内的酶，它主要的作用是在分解体内的蛋白质，其中一种被DPP-Ⅳ分解的蛋白质就是GLP-1。人体自身产生的GLP-1极易被体内的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解，其血浆半衰期不足2分钟，必须持续静脉滴注或持续皮下注射才能产生疗效，这大大限制了GLP-1的临床应用。然后人们研发了GLP-1类似物，与天然GLP-1分子结构相比有一个氨基酸差异，并增加了一个16碳棕榈酰脂肪酸侧链，与天然人GLP-1有95％同源性。由于脂肪酸侧链的存在，其分子不易被DPP-IV降解，并能与白蛋白结合因而有较高的代谢稳定性，t1/2长达12-14小时。但是GLP-1类似物所作用的时间还是太短了，限制了临床的使用。因此，研发一种对糖尿病有良好疗效且药效持久的糖尿病治疗制剂是本领域技术人员需要解决的技术问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明公开了一种治疗糖尿病的制剂及其制备方法和应用，所述制剂对糖尿病的治疗有效且持久。本发明提供的治疗糖尿病的制剂中，按浓度计，包括如下组分：胰岛样细胞0.05×106个/ml～0.5×106个/ml；胰高血糖素样肽-1类似物0.1mg/ml～0.5mg/ml；二肽基肽酶-4抑制剂0.25mg/ml～0.75mg/ml。一些实施例中，按浓度计，包括如下组分：胰岛样细胞0.25×106个/ml；胰高血糖素样肽-1类似物0.125mg/ml～0.375mg/ml；二肽基肽酶-4抑制剂0.375mg/ml～0.625mg/ml。一些实施例中，按浓度计，包括如下组分：胰岛样细胞0.25×106个/ml；胰高血糖素样肽-1类似物0.25mg/ml；二肽基肽酶-4抑制剂0.5mg/ml。一些实施例中，按浓度计，包括如下组分：胰岛样细胞0.25×106个/ml；胰高血糖素样肽-1类似物0.125mg/ml；二肽基肽酶-4抑制剂0.375mg/ml。一些实施例中，按浓度计，包括如下组分：胰岛样细胞0.25×106个/ml；胰高血糖素样肽-1类似物0.375mg/ml；二肽基肽酶-4抑制剂0.625mg/ml。优选地，胰高血糖素样肽-1类似物为利拉鲁肽。优选地，二肽基肽酶-4抑制剂为沙格列汀。优选地，所述制剂还包括溶剂，所述溶剂为生理盐水。本发明还公开了所述制剂的制备方法，包括以下步骤：将所述胰岛样细胞、胰高血糖素样肽-1类似物和二肽基肽酶-4抑制剂与溶剂混合，制得所述制剂。本发明还公开了所述制剂和所述制备方法制得的制剂在制备治疗糖尿病的药物制剂中的应用。本发明所述制剂中的胰岛样细胞是由脐带间充质干细胞经高血糖培养基诱导分化制得，所述高血糖培养基中血糖的浓度为25mmol/L。脐带一直是作为医疗废物被弃之不用，由羊膜被覆上皮、脐血管和位于两者之间被称为华氏胶(Wharton’sJelly)的黏液结缔组织组成。主要由肌纤维母细胞样基质细胞、胶原细胞和蛋白聚糖组成，华氏胶对脐血管起支撑和保护作用，华氏胶中存在着一种成纤维样细胞，该细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能，被称之为人脐带间充质干细胞(Humanumbilicalcordmesenchymalstemcell，hUCMSc)。在体外同样具有诱导成为骨细胞、脂肪细胞、胰岛样细胞等分化的潜能。其中脐带来源的间充质干细胞细胞纯度高、数量多。具有明显的优势：1、成本较低，脐带是医学废弃物；2、来源丰富，全世界每年都有数亿新生儿出生；3、不会给捐献者造成新的创伤和痛苦；4、不涉及伦理问题；5、hUCMSCs是一种较为原始的干细胞，表达某些胚胎干细胞的特异标志，具有极强的可塑性；6、无致瘤活性和低免疫原性；7、与骨髓间充质干细胞相比，不会随着传代次数增加和机体年龄增长导致增殖能力和分化能力降低。这些优势使hUCMSC可能成为一种更具潜力的种子细胞。为体外培养制备胰岛细胞和调节免疫排斥治疗糖尿病带来了新希望。脐带间充质干细胞的分离和培养包括：将脐带剪成1mm3大小的碎片，加入DMEM/F12培养液，在5％CO2和95％饱和湿度的37℃培养箱中培养；5天后第1次换液，待细胞贴壁生长以后每3天换1次液；当细胞长至70％～80％融合，传代。脐带间充质干细胞的分话方法包括：取第3代hU-MSCs，以1×104个/孔密度接种24孔细胞培养板；当细胞长至70％～80％，使用含1％DMSO的无血清DMEM培养基培养3天。更换培养基为不含DMSO但含有10％FBS的高血糖培养基(血糖浓度25mmol/L)，继续培养7天，可见球状体的细胞簇形成。继续培养4天左右，这些球状体细胞的数目出现显著增加。这些细胞形态学上类似于胰岛细胞，整个诱导周期约需14天。综上所述，本发明公开了一种治疗糖尿病的新型制剂及其制备方法和应用。在该新型制剂中，胰岛样细胞的优选浓度范围为0.05×106个/ml～0.5×106个/ml，过高或过低的胰岛样细胞浓度都会影响制剂的有效性；二肽基肽酶-4(DPP-Ⅳ)抑制剂可以保护胰高血糖素样肽一1(GLP-1)类似物的长效作用，在特定比例范围内，治疗效果达到最大。二肽基肽酶-4抑制剂(DPP-Ⅳ抑制剂)具有抑制DPP-Ⅳ的作用。通过抑制人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)在血液中分解，从而提高血液中胰高血糖素样肽一1(GLP-1)的浓度而发挥作用。本发明还提供了一种治疗糖尿病的方法，该方法具体为静脉滴注本发明提供的治疗糖尿病的制剂。本发明公开的新型制剂与现有技术相比，具有如下优点：1、制剂中的胰岛样细胞是由脐带间充质干细胞诱导分化而成，可以增加机体内胰岛B细胞的含量，从而提高内源性胰岛素分泌；2、GLP-1类似物能刺激胰岛素分泌，能够保护胰岛β细胞，使得外注射的胰岛细胞能够发挥更长的时间的作用效果。而且GLP-1不仅能使患者的体重降低，还能降低患者对胰岛素的依赖。同时，GLP-1类似物外加胰岛素样细胞使用方法可以让GLP-1在人体内的作用持续时间更加延长，可以达到3个月只需注射一次，患者自身的免疫系统就能实现自我调节的效果；3、DPP-Ⅳ抑制剂可以抑制DPP-Ⅳ的作用。由于DPP-Ⅳ的主要作用是分解体内的蛋白质，包括GLP-1，因此，加入DPP-Ⅳ抑制剂可以抑制人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及制剂中的GLP-1类似物在血液的中分解，从而提高血液中内源性GLP-1和外源性GLP-1类似物的浓度而发挥作用。具体实施方式本发明公开了一种治疗糖尿病的新型制剂及其制备方法和应用，该制剂可以在有效的治疗糖尿病。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明。本发明实施例中使用到的成分均为市售或自制来源。实施例组分中的GLP-1类似物使用市售的利拉鲁肽，DDP-IV抑制剂使用市售的沙格列汀。实施例1脐带间充质干细胞诱导分化成胰岛样细胞1、脐带间充质干细胞的分离和培养选择足月分娩的脐带，剪成1mm3大小的碎片，接种于T75培养瓶中，加入DMEM/F12培养液，在5％CO2和95％饱和湿度的37℃培养箱中培养。5天后第1次换液，待细胞贴壁生长以后每3天换1次液。培养期间倒置显微镜观察细胞形态。取第4代脐带间充质干细胞，PBS洗涤3遍后0.25％胰酶消化30s，镜下观察开始细胞脱落并且变圆，加入培养液终止消化，轻柔吹打，制成细胞悬浮液。以800g/min离心5min，调整细胞密度为106/100μl后分装在8个检测管中。往8个检测管中分别加入鼠抗人单克隆抗体CD14-FITC、CD45-FITC、CD79a-APC、CD90-APC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-PE和HLA-DR-PE各10μl，用流式细胞仪检测细胞表面的抗体表型。结果如下表格1：表12、脐带间充质干细胞的诱导分化按2×104个/孔的细胞密度接种24孔板，待细胞长至85％，更换成骨/成脂诱导培养液，每3天换液1次。诱导后进行茜素红染色/油红O染色以确定其拥有诱导分化的潜能。取第3代hU-MSCs，以1×104个/孔密度接种24孔细胞培养板；当细胞长至70％-80％，使用下述诱导方案进行脐带间充质干细胞向胰岛样细胞分化的诱导。诱导方案：使用含1％DMSO的无血清DMEM培养基培养3天。更换培养基为不含DMSO但含有10％FBS的高血糖培养基(血糖浓度25mmol/L)，继续培养7天，可见球状体的细胞簇形成。继续培养4天左右，这些球状体细胞的数目出现显著增加。这些细胞形态学上类似于胰岛细胞，整个诱导周期约需14天。实施例2～5制备制剂表2实施例2～4实施例2实施例3实施例4胰岛样细胞0.25×106个/ml0.25×106个/ml0.25×106个/ml利拉鲁肽0.25mg/ml0.125mg/ml0.375mg/ml沙格列汀0.5mg/ml0.375mg/ml0.625mg/ml按照表2处方，将利拉鲁肽、沙格列汀在室温下与20ml生理盐水混合，制得混合剂，以混合剂重悬实施例1制得的胰岛样细胞，调整细胞密度。充分混匀后置于4℃环境中保存备用。对比例1～4制备制剂表3对比例1～4按照表3处方，将利拉鲁肽、沙格列汀在室温下与20ml生理盐水混合，制得混合剂，以混合剂重悬实施例1制得的胰岛样细胞，调整细胞密度。充分混匀后置于4℃环境中保存备用。实施例6动物试验1、建立SD大鼠糖尿病动物模型选择180～220g的雌雄性健康SD大鼠90只，随机分组后，对照组80和模型组10只。动物饲养在清洁级环境中，室温18～22℃，相对湿度为40％～70％。标准配合饲料饲养，每笼5只，自由采食和饮水，勤换垫料，保持饲养环境通风和干燥。SD大鼠经适应性饲养1周后进行造模。造模前测定空腹血糖，禁食12h，模型组按体重给予65mg/kg的链脲佐菌素(链脲佐菌素以1.1mol/L、pH4.0的柠檬酸缓冲液溶解，临时配制成4mg/ml浓度)腹腔一次性注射，对照组注射柠檬酸缓冲液。7天后尾静脉采血测外周血血糖，若注射前血糖水平8mmol/1，注射后血糖维持在16mmol/L以上达两周的,即可认为造模成功。造模成功后的大鼠表现为多食、多饮、多尿、体重减轻、活动减少、反应迟钝，且伴有伤口易感染、消瘦、被毛杂乱无光泽、脱毛等症状。模型组大鼠在注射链脲佐菌素溶液后，前期呈缓慢生长趋势，随着血糖的升高，体重逐渐呈现下降趋势。而对照组的大鼠体重持续增长，随着时间的延长，对照组和实验组大鼠的体重差异越来越大。病理观察发现糖尿病大鼠的胰岛明显萎缩。2、对照试验模型组SD大鼠80只，随机分8组，每组均为10只，按照表3制剂方案对大鼠进行静脉给药，实验共进行8周，观察每组大鼠的血糖水平，记录在册，统计如表3表4：实验分组及每组SD大鼠血糖水平正常大鼠的血糖为：2.8～6.5mmol/L，根据表4的数据可以看出，实验表明阳性对照组的血糖浓度一直处于高血糖的状态；给予对比例1的制剂在开始的三周血糖恢复到正常的水平，但三周后又血糖又升高了；给予对比例2的制剂开始的前一周处于高血糖水平，然后从第二周开始，血糖慢慢降到正常的水平，到第七周又有升高的趋势；给予对比例3的制剂的血糖浓度在4周后开始升高；给予对比例4的制剂的血糖浓度在3周开始升高；给予实施例2的制剂血糖浓度在第7周开始升高；给予实施例3的制剂血糖浓度在第5周开始升高；给予实施例4的的血糖浓度在第10周开始升高。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3