本发明属于生物催化领域，具体涉及一种新型固定化酶制剂及其制备方法与应用。
背景技术：
酶是由活细胞产生的、催化特定生物化学反应的一种生物催化剂。酶制剂是酶经过提纯、加工后的具有催化功能的生物制品，主要用于催化生产过程中的各种化学反应，具有催化效率高、高度专一性、作用条件温和、降低能耗、减少化学污染等特点，其应用领域遍布食品(面包烘烤业、面粉深加工、果品加工业等)、纺织、饲料、洗涤剂、造纸、皮革、医药以及能源开发、环境保护等方面。
固定化酶(immobilized enzyme)是20世纪60年代发展起来的一种新技术。所谓固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。系统的固定化酶技术的研究开始于20世纪50年代，德国的Grubhofer和Schleith率先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后与淀粉酶、胃蛋白酶等结合，制成最早的固定化酶。但直到1971年第一届国际酶工程(Enzyme Engineering)会议，这种技术才被正式命名为固定化酶技术。之后人们对固定化酶的研究取得了长足的进展，包括固定化技术、载体材料及其在生化过程和酶制剂中的应用等。
固定化酶与水溶性酶相比具有如下优点：①固定化酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；②固定化酶极易与反应体系分离，简化了提纯工艺，而且产品收率高、质量好；③在多数情况下，酶经固定化后稳定性得到提高；④固定化酶的催化反应过程更易控制；⑤固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作；⑥固定化酶与游离酶相比更适于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协同效应使酶催化反应速率大大提高，而且还可以控制反应按一定顺序进行。
依据游离酶的理化特性和用途，酶的固定化方法可分为物理方法和化学方法。物理方法主要包括包埋法、吸附法；化学方法主要有化学交联法和共价键法。当前，由于固定化酶的方法过于复杂，效率低、成本高，或使用了有毒的化学试剂而不符合食品加工所必须满足的经济和安全的标准，所有这些都限制了固定化脂肪酶技术在食品工业中的应用。
技术实现要素：
为了克服现有技术中酶固定化方法过于复杂、效率低、成本高、难以回收利用、负载能力小等不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种新型固定化酶制剂的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的新型固定化酶制剂，该酶制剂酶的稳定性好、载酶量高，安全无毒。
本发明的再一目的在于提供上述新型固定化酶制剂的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种新型固定化酶制剂的制备方法，包含如下步骤：
(1)将壳聚糖溶解至醋酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液；然后在壳聚糖乙酸溶液加入四氧化三铁磁流体，40～50℃超声反应40～60min，得到产物1；将产物1加入液体石蜡/Span-80混合液中混合均匀，然后在60～70℃恒温水浴、快速搅拌的条件下加入交联剂戊二醛，并调节反应体系pH为9～11，恒温水浴继续反应1～2h，除杂，干燥，得到纳米磁性壳聚糖；
(2)将γ-环糊精和苯甲酸钾溶于水中，然后加入甲醇混匀，60～80℃反应12～24h后通氮气鼓泡使甲醇和水自然挥发，析出结晶，过滤，洗涤，干燥，得到金属有机骨架材料；
(3)将步骤(1)制得的纳米磁性壳聚糖加入NaOH溶液中碱化处理1～2h，然后加入步骤(2)制得的金属有机骨架材料40～60℃反应8～10h，得到纳米磁性壳聚糖-金属有机骨架材料；
(4)将上述纳米磁性壳聚糖-金属有机骨架材料作为载体与酶液混合，在0～25℃的温度下固定化1～24h，得到新型固定化酶制剂；
步骤(1)中所述的壳聚糖乙酸溶液中壳聚糖的质量分数优选为1～5％，乙酸的质量分数优选为1～10％；
步骤(1)中所述的壳聚糖乙酸溶液中壳聚糖的质量分数进一步优选为3％，乙酸的质量分数进一步优选为5％；
步骤(1)中所述的四氧化三铁磁流体与壳聚糖乙酸溶液的质量比优选为(1:2)～(1:5)；
步骤(1)中所述的液体石蜡与Span-80的体积比优选为(20:1)～(30:1)；
步骤(1)中所述的产物1与液体石蜡/Span-80混合液的体积比优选为(1:3)～(1:5)；
步骤(1)中所述的快速搅拌的转速优选为500～800r/min；
步骤(1)中所述的戊二醛的用量优选为总反应体系体积的5％～10％；
步骤(1)中所述的恒温水浴继续反应的时间优选为1.5h；
步骤(1)中所述的除杂优选为先减压过滤、然后依次用石油醚、无水乙醇抽提3～5次；
步骤(1)中所述的干燥的条件优选为：在30～60℃条件下真空干燥；
步骤(2)中所述的γ-环糊精和苯甲酸钾的摩尔比优选为(1:2)～(1:8)；
步骤(2)中所述的甲醇与水的体积比优选为(3:1)～(3:2)；
步骤(2)中所述的反应的条件优选为70℃反应20h；
步骤(3)中所述的NaOH溶液的质量分数优选为8～10％；
步骤(3)中所述的纳米磁性壳聚糖中的壳聚糖与金属有机骨架材料中的γ-环糊精的摩尔比优选为(1:5)～(1:20)；
步骤(3)中所述的反应的条件优选为50℃反应9h；
步骤(4)中所述的酶优选为脂肪酶、蛋白酶、过氧化物酶等；
步骤(4)中所述的固化的条件优选为15～25℃固定化4～20h；
一种新型固定化酶制剂，通过上述制备方法制备得到；
所述的新型固定化酶制剂在生物催化领域中的应用；
本发明的原理：
利用磁性纳米微球和金属-有机骨架材料(MOF)的多孔结构可以很有效地固定酶，但是前者无法进一步提高其负载量，是因为增加载体比表面积的同时不可避免的会减小微孔的直径，从而降低其负载能力；后者难以回收再利用，只能利用离心的手段进行分离，而此方法不利于固定化酶的重复利用并且会对酶活造成一定的损失；本发明将具有磁性的纳米微球纳米磁性壳聚糖和具有多孔、大比表面积和多金属位点等诸多性能的金属-有机骨架材料通过接枝共聚的方式结合，并进一步通过氢键和静电力等作用，将具有金属有机骨架结构化的γ-环糊精紧密吸附在米磁性壳聚糖的表面，构建了一种具有多孔网络结构的核壳结构的酶制剂载体，该载体具有很大的比表面积和很好的负载能力，且具有活泼的官能团利于酶蛋白的结合，酶可通过简单的嵌入方式或其他结合方式固定在载体上，从而得到固定化的酶制剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明制得的纳米磁性壳聚糖-金属有机骨架材料能够用作固定化酶的载体，能够很好地固定化脂肪酶、蛋白酶、过氧化物酶等一系列酶，成本较低、固定化效率高、酶的稳定性好、载酶量高，酶活回收率高。
(2)本发明在固定化酶过程中不使用戊二醛、甲醛等双功能试剂，操作简单，成本低，反应温和。
(3)本发明制得的酶制剂安全无毒，可应用于食品和医疗领域(不包含疾病的治疗与诊断)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)将壳聚糖溶解至醋酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液，其中，壳聚糖的质量分数为3％，乙酸的质量分数为5％；然后在壳聚糖乙酸溶液加入四氧化三铁磁流体，45℃超声反应50min，得到产物1，其中，四氧化三铁磁流体与壳聚糖乙酸溶液的质量比为1:3；将产物1加入液体石蜡/Span-80混合液(液体石蜡与Span-80的体积比为25:1)中混合均匀，产物1与液体石蜡/Span-80混合液的体积比为1:4；然后在65℃恒温水浴、600r/min快速搅拌的条件下加入交联剂戊二醛(戊二醛的用量为总反应体系体积的8％)，并调节反应体系pH为10，恒温水浴继续反应1.5h；然后减压过滤，依次用石油醚、无水乙醇抽提4次，在50℃条件下真空干燥，得到纳米磁性壳聚糖；
(2)将γ-环糊精和苯甲酸钾按照摩尔比1:5溶于水中，然后加入甲醇(甲醇与水的体积比为3:1)混匀，70℃反应20h后通氮气鼓泡使甲醇和水自然挥发，析出结晶，过滤，洗涤，干燥，得到金属有机骨架材料；
(3)将步骤(1)制得的纳米磁性壳聚糖加入质量分数为9％的NaOH溶液中碱化处理1.5h，然后加入步骤(2)制得的金属有机骨架材料50℃反应9h，其中，纳米磁性壳聚糖中的壳聚糖与金属有机骨架材料中的γ-环糊精的摩尔比为1:15；得到纳米磁性壳聚糖-金属有机骨架材料；
(4)将上述纳米磁性壳聚糖-金属有机骨架材料作为载体与黑曲霉脂肪酶液(20mg/mL)混合，在20℃的温度下固定化8h，然后用蒸馏水洗涤未固定化到载体上的酶，得到新型固定化酶制剂。
本实施例固定化酶效率为92.6％，酶活回收率为98％，制得的新型固定化酶制剂中黑曲霉脂肪酶的负载量为200.5mg酶/g载体。
实施例2
(1)将壳聚糖溶解至醋酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液，其中，壳聚糖的质量分数为1％，乙酸的质量分数为1％；然后在壳聚糖乙酸溶液加入四氧化三铁磁流体，40℃超声反应60min，得到产物1，其中，四氧化三铁磁流体与壳聚糖乙酸溶液的质量比为1:2；将产物1加入液体石蜡/Span-80混合液(液体石蜡与Span-80的体积比为30:1)中混合均匀，产物1与液体石蜡/Span-80混合液的体积比为1:5；然后在70℃恒温水浴、500r/min快速搅拌的条件下加入交联剂戊二醛(戊二醛的用量为总反应体系体积的5％)，并调节反应体系pH为11，恒温水浴继续反应2h；然后减压过滤，依次用石油醚、无水乙醇抽提3次，在30℃条件下真空干燥，得到纳米磁性壳聚糖；
(2)将γ-环糊精和苯甲酸钾按照摩尔比1:2溶于水中，然后加入甲醇(甲醇与水的体积比为3:2)混匀，60℃反应24h后通氮气鼓泡使甲醇和水自然挥发，析出结晶，过滤，洗涤，干燥，得到金属有机骨架材料；
(3)将步骤(1)制得的纳米磁性壳聚糖加入质量分数为8％的NaOH溶液中碱化处理2h，然后加入步骤(2)制得的金属有机骨架材料60℃反应8h，其中，纳米磁性壳聚糖中的壳聚糖与金属有机骨架材料中的γ-环糊精的摩尔比为1:20；得到纳米磁性壳聚糖-金属有机骨架材料；
(4)将上述纳米磁性壳聚糖-金属有机骨架材料作为载体与黑曲霉脂肪酶液(20mg/mL)混合，在15℃的温度下固定化20h，得到新型固定化酶制剂。
本实施例固定化酶效率为89.2％，酶活回收率为94％，制得的新型固定化酶制剂中黑曲霉脂肪酶的负载量为186.3mg酶/g载体。
实施例3
(1)将壳聚糖溶解至醋酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液，其中，壳聚糖的质量分数为5％，乙酸的质量分数为10％；然后在壳聚糖乙酸溶液加入四氧化三铁磁流体，50℃超声反应40min，得到产物1，其中，四氧化三铁磁流体与壳聚糖乙酸溶液的质量比为1:5；将产物1加入液体石蜡/Span-80混合液(液体石蜡与Span-80的体积比为20:1)中混合均匀，产物1与液体石蜡/Span-80混合液的体积比为1:3；然后在60℃恒温水浴、800r/min快速搅拌的条件下加入交联剂戊二醛(戊二醛的用量为总反应体系体积的10％)，并调节反应体系pH为9，恒温水浴继续反应1h；然后减压过滤，依次用石油醚、无水乙醇抽提5次，在60℃条件下真空干燥，得到纳米磁性壳聚糖；
(2)将γ-环糊精和苯甲酸钾按照摩尔比1:8溶于水中，然后加入甲醇(甲醇与水的体积比为3:1)混匀，80℃反应12h后通氮气鼓泡使甲醇和水自然挥发，析出结晶，过滤，洗涤，干燥，得到金属有机骨架材料；
(3)将步骤(1)制得的纳米磁性壳聚糖加入质量分数为10％的NaOH溶液中碱化处理1h，然后加入步骤(2)制得的金属有机骨架材料40℃反应10h，其中，纳米磁性壳聚糖中的壳聚糖与金属有机骨架材料中的γ-环糊精的摩尔比为1:5；得到纳米磁性壳聚糖-金属有机骨架材料；
(4)将上述纳米磁性壳聚糖-金属有机骨架材料作为载体与黑曲霉脂肪酶液(20mg/mL)混合，在25℃的温度下固定化4h，得到新型固定化酶制剂。
本实施例固定化酶效率为88.9％，酶活回收率为90.2％，制得的新型固定化酶制剂中黑曲霉脂肪酶的负载量为169.4mg酶/g载体。
对比实施例
(1)将壳聚糖溶解至醋酸溶液中，得到壳聚糖乙酸溶液，其中，壳聚糖的质量分数为3％，乙酸的质量分数为5％；然后在壳聚糖乙酸溶液加入四氧化三铁磁流体，45℃超声反应50min，得到产物1，其中，四氧化三铁磁流体与壳聚糖乙酸溶液的质量比为1:3；将产物1加入液体石蜡/Span-80混合液(液体石蜡与Span-80的体积比为25:1)中混合均匀，产物1与液体石蜡/Span-80混合液的体积比为1:4；然后在65℃恒温水浴、快速搅拌的条件下加入交联剂戊二醛(戊二醛的用量为总反应体系体积的8％)，并调节反应体系pH为10，恒温水浴继续反应1.5h；然后减压过滤，依次用石油醚、无水乙醇抽提4次，在50℃条件下真空干燥，得到纳米磁性壳聚糖；
(2)将上述纳米磁性壳聚糖作为载体与黑曲霉脂肪酶液(20mg/mL)混合，在20℃的温度下固定化8h，得到固定化酶制剂。
本实施例固定化酶效率为70.8％，酶活回收率为73.5％，制得的固定化酶制剂中黑曲霉脂肪酶的负载量为80.6mg酶/g载体。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。