几丁质脱乙酰基酶和纳米几丁质的制备和应用的制作方法

本发明涉及天然高分子领域，具体涉及一种几丁质脱乙酰基酶和其构建方法以及纳米几丁质的制备和应用。

背景技术：

(1)几丁质和壳聚糖的分子结构及理化性质

几丁质(俗称，甲壳质、甲克素、壳多糖)是自然界中唯一带正电荷的天然高分子聚合物，属直链氨基多糖，其单体结构为(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，如(Ⅰ)所示。

几丁质的主要来源是虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软件动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及某些真菌类的细胞壁等。其蕴藏量在地球上的天然高分子中占第二位，估计每年自然界生物的合成量可达几百亿吨,仅次于纤维素。一般由虾蟹壳提炼的几丁质，约含有15％的胺基(-NH₂)与85％的乙酰基(-COCH₃)。几丁质的分子量一般在100万以上(1000KDa)，在自然条件下不溶于水，也不溶于酸碱或有机溶剂，因此很难被有效利用。壳聚糖是几丁质的衍生物，在一定条件下，几丁质经降解和脱酰反应，50％以上的酰基被脱去，分子量小到一定程度时，其产物能溶解在弱酸中，这个产物称之为壳聚糖(或甲壳胺)¹，其分子结构包括：氨基葡萄糖【GlcN，(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖)】和N-乙酰葡萄糖【GlcNAc)(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖】两种单体结构，如(Ⅱ)所示。

在弱酸中，氨基质子化后，壳聚糖便成为带正电荷的聚合物，如(Ⅲ)所示，从而具有生物活性，可广泛应用于医药、植物病虫害防治等领域。

理论讲，不大可能通过脱乙酰基的方法生产100％脱乙酰度的壳聚糖。目前所有壳聚糖的产品都是部分脱乙酰，每个糖基上也许都有N-乙酰基，也许不一定都有N—乙酰基。凡N—乙酰度在50％以上产品，仍应称之为几丁质¹，因为它肯定不溶于稀酸中。几丁质脱乙酰化的程度越高，发挥的生理效应也越强。当几丁质脱乙酰度达到90％以上，国际医学营养食品学会将此物质命名为除糖、蛋白质、脂及、维生素和矿物质五大生命要素后的第六大生命要素，因此越来越受到广泛关注。但是，目前很多文献报道中“几丁质”或“甲克素、甲壳质”在各方面的应用，多将几丁质和壳聚糖混为一谈，造成概念上的混乱，误导人们对这两种产品的使用。

(2)几丁质的晶体结构

和纤维素一样，天然几丁质也是以纤维状形式存在，通过分子间和分子内的氢键将N-乙酰葡萄糖分子紧密结合在一起，形成具有晶体和非晶体两种结构的几丁质纤维²。几丁质的晶体结构有三种，即α，β和γ型^3，4。α-几丁质(α-Chitin)由两条反向平行链组成，β-几丁质(β-Chitin)由两条同向平行链组成，γ-几丁质(γ-Chitin)由三条链组成，两条同向，一条反向。如(Ⅳ)所示，其中(A)为α-几丁质，(B)为β-几丁质。

不同来源的几丁质，其化学结构和性质也不相同。虾蟹外壳主要是α-型，β-型几丁质是鱿鱼的羽状壳中，真菌细胞壁的几丁质是γ-型且结晶度较低。α-型和β-型几丁质最丰富，因结晶度高，最稳定，不易熔化，不易溶解，同时也不易溶于一般有机溶剂。不同分离纯化的天然α-，β-几丁质在C-2位上连接有胺基，可在酸性条件下质子化。α-型几丁质资源丰富，易于工业化上产。

(3)几丁质的合成

1)几丁质和壳聚糖的合成方法

纯净几丁质的制备一般不需要复杂的工序和化学反应。目前常用的方法是将原料(如虾或蟹壳)用稀的氢氧化钠液除去蛋白质，然后用盐酸除去钙盐，最后，烘干粉碎就是几丁质了。几丁质低聚糖的制备方法有酸降解法、酶法、氧化降解法、合成法等⁵。传统工艺生产壳聚糖是化学脱酰反应或水解法，其原理是通过水解破坏几丁质的二级结构(主要是破坏非晶体结构部分)，使分子键断裂，分子链中部分N-乙酰葡萄糖脱酰，提高其亲水性¹。但化学脱酰或水解法反应条件要求较高，不宜控制，且反应时间较长，耗能，环境污染(废水，化学废料)，壳聚糖工艺生产流程^6，7，如(Ⅴ)所示。利用酶解法可解决这些问题，包括使用甲壳素酶，壳聚糖酶和溶菌酶进行水解。但此类酶价格昂贵且不易获得，造成产品成本过高^8，9。

2)已报导纳米几丁质的制备方法

近年来，用盐酸水解制备纳米几丁质的方法有很多报道^2,10,11。有报道称，酸水解制备的纳米几丁质颗粒大小为宽10-15nm，长200-500nm²，也有报导纳米颗粒在150-800nm长，宽5-70nm¹¹。纳米几丁质颗粒依然偏大，其产品的脱乙酰度(电荷电量)鲜有报道，最佳工业化生产纳米几丁质的条件也未见报道。在如此严厉的条件下用酸水解几丁质，会产生大量的浪费，也会对工业带来损失。因此，迫切需要研发出一种反应条件温和的、浪费少的新型的几丁质纳米化方法。

(4)几丁质(chitin)及壳聚糖(chitosan)的应用

由于几丁质的天然性质和独特的分子结构，越来越受到科学界的重视。大量研究表明，几丁质具有无毒、生物相容、生物可降解性等性，但几丁质及其衍生物产品在医药、生物、农业上的应用，主要是指壳聚糖或低分子量的几丁寡糖，如用于废水处理^12,13，食品和饲料^14,15，和药物/生物活性物质传输^16,17,18等的物质。几丁质在农业生产中用作病虫害防治^19,20,21，种子包衣，水果和蔬菜的涂层^{22,23,24,25,26}，以及用于提高植物生长，诱发植物抗性和提高植物免疫力作用的活性物质^27,28,29,30无一不是指壳聚糖。很多中文文献在报道或引用外文资料时，简单地把chitosan(壳聚糖)当做几丁质(chitin)，造成了学术名称的混乱和应用上的误导。但纳米几丁质除了继承几丁质的基本性质外，还有很高的比表面积、结晶度和聚阳离子的性质，被视为综合性能优异的天然高分子材料。利用水解联合特异性脱乙酰酶制备成纳米的几丁质，比表面积较大且携带一定量的聚阳离子，其纳米颗粒具有显着的生物活性^31,32,33。因此它将成为新一类植物增长调节剂，或新型农药的辅助剂。

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技术实现要素：

本发明所解决的现有技术的问题是：现有的化学脱酰或水解脱酰，反应条件要求较高，不宜控制，且反应时间较长，耗能，环境污染(废水，化学废料)；而现有的酶法脱酰，包括甲壳素酶，壳聚糖酶和溶菌酶，其酶价格昂贵且不易获得，造成产品成本过高，而且得到的纳米几丁质颗粒偏大，脱乙酰度也是良莠不齐，更是不易于应用于工业化生产中。

为了解决上述问题，本发明提供了一种几丁质脱乙酰基酶和其构建方法，以及由几丁质脱乙酰基酶制备得到的纳米几丁质及其制备方法和应用。

具体而言，本发明提供了如下技术方案。

一方面，本发明提供了一种几丁质脱乙酰基酶，所述几丁质脱乙酰基酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，或者在SEQ ID NO.2中限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有几丁质脱乙酰基酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

优选的，所述几丁质所乙酰基酶编码的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

另一方面，本发明提供了一种几丁质脱乙酰基酶的构建方法，包括如下步骤：

(1)：构建几丁质脱乙酰酶重组表达载体质粒；

(2)：将步骤(1)所得的重组表达载体质粒导入大肠杆菌宿主细胞，诱导表达，获得表达产物；

(3)：分离纯化步骤(2)所得到的重组蛋白，即SEQ ID NO.2中氨基酸所示的几丁质脱乙酰酶；或者在SEQ ID NO.2中限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或者几个氨基酸且具有几丁质脱乙酰基酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

第三方面，本发明提供了以上所述的几丁质脱乙酰基酶在制备纳米几丁质领域中的应用。

第四方面，本发明提供了一种纳米几丁质的制备方法，包括如下步骤：

(1)在酸的作用下，水解含有几丁质的原料，然后去除酸，加入溶剂后得到预制备的纳米几丁质悬浮液；

(2)向纳米几丁质悬浮液中加入几丁质脱乙酰基酶，脱乙酰得到纳米几丁质。

优选的，步骤(1)中，水解温度为70-90℃，优选为70-85℃，水解时间为2-4h，优选为2-3h。

优选的，步骤(1)中所述酸选自盐酸、硫酸、硝酸中的一种，优选为盐酸，所述盐酸的浓度优选为3M-5M。

优选的，步骤(1)加入溶剂后还包括超声破碎的步骤，得到预制备的纳米几丁质悬浮液，所述溶剂优选为去离子水。

优选的，步骤(2)中，脱乙酰温度为50-60℃，反应时间为30-60min。

优选的，步骤(2)中几丁质脱乙酰酶与步骤(1)中的纳米几丁质悬浮液的比例为(1-10):(3000-5000)(wt/wt)。

优选的，步骤(2)中加入催化剂进行脱乙酰反应，所述催化剂优选为氯化钴。

第五方面，本发明提供了一种纳米几丁质，其采用以上任一项所述的制备方法制备得到。

第六方面，本发明提供了以上所述的纳米几丁质在废水处理、食品和饲料、制药、农药制剂、肥料和植物生长调节剂领域中的应用。

本发明所取得的有益效果为：本发明在pVT-CDase的作用下，生产纳米几丁质，其脱乙酰化程度较高，纳米粒度较小，且均匀，同时缩短酸解过程，达到节省成本，提高效能和产品质量的功效。本发明的制备方法，反应条件温和，避免了浪费，对应用于产业上生产纳米几丁质具有极大的益处，而且、对环境保护具有重大的现实意义和市场前景，并能取得巨大的社会和经济效益。

附图说明

图1为实施例一中pVT-CDase基因的琼脂糖电泳结果，其中1为pET19(b)/pVT-CDase，2为酶切后克隆片段，M为DNA marker大小。

图2为实施例一表达产物的SDS-PAGE分析结果，其中1为蛋白质marker的分子量，2，3，4分别为诱导表达的裂解上清液的SDS-PAGE结果图。

图3为实施例一制备得到的纳米几丁质的原子力显微镜图。

图4为实施例一制备得到的纳米几丁质的Zeta potential。

图5为实施例一制备得到的纳米几丁质的电导率及电荷密度测定结果图。

图6为对比例一经酸水解制备得到的纳米几丁质的原子力显微镜图。

图7为对比例二经酶解再酸解之后得到的纳米几丁质的原子力显微镜图。

具体实施方式

如上所述，本发明的目的在于，提供一种特异性几丁质脱乙酰基酶及采用几丁质脱乙酰基酶制备纳米几丁质的方法和应用。

其中，在本发明的一种优选实施方式中，所述几丁质脱乙酰基酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，或者在SEQ ID NO.2中限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有几丁质脱乙酰基酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

在本发明的另一种优选实施方式中，所述纳米几丁质的制备方法包括如下步骤：

(1)在酸的作用下，化学水解含有几丁质的原料，化学水解的产物经离心、透析除去游离的酸，加入去离子水，并进行超声破碎，使几丁质颗粒均匀分散在去离子水中，得到预制备的纳米几丁质悬浮液；

(2)向纳米几丁质悬浮液中加入几丁质脱乙酰基酶，在催化剂的作用下，进行脱乙酰得到纳米几丁质。

本发明首先通过酸水解，将较大的几丁质纤维降解为微纳米级别的颗粒，进一步用几丁质脱乙酰酶进行脱酰基，制备得到生物活性更强的纳米晶须。

本发明所用到的原料可以为任何含有几丁质的原料，优选为虾皮。

下面结合附图和具体的实施例对本发明作进一步的详细的说明。但是，这些实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明范围的限制。

其中，本发明中用到的试剂、仪器的厂家及型号如下：

CoCl₂，分析纯，厂家：天津市盛鑫伟业贸易有限公司；

原子力显微镜，型号MFP-3D-Bio厂家：牛津仪器Asylum Research；

Zeta电位分析仪，型号Nano ZS90，厂家：Malvern Instruments Ltd.

PCR仪，型号T100，美国Bio-Rad；

异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，

氨苄青霉素，分析纯，购自：上海励瑞生物科技有限公司；

质粒，包括pUC57，pET19，购自：南京金斯瑞生物科技有限公司；

虾皮几丁质，购自：Sigma Aldrich。

实施例一

(一)特异性脱乙酰酶的基因构建(pVT-CDase)、基因克隆和蛋白表达

1.特异性脱乙酰酶基因的构建

pVT-CDase基因来源于菜豆炭疽病原真菌(Colletotrichum lindemuthianum)基因序列，记载在GenBank(GenBank:AY633657.1.protein ID:AAT68493.1)中，采用重组基因方法，经基因优化，构建用于细菌表达的基因序列。基因重组、基因优化和基因克隆构建的质粒由南京金斯瑞公司完成并保存。基因序列(SEQ ID No.1)为：

TATACCATGGGCCACTTTAGCACGCTGTTCGGCGCGGCGGCAACGGCGGCACTGGCAGGTTCCACCAACGCATCACCGCTGGCACGTCGTCAGGTCCCGGTCGGCACCCCGATTCTGCAGTGCACGCAACCGGGCCTGGTGGCACTGACCTATGATGACGGTCCGTTTACCTTCACGCCGCAGCTGCTGGATATCCTGAAACAAAATGACGTGCGTGCTACCTTTTTCGTTAACGGCAACAATTGGGCGAATATTGAAGCCGGTAGTAACCCGGATACCATCCGTCGCATGCGTGCAGACGGTCATCTGGTTGGTTCACATACCTACGCACACCCGGATCTGAACACGCTGAGCTCTGCTGACCGTATTAGCCAGATGCGCCACGTCGAAGAAGCGACCCGTCGCATCGATGGCTTTGCGCCGAAATATATGCGTGCACCGTACCTGTCCTGCGATGCAGGTTGTCAGGGTGACCTGGGCGGTCTGGGTTATCATATTATCGATACCAATCTGGATACGAAAGACTACGAAAACAATAAACCGGAAACCACGCACCTGTCAGCGGAAAAATTCAACAATGAACTGTCGGCAGATGTGGGCGCTAACAGTTATATTGTTCTGTCCCATGACGTCCACGAACAGACCGTGGTTAGCCTGACGCAAAAACTGATCGATACCCTGAAATCTAAAGGTTACCGCGCCGTCACGGTGGGCGAATGTCTGGGCGACGCACCGGAAAATTGGTACAAAGCGCATCATCATCATCATCACTAACTCGAG

pVT/CDase基因大小为780bp，如图1所示，含NcoI、XhoI两种内切酶和His Tag。其中附图1为几丁质脱乙酰基酶(pVT-CDase)基因的琼脂糖电泳结果，其中标号1为pET19(b)/pVT-CDase，标号2为酶切后克隆片段，标号M为DNA marker大小，从大到小依次为8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp和500bp。

2.基因克隆

pVT-CDase基因克隆所用载体为高复制质粒:pUC57；高表达质粒：pET19(b)。

将pVT-CDase基因插入到融合表达载体pET19(b)的多克隆位点NcoI和xhoI之间，并将携带pVT-CDase基因的融合表达载体转入大肠杆菌宿主菌E.coli BL21(DE3)菌株中。

3.蛋白表达

基因表达蛋白质的氨基酸序列中含255个Amino Acids。其蛋白序列SEQ ID No.2为：

MGHFSTLFGAAATAALAGSTNASPLARRQVPVGTPILQCTQPGLVALTYDDGPFTFTPQLLDILKQNDVRATFFVNGNNWANIEAGSNPDTIRRMRADGHLVGSHTYAHPDLNTLSSADRISQMRHVEEATRRIDGFAPKYMRAPYLSCDAGCQGDLGGLGYHIIDTNLDTKDYENNKPETTHLSAEKFNNELSADVGANSYIVLSHDVHEQTVVSLTQKLIDTLKSKGYRAVTVGECLGDAPENWYKAHHHHHH。

将含有pET19(b)-pVT-CDase表达载体的BL21(DE3)菌株于37℃活化过夜后，按1:800稀释的量接入含有100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基500mL中，菌液37℃条件下培养至OD0.6～0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，终浓度为1mmol/L)诱导蛋白表达，继续培养6h。培养液经5000×g/4℃离心5min收集菌体。

将收集的菌液用PBS重悬，冰上放置30分钟，用超声破波裂解法(设置为35％output，5s×5s，总计1min)提取周质蛋白，1200rpm/4℃离心，保留上清液。

经此方法表达的为周质蛋白，分子量为27.92KDa。该蛋白的理论pI 6.07，可用Ni柱(HisTrap TM FF Crude)纯化His-tag蛋白质，用SDS/PAGE分析蛋白质的分布，如图2所示。其中，1为蛋白质marker的分子量，2，3，4分别为诱导表达的裂解上清液的SDS-PAGE结果图，介于30kd和40kd之间的为糖基化的几丁质脱乙酰基酶，介于20kd和30kd之间的为未糖基化的几丁质脱乙酰基酶。

(二)pVT-CDase酶法制备纳米几丁质的方法

pVT-CDase是一种特异性几丁质脱乙酰酶，主要用于α-几丁质脱乙酰。

具体方法如下：

(1)取虾皮1g，然后加入3M的HCl 300mL，在80℃条件下处理2h；反应产物透析去除盐酸残留；

(2)将pVT-CDase按10:3000(wt/wt)的比例加入酸水解透析后几丁质悬浮液中，然后用0.1MNaOH将反应液调至pH8.0；

(3)加入CoCl₂至最终浓度0.1mM，增加离子强度，催化脱酰反应，其中CoCl₂作为反应的催化剂；

(4)在恒温60℃的条件下，搅拌反应30min，然后加热至100℃，继续搅拌10min终止反应；

(5)1200rpm，4℃离心5min，上清液即为最终产品；

(6)用原子力显微镜表征，经pVT-CDase处理后的纳米几丁质大小在50nm左右，如图3所示。ZetaSizer检测纳米粒子粒度，通过光散射法纳米几丁质颗粒(0.03％wt/v)在水中的分散度和Zeta potential，如图4所示。经检测，0.03％纳米几丁质Zeta potential为58±1mV，表明其聚阳离子性质。

电导滴定法测定综合电荷电量。用0.3-0.5％(wt/v)的纳米几丁质样品50mL，用0.1N HCl将pH值调至3.4，然后用0.005N的NaOH滴定。根据有效OH-消耗量，计算样品综合电荷密度(58mmol/g)，如图5所示。

实施例二

实施例二采用同实施例一相同的方法制备pVT-CDase酶，同时应用pVT-CDase酶制备纳米几丁质。

(1)取虾皮1g，然后加入5M的HCl，在70℃条件下处理3h；

(2)将pVT-CDase按5:3000(wt/wt)的比例加入酸水解透析后几丁质悬浮液中，然后用0.1MNaOH将反应液调至pH8.0；

(3)加入CoCl₂至最终浓度0.1mM，增加离子强度，催化脱酰反应；

(4)在恒温55℃的条件下，搅拌反应45min，然后加热至100℃，继续搅拌10min终止反应；

(5)1200rpm，4℃离心5min，上清液即为最终产品；

(6)用原子力显微镜表征，经pVT-CDase处理后的纳米几丁质大小在50-100nm的范围内。

ZetaSizer检测纳米粒子粒度，通过光散射法纳米几丁质颗粒(0.03％wt/v)在水中的分散度和Zeta potential。经检测，0.03％纳米几丁质Zeta potential为38.9±1mV，表明其聚阳离子性质。

实施例三

实施例三采用同实施例一相同的方法制备pVT-CDase酶，同时应用pVT-CDase酶制备纳米几丁质。

(1)取虾皮1g，然后加入3M的HCl，在90℃条件下处理4h；

(2)将pVT-CDase按1:3000(wt/wt)的比例加入酸水解透析后几丁质悬浮液中，然后用0.1MNaOH将反应液调至pH8.0；

(3)加入CoCl₂至最终浓度0.1mM，增加离子强度，催化脱酰反应；

(4)在恒温50℃的条件下，搅拌反应60min，然后加热至100℃，继续搅拌10min终止反应；

(5)1200rpm，4℃离心5min，上清液即为最终产品；

(6)用原子力显微镜表征，经pVT-CDase处理后的纳米几丁质大小在150-230nm的范围内。

ZetaSizer检测纳米粒子粒度，通过光散射法纳米几丁质颗粒(0.03％wt/v)在水中的分散度和Zeta potential。经检测，0.03％纳米几丁质Zeta potential为38.4±1mV，表明其聚阳离子性质。

对比例一

对比例一与实施例一的不同之处在于，仅仅经过酸水解制备纳米几丁质，不经过本发明制备的pVT-CDase酶处理，即对比例一包含如下步骤：

(1)取虾皮1g，然后加入3M的HCl，在80℃条件下处理2h；反应产物透析去除盐酸残留；

(2)1200rpm，4℃离心5min，上清液即为最终产品；

(3)用原子力显微镜表征，经酸处理后的纳米几丁质的原子力纤维镜图如图6所示，从图6不难看出，仅仅采用酸进行水解，得到的纳米几丁质，纳米几丁质粒径较大，而且粒径均一性较差。

对比例二

对比例二与实施例的不同之处在于，对比例二首先采用本发明制备的pVT-CDase酶处理，然后进行酸解，其制备过程如下：

(1)取虾皮1g，将pVT-CDase按5:3000(wt/wt)的比例加入；

(2)加入CoCl₂至最终浓度0.1mM，增加离子强度，催化脱酰反应，其中CoCl₂作为反应的催化剂；

(3)在恒温60℃的条件下，搅拌反应30min，然后加热至100℃，继续搅拌10min终止反应；

(4)1200rpm，4℃离心5min，取上清液；

(5)向上清液中加入3M的HCl，在80℃条件下处理2h；反应产物透析去除盐酸残留；

(6)用0.1MNaOH将反应液调至pH8.0；

(7)1200rpm，4℃离心5min，上清液即为最终产品；

(8)用原子力显微镜表征，对比例二制备得到的纳米几丁质如图7所示。从图7可以看出，采用对比例二的方法，即先进行酶解，然后再进行酸解的方法，得到的纳米几丁质，其粒径大也分布不均匀，而且容易聚集成团。

综上所述，采用本发明的几丁质脱乙酰基酶制备得到的纳米几丁质，其粒径均一，纳米几丁质粒径较小且均匀，产品的质量较高。而且采用本发明的方法，反应提交温和，从而避免了浪费。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。