本发明涉及一种生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂，具体涉及一种以海带、植物原料、鱼粉为原料的生物发酵的高效氨基酸型有机酶制剂的制备方法及应用。
背景技术：
众所周知，现代农法是大量使用化肥农药，虽然此方法能使农作物产量大增，土地被充分利用，但是伴随着的一连串的问题：环境污染、土地酸败废耕、病虫害日益严重、农产品品质下降、化肥农药残留等等，而这些问题在日益严重，直接影响到人们的生活及整个地球的生态环境。氨基酸叶面肥为含有氨基酸类物质的叶面肥料。氨基酸作为构成蛋白质的最小分子存在于肥料中，有易于被作物吸收的特点；亦有提高施肥对象抗病性，改善施肥作物品质的功能。补充植物必需的氨基酸，刺激和调节植物快速生长，促使植物生长健壮，促进对营养物质的吸收。
但是目前氨基酸的生产工艺因为考虑到成本，多是使用盐酸，很少有用硫酸做的。所以原液中一般含有12～14％的氯化铵，氯离子含量偏高，达到10％左右，用做叶面肥容易引起作物烧根烧苗。虽然氨基酸叶面肥速效性好，但是持效性就不可乐观了。
本发明提供的一种生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂，由海带、植物原料、鱼粉为原料生物发酵而成，本发明提供的方法是先将海带、植物原料、鱼粉按比例混合，打碎，再用酵素菌和EM菌分别进行第一次发酵、第二次发酵，所得发酵原液和水混合即得生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂。其中的酵素菌菌种主要有固氮菌、解磷菌、解钾菌、酵母菌、放线菌、真菌以及多种有益的菌群组成。发酵过程中产生的各种氨基酸、酶类、生物激素类物质以及植物生长必需的营养元素及微量元素等,其中酶在生命活动中起着非常重要的作用，没有这些酶，植物就不能生长。EM菌是以光合细菌、乳酸菌、酵母菌和放线菌为主的10个属80余个微生物复合而成的一种微生活菌制剂。能同时分泌与合成大量氨基酸、蛋白质、维生素和各种生化酶、抗生素、促生长因子等营养与激素类物质。此发酵方法通过两次发酵，原料得到充分利用，发酵产物丰富，发酵物中含有植物必需的主要中、微量元素、多种氨基酸和酶类，能提供农作物内的活性酶所需营养，加强吸收度，促进根系吸收营养，促进根系发达，增强免疫力，增强对病虫害的抵抗能力，抗旱涝、耐严寒，改善农作物品质；有助于农作物在修剪、移栽、病害、伤冻之后的机能快速恢复；其中发酵物有醯胺酶产生，提高作物保鲜能力，有效延长储藏期，减少长途运输上的损失，大大提高经济效益。
本发明所提供的一种生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂，其对小麦、水稻、棉花、大豆、花生、油菜、甜菜和各种蔬菜、果树等作物都能起到高效且持效性长，显著的增产效果。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术存在的上述缺点，提供一种绿色无污染对作物安全、作用高效且持效性长、使用成本低的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂。
本发明还提供了上述生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂的制备方法，采用了如下步骤实现：
(1)将海带15％～30％、树叶10％～20％、干草10％～20％、鱼粉15％～30％按比例混合好，打碎，进行消毒，其水分含量30％～40％，得到发酵原材料，倒入发酵灌中备用。
(2)制备酵素菌液，首先将酵素菌菌种于30℃～36℃恒温复活12h，用接种环将复活后菌群涂于琼脂平板上，继续于30℃～36℃恒温培养36h，然后转入培养基中，摇床厌氧培养8h，得培养液，然后将培养液移种到新配制的培养基中，好氧培养30h，即得到酵素菌液。所述培养基配方包含以下重量百分比：葡萄糖10％～20％、蛋白胨5％～8％、酵母膏3％～5％、硫酸铵3％～6％、磷酸二氢钾1％～2％、磷酸氢二钾1％～2％,余量用纯净水补足。所述酵素菌菌种购自河南磐龙酵素菌生物工程有限公司，具体为其购进代理的日本进口酵素菌原装进口菌种。
(3)制备EM菌液，将EM菌原液、红糖按2：1重量比混合，即得到EM菌液。所述EM菌原液购自爱睦乐环保生物技术有限公司，具体为其购进代理的日本进口酵素菌原装进口菌种。
(4)一次发酵，将步骤(2)制备的酵素菌液移种到发酵罐内，用酸度调节剂或碱度调节剂，调pH值为6.8～7.2，好氧发酵48h，发酵罐内物料由棕红色变成淡黄色则停止发酵，备用。所述酸度调节剂为柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸钠、磷酸中的一种或几种。所述碱度调节剂氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢三钠中的一种或几种。
(5)二次发酵，将步骤(3)制备的EM菌液移种到发酵罐内，用酸度调节剂或碱度调节剂，调pH值为6.8～7.2，在22℃下厌氧发酵25天，发酵过程中每天早上9点和下午5点用每分钟40转的搅拌器各搅拌30分钟，滤除同体杂质，即得到发酵原液。所述酸度调节剂为柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸钠、磷酸中的一种或几种。所述碱度调节剂氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢三钠中的一种或几种。
(6)将步骤(5)制备的发酵原液与水按3：7重量比混合，即得本发明所述生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂，所述水为自来水或蒸馏水的一种。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
上述的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂的制备方法，其中所述的步骤(1)中发酵原材料重量百分比优选为海带30％、树叶20％、干草20％、鱼粉30％按比例混合好，打碎，其水分含量30％。
上述的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂的制备方法，其中所述的步骤(2)中所述培养基配方重量百分比优选为：葡萄糖20％、蛋白胨5％、酵母膏3％、硫酸铵3％、磷酸二氢钾1％、磷酸氢二钾1％,余量用纯净水补足。
上述的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂的制备方法，其中所述的步骤(4)所述酸度调节剂优选为柠檬酸钠、柠檬酸、乳酸中的一种或几种。所述碱度调节剂优选为碳酸钾。
上述的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂的制备方法，所得发酵原液，经检验发现其中含有碳水化合物类如葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、麥芽糖、鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖、寡糖素等；氨基酸类如脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸、氨基丁酸、谷氨酸、丙氨酸、天冬酰胺酸、丝氨酸、胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、精氨酸等；有机酸类如鞑靼酸、恶喹酸、黄水晶酸、醋酸、丙酸、丁酸、戊酸、琥珀酸、腐植酸乙醇酸等；酶类如醯胺酶、碱性磷酸酶、酯酶(C4)、酯酶脂肪酶(C8)、缬氨酸芳基氨肽酶、酸性磷酸酶、色酚AS-BI磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、β-葡糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶等；还含有其他物质如生物素、硫胺素、泛酸、烟酸(尼克酸)、科林、肌苷吡哆醇、吡哆醇、p-氨基苯甲酸过、n-烟酸甲酯酸等；及含有种元素碳、氢、氮、磷、钾、钙、镁、硫、铁、锰、铜、锌、钼、钴、氯、硫为植物生长必需的营养元素。营养物质丰富，能提供农作物内的活性酶所需营养，加强吸收度，促进根系吸收营养，促进根系发达，增强免疫力，增强对病虫害的抵抗能力，抗旱涝、耐严寒，改善农作物品质；有助于农作物在修剪、移栽、病害、伤冻之后的机能快速恢复；其中发酵物有醯胺酶产生，提高作物保鲜能力，有效延长储藏期，减少长途运输上的损失，大大提高经济效益。因为含有大量有机质，再加上微生物繁衍生殖所产生的各类有机酸、氨基酸、脂肪酸、游离氨基酸等都具有释放速度慢、肥效长的特点。
上述的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂的制备方法，所得生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂所含酶类含量如下为合格产品：醯胺酶为5～20mmol/L、碱性磷酸酶为5～20mmol/L、酯酶(C4)为5～20mmol/L、酯酶脂肪酶(C8)为5～20mmol/L、缬氨酸芳基氨肽酶为1～10mmol/L、酸性磷酸酶为1～10mmol/L、色酚AS-BI磷酸水解酶为5～20mmol/L、β-半乳糖苷酶为1～10mmol/L、β-葡糖醛酸酶为1～10mmol/L、β-葡糖苷酶为5～20mmol/L、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶为10～30mmol/L。生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂所含酶类检测方法为取生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂，在无菌环境稀释50倍，在API ZYM平板上的杯子里各自放入稀释液65μL。把平板温度调到37C°，保温5小时。然后，把ZYM A试药以及ZYM B试药各自添加1滴，着色5分钟。使用强光源，排除残留Fast Blue(黄色色素)。光照射后，把平板静置2分钟。根据判定表读取结果。
借由上述技术方案，生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂及其制备方法至少具有下列优点：
(1)本发明的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂所用原料均廉价易得，制备成本低。
(2)本发明的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂中重金属含量低，对土壤污染小。
(3)本发明的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂氨基酸含量高达8％～12％，且含有多种微量元素，营养丰富。
(4)本发明的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂保鲜力强，大大提高作物保鲜能力，有效延长储藏期，减少长途运输上的损失，大大提高经济效益。
(5)本发明的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂高效且持效性长，有显著的增产效果。
(6)本发明的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂还含有多种有益微生物，能有效抑制病原微生物的生长繁殖。
具体实施方式
实施例一：生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂的制备方法，步骤如下：
(1)将海带3千克、树叶2千克、干草2千克、鱼粉3千克按比例混合好，打碎，加水至其水分含量30％，进行高压消毒，得到发酵原材料，倒入发酵灌中备用。
(2)制备酵素菌液：首先将酵素菌菌种恒温箱内,36℃恒温复活12小时后，用接种环将复活后菌群涂布于琼脂平板上，放入恒温箱内继续于36℃恒温培养36h，取4个三角瓶分别装入200ml培养基，把培养出来的菌群移入三角瓶内，封闭瓶口，放入摇床内，恒温36℃厌氧培养8h，得培养液，再选200L种子罐，灭菌20min，冷却后转入培养基再进行实罐灭菌，将上述厌氧培养制备的培养液移种到种子罐内，启动搅拌机(转速100r/min)，开启进气阀和放气阀，于温度36℃，pH7，好氧培养30h，得到酵素菌液。好氧培养和厌氧培养接种量均为培养基质量的6％。
(3)制备EM菌液，将EM菌原液、红糖按2：1重量比混合，即得到EM菌液。所述EM菌原液购自爱睦乐环保生物技术有限公司，具体为其购进代理的日本进口酵素菌原装进口菌种。(4)一次发酵，将步骤(2)制备的酵素菌液移种到发酵罐内，关闭液面以下的所有阀门，打开液面以上的所有阀门，开启发酵罐搅拌器，转速150r/min，打开空气进气阀，通入无菌空气，调节温度37℃，用柠檬酸钠或碳酸钠，调pH值为6.8，好氧发酵48h。
(5)二次发酵，将EM菌液移种到发酵罐内，调pH值为7.0，在22℃下厌氧发酵25天，发酵过程中每天早上9点和下午5点用每分钟40转的搅拌器各搅拌30分钟，滤除同体杂质，即得到发酵原液。
(6)将步骤(5)制备的发酵原液与水按3：7重量比混合，即得本发明所述生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂。
实施例二：含有酶类检测
取实施例一中所得生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂，在无菌环境稀释50倍，在API ZYM平板上的杯子里各自放入稀释液65μL。把平板温度调到37C°，保温5小时。然后，把ZYM A试药以及ZYM B试药各自添加1滴，着色5分钟。使用强光源，排除残留Fast Blue(黄色色素)。光照射后，把平板静置2分钟。读取结果。结果：生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂中含有的酶类如下醯胺酶7.7mmol/L、碱性磷酸酶7.7mmol/L、酯酶(C4)7.7mmol/L、酯酶脂肪酶(C8)7.7mmol/L、缬氨酸芳基氨肽酶3.8mmol/L、酸性磷酸酶3.8mmol/L、色酚AS-BI磷酸水解酶7.7mmol/L、β-半乳糖苷酶3.8mmol/L、β-葡糖醛酸酶5nmol、β-葡糖苷酶7.7mmol/L、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶15.4mmol/L。检测证明实施例一中所得生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂为合格产品。
实施例三：对照氨基酸有机酶制剂A的制备
(1)将海带3千克、树叶2千克、干草2千克、鱼粉3千克按比例混合好，打碎，加水至其水分含量30％，进行高压消毒，得到发酵原材料，倒入发酵灌中备用。
(2)制备酵素菌液：首先将酵素菌菌种恒温箱内,36℃恒温复活12小时后，用接种环将复活后菌群涂布于琼脂平板上，放入恒温箱内继续于36℃恒温培养36h，取4个三角瓶分别装入200ml培养基，把培养出来的菌群移入三角瓶内，封闭瓶口，放入摇床内，恒温36℃厌氧培养8h，得培养液，再选200L种子罐，灭菌20min，冷却后转入培养基再进行实罐灭菌，将上述厌氧培养制备的培养液移种到种子罐内，启动搅拌机(转速100r/min)，开启进气阀和放气阀，于温度36℃，pH7，好氧培养30h，得到酵素菌液。好氧培养和厌氧培养接种量均为培养基质量的6％。
(3)发酵，将酵素菌液移种到发酵罐内，关闭液面以下的所有阀门，打开液面以上的所有阀门，开启发酵罐搅拌器，转速150r/min，打开空气进气阀，通入无菌空气，调节温度37℃，用柠檬酸钠或碳酸钠，调pH值为6.8，好氧发酵48h。
(4)将步骤(3)制备的发酵原液与水按3：7重量比混合，即得对照氨基酸有机酶制剂A。
实施例四：对照氨基酸有机酶制剂B的制备
(1)将海带3千克、树叶2千克、干草2千克、鱼粉3千克按比例混合好，打碎，加水至其水分含量30％，进行高压消毒，得到发酵原材料，倒入发酵灌中备用。
(2)制备EM菌液，将EM菌原液、红糖按2：1重量比混合，即得到EM菌液。所述EM菌原液购自爱睦乐环保生物技术有限公司，具体为其购进代理的日本进口酵素菌原装进口菌种。
(3)发酵，将EM菌液移种到发酵罐内，用柠檬酸钠或碳酸钠，调pH值为7.0，在22℃下厌氧发酵25天，发酵过程中每天早上9点和下午5点用每分钟40转的搅拌器各搅拌30分钟，滤除同体杂质，即得到发酵原液。
(4)将步骤(3)制备的发酵原液与水按3：7重量比混合，即得对照氨基酸有机酶制剂B。
实施例五：生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂试验
试验地点澄迈县福橙基地，试验时间2015年9月6日，使用方法：坐果后，实验组喷施本发明实施例一制备的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂2次，间隔7天，浓度为200倍液。以实施例二、三制备的对照氨基酸有机酶制剂A、对照氨基酸有机酶制剂B、普通氨基酸有机酶制剂、清水做对照，分别喷施2次，间隔7天，浓度为200倍液。采摘测定结果如下：
表l 2015年10月20日试验组数据表
表2 2015年10月20日对照组1使用对照氨基酸有机酶制剂A数据表
表3 2015年10月20日对照组2使用对照氨基酸有机酶制剂B数据表
表4 2015年10月20日对照组3使用普通氨基酸有机酶制剂数据表
表5 2015年10月20日对照组4使用清水数据表
表6实验组与对照组效果对比
试验结论：由表6可以看出，福橙坐果后，使用本发明的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂，效果较好，糖度增加47.33％，单果重增加48.08％，增产48.08％，预期产值增加48％以上，经济效益显著。福橙采收后观察，实验组并无病害出现，说明其它对照组均有不同病害出现。这个实验可以看出本发明的生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂作用高效且持效性长。
实施例六：生物发酵高效氨基酸型有机酶制剂保鲜试验
随机选出取实施例二中试验组和4个对照组各10个熟透的橙子，在室温300C下放置，10天后观察结果，发现4个对照组中的橙子好果率低于50％，且有异味。而试验组的橙子好果率为80.5％，无异味。