本发明涉及一种虎奶菇菌丝体自溶蛋白质的制备方法。
背景技术：
虎奶菇,为担子菌纲侧耳科植物虎奶菌的菌核。富含蛋白质、多糖等活性物质和钾、钙、镁等矿质元素。且含有高达77．4％的膳食纤维，因此在食品工业中具有非常广阔的应用开发前景。目前已报道幺幺状真菌在自溶过程中会产生细胞溶酶，该酶能降解细胞壁多糖和细胞质物质，此时应用差异蛋白质组学方法希望能够鉴定出并验证虎奶菇菌丝体自溶过程出现的关键水解酶。为进一步研究虎奶菇菌丝体自溶机制提供依据，双向电泳技术是目前分离蛋白质的关键技术，能够有效分离高度复杂的蛋白混合物。虎奶菇是大型食用真菌，其体内除含有植物组织的多种次生代谢物质外，还含有大量多糖，其蛋白质提取较其他植物更为困难。
技术实现要素：
本发明提出一种虎奶菇茵丝体自溶蛋白质的制备方法。
一种虎奶菇茵丝体自溶蛋白质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将菌种转移到PDA固体培养基上，置恒温暗培养箱中，30℃培养7 d，在40℃环境下保存备用；
（2）将上述平板培养基上的菌丝用组织捣碎机捣碎后，吸取培养基体积l％的量接种于GPY培养基中，振荡培养14 d后，以4800r/min，在4℃环境下离心收集菌丝体，将收集的菌丝体先用自来水冲洗，再用蒸馏水洗涤3次备用；
（3）取l g虎奶菇菌丝置于预冷过的钵体中，加入液氮，快速研磨；待菌丝体成粉末状时，快速转移菌丝体至离心管中，加入10 mL丙酮(含10％TCA和0．07％B一巯基乙醇)，摇匀，沉淀过夜，ll 000 r·min。离心30 min后弃上清，以100％丙酮(含0．07％B一巯基乙醇)洗涤沉淀1次，11 000 r·min’1离心30 min后弃上清，再以80％丙酮(含0．07％13一巯基乙醇)洗涤沉淀1次，以ll 000 r·min离心30 min后弃上清液；将沉淀物真空干燥，于-70℃至-20℃环境下保存后备用；
（4）将经温度处理后的菌丝体滤去，滤液离心取上清，加入1／10体积100％TCA，沉淀过夜，1l 000 r·min离心30 min后弃上清，重复以上操作，收集全部蛋白质沉淀，加入5 mL 80％冷丙酮(含0．07％一巯基乙醇，一20℃预冷)，振荡．放置-20℃冰箱中5 h后，11 000 r·min离心30min，弃上清，所述沉淀物即为虎奶菇茵丝体自溶蛋白质，将其干燥后储存于-70℃至-20℃的环境中。
优选地，所述步骤(3)加入10 mL丙酮，所述丙酮含10％TCA和0．07％B一巯基乙醇。
优选地，所述步骤以100％丙酮洗涤沉淀1次步骤中丙酮含有0．07％B一巯基乙醇。
本发明所述方法制备的虎奶菇茵丝体自溶蛋白质，方法简单，蛋白产产量高，可工业化生产，实用性强。
具体实施方式
实施例1。
一种虎奶菇茵丝体自溶蛋白质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将菌种转移到PDA固体培养基上，置恒温暗培养箱中，30℃培养7 d，在40℃环境下保存备用；
（2）将上述平板培养基上的菌丝用组织捣碎机捣碎后，吸取培养基体积l％的量接种于GPY培养基中，振荡培养14 d后，以4800r/min，在4℃环境下离心收集菌丝体，将收集的菌丝体先用自来水冲洗，再用蒸馏水洗涤3次备用；
（3）取l g虎奶菇菌丝置于预冷过的钵体中，加入液氮，快速研磨；待菌丝体成粉末状时，快速转移菌丝体至离心管中，加入10 mL丙酮(含10％TCA和0．07％B一巯基乙醇)，摇匀，沉淀过夜，ll 000 r·min。离心30 min后弃上清，以100％丙酮(含0．07％B一巯基乙醇)洗涤沉淀1次，11 000 r·min’1离心30 min后弃上清，再以80％丙酮(含0．07％13一巯基乙醇)洗涤沉淀1次，以ll 000 r·min离心30 min后弃上清液；将沉淀物真空干燥，于-70℃至-20℃环境下保存后备用；
（4）将经温度处理后的菌丝体滤去，滤液离心取上清，加入1／10体积100％TCA，沉淀过夜，1l 000 r·min离心30 min后弃上清，重复以上操作，收集全部蛋白质沉淀，加入5 mL 80％冷丙酮(含O．07％一巯基乙醇，一20℃预冷)，振荡．放置-20℃冰箱中5 h后，11 000 r·min离心30min，弃上清，所述沉淀物即为虎奶菇茵丝体自溶蛋白质，将其干燥后储存于-70℃至-20℃的环境中；
（5）所述步骤(3)加入10 mL丙酮，所述丙酮含10％TCA和0．07％B一巯基乙醇。
实施例2。
一种虎奶菇茵丝体自溶蛋白质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将菌种转移到PDA固体培养基上，置恒温暗培养箱中，30℃培养7 d，在40℃环境下保存备用；
（2）将上述平板培养基上的菌丝用组织捣碎机捣碎后，吸取培养基体积l％的量接种于GPY培养基中，振荡培养14 d后，以4800r/min，在4℃环境下离心收集菌丝体，将收集的菌丝体先用自来水冲洗，再用蒸馏水洗涤3次备用；
（3）取l g虎奶菇菌丝置于预冷过的钵体中，加入液氮，快速研磨；待菌丝体成粉末状时，快速转移菌丝体至离心管中，加入10 mL丙酮(含10％TCA和0．07％B一巯基乙醇)，摇匀，沉淀过夜，ll 000 r·min。离心30 min后弃上清，以100％丙酮(含0．07％B一巯基乙醇)洗涤沉淀1次，11 000 r·min’1离心30 min后弃上清，再以80％丙酮(含0．07％13一巯基乙醇)洗涤沉淀1次，以ll 000 r·min离心30 min后弃上清液；将沉淀物真空干燥，于-70℃至-20℃环境下保存后备用；
（4）将经温度处理后的菌丝体滤去，滤液离心取上清，加入1／10体积100％TCA，沉淀过夜，1l 000 r·min离心30 min后弃上清，重复以上操作，收集全部蛋白质沉淀，加入5 mL 80％冷丙酮(含O．07％一巯基乙醇，一20℃预冷)，振荡．放置-20℃冰箱中5 h后，11 000 r·min离心30min，弃上清，所述沉淀物即为虎奶菇茵丝体自溶蛋白质，将其干燥后储存于-70℃至-20℃的环境中；
（5）所述步骤(3)加入10 mL丙酮，所述丙酮含10％TCA和0．07％B一巯基乙醇；
所述步骤以100％丙酮洗涤沉淀1次步骤中丙酮含有0．07％B一巯基乙醇。