麦芽寡糖基海藻糖水解酶及其表达基因与应用的制作方法

本发明涉及麦芽寡糖基海藻糖水解酶及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

海藻糖是由两分子葡萄糖通过α-1,1糖苷键结合而成的一种安全的非还原性二糖，广泛存在于植物、动物及微生物中。海藻糖具有广泛的生物学意义，在医药中是一种很好的稳定剂，可用来保护激素、维生素、抗生素、生物制剂、酶、抗血清、疫苗等易失活的物质；在化妆品中可以维持细胞活力，具有保湿、抗辐射的作用；在农业中可维持作物在高温、高旱、高盐条件下的正常生长；在食品中被用作改善质量和风味的天然添加剂，同时还具有保鲜的作用；因此在科学界被誉为“生命之糖”。

目前生产海藻糖的方法主要包括单酶法以及双酶法。单酶法主要利用海藻糖合酶以麦芽糖为底物生成海藻糖，但该酶的稳定性差，极易失活，目前并没有利用该工艺大规模生产海藻糖的报道。双酶法是利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，以直链淀粉为底物直接催化生成海藻糖。MTSase主要催化分子内转糖基反应，将淀粉的还原性末端的α-1,4-糖苷键转化为α-1,1-糖苷键，得到中间产物麦芽寡糖基海藻糖；MTHase专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖连接的α-1,4-糖苷键，产生一分子海藻糖和减少2个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，并作为新的底物进行下一轮反应。目前双酶法是最经济实用的工艺路线，且被应用于工业化生产。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶最早在节杆菌(Arthrobactor sp.StrainQ36)中被发现报道，后来又在根瘤菌(Rhizobium sp.Strain M11)，微黄短杆菌(Brevibactierium helvolum)，嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909)中相继发现了这两种酶。不同来源的MTSase和MTHase具有不同的酶学特性，Arthrobactor sp.StrainQ36的最适反应温度40℃、pH6.5，转化率高达80％，Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909具有较高的最适反应温度75℃以及较低的pH 5.0，但酶活力均很低。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供麦芽寡糖基海藻糖水解酶及其表达基因与应用。

本发明技术方案如下：

麦芽寡糖基海藻糖水解酶表达基因MTHase，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种重组表达载体，表达载体中插入了上述表达基因MTHase。

优选的，所述表达载体为表达载体pET-22b(+)。

一种重组细胞，含有上述重组表达载体。

优选的，所述的重组细胞通过将上述表达载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)后获得。

上述麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase、上述表达基因MTHase、上述重组细胞在制备生产海藻糖中的应用。

有益效果

本发明首次发现了由氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)提取获得的麦芽寡糖基海藻糖水解酶表达基因MTHase，该基因表达的麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase最适温度为57℃，最适pH5.5，以20％麦芽五糖为底物生产麦芽五糖基海藻糖，酶活可达到35.7U/ml，显著优于现有已知的麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，该酶与同样来源于氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)共同作用生产海藻糖时，产率高，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是MTSase、MTHase基因获得过程的流程图；

图2是MTSase基因PCR扩增后的电泳检测结果照片；

图3是MTHase基因PCR扩增后的电泳检测结果照片；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

菌种来源

所述氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)购自中国普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏编号NO.1.1925。

实施例1：氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)基因组总DNA的提取。

将-80℃下保存的氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)菌株接种至LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中活化培养24小时，其后按照1％接种量接种至新鲜LB培养基中培养24小时，取10mL菌液按照上海生工细菌基因组提取试剂盒所提供的方法提取该菌基因组总DNA。

实施例2：MTSase、MTHase基因的获取

MTSase、MTHase基因的获取如图1所示，根据同源比对分别设计简并引物F1和R1、F2和R2。

F1：GGTTCCGSGTGSGASGTGAAGAACTGCCA

R1：TTGGCCATSACCATKCCSGAGGTCTGCTGGAA

F2：ATCTACGARCTSCACSTGGGCACCTT

R2：GGTTCCGSGTGSGASGTGAAGAACTGCCA

以实施例1制得的基因组总DNA为模板，分别以F1(上游引物)、R1(下游引物)和F2(上游引物)、R2(下游引物)为引物，利用TaKaRa公司的Ex TaqTM试剂盒根据产品说明书进行PCR扩增；

所述PCR扩增体系如下：

基因组DNA 2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，Taq酶25μL，ddH₂O 19μL。

PCR条件为：95℃变性5min；95℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

凝胶电泳分别得到两条1000bp左右条带，割胶回收。将PCR产物分别与pTOPO-T载体连接转化进DH5α中，挑选阳性克隆子，送至上海生工测序，记做测序结果1。

根据测序结果1与同源序列设计简并引物F3和R3、F4和R4、F5和R5。

F3：ACSCGGCGGTAGGGCATGGWTTC

R3：CCGGGCAGTGGAGCGACGACT

F4：CCCGCCGTAGCCTTCATGGAC

R4：ACCTCGGGAATGGTCATGGC

F5：CTTGTCCAGGTCGTCGTCCGAG

R5：CTTGTCCAGGTCGTCGTCCGAG

以实施例1制得的基因组总DNA为模板，分别以F3(上游引物)和R3(下游引物)、F4(上游引物)和R4(下游引物)、F5(上游引物)和R5(下游引物)为引物，利用TaKaRa公司的Ex TaqTM试剂盒根据产品说明书进行进行PCR扩增；

所述PCR扩增体系如下：

基因组DNA 2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，Taq酶25μL，ddH₂O 19μL。

PCR条件为：95℃变性5min；95℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

凝胶电泳分别得到1000bp、1000bp、1500bp左右条带，割胶回收。将PCR产物分别与pTOPO-T载体连接转化进DH5α中，挑选阳性克隆子，送至上海生工测序，记做测序结果2。

根据测序结果2可得到MTSase和MTHase基因首尾碱基序列，以及目标载体pET-22b序列，借助引物设计软件CE Design V1.03设计无缝克隆多片段嵌合体引物F6和R6，F7和R7。黑体部分为酶切位点Nde I和Xho I。

F6：taagaaggagatataAGGGTCCCGGCATCCAC

R6：gtggtggtggtggtgTGCCTTTTCTCCATCCGCC

F7：taagaaggagatataATGACCCTCGTCAATGGCGG

R7：gtggtggtggtggtgGGATTTGACGATTGCCGCA

以实施例1制得的基因组总DNA为模板，分别以F6(上游引物)和R6(下游引物)，F7(上游引物)和R7(下游引物)为引物，利用TaKaRa公司的Ex TaqTM试剂盒根据产品说明书进行PCR扩增；

所述PCR扩增体系如下：

基因组DNA 2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，Taq酶25μL，ddH₂O 19μL。

PCR条件为：95℃变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2.5min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

凝胶电泳分别得到2300bp和1800bp左右条带，如图2、图3所示，与理论值相符，割胶回收。

实施例3：重组质粒的构建及转化

将纯化后的目的基因MTSase、MTHase产物分别和线性化后的载体pET-22b(+)/(Nde I、Xho I)连接，连接体系如表1所示，将连接产物转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，37℃200r/min培养1h，随后将转化细胞涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃恒温过夜培养，挑取单菌落并通过菌落PCR筛选得到阳性克隆子，送至上海生工测序，结果表明插入片段分别含有一个长2328bp(如SEQ ID NO:1所示)和1770bp(如SEQ ID NO:3所示)的开放阅读框(ORF)，分别编码由775和589个氨基酸编码的蛋白质。

表1：连接体系

实施例4：重组菌株的诱导表达

将重组菌株E.coli BL21(pET-22b-MTSase)和E.coli BL21(pET-22b-MTHase)按照质量百分比1％的接种量接种到50mL含浓度为100μg.mL^-1氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.8，加入IPTG诱导剂后，再转入22℃恒温振荡培养箱进行诱导表达。诱导12h后收集菌体5000r/min离心5min，加入10mL pH 6.47的磷酸盐缓冲液重悬菌体，进行超声破碎(功率300W、间歇时间6s、破碎时间4s、全程13min)，8000rpm离心10min收集上清液作为粗酶液。

所述LB液体培养基，每升组分如下：

蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0～7.4；

实施例5：Ni-NTA亲和层析纯化

取出保存在4℃冰箱的镍柱，用酒精重悬填料并在填料完全下沉后将柱内酒精全部放出。用5-10倍体积的Ni-Native-0缓冲液平衡填料，流速控制为1mL/min；加入实施例4所得粗酶液，保持流速1mL/min 30min，收集流出液；用Ni-Native-100缓冲液溶解目的蛋白，控制流速为1mL/min，并收集流出液；用Ni-Native-250缓冲液溶解目的蛋白，流速为1mL/min，收集流出液；加入5-10倍体积的Ni-Native-0缓冲液平衡柱子，并用体积百分比为30％的乙醇溶液保存填料，收集到的酶液样品进行SDS-PAGE分析，得到MTSase和MTHase的分子量分别为85000Da和65000Da。

实施例6：MTSase和MTHase酶活的测定

MTSase酶活测定：将麦芽五糖溶解于50m mol/L pH 5.5的磷酸-柠檬酸缓冲液中，配成质量浓度为20％的溶液，取100mL该溶液加入1mL MTSase酶液，50℃反应10min，100℃煮沸10min终止反应。待溶液冷却后，调节pH4.2，加入0.1mL糖化酶，50℃糖化24h，HPLC测定海藻糖的量。

MTSase酶活单位(U)定义：每1min转化麦芽五糖生成1m mol麦芽五糖基海藻糖所需要的酶量。

MTHase酶活测定：将麦芽五糖溶解于50m mol/L pH 5.5的磷酸-柠檬酸缓冲液中，配成质量浓度为20％的溶液，取100mL该溶液加入200U MTSase酶液，50℃反应5h，100℃煮沸10min终止反应。待溶液冷却后，调节pH5.5，加入1mL MTHase酶液，50℃反应10min，100℃煮沸10min终止反应，HPLC测定海藻糖的量。

MTSase酶活单位(U)定义：每1min水解麦芽五糖生成1m mol海藻糖所需要的酶量。

经测定，MTSase和MTHase的酶活分别为35.7U/mL和80.2U/mL。

实施例7：双酶法在海藻糖中的应用

将可溶性淀粉溶于50m mol/L的磷酸-柠檬酸缓冲液中，配成质量浓度为20％的淀粉溶液，80℃糊化10min，加入α-淀粉酶100U(g淀粉)-¹，50℃反应10min，120℃灭活α-淀粉酶，将MTSase和MTHase粗酶液加入到淀粉溶液中，在pH5.5的条件下60℃反应24h，海藻糖的转化率为82.5％。

本发明两种酶MTSase和MTHase与其他来源的双酶比较，具有较高的最适反应温度60℃，以及较低的最适pH5.5，更适用于工业化生产，以质量分数为20％的淀粉溶液为底物，双酶作用条件下反应24h，转化率可高达82.5％。

对比例：

本发明中麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)与专利文献CN103205475A(申请号201310128939.1)中实施例3-1制备的MTHase在本发明实施例6中所述的条件下反应，本发明中MTHase的酶活可高达80.2U/mL，高于专利文献CN103205475A(申请号201310128939.1)中所述MTHase的酶活72.5U/mL。

本发明中麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)与专利文献CN103205475A(申请号201310128939.1)中麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)共同作用于直链淀粉，在本发明实施例7的条件下反应，转化率仅为70.5％；本发明中MTSase与同样来源于该菌株的MTHase共同作用，转化率可高达82.5％。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 麦芽寡糖基海藻糖水解酶及其表达基因与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2328

<212> DNA

<213> Arthrobacter oxydans

<400> 1

atgagggtcc cggcatccac ctaccgactt cagatccgcc gcagcttcac cctgttcgac 60

gccgccgaca aggtcccgta cctcaaggac ctcggcgttg actgggtcta cctctcgccc 120

atcctcaccg cggagcaggg ctcggatcac ggctacgacg tgaccgaccc ctccgcggtg 180

gacccggagc ggggcggccc cgagggcctg ctggccctgt ccaaggctgc ccgcgagcac 240

ggcatgggtg tcctggtgga catcgtgccc aaccacgtgg gcgtagcgac gcccgtgcag 300

aacccctggt ggtggtccct gctgaaggaa gggcagggct cgccctacgc cgaagccttc 360

gacgtcgact gggacctggc aggcgggaag atccggctgc ccatgcttgg ctcggacgac 420

gacctggaca agcttgaaat caaggacggc gagctccgct actacgacca ccggttcccg 480

ctcgcttcgg gaagctactc ggagggcgac tccccccagg aagtgcacag ccggcagcac 540

tatgagctga tggactggcg ccgggcggac gccgaactga actaccggcg cttcttcgca 600

gtgaccacgt tggccgggat ccgggtggaa acccccaagg tcttcgagga agcacatgcc 660

gaggtgggcc gctggttcaa ggaaggcctg gtggacggcc tgcgggttga ccacccggac 720

ggcctggccg accccgccgg ctacctgcgc tggctgaagg acctcagcgg cggagcctac 780

gtcctggtgg aaaagatcct cgagccgggc gaaaccctgc cgcaggactt cgccaccgag 840

ggaaccaccg ggtacgacgc cctcgcggac gtggaccggg tgttcgtgga ccccgcaggc 900

cagcaggcgc tggacgagct cgacgcgaag cttcgcggct ccagcacccc cgcggactac 960

gcggagatga tcaggggcac caagcggatg atcgcggacg gcatcctgcg gtccgaggtc 1020

ctgcgcctgg cccgcctggt accggagtcc tatgggctgc cggtggagca ggcagcagat 1080

gccattgccg agatcatcgc tgccttcccg gtctaccgga cgtacctgcc caccggcgcc 1140

gagatcctca aggaagcgtg cgaatcagcg gcggcccacc ggcccgacct cgaggttgcc 1200

gtgggcaccc tgctgccgct gctccttgat cccgggaacc ccatcgcggt ccgcttccag 1260

cagacctcgg gaatggtcat ggccaagggc gtcgaggaca cggcgttcta ccgctacacc 1320

cgcctgggca ccctgacaga ggtgggggcc gaaccgacag agttctctgt ttccacggcc 1380

gagttccacc agcggatggc ccggcgccaa caggaacttc ccctgtccat gaccaccatg 1440

tccacgcatg acaccaagcg cagcgaggac gcccgggccc ggatctcggt catcgccgaa 1500

ctgccggagg agtgggcgga caccttggcc acgctccgcg gactcgcccc gattccggac 1560

ggcccctacg agaacctgct gtggcaggct gtggtggggg cttggcccgc aagcagggaa 1620

cgcctgcagg gctacgccga gaaggctgcc cgggaagccg gcaactccac cacctggacc 1680

agccccgacg aggacttcga atcctccgtc aaggccgcgg tggacgcagt gttcgacgac 1740

ggccgcgtca ccaaagcggt ggaggacttc gtggcacgga tcgattccta cgccgcgtcc 1800

aactccgtgt ccgccaagct ggtccagctg accatgcccg gcgtgccgga tgtttaccag 1860

ggcagcgagt tctgggaacg gtccctgacc gaccccgaca accggcggcc ggtggacttt 1920

gaagtccgcc ggcaggagct cgccaagctc gacgccggca ccctccccgc ggccggcacg 1980

gaacccagca agctcctggc cacgtcccgc gcgctccggc tccgccgcga ccggcccgaa 2040

ctgttccagg gctacagccc cgtgacagcc acgggcccgg cggcggatca cgtcctcgcg 2100

ttccaccgcg ggggtgacgg cgccctgggc gccctgaccc tggccacccg gcttcccgcc 2160

ggactcgcgg ccgacggcgg atggcgggac accgccgtcg agcttcccgt tgcggtgtgt 2220

gacgaactca ccggcaacgc ctacggaccc ggctccgttc cggtggccga ggtcctgggc 2280

acctaccccg tggcattgct cgtaccggcg gatggagaaa aggcatga 2328

<210> 2

<211> 775

<212> PRT

<213> Arthrobacter oxydans

<400> 2

Met Arg Val Pro Ala Ser Thr Tyr Arg Leu Gln Ile Arg Arg Ser Phe

1 5 10 15

Thr Leu Phe Asp Ala Ala Asp Lys Val Pro Tyr Leu Lys Asp Leu Gly

20 25 30

Val Asp Trp Val Tyr Leu Ser Pro Ile Leu Thr Ala Glu Gln Gly Ser

35 40 45

Asp His Gly Tyr Asp Val Thr Asp Pro Ser Ala Val Asp Pro Glu Arg

50 55 60

Gly Gly Pro Glu Gly Leu Leu Ala Leu Ser Lys Ala Ala Arg Glu His

65 70 75 80

Gly Met Gly Val Leu Val Asp Ile Val Pro Asn His Val Gly Val Ala

85 90 95

Thr Pro Val Gln Asn Pro Trp Trp Trp Ser Leu Leu Lys Glu Gly Gln

100 105 110

Gly Ser Pro Tyr Ala Glu Ala Phe Asp Val Asp Trp Asp Leu Ala Gly

115 120 125

Gly Lys Ile Arg Leu Pro Met Leu Gly Ser Asp Asp Asp Leu Asp Lys

130 135 140

Leu Glu Ile Lys Asp Gly Glu Leu Arg Tyr Tyr Asp His Arg Phe Pro

145 150 155 160

Leu Ala Ser Gly Ser Tyr Ser Glu Gly Asp Ser Pro Gln Glu Val His

165 170 175

Ser Arg Gln His Tyr Glu Leu Met Asp Trp Arg Arg Ala Asp Ala Glu

180 185 190

Leu Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala Val Thr Thr Leu Ala Gly Ile Arg

195 200 205

Val Glu Thr Pro Lys Val Phe Glu Glu Ala His Ala Glu Val Gly Arg

210 215 220

Trp Phe Lys Glu Gly Leu Val Asp Gly Leu Arg Val Asp His Pro Asp

225 230 235 240

Gly Leu Ala Asp Pro Ala Gly Tyr Leu Arg Trp Leu Lys Asp Leu Ser

245 250 255

Gly Gly Ala Tyr Val Leu Val Glu Lys Ile Leu Glu Pro Gly Glu Thr

260 265 270

Leu Pro Gln Asp Phe Ala Thr Glu Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu

275 280 285

Ala Asp Val Asp Arg Val Phe Val Asp Pro Ala Gly Gln Gln Ala Leu

290 295 300

Asp Glu Leu Asp Ala Lys Leu Arg Gly Ser Ser Thr Pro Ala Asp Tyr

305 310 315 320

Ala Glu Met Ile Arg Gly Thr Lys Arg Met Ile Ala Asp Gly Ile Leu

325 330 335

Arg Ser Glu Val Leu Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro Glu Ser Tyr Gly

340 345 350

Leu Pro Val Glu Gln Ala Ala Asp Ala Ile Ala Glu Ile Ile Ala Ala

355 360 365

Phe Pro Val Tyr Arg Thr Tyr Leu Pro Thr Gly Ala Glu Ile Leu Lys

370 375 380

Glu Ala Cys Glu Ser Ala Ala Ala His Arg Pro Asp Leu Glu Val Ala

385 390 395 400

Val Gly Thr Leu Leu Pro Leu Leu Leu Asp Pro Gly Asn Pro Ile Ala

405 410 415

Val Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met Val Met Ala Lys Gly Val Glu

420 425 430

Asp Thr Ala Phe Tyr Arg Tyr Thr Arg Leu Gly Thr Leu Thr Glu Val

435 440 445

Gly Ala Glu Pro Thr Glu Phe Ser Val Ser Thr Ala Glu Phe His Gln

450 455 460

Arg Met Ala Arg Arg Gln Gln Glu Leu Pro Leu Ser Met Thr Thr Met

465 470 475 480

Ser Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu Asp Ala Arg Ala Arg Ile Ser

485 490 495

Val Ile Ala Glu Leu Pro Glu Glu Trp Ala Asp Thr Leu Ala Thr Leu

500 505 510

Arg Gly Leu Ala Pro Ile Pro Asp Gly Pro Tyr Glu Asn Leu Leu Trp

515 520 525

Gln Ala Val Val Gly Ala Trp Pro Ala Ser Arg Glu Arg Leu Gln Gly

530 535 540

Tyr Ala Glu Lys Ala Ala Arg Glu Ala Gly Asn Ser Thr Thr Trp Thr

545 550 555 560

Ser Pro Asp Glu Asp Phe Glu Ser Ser Val Lys Ala Ala Val Asp Ala

565 570 575

Val Phe Asp Asp Gly Arg Val Thr Lys Ala Val Glu Asp Phe Val Ala

580 585 590

Arg Ile Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Asn Ser Val Ser Ala Lys Leu Val

595 600 605

Gln Leu Thr Met Pro Gly Val Pro Asp Val Tyr Gln Gly Ser Glu Phe

610 615 620

Trp Glu Arg Ser Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Arg Pro Val Asp Phe

625 630 635 640

Glu Val Arg Arg Gln Glu Leu Ala Lys Leu Asp Ala Gly Thr Leu Pro

645 650 655

Ala Ala Gly Thr Glu Pro Ser Lys Leu Leu Ala Thr Ser Arg Ala Leu

660 665 670

Arg Leu Arg Arg Asp Arg Pro Glu Leu Phe Gln Gly Tyr Ser Pro Val

675 680 685

Thr Ala Thr Gly Pro Ala Ala Asp His Val Leu Ala Phe His Arg Gly

690 695 700

Gly Asp Gly Ala Leu Gly Ala Leu Thr Leu Ala Thr Arg Leu Pro Ala

705 710 715 720

Gly Leu Ala Ala Asp Gly Gly Trp Arg Asp Thr Ala Val Glu Leu Pro

725 730 735

Val Ala Val Cys Asp Glu Leu Thr Gly Asn Ala Tyr Gly Pro Gly Ser

740 745 750

Val Pro Val Ala Glu Val Leu Gly Thr Tyr Pro Val Ala Leu Leu Val

755 760 765

Pro Ala Asp Gly Glu Lys Ala

770 775

<210> 3

<211> 1770

<212> DNA

<213> Arthrobacter oxydans

<400> 3

atgaccctcg tcaatggcgg gcccgagcgc ttcgacgtct gggctcccga cgctaaatcc 60

gtgatactgc tggccggcgg ccagcagtat cccatggagg aaaaggacac ggcgcctggc 120

tctgaaggct ggtggacagc cccggacgct ccgggtggcg gtgaggtgga ctacggctac 180

ctgctggacg gtgacagtca cccagttccc gatccgcggt cgcgccgcct gcccgccggc 240

gtccatgagc tctccaggac gttcgacccc gcagcccacg cctggcagga ctccggctgg 300

aagggcaagg agctgaaggg ttcggtaatc tacgaactcc acatcggcac cttcacccct 360

gagggaaccc ttgacgctgc agccgaaaag ctcggctacc ttgcggacct gggaatcgac 420

tttgtcgagc tgctcccggt caatggcttc aacgggaccc acaactgggg ctacgacggc 480

gtccagtggt acgcggtcca tgaaggctac ggcgggcctg cggcctacca gcgctttgtg 540

gatgctgccc acgccgccgg cctgggcgtc atccaggacg tggtgtacaa ccacctcggc 600

ccgagcggaa actacctgtc caagttcggc ccgtacctga aacaggggga tgccaacacc 660

tggggtgact ccgtgaacct ggacggtccc ggctccgacg tggtgcggga atacatcctg 720

gacaaccttg ccctctggct ccgggattac cacgtggacg gcctccgcct ggacgccgtg 780

cacgcgctga aggacgagcg cgccgtgcac atccttgagg agttcggggc cctgggcgac 840

gccgtctcgg cggagaccgg gctgccgaag accctgattg ccgagtcgga cctgaacaac 900

ccccgcctgc tttacccgcg ggacgtcaac gggtacgggc tggccgggca gtggagcgac 960

gacttccacc acgcggtcca cgtcagcgtc agcggcgaga ccaccgggta ctacgaggac 1020

ttccagtccc tggcggtgct ggcaaaggtc ctgaaggacg gcttcctgca cgacggcagc 1080

tactccagct tccgcggccg gcaccacggc cggcctatca atgcctcgct ggtgcaccct 1140

gcggcgctgg tggtctgcaa ccagaaccac gaccagatcg gcaaccgcgc cacgggggac 1200

aggctctcgc agtcgctgtc ccacgggcag ctggccgtgg ccgccgtgct caccctgacg 1260

tccccgttca cgcccatgct gttcatgggc gaggagtttg cggccagcac cccttggcag 1320

ttcttcacct cccacccgga gccggagctg ggcaaggcta ccgcggaagg ccggatcaag 1380

gagttcgagc gcatggggtg ggatcccgcc gtcgtgcccg acccccagga tccggaaacc 1440

ttccgccggt ccaagctgga ctggaacgag tcctcaggcg gggaccacgc acggctcctg 1500

gagctttacc gctccctcac ggcgctgcgc cgcgggcacc ccgagcttgc cgggctcggc 1560

ttcaccgaga cggacgtgac gttcgacgac gacgccggct ggccgcgttt ccgccgcgga 1620

agcgttgagg tactgctgaa cctctcagac gccaaggtgc ggctggagga cgtttccggg 1680

acggtgctgc ttgcaacgga cgagggaacc ggccttgacg gcgaggccct cgccctggcg 1740

ccctggagtg cggcaatcgt caaatcctga 1770

<210> 4

<211> 589

<212> PRT

<213> Arthrobacter oxydans

<400> 4

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1 5 10 15

Asp Ala Lys Ser Val Ile Leu Leu Ala Gly Gly Gln Gln Tyr Pro Met

20 25 30

Glu Glu Lys Asp Thr Ala Pro Gly Ser Glu Gly Trp Trp Thr Ala Pro

35 40 45

Asp Ala Pro Gly Gly Gly Glu Val Asp Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly

50 55 60

Asp Ser His Pro Val Pro Asp Pro Arg Ser Arg Arg Leu Pro Ala Gly

65 70 75 80

Val His Glu Leu Ser Arg Thr Phe Asp Pro Ala Ala His Ala Trp Gln

85 90 95

Asp Ser Gly Trp Lys Gly Lys Glu Leu Lys Gly Ser Val Ile Tyr Glu

100 105 110

Leu His Ile Gly Thr Phe Thr Pro Glu Gly Thr Leu Asp Ala Ala Ala

115 120 125

Glu Lys Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Leu Gly Ile Asp Phe Val Glu Leu

130 135 140

Leu Pro Val Asn Gly Phe Asn Gly Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly

145 150 155 160

Val Gln Trp Tyr Ala Val His Glu Gly Tyr Gly Gly Pro Ala Ala Tyr

165 170 175

Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln

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Asp Val Val Tyr Asn His Leu Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Ser Lys

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Asp Asn Leu Ala Leu Trp Leu Arg Asp Tyr His Val Asp Gly Leu Arg

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325 330 335

Tyr Tyr Glu Asp Phe Gln Ser Leu Ala Val Leu Ala Lys Val Leu Lys

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Asp Gly Phe Leu His Asp Gly Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Gly Arg His

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Val Cys Asn Gln Asn His Asp Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp

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Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr

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Phe Arg Arg Ser Lys Leu Asp Trp Asn Glu Ser Ser Gly Gly Asp His

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Leu Leu Asn Leu Ser Asp Ala Lys Val Arg Leu Glu Asp Val Ser Gly

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Thr Val Leu Leu Ala Thr Asp Glu Gly Thr Gly Leu Asp Gly Glu Ala

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Leu Ala Leu Ala Pro Trp Ser Ala Ala Ile Val Lys Ser

580 585