蛋白VvMas、编码基因及其在提高植物耐盐性中的应用的制作方法

本发明涉及一种植物耐盐性相关蛋白VvMas及其编码基因与应用，特别是来源于葡萄的耐盐性相关蛋白VvMas及其编码基因与应用。

背景技术：

世界上存在大面积的盐渍化的土地。据统计，全世界共有8亿hm²盐碱地，在灌溉地区还有占耕地面积33％的次生盐渍化土地，土壤的盐溃化严重影响现代农业的发展。就我国而言，在全国18亿亩耕地中有近十分之一的次生盐溃化土地，另外还有2000万hm²盐碱荒地。一般来说，盐浓度在0.2％-0.5％会影响作物的生长，但是盐碱地的盐分大都在0.6％-10％。大面积的盐渍化土地的存在严重影响了粮食生产，成为限制农业生产的主要因素。随着世界人口的剧增及可耕地面积的逐年下降，粮食生产安全受到了严重威胁，对于人均耕地面积相对较小的中国更是日益严重的问题。通过对植物耐盐机理的深入研究，培育耐盐作物新品种是利用盐碱地资源最经济、有效的措施之一。

植物的耐盐机理相当复杂，它涉及到生长发育、形态结构、生理特征以及代谢调节等诸多方面。当植物受到盐胁迫时，植物的形态、生理生化等方面都会发生一系列的变化，才能维持其生存。盐害抑制植物组织、器官的生长和分化，影响植物细胞膜结构，使细胞膜透性增大，降低光合速率，导致大量电解质和非电解质外渗，膜脂组分发生改变，膜蛋白的组分和活性受到影响，进而影响植物的生理代谢。因此植物在长期的进化及适应过程中，逐步形成了一系列抵御外界不良环境变化的机制。

植物在盐胁迫条件下，会采用一定的策略去阻止或减轻盐的危害，在长期的进化过程中，植物发展出了一系列的耐盐机制。随着分子生物学的迅速发展，植物耐盐生理生化机制日益明确，使得克隆与植物耐盐相关基因成为可能。加强植物耐盐生理的研究，探明植物在逆境下的生命活动规律并加以人为调控，培育具有抵抗不良环境性状的优良品种，以提高作物的产量和品质，对于获得农业高产稳产具有重要意义。

技术实现要素：

技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种植物耐盐性相关蛋白VvMas及其编码基因，还提供了上述蛋白的应用。

技术方案：本发明提供的与植物耐盐性相关蛋白，其名称为VvMas(α/β水解酶)，来源于葡萄(Vitis vinifera)是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

本发明还提供了编码蛋白VvMas的基因。

所述基因，与碳氮代谢相关蛋白，为如下(1)-(3)中任一所述的基因：

(1)其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物耐盐性相关蛋白的DNA分子；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性且编码植物耐盐性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列SEQ ID NO：1由1224个碱基组成，编码序列表中序列SEQ ID NO：2所示的蛋白。

本发明还提供了含有所述与植物耐盐性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

所述重组表达载体为将上述基因插入表达载体中即得。

具体地，所述重组载体是在载体pCBGUS的多克隆位点间插入所述编码基因得到的。

其中，所述载体pCBGUS是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA1301载体经过Hind III和EcoR I双酶切，回收载体大片段；

(2)将pBI 121载体经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的片段连接，即得载体pCBGUS。

所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI 121载体购自Clontech公司。

本发明还提供了扩增所述与植物耐盐性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对。

具体地，所述引物对序列如下：

GSP-1：5’-CTGAGACGAGTTGGGGTGGAA-3’

GSP-2：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

GSP-3：5’-GACTTGGCCTCCAGGTTGACCTTGA-3’

GSP-4：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3’

GSP-5：5’-ATGAAAGGCGTCTTTTCGGCGCCAG-3’

GSP-6：5’-TTACACAAGACATCTACTTTTCCAA-3’

本发明还提供了蛋白VvMas、其编码基因或其重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌在提高植物耐盐性中的应用；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物，即得。

具体地，权利要求1所述蛋白的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物；所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物优选拟南芥或水稻。

有益效果：本发明提供的VvMas基因所编码的蛋白可以提高植物的耐盐性，具有重要的应用价值，为提高葡萄耐盐性的研究提供重要的依据。

本发明的蛋白及其编码基因对培育耐盐性植物品种具有重要的应用价值，从而提高农作物产量具有重要意义，将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1本发明葡萄VvMas基因植物表达载体简图。

图2本发明VvMas转基因拟南芥植株的PCR检测结果图。

图3本发明VvMas转基因水稻植株的PCR检测结果图。

图4本发明VvMas转基因拟南芥植株的耐盐性盆栽鉴定图。

图5本发明VvMas转基因水稻植株的耐盐性离体鉴定图。

图6本发明VvMas转基因水稻植株的耐盐性水培鉴定图。

图7本发明VvMas转基因水稻植株的耐盐性盆栽鉴定图。

具体实施方式

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

葡萄(Vitis vinifera)品种PN40024，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)的种子经过2.5％(v/v)CaClO₂消毒后种植在黑土：蛭石：珍珠岩(1:1:1)的混合基质中，22℃，16h光照培养(16h光照，8h黑暗，冷光源)生长2周。

水稻(Oryza sativa)品种中花11号，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。克隆载体PMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。

本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》【Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989】。

下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【Sambook J,Frets EF,Mannsdes T et al.In:Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989】。

实施例1葡萄耐盐性相关的蛋白及其编码基因的获得

1.实验材料

将葡萄品种PN40024无菌苗展开叶叶片取下，液氮速冻，-80℃保存。

2.叶片总RNA提取和纯化

取PN40024无菌苗展开叶叶片约2.0g，在液氮中研磨成粉状，加入10mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒(Applygen Technologies Inc，Beijing)提取甘薯块根总RNA，试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit(QIAGEN，GmbH，Germany)从总RNA中纯化mRNA。最后，取1μL于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD260)和纯度(OD260/OD280)，提取的PN40024无菌苗叶片总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于葡萄VvMas蛋白cDNA全长的克隆。

3.VvMas蛋白cDNA的全长克隆

以本实验室获得的VvMas EST片段设计引物进行VvMas蛋白cDNA的全长克隆。

(1)3’-RACE

以PN40024cDNA为模板，用VvMas EST正向引物GSP-1和反向引物GSP-2进行PCR反应。引物序列如下：

GSP-1：5’-CTGAGACGAGTTGGGGTGGAA-3’

GSP-2：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

PCR得到的3’RACE片段，回收后连接pMD19-T载体(购自北京六合通经贸有限公司，产品目录号为D102A)进行TA克隆，以BcaBESTTM Sequencing Primers/M13Primers通用引物进行测序。

(2)5’-RACE

以PN40024cDNA为模板，用VvMas EST正向引物GSP-3和反向引物GSP-4进行PCR反应。引物序列如下：

GSP-3：5’-GACTTGGCCTCCAGGTTGACCTTGA-3’

GSP-4：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3’

PCR得到的5’RACE片段，回收后连接pMD19-T载体(购自北京六合通经贸有限公司，产品目录号为D102A)进行TA克隆，以BcaBESTTM Sequencing Primers/M13Primers通用引物进行测序。

(3)PCR扩增VvMas蛋白cDNA的编码区

利用DNAMAN 7.0软件拼接候选的葡萄VvMas蛋白cDNA序列。进一步设计正向引物GSP-5和反向引物GSP-6进行PCR扩增VvMas蛋白cDNA的编码区。引物序列如下：

GSP-5：5’-ATGAAAGGCGTCTTTTCGGCGCCAG-3’

GSP-6：5’-TTACACAAGACATCTACTTTTCCAA-3’

以PN40024叶片总RNA经Oligo(dT)反转录为模板，用高保真的FastPfu酶，进行PCR扩增，PCR条件为95℃1min，随后95℃20s，53℃20s和72℃1min，进行40个循环，最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1224bp长度的扩增片段。

综合上述步骤的结果，获得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO：1所示。序列表中序列SEQ ID NO：1由1224个碱基组成，自5’端第1位-第1224位碱基为其开放阅读框，编码具有序列表中序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列SEQ ID NO：2由407个氨基酸残基组成。将该基因命名为VvMas，将其编码的蛋白命名为VvMas。

实施例2 VvMas基因过表达载体的构建

将实施例1中测序鉴定正确的含有序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸的DNA片段用BamH I和Sac I进行双酶切，用1％琼脂糖凝胶回收DNA片段，通过T₄DNA连接酶将回收的VvMas基因片段与含有双35S启动子pYPx245质粒连接，酶切鉴定和序列分析测定获得了含有葡萄VvMas基因的重组质粒AH128。该表达载体还包含gusA报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因，载体如图1所示。

实施例3VvMas基因转化拟南芥

将实施例2构建的葡萄VvMas基因的植物表达载体pCAMBIA1301-VvMas用蘸花法转化拟南芥，具体方法如下：

1.农杆菌的准备

(1)将pCAMBIA1301-VvMas用电击法转化根癌农杆菌LBA4404菌株(Biovector Co.,LTD)，得到含有pCAMBIA1301-VvMas的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。

(2)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养20h。

(3)取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养约12h，测OD 600≈1.5。

(4)8000rpm，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀释至OD 600≈0.8。

2.拟南芥蘸花法转化

(1)将拟南芥的花薹浸入上述侵染液中，轻轻搅动约10s后取出，全部转化完毕后，用保鲜袋罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置，22℃避光培养，24h后去掉保鲜袋直立培养。

(2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。

(3)生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱储存待用。

经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。

实施例3 VvMas基因转水稻

将实施例2构建的葡萄VvMas基因的植物表达载体pCAMBIA1301-VvMas转化水稻，具体方法如下：

1.农杆菌的准备

(1)将pCAMBIA1301-VvMas用电击法转化根癌农杆菌EHA105菌株(Biovector Co.,LTD)，得到含有pCAMBIA1301-VvMas的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。

(2)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养20h。

(3)取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养约12h，测OD 600≈1.5。

(4)8000rpm，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀释至OD 600≈0.8。

2.水稻成熟胚愈伤的获取

(1)将成熟的水稻品种中花11号种子去掉颖壳，用70％酒精消毒1-2min；

(2)然后用20％的次氯酸钠浸泡30-40min，用无菌蒸馏水冲洗4遍，将种子转移到灭过菌的滤纸上吸干表面水分，然后接种在NB诱导培养基上；

(3)暗培养7-10d后，当盾片膨大，胚乳变软时，去掉胚和芽，把剥下的胚性愈伤转移到NB继代培养基上，大约3w继代一次，继代2-3次后就可以作为受体进行转化。

3.农秆菌介导转化水稻愈伤组织

(1)选取良好的胚性愈伤组织放于上述侵染液中，浸泡30min；

(2)将愈伤组织取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，然后置于NB共培养培养基上培养至刚有菌落出现(大约2-3d)；

(3)用无菌水振荡清洗3-4次，直至上清液完全清洁为止，用500mg/L头孢霉素溶液振荡清洗40min；

(4)取出愈伤组织，放入只带滤纸的无菌培养皿中0.4m/s风干4h，转入NB筛选培养基筛选两轮(每轮3-4w)；

(5)将抗性愈伤进行预分化2-3w，然后转移到分化培养基中光照培养2-3w；

(6)待幼芽长至约1cm时转入壮苗培养基培养30d左右；

(7)揭去封口膜炼苗培养一周左右，然后移栽到土中。

实施例4 VvMas基因转基因拟南芥植株PCR检测

1.转基因拟南芥种子的筛选

(1)称25-30mg种子放入1.5mL离心管；

(2)1mL 75％乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000rpm离心5s，去上清；

(3)加入1mL过滤后的漂白粉(2.5％)消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000rpm离心5s，去上清；

(4)无菌水洗涤3-4次；

(5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(潮霉素50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16h光照培养10天。

(6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T₁)培养至开花结实，收集T₁植株上所结T₂种子，进一步筛选得到T₃种子。

2.转基因拟南芥植株PCR检测

(1)试验方法

用CTAB法提取T₃拟南芥转基因植株和野生型植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的VvMas基因引物为：primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA-3’和primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2mL Eppendorf离心管中加入10×PCR buffer 2μL、4dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均为1μL、模板DNA(50ng/uL)2μL、Taq DNA聚合酶0.25μL，加ddH₂O至总体积20μL。反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，共35个循环。

(2)试验结果

电泳检测扩增结果见图2(图2中，泳道M为Maker；泳道W：水；泳道P：阳性对照(重组质粒pCAMBIA1301-VvMas)；泳道Col-0：野生型拟南芥植株；泳道#1-#5：为转化pCAMBIA1301-VvMas的拟南芥转基因植株)。从图中可见，转化pCAMBIA1301-VvMas的拟南芥拟转基因植株和阳性对照扩增出591bp的目标条带，表明VvMas基因已经整合到拟南芥的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型拟南芥植株没有扩增出591bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。

实施例5 VvMas基因转基因水稻植株PCR检测

(1)试验方法

用CTAB法提取T₂水稻转基因植株和野生型植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的VvMas基因引物为：primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA-3’和primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2mL Eppendorf离心管中加入10×PCR buffer 2μL、4dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均为1μL、模板DNA(50ng/uL)2μL、Taq DNA聚合酶0.25μL，加ddH₂O至总体积20μL。反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，共35个循环。

(2)试验结果

电泳检测扩增结果见图3(图3中，泳道M为Maker；泳道W：水；泳道P：阳性对照(重组质粒pCAMBIA1301-VvMas)；泳道WT：野生型水稻植株；泳道OE1-OE11：为转化pCAMBIA1301-VvMas的水稻转基因植株)。从图中可见，转化pCAMBIA1301-VvMas的水稻拟转基因植株和阳性对照扩增出591bp的目标条带，表明VvMas基因已经整合到水稻的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型水稻植株没有扩增出591bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。

实施例6 VvMas基因转基因拟南芥植株耐盐性鉴定

(1)试验方法

将转基因拟南芥和野生型种子在1/2MS培养基上培养2w后，将植株移栽到盆中培养2w后，进行盐胁迫处理。用含有300mM NaCl的1/2霍格兰营养液每个2d灌溉1次，每次200mL，处理4w，观察植株生长情况并照相、统计存活率。

(2)试验结果

结果显示，通过耐盐性盆栽鉴定，结果见图4，盐处理4w后，转基因植株的生长状态显著优于野生型植株，转基因植株的存活率显著高于野生性植株。表明过表达VvMas基因显著提高转基因拟南芥植株的耐盐性。

实施例7 VvMas基因转基因水稻植株耐盐性鉴定

1.转基因水稻植株生长势比较

(1)试验方法

将转基因水稻材料和野生型材料的种子消毒，种子播种在MS固体平板上，种子发芽2-3d后，选取发芽状态一致的种子，分别播种在MS和MS+NaCl(200mM)的不同中指管培养基上，苗生长7-10d之后，不同处理的苗长势开始出现差异，进行照相和生长势统计，包括苗长和鲜重数据。

(2)试验结果

结果显示，在盐胁迫处理条件下，结果见图5，转基因材料和野生型WT材料均因为盐胁迫条件的存在，植株变小；但是转基因材料和野生型WT相比，生长状态相对较好，生长势数据统计显示，转基因材料的的苗长和鲜重均优于野生型WT材料。

2.转基因水稻植株耐盐性水培鉴定

(1)试验方法

将纯合的T₂转基因水稻和野生型水稻种子接种在MS培养基上，生长大约3-4d。挑选长势一致的幼苗，移栽到96孔PCR板(其底部已经被剪掉)中，每隔1d更换一次营养液，避免苗根部长菌，正常生长4w后；将其转移到200mM NaCl霍格兰溶液中进行胁迫处理2w，观察其表型，进行照相并调查其存活率。

(2)试验结果

结果显示，在盐胁迫处理条件2w后，结果见图6，转基因材料与野生型材料相比，差异很明显，转基因材料的生长状态显著优于野生型材料，转基因植株的存活率显著高于野生性植株。表明过表达VvMas基因显著提高转基因水稻植株的耐盐性。

3.转基因水稻植株耐盐性盆栽鉴定

(1)试验方法

为了进一步验证转基因水稻材料的耐盐性，将纯合的T₂转基因水稻和野生型水稻种子表面消毒，用纯净水催芽，接种在MS培养基上，生长大约3-4d。挑选长势一致的幼苗，种植在以营养土：蛭石＝1:2的营养土中，注意每天浇水，等到植株长到4片真叶时开始进行盐胁迫处理。用含有200mM NaCl的1/2霍格兰营养液每个2d灌溉1次，每次200mL，处理2w，观察其表型，进行照相并调查其存活率。

(2)试验结果

图7结果显示在盐胁迫处理条件2w后，耐盐盆栽实验表明转基因材料与野生型材料相比，差异很明显，转基因材料的生长状态显著优于野生型材料，转基因植株的存活率显著高于野生性植株。表明过表达VvMas基因显著提高转基因水稻植株的耐盐性。

<110> 淮阴工学院

<120> 蛋白VvMas、编码基因及其在提高植物耐盐性中的应用

<130> 20161118002

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1224

<212> DNA

<213> Vitis vinifera

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1224)

<400> 1

atgaaaggcg tcttttcggc gccaggagat tacatccact tcaagtctca ggtccctctt 60

cacaagatcc ccattggcac aaagcagtgg cggtattatg attttggtcc aaaagtggtc 120

cctccactta tttgtcttcc tgggacagca ggaactgcag atgtctatta caaacagata 180

atgtcattgt ccataaaggg ttaccgggtg atctctgttg atattcctcg cgtatggaac 240

catcatgagt ggattcaagc atttgaaaag tttttggatg ctattgatgt gcaccatata 300

catctttatg gcacatccct tggaggcttc ctggcacaac tttttgctca gcatcgtcca 360

agacgggtta ggtcgttgat tctctcaaat tcatttttgg agacacgcag tttctcatct 420

gcaatgccat gggcccctat tgtcagttgg accccttctt ttttgctgaa gagatatgtc 480

ttaacgggaa ttccagatgg cccccatgaa ccatttattg cagattcagt agactttgtt 540

gtttcccagg ttgaaacact ctcaagagag gacttggcct ccaggttgac cttgactgtt 600

gatgctgctt ccattggacc tcttcttctc tcagattcat tcatcactct aatggataca 660

aatgactact gttcaattcc tcaacaactc aaagatcagc tgagtgaaag gtaccctgga 720

gcaaggcgag catacttaaa aactggaggt gatttcccat ttctttcacg ttcagatgaa 780

gtaaacctac atcttcagtt acacctgaga cgagttgggg tggaagcccg tccagatttg 840

gtcaagggta tctcaaagga tggtagtggt gggagttcta gtgaaaagaa tgatgaaaga 900

gaagattcag atgttcctcc taaggacaat gggggaagtc ctgaaagccc ttccactgaa 960

acccaattgc cagaggctcc agaaagttcg ggttctcata gcttagatga ccagctcctc 1020

agcaatgcaa aggtttgctt caccagtcct gaacatgtga ggcttcccat atctcatgca 1080

ttttttgaga aacagcaaga cattgtatcc acaaggtttg tccaaccggc ttgggagatt 1140

tttattcttt gtctgcttcc tctctatgtg gaaacaatgt acattacttg gattttttgt 1200

tggaaaagta gatgtcttgt gtaa 1224

<210> 2

<211> 407

<212> PRT

<213> Vitis vinifera

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(407)

<400> 2

Met Lys Gly Val Phe Ser Ala Pro Gly Asp Tyr Ile His Phe Lys Ser

1 5 10 15

Gln Val Pro Leu His Lys Ile Pro Ile Gly Thr Lys Gln Trp Arg Tyr

20 25 30

Tyr Asp Phe Gly Pro Lys Val Val Pro Pro Leu Ile Cys Leu Pro Gly

35 40 45

Thr Ala Gly Thr Ala Asp Val Tyr Tyr Lys Gln Ile Met Ser Leu Ser

50 55 60

Ile Lys Gly Tyr Arg Val Ile Ser Val Asp Ile Pro Arg Val Trp Asn

65 70 75 80

His His Glu Trp Ile Gln Ala Phe Glu Lys Phe Leu Asp Ala Ile Asp

85 90 95

Val His His Ile His Leu Tyr Gly Thr Ser Leu Gly Gly Phe Leu Ala

100 105 110

Gln Leu Phe Ala Gln His Arg Pro Arg Arg Val Arg Ser Leu Ile Leu

115 120 125

Ser Asn Ser Phe Leu Glu Thr Arg Ser Phe Ser Ser Ala Met Pro Trp

130 135 140

Ala Pro Ile Val Ser Trp Thr Pro Ser Phe Leu Leu Lys Arg Tyr Val

145 150 155 160

Leu Thr Gly Ile Pro Asp Gly Pro His Glu Pro Phe Ile Ala Asp Ser

165 170 175

Val Asp Phe Val Val Ser Gln Val Glu Thr Leu Ser Arg Glu Asp Leu

180 185 190

Ala Ser Arg Leu Thr Leu Thr Val Asp Ala Ala Ser Ile Gly Pro Leu

195 200 205

Leu Leu Ser Asp Ser Phe Ile Thr Leu Met Asp Thr Asn Asp Tyr Cys

210 215 220

Ser Ile Pro Gln Gln Leu Lys Asp Gln Leu Ser Glu Arg Tyr Pro Gly

225 230 235 240

Ala Arg Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Gly Gly Asp Phe Pro Phe Leu Ser

245 250 255

Arg Ser Asp Glu Val Asn Leu His Leu Gln Leu His Leu Arg Arg Val

260 265 270

Gly Val Glu Ala Arg Pro Asp Leu Val Lys Gly Ile Ser Lys Asp Gly

275 280 285

Ser Gly Gly Ser Ser Ser Glu Lys Asn Asp Glu Arg Glu Asp Ser Asp

290 295 300

Val Pro Pro Lys Asp Asn Gly Gly Ser Pro Glu Ser Pro Ser Thr Glu

305 310 315 320

Thr Gln Leu Pro Glu Ala Pro Glu Ser Ser Gly Ser His Ser Leu Asp

325 330 335

Asp Gln Leu Leu Ser Asn Ala Lys Val Cys Phe Thr Ser Pro Glu His

340 345 350

Val Arg Leu Pro Ile Ser His Ala Phe Phe Glu Lys Gln Gln Asp Ile

355 360 365

Val Ser Thr Arg Phe Val Gln Pro Ala Trp Glu Ile Phe Ile Leu Cys

370 375 380

Leu Leu Pro Leu Tyr Val Glu Thr Met Tyr Ile Thr Trp Ile Phe Cys

385 390 395 400

Trp Lys Ser Arg Cys Leu Val

405

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GSP-1

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<400> 3

ctgagacgag ttggggtgga a 21

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GSP-2

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<400> 4

gttttcccag tcacgac 17

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GSP-3

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<400> 5

gacttggcct ccaggttgac cttga 25

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GSP-4

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<400> 6

ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg 30

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GSP-5

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<400> 7

atgaaaggcg tcttttcggc gccag 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GSP-6

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<400> 8

ttacacaaga catctacttt tccaa 25