专利名称：植物抗逆性相关蛋白TaNAC67及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物抗逆相关蛋白TaNAC67及其编码基因与应用。
背景技术：
干旱缺水是全球农业生产面临的严重问题，也是制约我国粮食生产发展的重要因素。主要粮食作物小麦的栽培需要大量的水，我国平均每生产I吨小麦需水量约500-700m3。全世界发展中国家至少有6000万公顷小麦栽培在雨养耕地，但其产量水平只有灌溉条件下的10%-50%。所以，发展抗旱节水小麦品种，以提高作物的水分利用效率，既可增加产量，又可以缓解水资源短缺的矛盾。改良作物抗旱性对于提高农业生产力具有重大意义，受到世界各国的高度重视，近期我国启动的转基因作物新品种培育重大专项就是最好的实证。研究植物的抗旱机理、克隆抗旱相关基因、通过基因工程改良作物抗旱性是培育抗旱作物新品种的一条有效途径。虽然作物的抗旱性遗传基础复杂，克隆、转化抗旱基因获得抗旱性明显提高的新品种难度较大，但经众多科学家的共同努力，已经取得了一定的进步，涌现了不少成功的例子，如 Cheng 等(Wheat LEA genes, PMA80 and PMA1959, enhancedehydration tolerance oftransgenic rice (Oryza sativaL.), Molecular Breeding, 2002,10 71-82)把小麦的 LEA蛋白基因导入水稻，转基因植株的抗旱、耐盐性得到了明显提高；WU等(Over-expressionof an Arabidopsis δ-OAT gene enhances saltand drought tolerance intransgenicrice, Chinese Science Bulletin :2003，48 :2594_2600)将拟南芥的 δ-OAT 基因转入水稻中过量表达，转基因植株中脯氨酸含量明显增加，抗旱和耐盐性明显增强；Dubouzet等(OsDREB genes in rice,Oryza sativaL.，encode transcription activators thatfunction in drought-, high-salt-andcold-responsive gene expression, Plant J，2003,33 751-763)将水稻转录激活蛋白基因OsDREB导入拟南芥后，转基因植株表现了强抗旱、抗盐和耐寒特性。Hu等将OsNACl基因导入到水稻中，转基因后代的抗旱性得到明显增强，而且不影响后代产量(Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcriptionfactor enhancesdrought resistance and salt tolerance in rice, Hu 等 2006, ProcNatl Acad SciUSA, 10 :71_82)。目前，已克隆的抗旱相关基因主要包两大类，第一类为功能基因，这类基因包括低分子可溶性糖、氨基酸和小分子蛋白质等合成相关基因，以及保护细胞免受损害的酶类，如脯氨酸合成相关酶基因，包括吡咯啉-5-羧酸合成酶基因P5CS及PVAB2，吡咯琳-5-羧酸还原酶基因P5CR等；晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)，小麦LEA蛋白基因(The molecular basisof dehydration tolerance in plants, Ingram 等 1996, AnnuRev Plant Physiol PlantMol Biol,47 :377_403)。第二类是调节基因，包括各种参与水分胁迫信号传递的基因，主要包括(I)参与ΑΒΑ、乙烯等信号分子合成的关键酶类(Plant responses to water deficit,Brayl997, Trends in Plant Science, 2 :48_54) ； (2)蛋白憐酸酶，如蛋白质憐酸酶 2A 和 2C 等，它们参与 ABA 信号的传递(Disruption of a guard cell-expressedproteinphosphatase 2A regulatory subunit，RCNI, confers absci sicacidinsensitivityin Arabidopsis, Kwak 等 2002，Plant Cell，14 :2849_2861 ；TheArabidopsis ABSCISICACID-INSENSITIVE2(ABI2)and ABI lgenes encode homologousprotein phosphatases2C involved in abscisic acid aignal transduction， Leung等 1997，Plant Cell，9 :759_771 ;The ABIl and ABI2 protein phosphatase 2C act ina negative feedbackregulatory loop of the abscisi c acid signalling pathway,Merlot 等 2001， PlantJ，25 :295_303 ;Mutational analysis of protein phosphatase2C involved inabscisic acid signal transduction in higher plants， Sheen 1998，Proc Natl AcadSci USA，95 :975_980)。(4)蛋白磷酸激酶，植物蛋白激酶家族非常，主要包括分裂素激活蛋白激酶(MAPK) (Abscisic a ci d induces mitogen-activatedprotein kinaseactivation in barley aleurone protoplasts， Knetsch 等 1996，Plant Cell，8 :1061_1067)，f丐依赖的蛋白激酶(CDPK) (An abscisic acid-activatedandcalciumindependent protein kinasa from guard cells of fava bean,Li 等1996， Plant Cell，8 :2359_2368;CDPK-mediated signaling pathways:specificityandcross-talk，Sauer 等 2004，J Exp Bot，55 :181-188 ;Ca2+dependent protein kinaseandstress signal transduction in plant，Sheen 1996，Science，274 :1900-1902)和鹿糖非发酵相关蛋白激酶(SnRK) ο (3)转录因子(The Arabidopsis homeobox geneAtHB-7is induced by water deficit and by abscisic acid， Soderman 等 1996， Plant J，10:375-381)，如 DREB (Wang 等 2008， Plant Mol Bio，67 :589_602 ;Stress_inducibleDREB2A transcription factor from Pennisetum glaucum is aphosphoprotein and itsphosphorylation negatively regulates its DNA-bindingactivity， Agarwal 等 2007，Mol Genet Genomics，277 :189-198 ;GmDREB2，a soybeanDRE-binding transcriptionfactor, conferred drought and high-salt tolerance intransgenic plants，Chen 等2007， Biochem Biophys Res Commun，353 :299_305 ;Identification of cold-inducibledownstream genes of the ArabidopsisDREBlA/CBF3transcript ional factor us ingtwo micro-array systems，Maruyama 等 2004，Plant J，38 :982_993 ;0sDREB genes inrice, Oryza sativa L.，encodetranscription activators that function in drought~, high-salt-andcold-responsive gene expression, Dubouzet 等 2003，Plant J，33 :751_763)， NF-YB1 (Plant nuclear factor Y(NF-Y)B subunits confer droughttolerance and lead toimproved corn yields on water limited acres， Nelson 等2007,Proc Natl Acad SciUSA, 104 16450-16455),HD-ATART (Activated expression ofan ArabidopsisHD—START protein confers drought tolerance with improved rootsystem andreduced stomatal density, Yu 等 2008， Plant Cell，20 :1134_1151)， OsNACl(Overexpressing a NAMj ATAFj and CUC (NAC) transcription factor enhancesdroughtresistance and salt tolerance in rice，Hu等2006，Proc Natl Acad SciUSA，10 :71_82)
坐寸οNAC (NAM, ATAF和⑶C)转录因子是植物特有的转录因子超家族之一。该类转录因子N端为高度保守的DNA结合结构域，而其C端为变异非常大的转录激活结构域(Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativaand Arabidopsisthaliana, Ooka 等 2003，DNA Res，10 :239_247)。目前，在模式植物拟南芥和水稻中发现了 100多个家族成员(Systematic sequence analysisand identification oftissue—specific or stress-responsive genes of NACtranscription factor familyin rice，Fang等2008，Mol Genet Genomics，280 :547_563 ;Comprehensive analysisof NAC fami Iy genes in Oryza sativaand Arabidopsisthaliana， Ooka 等 2003， DNA Res，10 :239_247 ；Transcription factor families inArabidopsis:majorprogress and outstanding issues for future research， Qu 等2006, Curr Opin PlantBiol，9 :544_549)。许多证据表明，NAC转录因子在植物的生长发育过程中起着重要作用，如胚胎、花、次生壁形成，叶片衰老，根系生长等(The no apicalmeristem geneof Petunia is required for pattern format ion in embryos andflowers and isexpressed at meristem and primordia boundaries， Souer 等 1996，Cell，85 :159_170 ；NAC transcription factors NSTland NST3 regulate pod shatteringin a partiallyredundant manner by promoting secondary wall formation afterthe establishmentof tissue identity, Mitsuda 等 2008，Plant J, 56 :768_778 ； SNDlj a NAC domaintranscription factor,is a key regulator of secondary wallsynthesis in fibersof Arabidopsis，Zhong等2006，Plant Cell，18 :3158_3170 ;Two NACdomaintranscription factors, SNDland NSTlj function redundantly in regulationofsecondary wall synthesis in fibers of Arabidopsis， Zhong 等 2007， Planta，225，1603-1611 ;AtNAP，a NAC family transcription factor, has an important role inleafsenescence，Guo 等 2006，Plant J,46 :601_612 ；The Arabidopsis NACtranscriptionfactor VNI2 integrates abscisic acid signals into leafsenescence via the COR/RD genes，Yang 等 2011，Plant Cell，23 :2155_2168 ;SoybeanNAC transcription factorspromote abiotic stress tolerance and lateral rootformation in transgenicplants，Hao 等 2011，Plant J, 68 :302_313 ；AtNAC2,atranscription factor downstreamof ethylene and auxin signaling pathways, isinvolved in salt stress response andlateral root development，He 等 2005，Plant J，44 :903_916 ;TaNAC2，a NAC-type wheattranscription factor conferringenhanced multiple abiotic stress tolerances inArabidopsis，Mao等2012，J ExpBot，63 :2933_2946 ;Arabidopsis NACl transduces auxinsignal downstream of TIRlto promote lateral root development, Xie 等 2000，GenesDev,14 3024-3036)o近期，越来越多的证据表明，NAC转录因子参与对各种逆境和非生物逆境胁迫的应答，包括病害、干旱、高盐、冷害、缺氧等。在拟南芥中，人们发现ANAC019，ANAC055和ANAC072能够与ERDl基因的上游启动子结合，从而增强拟南芥的抗旱性(Isolationandfunctional analysis of Arabidopsis stress—inducible NAC transcriptionfactorsthat bind to a drought-responsive cis—element in the early responsivetodehydration stress lpromoter，Tran 等 2004，Plant Cell，16 :2481_2498)。AtAFl，AtAF2以及大麦中的同源基因HvNAC6在抗旱和抗病反应过程中具有负效应(The transcriptionfactor ATAF2 represses the expression ofpathogenesis-related genes inArabidopsis，Delessert 等 2005，Plant J, 43 :745_757 ；The HvNAC6transcriptionfactor:a positive regulator of penetrationresistance in barley andArabidopsis， Jensen 等 2007， Plan tMolBiol，65 :137_150 ;A novel drought-induciblegene,ATAFlj encodes a NAC family protein thatnegatively regulates the expressionof stress-responsive genes in Arabidopsis， Lu 等 2007， Plant Mol Biol,63 289-305) o在水稻中，过量表达SNACl/OsNACl能增强水稻的抗旱性(Overexpressinga NAMj ATAFj and CUC(NAC)transcriptionfactor enhances drought resistance andsalt tolerance in rice，Hu 等 2006，Proc Natl Acad SciU USA，103 :12987-12992)，而过量表达SNAC2/0sNAC6，0sNAC5，0sNAC045，0sNAC063转基因植物对多种非生物逆境的抗性(Characterization oftranscription factor gene SNAC2 conferring coldand salt tolerance in rice，Hu 等 2008，Plant Mol Biol，67 :169_181 ;Functionalanalysis of a NAC-typetranscription factor 0sNAC6 involved in abiotic andbiotic stress-responsivegene expression in rice， Nakashima 等 2007， Plant J，51:617_630 ；The abioticstress-responsive NAC-type transcription factor 0sNAC5regulatesstress-inducible genes and stress tolerance in rice， Takasaki 等 2010，
Mol GenetGenomics, 284 173, 183 ；Tolerance to various environmental stressesconferredby the salt-responsive rice gene 0NAC063 in transgenic Arabidopsis，Yokotani 等 2009，Planta，229 :1065-1075 ;0verexpression of a NAC transcriptionfactorenhances rice drought and salt tolerance， Zheng 等 2009， Biochem BiophysResCommun，379 :985_989)。过量表达大豆的NAC基因GmNAC20能增强拟南芥的耐盐性和耐冷性(Soybean NAC transcription factors promote abiotic stress toleranceandlateral root formation in transgenic plants， Hao 等，2011， Plant J，68 :302_313)。研究人员在小麦中发现TaGRABl和TaGRAB2能与颗粒病毒RepA蛋白结合，从而抑制病毒的复制(GRAB proteins, novel members of the NAC domainfamily, isolated bytheir interaction with a geminivirus protein， Xie 等 1999， PlantMol Biol,39 647-656)。Xia等(2010)发现，TaNAC4和TaNAC8参与对多种生物和非生物逆境的胁迫反应(Characterization of a novel wheat NAC transcriptionfactor gene involved indefense response against stripe rust pathogen infectionand abiotic stresses，Xia等2010，Mol Biol Rep，37，3703-3712 ;TaNAC8，a novelNAC transcription factor genein wheat, responds to stripe rust pathogeninfection and abiotic stresses,Xia等 2010，Physiol Mol Plant Pathol，74，394-402)。过量表达 TaNAC2 和 TaNAC69 能增强植物对多种逆境的抗性(TaNAC2，aNAC-type wheat transcription factor conferringenhanced multiple abioticstress tolerances in Arabidopsis，Mao等2012，J Exp Bot，63 :2933_2946 ；Overexpression of TaNAC69 leads to enhanced transcript levels ofstressup-regulated genes and dehydration tolerance in bread wheat， Xue 等 2011，MolPlant，4 :697_712)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的植物抗逆相关蛋白，来源于普通小麦(Triticum aestivum L.),为如下(a)或(b)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆相关的由(a)衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表I所示的标签。表I.标签的序列
标签残基序列
Poly-Arg5-6 (通常为 5 个) RRRRR
Poly-His2-10(通常为 6 个)~HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II 8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得至IJ。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列I的自5'端第93至986位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表I所示的标签的编码序列得到。上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的多态变异引起的，例如由获得蛋白质的生物的物种、个体等的差异导致；有的是由定点诱变、随机诱变等人工诱变处理弓I起。本发明所提供的编码基因为如下1)、2)、3)或4)的基因I)其核苷酸序列是序列表中序列I的自5 ^末端第93-986位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列I所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述抗逆相关蛋白的DNA分子;4)与I)或2)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述抗逆相关蛋白的DNA分子。上述严格条件是，在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用2X SSC，
O.1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。序列表中序列I由1098个脱氧核糖核苷酸组成，包括92bp的5' UTR、894bp的ORF区、112bp的3 ' UTR ;该基因的开放阅读框为894bp (序列表中序列I的自5 '端第93-986位核苷酸)，编码297个氨基酸(序列表中序列2所示)。
含有上述任一所述编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有本发明基因的重组表达载体。本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆植物的方法。本发明所提供的培育抗逆植物的方法，是将上述任一所述的编码基因导入目的植物中，培育得到抗逆植物。可以采用常规方法将所述编码基因导入目的植物中，例如基因枪法，高压电穿孔法，脂质体法，菌转化或转染等。本发明中的具体操作是，先将基因导入载体中，得到重组表达载体，再将重组表达载体导入农杆菌中，得到含有本发明基因的重组农杆菌，再通过农杆菌将基因导入目的植物中。
上述抗逆植物是抗干旱和/或抗高盐/耐低温的植物。本发明方法对单子叶植物或双子叶植物均可以，单子叶植物具体可为小麦，双子叶植物具体可为拟南芥。实验证明，将本发明基因导入植物中，可以促进转基因植物根系的生长。提高了植物的抗逆性，如抗旱性和/或抗盐性和/或耐冷性。在干旱条件下，转入本发明基因的植物的存活率为30-60%，而未转入本发明基因的野生型和转入空载体的对照植物的存活率只有5-8% ;在高盐胁迫条件下，植物的存活率可达35-65%，而未转入本发明基因的野生型植物的存活率只有25% ;在冷冻胁迫条件下，植物的存活率可达18-38%，而未转入本发明基因的野生型植物和空载体对照的存活率仅有8-13%。同时本发明基因对单子叶、双子叶植物均适用。因此，本发明基因及其应用对培育抗旱节水、抗盐、耐冷农作物新品种具有重要的意义，适合于推广应用。
图I为TaNAC67与来自不同植物NAC成员序列间的差异。图2为TaNAC67受水分胁迫、高盐、低温和ABA处理后的表达情况。图3为不同拟南芥株系中TaNAC67的相对表达量。图4为转基因拟南芥的抗旱、耐盐和耐冻性鉴定结果。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例I、小麦中抗逆相关蛋白的编码基因TaNAC67的分离一、抗逆相关蛋白的编码基因TaNAC67的分离I、构建小麦的全长cDNA文库,按照文献(用改进的Cap-trapper法构建拟斯卑尔脱山羊草全长cDNA文库，毛新国等2005，遗传学报，32 (8) :811_817)中所述方法进行，具体如下所述
(I)总RNA提取及mRNA纯化，用TRIZOL提取小麦(偃展I号，国家作物种质库)不同组织器官总RNA，用oligo (dT)纤维素分离纯化mRNA。(2)第一链cDNA的合成取IOug mRNA与引物I (表I)混合，变性后加入第一链cDNA合成的试剂，当温度升到40°C时,加入反转录酶，当反应进行到40分钟时加入引物II(第一链合成引物如表2所示)。为得到更多全长cDNA，在第一链合成时向反应体系中加入海藻糖和山犁糖醇；为限制poly(A)尾巴的长度，以便于大规模测序，用混合引物替代传统的单一引物oligo (dT) 18。反应结束后用CTAB-UREA法除去糖类，沉淀cDNA/RNA。表2.第一链cDNA合成引物
权利要求
1.一种蛋白，选自如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.权利要求I所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下I)或2)或3)或4)的基因 1)其核苷酸序列是序列表中序列I的自5^末端第93-986位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子； 2)其核苷酸序列是序列表中序列I所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述抗逆相关蛋白的DNA分子; 4)与I)或2)限定的DNA序列有94%以上同源性且编码所述抗逆相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
5.权利要求I所述的蛋白在培育抗逆性提高的植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述抗逆植物是抗干旱和/或耐盐和/或耐冷的植物。
7.一种培育抗逆植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物中，培育得到抗逆植物。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述编码基因是通过权利要求4所述的重组表达载体导入所述目的植物中的。
9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述抗逆植物是抗干旱和/或耐盐和/或耐冷的植物。
10.根据权利9所述的方法，其特征在于所述目的植物为小麦或拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用。本发明蛋白，选自如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆相关的由(a)衍生的蛋白质。实验证明，将本发明基因导入植物细胞中，可提高植物的抗逆性，如抗旱节水、抗盐或耐寒，因此，本发明基因及其应用对培育抗旱节水、抗盐或耐寒新品种具有重要的现实意义。
文档编号C12N15/82GK102924582SQ20121047788
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者毛新国, 景蕊莲, 李昂 申请人:中国农业科学院作物科学研究所