专利名称：一种植物抗病毒蛋白基因的克隆的制作方法
技术领域：
抗病毒蛋白是植物细胞中的一种重要的免疫组分，其重要作用就是拮抗植物感染 病毒的侵染，从植物组织和细胞中分离的抗病毒蛋白对于生物农药的应用具有重要作用。 本发明通过改进的DNA克隆技术和基因重组技术，将一种辣椒的抗病毒蛋白基因从辣椒 (Capsicum frutescens var)叶片中分离出来，该发明属于生物农药合成工程技术领域。
背景技术：
利用植物组织中已经合成的生物蛋白实现农药生产应用的绿色与环保是现代农 药生产与生物防治研究的重要研究课题。栽培植物及其农作物具有完备的防卫系统，能够 抵御来自于微生物的侵染和危害。植物个体自身的生化反应过程产生了许多拮抗病原菌的 化合物——各种蛋 白、多肽、酯类、酚类的生化小分子，这些生化物质构成了植物的防卫反 应系统。来自于植物自身的合成产物通常对人类和植物本身是没有危害的，也不会对人体 产生负面的影响，是环境友好型的环保产品。因此，植物化合物生产是生物防治和药物生产 的重要产业。病害的防治从无机化学农药、有机化学农药到生物农药的发展，农业科技人员开 展了大量深入而细致的研究。这些研究包括病毒致病过程、化学防治技术、植物抗病机制及 抗病品种培育等。随着分子病理学研究的深入，建立在现代分子生物学和植物基因工程技 术之上的抗病基因工程研究丰富了植物抗病研究的理论基础，推动了植物病害防治和生物 农药的发展。自从1986年诞生第一株抗病毒工程植株以来，植物抗病毒基因工程研究不论在 深度上还是广度上都取得了很大的发展。来自于番茄的病毒抗性基因Tm-2能够在植物组 织内获得植物免疫系统的启动和抗性形状的表达，有助于植物自身免疫系统的激发和有到 对病毒的抗病性。那么，基因工程的方法获得的基因产物及其表达的抗病毒蛋白，无论在理 论和实践上都具有及其重要的应用价值。
发明内容
本研究采用植物中存在的抗病毒蛋白基因进行重组抗病毒基因的克隆技术方法。 这种抗病毒蛋白对自身基因转录与蛋白的合成不起破坏作用，但能特异失活与其亲缘关系 较远的物种的核糖体功能，抑制蛋白质合成，使得浸染的病毒不能完成正常的侵染过程。大 量的研究结果表明，植物体中的抗病毒蛋白具有多种抑制病原微生物活性的特点。Tm-cf基 因是一种从辣椒(Capsicum frutescens var)中提取的DNA，其编码蛋白的产物是一种具有 侵染病毒抗性的抗病毒蛋白。实践证明，通过基因克隆和基因工程实施抗病毒蛋白分离和 合成，能有效地避免环境污染，为植物病害防治开拓了广阔的应用前景。本发明的目的是通过基因克隆技术和基因重组技术，从辣椒叶片中分离和克隆抗 病毒蛋白基因，期待在原核中生物体中表达具有功能的编码蛋白，获得无污染、有利于环境 和人类健康的抗病毒蛋白，应用于生物防治。
本发明应用DNA重组技术和分子生物学方法，从辣椒叶片中分离了一个长度为 2607bp的抗病毒蛋白基因Tm-cf，并在大肠杆菌中表达了这段目的基因。本发明的是由以 下技术方案实现的，1)分离了一种抗病毒蛋白基因；2)在大肠杆菌中重组和表达了该基 因。该基因片断的核苷酸序列为SEQ NO. 1所示的长度从ATG到TGA为2607bp。所述的长度为2607bp的抗病毒蛋白基因Tm-cf，其插入到克隆载体pMD_18中时， 获得了含有Tm-cf基因扩增片断的重组DNA质粒pMD-18 (cf)。质粒pMD_18 (cf)包含有长 度为2607bp的抗病毒蛋白基因Tm-cf。该质粒经转化大肠杆菌(E. coli)DH5 α获得克隆菌 株pMD/Tm-cf，其菌种将在近期获得并补充保藏号。本发明的技术特点一是从辣椒叶片中分离抗病毒基因；二是所分离的抗病毒蛋 白基因能够通过大肠杆菌表达；三是该基因克隆的方法是与基因重组技术相结合；四是该 基因经过重组可以获得生物农药。利用 CD-Search 月艮务 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/)来分析本 发明申请专利保护的抗病毒蛋白基因Tm-cf。发现Tm-cf基因具有如下结构特点1)基因 长度为2607bp ；2) N端的第289-300bp和第316_333bp处分别含有12和18个碱基的插入 (GCAATCTGTTGT 和 TGCATCCCTTCTTGTGCT) ；3)具有 CC-NBS-LRR 蛋白特征；4)拥有 15 个磷酸 化位点；5)具有ATP/GTP结合位点的基序A(P-Ioop)。
因此，以该基因保守序列为模版合成的或分离的其它植物蛋白，如果其基因结构 与SEQN0. 1的所述的核苷酸序列，则在具有专业知识的工程技术人员的操作下，经过一定 的和部分的核苷酸序列的修饰(突变、缺失、替代、剪贴、重复、倒位、易位、转座、重组和拼 接)以及一个或数个碱基(氨基酸)的改变，可以获得同类基因，并不能够显著地影响抗病 毒蛋白的功能。使用经过核苷酸序列的修饰以及一个或数个碱基改变的抗病毒蛋白基因， 并且具有与SEQ NO. 1的核苷酸序列70%以上相似序列都属于本专利的发明内容和保护范 围。
具体实施例方式本发明以几种重要的茄科病毒抗性基因的DNA序列设计扩增引物，对辣椒 (Capsicumfrutescens var)基因组DNA进行扩增，获得了一个抗病毒相关的基因。具体实 施方式如下1)采用Primer Premier 5. O软件设计N对引物。2)辣椒DNA的提取采用CTAB法提取，实施PCR基因扩增技术获得目标序列。PCR 程序为 95°C IOmin ；95°C 30S，53°C 30S，72°C 2. 5min，42 个循环；72°C延伸 lOmin。3)PCR产物回收后克隆至载体pMD-18中。双向测序验证并获得了长度为2607bp 的DNA扩增片断。4)采用Trizal法提取辣椒叶片的总RNA，DNase I处理纯化后，用UNT0-10柱式 mRNA抽提试剂盒获得mRNA，随后用MMLV第一链cDNA合成试剂盒获得反转录的cDNA，并利 用CAAdaptor建立cDNA文库，再以相同的引物实施PCR扩增。PCR产物回收后克隆到载体 pMD-18中，双向测序验证已经克隆的长度为2607bp的基因产物。5)利用DNAMAN 5. O进行辣椒同源基因的核苷酸序列序列比对和验证，利用NCBI 网站的⑶-Search服务来分析核苷酸序列的特异性。
SEQ NO. 1抗病毒蛋白基因的核苷酸序列序列表SEQ NO. 1<110> 姜国勇<120>—种植物抗病毒蛋白基因的克隆<140>专利申请号<141>2009-12-16<170>Patent In Version 2.1<210>1
<211>2607<212>DNA<213>pMD-18/Tm-cf<220><221>misc_feature<222>(1). · · (2607)<223>n = a 或 g 或 c 或 t<220><221>insertion<222>(289). . . (300)<220><221>insertion<222>(316). . . (333)<220><221>gene(Kan resistance)<222>(1). · · (2607)<311><400>(1). . . (2607)ATGGCTGAM TTCTTCTTAC ATCAGTCATC MTAMGCTG TAGATATAGC TGGAMTCGA 60CTCTTTCMG MGGMCGCA TTTGTATTCT TTGAMGATG ACATCGMTG GCTCCAGAGA 120GAMTGAGM GCATGTGAGC ATACATCGAT GACGCAMGG AAMGGCMC TGGAGGTGAC 180TCMGGGTGA AAMCTTGAT AAMCATATT CMGMCTGG CATGTGGTGC GGAGGATCTC 240TTAGATGAGT TTCTTCCAM MTTCMCM TCCMCMGT GCAMGGCGC MTCTGTTGT 300TGCCTTMGA CTGTTTGCAT CCCTTCTTGT GCTTCTTTTG CCMTGAGTT TTCTATGGAG 360ATCGAGMGA TAMGAAMG GGTTGTTGAC ATTCACCGTT TMGGACMC TTACMCATT 420GTAGATACM GTMCMCM TMTGATTGC ATTCCATTGG ACCGGAGMG ATTATTCCTT 480TATGCTGATG AMCAGAGGT CATCGGCTTG GATGATGACT TCMTATGCT ACMGCCAM 540TTACTTGATC CAGATTTGCC TTATGGAGTA GTTTCCATAG TTGGCATGCC CGGTCTGGGG 600MMCMCTC TTGCCMGM ACTCTATAGG CATGTCCGTG ATCMTTTGA GTGTTCGGGA 660CTGGTCTATG TGTCGCMCA ACCMGAGAG AGAGAMTCT TACTTGACAT ATCCAMCM 720GTTGGAGTGA CAGMGAGGA MGGAMGAT MCTTGGAGG ACMCCTAM ATCCCTATTG 780
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1.一种植物的抗病毒蛋白基因，其特征在于所述的抗病毒蛋白基因Tm-Cf的核苷酸 序列为SEQ NO. 1所示的2607bp。
2.一种含有抗病毒蛋白基因的重组质粒，并在大肠杆菌(E.Coli)DH5a获得克隆菌株 pMD/Tm-cf，该菌株含有克隆获得的抗病毒蛋白基因Tm-cf，该菌株拥有保藏号。
3.所述抗病毒基因具有CC-NBS-LRR蛋白特征；其长度为2607bp中的N端第289_300bp 和第316-333bp处分别含有12和18个碱基的插入，其核苷酸序列分别为GCAATCTGTTGT和 TGCATCCCTTCTTGTGCT。
4.一种植物的抗病毒蛋白基因的克隆技术和方法，其技术特征1)引物设计；2)CTAB 法DNA提取；3)载体克隆；4)反转录的cDNA验证；5)同源基因的核苷酸序列序列比对和验 证。
5.使用经过核苷酸序列的修饰以及一个或数个碱基改变的抗病毒蛋白基因，并且具有 与SEQ NO. 1的核苷酸序列70%以上相似序列都属于本专利的发明内容和保护范围。
全文摘要
本发明通过改进的DNA克隆技术和基因重组技术，将一种辣椒的抗病毒蛋白基因从辣椒(Capsicum frutescens var)叶片中分离出来，该发明属于生物农药合成工程技术领域。本发明克隆了一种抗病毒蛋白基因，并在大肠杆菌中表达了该基因。该基因片断的核苷酸序列为SEQ N0.1所示的长度从ATG到TGA为2607bp。该质粒经转化大肠杆菌(E.coli)DH5α获得克隆菌株pMD/Tm-cf，并获得保藏号。本发明的技术特点一是从辣椒叶片中分离抗病毒蛋白基因；二是通过大肠杆菌表达了抗病毒蛋白基因；三是该基因克隆的方法是基因重组克隆技术；四是该基因经过重组技术可以获得生物农药。
文档编号C12R1/19GK102102105SQ20091025566
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者姜国勇 申请人:姜国勇