专利名称：苹果抗逆相关基因MdSIMYB2的克隆及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种苹果抗逆相关基因MdSMYB2的克隆及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
植物一生中经常遭受各种不良环境和病虫害的侵袭，在长期的适应与进化过程中，植物形成了一系列防御反应机制，用来抵抗不良环境的伤害。其中，环境胁迫主要包括各种生物胁迫和非生物胁迫。生物胁迫主要来自昆虫、食草动物、植物病菌等；非生物胁迫种类众多，包括干旱、盐溃、极端温度、化学污染和氧损伤等胁迫。为了适应繁杂多变的环境，减少不利环境对机体的伤害，植物体内演化出了涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。其中，MdSIMYB2基因对非生物胁迫具有抵抗能力。
苹果是世界性果品，是温带地区的主要栽培树种。其适应能力较强，果品营养价值较高，耐贮性好，供应周期长，世界上很多国家都将其列为主要消费果品而大力支持。但是在苹果的生长发育过程中，许多非生物胁迫是影响苹果地理分布和产量提高的主要限制因子，尤其是高盐、干旱和低温等，世界苹果生产国都把选育抗盐、抗旱、抗寒等优质苹果新品种作为主要育种目标。由于苹果是多年生木本植物，遗传背景复杂、杂和度高、童期长、自交亲和性差等诸多问题给遗传育种带来了很大障碍，常规育种进展缓慢。近年来，苹果基因组的测序(Velasco等，2010)的完成、以及迅速发展的现代生物技术为解决这些问题开辟了新途径，通过基因工程技术有目的提高果树抗盐、抗旱、抗寒能力，成为果树遗传改良的重要研究方向，大量植物抗逆功能基因的分离和鉴定则为基因工程遗传改良提供了目的基因。MYB转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中扮演着非常重要的角色(刘蕾等，2008)。MYB基因在植株中的过量表达能够显著提高植物的抗非生物胁迫能力，在植物抗逆反应过程中，当植物收到外界环境胁迫时植物通过信号转导途径调控体内相关基因的表达，进而引发一系列生理、生化反应，降低或消除给植株带来的伤害。目前对MYB的研究主要集中在拟南芥、水稻，大豆上等少数模式植物上，而在果树方面研究较少。由于诸多方面的原因，可耕土地面积越来越少，再加上低温、干旱、土壤盐溃化和病、虫害导致果树的种植面积和范围受到严重影响。因此挖掘苹果MYB基因并进行功能研究，为果树抗逆转基因育种提供潜在的有效候选基因，不但具有重要的理论意义，而且具有广泛的应用价值。苹果转基因育种多在苹果砧木上进行，而苹果砧木主要生活在地下，不开花坐果，减少了基因工程在果树应用上的争议。随着人们对苹果品质的要求越来越高，品种的改良问题成为科研工作者的一项重要任务，因此苹果育种在世界各国果树研究工作中不断得到加强。但是，苹果为多年生木本植物，通过常规育种选育抗性品种周期长。
三、发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种苹果抗逆相关基因MdSMYB2的克隆方法及核苷酸序列，同时提供了该基因在获得抗逆，尤其是在抗旱、抗盐、抗低温的转基因番茄和苹果中的应用，并可应用于生产改良其他粮食作物或经济作物。本发明利用同源克隆和RACE技术从苹果嘎啦中获得了苹果新型抗逆境相关基因MdSMYB2，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。具体方法如下经NaCl处理24h的嘎啦苹果组培苗提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库中已发布的拟南芥中MYB基因家族的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)。将所得PCR产物与pMD18_T载体连接，转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，筛选重组子，并进行测序分析确认；再通过5' -RACE和3' -RACE技术分别获得5'和3'端序列，拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的3'和5'端序列设计特异引物，以嘎啦苹果组培苗的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长 序列。利用RACE方法克隆该基因得到1401bp,其开放阅读框(open readingframe, 0RF)为1095bp。该基因编码364个氨基酸，预测分子量约为39. IOkDa,等电点PI为8.17。将其氨基酸序列在NCBI中检索，发现与已公布的AtMYB5 (拟南芥，NM_112200. 2)、AtMYB17 (拟南芥，NM_115989. 3)、AtMYB25 (拟南芥，NM_129546. I)、PhPH4 (矮牵牛，AY973324. I)有较高的同源性，其氨基酸同源性分别为69. 23%,66. 35%,65. 38%,64. 42%。由此表明，经过上述克隆步骤得到了一个苹果中MYB基因，该基因与盐胁迫有关，又因我们已鉴定出MdSMYBl参与响应非生物胁迫(见专利201210197919. 5)，所以将该基因命名为MdSIMYB20该基因序列如下序列表(l)SEQ. ID. NO. I 的信息(a)序列特征长度140Ibp类型核酸拓扑结构线性(b)分析类型cDNA(C)假设否(d)反义否(e)最初来源苹果(Malus domestica)(f)序列描述SEQ. ID. NO. ITTTTTTTTTG AACACTGAAA AAGCTTTACA 固 AGGMCC CATCGTCTTC GTCGAAAGCA 60GCAGCAGCAG CAAGTGCTAA GATGCAAA0G A0GATAACAG CGCOGTCCTC GT0GAGCAAG 120GCGGCTGGGG TTGCTGGAGG GACCAAGA0G C0GTGTTG0G CAAAGGTGGG TTTGAAGAGA 180GGGCCTTGGA CTCCCGAAGA GGACGAGCTG CTGGCAAATT ACATCAAGAA AGAAGGGGAG 240GGACGGTGGC GGACCCTTCC CAAGOGGGCT GGGTTGCTCC GCTGCGGTAA GAGCTGCCGC 300CTCCGCTGGA TGAACTATCT CCGCCCTTCT GTCAAG0G0G GCCAGATOGC CCCCGATGAA 360
GAAGATCTTA TCCTTOGCCT CCATOGCCTT CTGGGCAATC GGTGGTCTTT GATAGCTGGG 420AGGATTCCAG GCCGTACGGA CAATGAGATA AAGAACTACT GGAACACACA CCTGAGCAAG 480AAGCTGATAA GCCAAGGCAT AGATCCCAGA ACCCACAAGC CTCTCAATTC AGATCATCAC 540TCTGCTGCTG ATGATGCTGA OGTGGACAAC ACAAACAAAT CAACTGCTGT TGCTTCTTCT 600TCCAAAGCCA ATGATOGGTT CTTAAACCCT AACCCTAGTC CCCCTTCTGA TCGTCTTGTC 660CATAAAGAAG GGGATCCAAA TAACAGCCGT AATGATGGAA ACATCGCAAT TGCTGATCAT 720GATCTGGGCA CTATAGTCCA TGGCTTTGCA AATATGATCA CGTCCATCAA CAATCCOGAT 780GCTTCTTCTT CGGCCGCGGC AAOGGGTACT TTGAGTTTGA GGAGCAACAA CAGCCAOGGT 840 GGAGTACTAC TTGGGGGAGG AGGAAATGAA GAGGACGAOG TCTTCTCTTC GTTTCTGAAT 900TCGTTGATCA ATGAGGATCC ATTTCCTGGA CAACACCAAT TGCAACAAGT ACTGCAGAAT 960GGGAATGTTA GTGCACAOGC AGCTGCTGCT CGTTCCGAGA ACCTTCCTTT GATTACTATG 1020ACTAGTACTA CGGOGCCATC AACATTTGGC TGGGAGTCTG COGTGCTCAT GTCTTCTGCT 1080TTCATCCAAA ATGATCACCA GAGCGTTAAT GAT CAAACGG AGj~n CAGCT AGCCACCTGT 1140TTGATTGATC AGTOGCACTG TGCATGTTGA ACAAGCAATG CGGTTGCTTA ATTAGTTAAT 1200TTATATGTAG AAATTAGTCC TAGCTAGGGT TTGAAATATC ATATGAAATG TGATTTTGTG 1260TGCTATCTCT ATTCTTAATT ATTCGACTAC CCCAACATOG CTCTAOGAAT GGGGGCGTAT 1320ATCAATGTAT TGTOGATCAC GTTTGTAATA TCATCTATCT ATCTATATAT GTTACCGGTA 1380TTGTAAAACA AACATAAAAA A1401说明透明方框中的M表示起始密码子，而黄色方框内的画I表示终止密码子。(2 ) SEQ. ID. NO. 2 的信息(a)序列特征编码区长度364个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性(b)分析类型蛋白质(c)序列描述SEQ. ID. NO. 2MET Arg Asn Pro Ser Ser Ser Ser Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ser51015Ala Lys MET Gln Thr Thr lie Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Lys202530Ala Ala Gly Val Ala Gly Gly Thr Lys Thr Pro Cys Cys Ala Lys354045Val Gly Leu Lys Arg Gly Pro Trp Thr Pro Glu Glu Asp Glu Leu505560Leu Ala Asn Tyr lie Lys Lys Glu Gly Glu Gly Arg Trp Arg Thr657075Leu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg
80 8590Leu Arg Trp MET AsnTyr Leu Arg Pro Ser ValLys Arg Gly Gln95 100105He Ala Pro Asp GluGlu Asp Leu He Leu ArgLeu His Arg Leu110 115120Leu Gly Asn Arg TrpSer Leu He Ala Gly ArgHe Pro Gly Arg125 130135Thr Asp Asn Glu HeLys Asn Tyr Trp Asn ThrHis Leu Ser Lys 140 145150Lys Leu He Ser GlnGly He Asp Pro Arg ThrHis Lys Pro Leu155 160165Asn Ser Asp His HisSer Ala Ala Asp Asp AlaAsp Val Asp Asn170 175180Thr Asn Lys Ser ThrAla Val Ala Ser Ser SerLys Ala Asn Asp185 190195Arg Phe Leu Asn ProAsn Pro Ser Pro Pro SerAsp Arg Leu Val200 205210His Lys Glu Gly AspPro Asn Asn Ser Arg AsnAsp Gly Asn He215 220225Ala He Ala Asp HisAsp Leu Gly Thr He ValHis Gly Phe Ala230 235240Asn MET He Thr SerHe Asn Asn Pro Asp AlaSer Ser Ser Ala245 250255Ala Ala Thr Gly ThrLeu Ser Leu Arg Ser AsnAsn Ser His Gly260 265270Gly Val Leu Leu GlyGly Gly Gly Asn Glu GluAsp Asp Val Phe275 280285Ser Ser Phe Leu AsnSer Leu He Asn Glu AspPro Phe Pro Gly290 295300Gln His Gln Leu GlnGln Val Leu Gln Asn GlyAsn Val Ser Ala305 310315His Ala Ala Ala AlaArg Ser Glu Asn Leu ProLeu He Thr MET320 325330Thr Ser Thr Thr AlaPro Ser Thr Phe Gly TrpGlu Ser Ala Val335 340345Leu MET Ser Ser AlaPhe He Gln Asn Asp HisGln Ser Val Asn350 355360Asp Gln Thr Glu364
本发明提供了苹果非生物逆境相关基因MdSMYB2在番茄、苹果和其它植物中应用的方法，能够提高转基因植物抵抗干旱、低温和盐等逆境的能力。步骤为(a)利用如上所述的MdSMYB2基因，将cDNA序列置于花椰菜病毒CaMV35S启动子之下，构建植物过量表达载体。(b)用农杆菌(LBA4404)介导法将构建好的表达载体导入植物细胞，获得转基因植株。本发明涉及一种植物表达载体，包含核苷酸序列SEQ. ID. NO. I，用于提高植物抗逆境能力，尤其是抗干旱、低温和盐的能力。本发明涉及将上述植物表达载体导入植物细胞中，导入方法是本领域人员熟知的 农杆菌(LBA4404)介导法，得到抗干旱、盐和低温的转基因植物。草本植物番茄SNl是基因工程研究的模式植物之一，具有生活周期短、再生能力强、遗传转化效率高的特点，而木本植物苹果生活周期长，遗传转化效率低，因而在下述实施例中以番茄和苹果两类植物为例对本发明进行详细说明，但本发明中MdSIMYB2基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它提高抗逆境能力的转基因植物。本发明采用离体叶片接种法对获得的转基因番茄纯合体和苹果进行抗逆能力分析发现，转基因番茄和苹果中MdSIMYB2的过量表达株系，均能显著提高其抗干旱、低温和盐的能力。可把该基因转入桃树、梨树、杨树等木本植物、或小麦、玉米、水稻等农作物上，从而提高转基因植株的抗逆境能力，产生重大的经济效益和社会价值。本发明从苹果中分离到一个R2R3类型的MYB家族基因MdSMYB2，通过转基因功能验证表明它能够抵抗高盐，低温，干旱等非生物逆境；并提供了一种新的、快速的育种途径，尤其是在转基因苹果砧木中，MdSIMYB2基因的发掘不仅能为苹果抗逆基因工程提供新的候选基因，丰富植物抗逆基因工程理论体系，而且对于培育其它植物的抗逆种质材料(包括一年生植物和多年生木本植物)也具有重要的现实意义。四
图I :苹果中MdSIMYB2蛋白结构保守域示意图及不同R2R3类型的MYB家族植物的氨基酸序列的同源性比较。A.苹果的MdSIMYB2蛋白结构保守域示意图；B.不同R2R3类型的MYB家族植物的氨基酸序列的同源性比较。其中，AtMYB5(NM_l 12200. 2)、AtMYB17 (NM_115989. 3) ,AtMYB108(NM_111525. 3)、PhPH4 (AY973324. I), R2、R3分别表示MYB家族基因的特征结构域。图2 :苹果中MdSMYB2蛋白的进化树分析。其中，白花紫露草TfMYB6 (AY456184. I)，棉花 GhMYBl (L04497. I),毛果杨PtMYB180(XM_002327312. I) ,PtMYBlll (XM_002302716. I),拟南芥 AtMYB5 (NM_112200. 2)、AtMYB17 (NM_115989. 3)、AtMYB108(NM_111525. 3)，矮牵牛 PhPH4 (AY973324. I),大豆 GmW2 (AB597932. I)，水稻 0sMYB4 (D88620. I)，车前草 CpMYBlO (AF510112. I)，百脉根 LjTT2a (AB300033. 2)，大麦 HvMYB2 (X70876. I)，红皮云杉 PgMYB5 (EF601068. I)，大豆GmMYB54 (DQ822881. I)，蛇麻草 HlMYBl (AB292244. I)。图3 :嘎啦组培苗中MdSMYB2基因对非生物逆境的响应。BI B4.分别用干旱(2%PEG) ,NaCl (200mM)、低温(4°C ) >ABA (100 u M)处理嘎啦苹果组培苗0h、6h、12h、24h、48h后，MdSIMYB2基因的相对表达量。
图4 :逆境处理后的MdSMYB2转基因番茄苗生长状况。A、野生型番茄和转基因番茄株系的半定量RT-PCR检测；B1、正常管理条件下培养6周番茄生长情况；B2.生长量一致的6周番茄苗，连续IOd不浇水做干旱处理的生长情况；B3.生长量一致的6周番茄苗，经300mM NaCl处理12d后的生长情况；B4.生长量一致的6周番茄苗，4°C低温处理4d后的生长情况。其中，WT :对照；0E-1，0E-3，0E-4 :过量表达的转基因株系。图5 :逆境处理后的MdSMYB2转基因苹果幼苗生长情况。A、野生型苹果和转基因苹果株系(MdSMYB2基因过量表达)的半定量RT-PCR检测；其中，WT :对照；T1-T4 :过量表达的转基因株系。B、生长6个月且长势一致的嘎啦苹果生根苗和MdSMYB2过量表达生根苗，经不同逆境处理后的生长情况。BI :连续15d不浇水进行干旱处理的情况；B2 :干旱处理后复水处理3d后生长情况；C1 :经300mM NaCl处理，生长至14d的生长情况；C2 :经300mM NaCl处理后，恢复生长至16d的生长情况；D1:4°C低温条件培养16d后的生长情况；D2 :4°C低温条件培养后置正常环境25d后的生长情况。其中，WT :对照；T-1，Τ-2，Τ-4 :过量表达的转基因株系。五、具体实例方式以下结合具体实例，对本发明进行详细说明。实例I :苹果MdSIMYB2基因的克隆。一、RNA的提取及反转录取经200mM NaCl盐处理24h的嘎啦苹果组培苗叶片，提取其RNA并反转录一)利用天根试剂盒RNAplant Plus Reagment提取总RNA,具体方法如下I)取Ig冷冻的研磨过的苹果叶片，加入5ml提取试剂(4°C )，振荡混匀。2)室温放置5分钟。3) 40C 12，OOOrpm离心I分钟，上清转入新的无RNase离心管。4)每IOml上清加2ml5M NaCl,温和混匀。5)每IOml上清加6ml氯仿，上下颠倒混匀。6)40C 10, 000离心15分钟，取上层水相转入新的无RNase离心管。7)加入异丙醇(与所得水相等体积)，混匀，室温放置10分钟。8)4。。10，000 离心 15 分钟。弃上清，加 5_10ml75% 乙醇。9) 40C 5, OOOrpm离心5分钟。弃上清，室温晾干3-5分钟。10)加入100 μ I无RNase水，混匀，充分溶解RNA。得到RNA, _80°C保存备用，或立即进行以下反转录实验。二)反转录cDNA第一链的合成I)在O. 2ml的微量离心管中配制下列混合液(其RNA为实例I步骤一)提取获得的；如用_80°C储藏RNA，须在冰上缓慢融解)
权利要求
1.一种苹果MdSMYB2基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。
2.根据权利要求I所述的一种苹果MdSIMYB2基因，其特征在于该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.如权利要求I所述的一种苹果MdSIMYB2基因在转基因番茄中的应用，能提高转基因番茄抗干旱、抗盐和抗低温能力。
4.如权利要求I所述的苹果MdSIMYB2基因在苹果中的应用，能提高转基因苹果抗干旱、抗盐和抗低温的能力。
全文摘要
本发明涉及一种苹果抗逆相关基因MdSIMYB2的克隆及其应用；本发明利用同源克隆和RACE技术从苹果嘎啦中获得了苹果新型抗逆境相关基因MdSIMYB2，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。将该基因转入番茄，转基因番茄株系抗旱、抗盐和抗冷等逆境能力提高；该MdSIMYB2基因在苹果中过量表达能提高转基因苹果的表达水平，同时增强转基因苹果株系的抗旱、抗盐和抗冷等逆境能力。
文档编号C12N15/29GK102978218SQ20121057925
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者郝玉金, 由春香, 曹忠慧, 王荣凯 申请人:山东农业大学