一种克隆牦牛eVEGF120基因编码区全序列的方法
【专利摘要】本发明公开了一种克隆牦牛eVEGF120基因编码区全序列的方法，通过从牦牛的肝组织中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA，通过设计的特定引物，以cDNA为模板扩增eVEGF120基因合成目的基因片段，将目的基因片段与载体连接，挑取阳性菌落进行测序直接获取eVEGF120基因片段全序列。与传统方法相比，本发明的方法具有目的片段长度明确，实验工作量小、成本低的特点。
【专利说明】—种克隆牦牛eVEGF120基因编码区全序列的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及克隆耗牛eVEGF120 (vascular endothelial growth factorl20)基因编码区全序列的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]VEGF(血管内皮生长因子)由Ferrara等首次在牛垂体滤泡细胞中发现。其主要通过与血管内皮细胞表面特异性受体结合发挥生物学功能。VEGF与其受体结合后，能引起受体的自身磷酸化，经过一系列的调节，引起内皮细胞分裂、增生。
[0003]已有的研究发现，VEGF及其家族成员广泛存在于人和动物体内的多种器官，VEGF在机体适应低氧环境的过程中发挥重要作用，低氧环境能刺激VEGF及其受体在人和动物的内皮细胞和组织细胞中表达并发挥生物学功能。VEGF基因在低氧条件下能增加人脑部血管的通透性，并且参与高原脑水肿的病理过程。
[0004]人的VEGF基因由8个外显子和7个内含子组成，外显子的选择性剪接形成4个不同的异构体(VEGF120，VEGF165, VEGF189, VEGF206)。与其他亚型相比，VEGF120缺乏第6和第7外显子的编码产物。VEGF第6外显子编码的蛋白对肝素具有较高的亲和力，因此VEGF120在胞外呈游离状态。低氧条件下，VEGF亚型表达水平可能与骨骼肌生理结构的差异有关；不同动物骨骼肌中VEGF亚型表达模式可能存在差异，不同VEGF亚型对低氧的敏感性不同。目前对于VEGF的研究都集中在VEGF165上，而对于VEGF120的研究很少。
[0005]同时，对于如何有效地得到eVEGF120基因编码区全序列本领域研究甚少，传统的方法，例如分段PCR克隆法或cDNA末端快速扩增法在eVEGF120上也存在诸多缺陷。前者需要把基因分成若干段分别克隆，分成几段就需做几次亚克隆，然后再进行序列拼接，造成工作量大，成本高，且有序列碱基错读的可能；后者必须已知一段基因的cDNA片段，然后往两端延伸扩增从而获得完整的cDNA全序列，这种方法具有盲目性，扩增的PCR产物长度不明确,而且对实验技术要求高,工作量大,造成实验成本高。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种克隆方法，能够简单、快捷的获取牦牛eVEGF120基因的完整编码区序列，本发明公开的方法具有目的片段长度明确，实验工作量小，实验成本小的特点。
[0007]在本发明中，所针对的牦牛eVEGF120基因序列，具体的序列可参考序列SEQUENCELISTING 所示。
[0008]本发明所公开的克隆方法，具体是通过下述技术方案实现的:
[0009]一种克隆牦牛eVEGF120基因编码区全序列的方法，包括下述步骤:
[0010]I)从牦牛肝组织中 提取总RNA，将总RNA反转录成cDNA ；
[0011]2)以步骤I)的cDNA作为模板，采用下述引物进行PCR:
[0012]上游引物Pl:5 ‘-ATGAACTTTCTGCTCTCTTGGGTACA-3’ ；[0013]下游引物P2:5 ‘-TGGGTAGTTCTGTGTCAGTCTTTCC-3’ ；
[0014]3)回收和纯化上述PCR产物，获得目的基因片段；
[0015]4)将上述PCR获得的目的基因片段与pMD-19T载体连接加入到DH5a感受态细胞中进行转化培养，筛选其中的阳性菌落进行培养，以菌液为模板进行PCR即得eVEGF120基因片段全序列。
[0016]其中，上述所用的PCR引物是根据普通牛eVEGF120基因序列所设计的。
[0017]在本发明中，克隆牦牛eVEGF120基因编码区全序列的组织优选采用牦牛的肝脏组织提取总RNA，具体的提取方法如下所述:
[0018]将牦牛的肝脏组织于液氮环境下研磨成粉末，然后依次加入Trizol液、氯仿，室温静置后高速离心；取离心的上清液与异丙醇混匀后高速离心；取离心沉淀物用乙醇漂洗杂质后进行离心，离心的沉淀物变色后加入DEPC水用琼脂糖凝胶电泳检测，将合格的RNA反转录成cDNA。
[0019]在上述中，所用的词汇“高速离心、离心”是根据所用离心机的性能来描述的，一般来说高速离心的设定为不低于lOOOOg，通过提高离心速度有利于降低离心时间；通常的离心设定为不高于10000g，或更低，例如8000g。
[0020]在上述中，室温采用生物学上常用的室温环境，一般为15°C ;离心在4°C下进行。
[0021]在本发明中，步骤2)采用梯度PCR，温度的梯度范围在55°C到65°C之间。
[0022]上述PCR过程采用梯度PCR仪进行，在所给定的温度范围内设置多种退火温度条件(12种温度梯度或8种温度梯度，优选为8种)选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。
[0023]在本发明中，为了提高回收和纯化速度，步骤3)采用纯化回收试剂盒回收PCR产物。
[0024]市场上已有多种此类试剂盒在销售，具体的操作方法按照其说明书即可。
[0025]在本发明中，目的基因片段与pMD-19T的连接参照pMD_19T载体试剂盒使用说明书操作即可，市场上有多家供应商供应成熟稳定的PMD-19T载体试剂盒。
[0026]在本发明中，DH5 a感受态细胞既可以从试剂公司购买，也可以采用本领域常见方法，例如氯化钙法制备。
[0027]在本发明中，还包括将步骤4)所得eVEGF120基因片段全序列进行同源性比对的步骤，用来验证所得序列的准确性。
[0028]通过上述技术改进，本发明的方法能得到长短明确的目的PCR片段，整个克隆过程工作量小，成本低，效率高，可以简单、快捷的获取牦牛eVEGF120基因的完整编码区序列。
【具体实施方式】
[0029]本发明的克隆方法，具体步骤如下:
[0030]步骤1:提取牦牛肝组织中的总RNA (核糖核酸)，然后将总RNA反转录成cDNA ；
[0031]a.组织的采集:选取2周岁的牦牛，颈动脉放血后立即取约Ig肝脏组织放入液氮te中用于提取总RNA。
[0032] b.RNA的制备及cDNA的合成:取IOOmg牦牛肝组织，在液氮中磨成粉末装入1.5ml的EP管，加入1ml的Trizol液，用震荡仪震荡约30秒，室温放置5分钟；加入0.2ml的氯仿，剧烈振荡混匀15s后，室温放置15分钟，4°C下12000g离心15分钟；离心结束后，吸取该EP管中上层水相大约0.3ml移至另一新的离心管，加入0.3ml的异丙醇混匀，室温放置10分钟，4°C下12000g离心10分钟；弃去上清液，加入1ml的75%乙醇漂洗RNA中混合的杂质，4°C下8000g离心5分钟；弃去上清液，室温晾干10分钟，等EP管底部RNA沉淀变色后，加入50ul的DEPC水。
[0033]用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，效果好的RNA可以进行下一步试验。
[0034]步骤2:引物的设计及PCR反应；
[0035]依据普通牛eVEGF120基因的序列(登录号为⑶362063)设计引物，设计的引物为:
[0036]上游引物Pl:5 ‘-TGATGACGGACCAGCAGG-3’
[0037]下游引物P2:5 ‘ -CTTCTTACTGCACGCCCTC-3，。
[0038]以cDNA为模板进行梯度PCR扩增eVEGF120基因，温度范围在55°C到65°C之间的8个温度点。
[0039]所用的PCR反应体系(参考梯度PCR仪的使用说明书)为25ul体系(10 X LA扩增缓冲液 2.5 μ 1，IOmmol.L-1dNTP 混合物 4 μ l,20mmol.L-1P1 弓丨物 I μ l,20mmol.L-1P2 弓丨物 1μ l,cDNA2y I, LA Taq DNA 聚合酶 0.25 μ I)，反应条件为 Lidl05°C;预变性 95°C 5min ；30 个循环(95°C 30s, 59°C 30s, 72°C lmin);最后 72°C IOmin0
[0040]反应结束后将约有653bp的PCR产物收集到一个EP管中并切胶回收，将回收的基因片段克隆到质粒载体中，然后挑取阳性菌进行PCR反应，产物送测序公司测序。
[0041]步骤3 =PCR产物的回收和纯化:
[0042]用TIANGEN公司纯化回收试剂盒Gel Extraction Mini Kit回收PCR产物，具体操作步骤(参考试剂盒说明书)为:
[0043]a.将60ul PCR产物于I %的琼脂糖凝胶中电泳。用干净的手术刀割下与预期片段大小一致的DNA的琼脂块，放入EP管称取重量；
[0044]b.向吸附柱中加入500 μ I平衡液BL，13400 Xg离心lmin，倒掉收集管中的废液，
将吸附柱重新放回收集管中；
[0045]c.按每0.1克胶块加入IOOul PN溶液(溶胶液)；于50°C水浴放置，其间不断温和地上下翻转EP管管，确保胶块充分溶解；
[0046]d.溶解后的凝胶溶液全部加入到有吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2分钟，13400Xg离心I分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；
[0047]e.向吸附柱加入600ul PW溶液(漂洗液)，13400 Xg离心I分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；
[0048]f.向吸附柱加入500ul Pff溶液(漂洗液)，13400 X g离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；13400Xg离心2分钟，尽量除去漂洗液；将吸附柱彻底晾干，以防止残留漂洗液影响下一步的试验；
[0049]g.将吸附柱置于另一个干净的EP管中，向吸附膜中间位置悬空加入50ul EB溶液(洗脱缓冲液)，室温放置2min，13400 X g离心I分钟后后收集DNA溶液；
[0050]h.将回收产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测，检测回收纯度和浓度。
[0051]步骤4:克隆
[0052]4.1目的片段与载体连接:将回收、检测后的目的片段与PMD-19T载体连接，操作连接体系(参考TaKaRa的pMD_19T载体试剂盒使用说明书)为:
[0053]
PMD-19T VectorI ul
纯化回后的PCR片段4 ul
Solution I5 ul
Total10 ul
[0054]以上操作在冰上进行，16°C在低温水浴锅中连接12h，在_20°C保存备用；
[0055]4.2大肠杆菌感受态细胞的制备(常规的氯化钙法)
[0056]a.将保存好的DH5 α菌种划线接种于LB固体培养基上，37°C培养16h_18h ；
[0057]b.LB培养基上挑选新鲜的DH5a单菌落，接种于IOmL LB液体培养基中，370C 200rpm，摇菌过夜培养；
[0058]c.吸取2mL DH5 α菌液接种于含50mL LB液体培养基的锥形瓶中，37°C 200rpm，摇菌培养至0D600 = 0.5 ；
[0059]d.将细菌培养物无菌操作下转移至50mL离心管中，冰浴10分钟；
[0060]e.4°C 4000rpm离心10分钟,弃上清,收集菌落沉淀；
[0061]f.加入IOmL冰预冷的0.1M/L CaCl2重悬细胞，用吸管吹散，冰浴30分钟；再次4°C离心10min，弃上清，收集菌落沉淀；
[0062]g.将管倒置I分钟，每加50mL菌液加2mL冰预冷的0.1M CaCl2重悬各管细胞，4°C在冰箱中放置过夜；
[0063]h.按200ul/份加入15%冰预冷甘油，混匀分装，_80°C冻存备用；
[0064]4.3连接产物的转化
[0065]a.将IOul的连接产物加入到IOOul制备好的感受态细胞中，混匀并冰浴30mi η
[0066]b.2°C加热34s，再在冰中放置I分钟；
[0067]c.加入890 μ I无抗生素的LB液体培养基，37°C，100r/min培养60min
[0068]d.吸取200 μ I液体LB培养基重悬菌液，用灭菌涂布器均匀布于已提前涂布了IPTG和X-gal的琼脂平板，37°C倒置培养过夜。
[0069]4.4阳性菌落的筛选:
[0070]随机挑选菌落接种于LB/Amp培养液中，培养至中等浓度后以菌液为模板进行菌液PCR。扩增产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定为所克隆基因后，将50ul菌液加入EP管中，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
[0071]步骤5:检验本发明方法的正确性；
[0072]基于NCBI的blast在线比对软件将测序结果验证序列的正确性和该方法的可靠性。结果表明该方法获得的牦牛eVEGF120基因完整编码区序列的核苷酸序列(SEQUENCELISTING)与已知普通牛的同源性为100%。表明该方法能达到获得牦牛eVEGF120基因的完整编码区序列的目的。
【权利要求】
1.一种克隆牦牛eVEGF120基因编码区全序列的方法，其特征在于包括下述步骤: 1)从牦牛肝组织中提取总RNA，将总RNA反转录成cDNA； 2)以步骤I)的cDNA作为模板，采用下述引物进行PCR: 上游引物 Pl:5 ‘-ATGAACTTTCTGCTCTCTTGGGTACA-3’ ； 下游引物 P2:5 ‘-TGGGTAGTTCTGTGTCAGTCTTTCC-3’ ； 3)回收和纯化上述PCR产物，获得目的基因片段； 4)将目的基因片段与PMD-19T载体连接加入到DH5α感受态细胞中进行转化培养，筛选其中的阳性菌落进行培养，以菌液为模板进行PCR即得eVEGF120基因片段全序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤I)采用牦牛的肝脏组织提取总RNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于将牦牛的肝脏组织于液氮环境下研磨成粉末，然后依次加入Trizol液、氯仿，室温静置后高速离心；取离心的上清液与异丙醇混匀后高速离心；取离心沉淀物用乙醇漂洗杂质后进行离心，离心的沉淀物变色后加入DEPC水用琼脂糖凝胶电泳检测，将合格的RNA反转录成cDNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)采用梯度PCR，温度的梯度范围在55。。到65°C之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)采用纯化回收试剂盒回收PCR产物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于还包括将步骤4)所得eVEGF120基因片段全序列与普通牛eVEGF120基因片段全序列进行同源性比对验证的步骤。
【文档编号】C12N15/10GK103898097SQ201410124048
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】梁春年, 吴晓云, 阎萍, 丁学智, 包鹏甲, 郭宪, 王宏博, 裴杰, 褚敏 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所