沼水蛙抗菌肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及两种天然抗菌肽及其在制药领域中的应用，属于生物医学领域。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽由于其广谱抗菌活性和特殊的抑菌机制使其具有重要的理论研究和药物 开发应用价值。两栖动物皮肤能够分泌大量的抗菌肽来抵御外来微生物的侵袭，自研究者 从非洲爪蟾皮肤分泌物中发现第一个两栖动物抗菌肽magainins开始，已经有上千种抗菌 肽从两栖动物皮肤分泌物中通过分离纯化或基因克隆方法得到，这些抗菌肽一般由10-50 个氨基酸构成。根据抗菌肽的氨基酸序列将其分成100多个不同的家族，这些不同家族的 抗菌肽在分子量大小、电荷、疏水性、结构和功能上都不相同。通过对这些抗菌肽的结构和 功能的研究，不仅得到了许多具有广谱高效的杀菌作用的多肽，而且还改进了许多天然抗 菌肽。
[0003] 不同来源的两栖动物抗菌肽在氨基酸组成和序列上存在显著差异，根据二级结构 特征可以将其分为a-螺旋抗菌肽，P -折叠抗菌肽，无规卷曲抗菌肽和扩展型抗菌肽。研 究者通过圆二色谱研究发现，许多抗菌肽，如来源于JaeKi1S的Magainin2,来源于 TPana 的 temporin-lRNa、temporin-lRNb 等在抗菌肽在模拟细胞膜环境下 会自发折叠成两亲性的a-螺旋结构。这些抗菌肽通过静电相互作用与细菌细胞膜上的磷 脂双层结合，在细胞膜环境下折叠成两亲性的a -螺旋结构，从而破坏细胞膜完整性，造成 细胞内容物溶出而导致细胞死亡。随着对抗菌肽结构与功能关系的深入研究，抗菌肽的医 学价值越发明显，被研究者称为"多肽抗生素"。目前开发抗菌活性强，毒副作用小，结构简 单的抗菌肽已成为一个紧迫的任务。
[0004] 沼水娃（办是中国南部地区常见两栖动物，其皮肤分泌物中含 有多种抗菌肽。有研究表明，蛙科动物至少需要20-30种抗菌肽才能形成较好的抗菌屏障， 而目前已报道的沼水娃抗菌肽有9个，分别属于brevinin、temporin和guentherin家族， 仍然有许多沼水蛙皮肤抗菌肽未被发现。沼水蛙皮肤抗菌肽的分离纯化和抗菌活性研究还 需要进一步的加强。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供两种制备简单，抑菌活性强的沼水蛙抗菌肽，并且可以将该抗 菌肽应用于抗菌类药物的研制与开发。
[0006] -种沼水蛙抗菌肽，所述抗菌肽A由29个氨基酸构成，序列为SEQ ID NO. 1 : FLQHIIGALSKIFLVSIDKVRCKVAGGCN，C端的两个半胱氨酸形成一对二硫键。
[0007] -种沼水蛙抗菌肽，所述抗菌肽B由18个氨基酸构成，序列为SEQ ID NO. 2 : FFPLIFGALSKILPKIFL，C 末端酰胺化。
[0008] 本发明所述抗菌肽包括与SEQ ID NO. 1或者SEQ ID NO. 2所述抗菌肽具有80%或 以上同源性的多肽，该多肽功能与SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所述抗菌肽相同或相似。
[0009] 本发明的另一个目的是提供一种多肽片段，包括序列为SEQ ID NO. 1或SEQID NO. 2的多肽或同源性多肽。该多肽片段与序列为SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2的抗菌肽功 能相同或相似。
[0010] 所述抗菌肽A具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有强抑制作 用，而抗菌肽B对革兰氏阳性菌效果突出。与其最小抑菌浓度相比，抗菌肽A和B的溶血性 均比较低，表明它们在抗菌药物开发和应用方面有重要价值。上述抗菌肽对细菌的抑制作 用见实施例3,溶血活性结果见实施例4。
[0011] 本发明所述抗菌肽在疏水环境中形成a _螺旋结构。利用圆二色谱（⑶）测定抗 菌肽在不同浓度三氟乙醇（2, 2, 2-Triflu〇r〇ethan〇l，TFE，模拟细胞膜疏水环境）中的二级 结构，结果表明抗菌肽A和B的a -螺旋结构含量随着TFE浓度提高而增加。该结构特征 对研究抗菌肽的抑菌机理有重要意义。
[0012] 本发明所述抗菌肽的螺旋轮状图分析可知，该抗菌肽的疏水面或者亲水面对应氨 基酸替换、缺失或修饰得到的抗菌肽A或B的类似物都可能与原抗菌肽具有相同或相似的 活性。
[0013] 鉴于上述抗菌肽的性质和功能，本领域普通技术人员可以以该抗菌肽为模板，通 过改变该抗菌肽的序列对沼水蛙抗菌肽定向改造或合成其衍生物以提高其抗菌活性，用于 药物研发和临床治疗。
【附图说明】
[0014] 图1:沼水蛙皮肤分泌物S印hedex G-50凝胶过滤色谱图。
[0015] 图2:凝胶过滤色谱分离组分峰1和峰2对大肠杆菌（A)和金黄色葡萄球菌（B)的 抑制作用。
[0016] 图3:凝胶色谱洗脱峰峰1的反相高效液相色谱图。
[0017] 图4:沼水蛙抗菌肽A和B在不同浓度TFE溶液中的圆二色谱。
[0018] 图5:沼水蛙抗菌肽A的螺旋轮状图（A)和抗菌肽B的螺旋轮状图（B)。
【具体实施方式】
[0019] 本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过 程，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施例。
[0020] 实施例1 本发明所述抗菌肽的分离纯化包括SephadexG-50凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱(RP-HPLC)两个步骤。
[0021] 提取沼水蛙皮肤分泌物：成年沼水蛙，去离子水洗净，市售9 V直流电池电击沼 水蛙耳后腺及背部腺体发达部分皮肤，待实验个体皮肤表面产生大量分泌物，用含〇. 05% (K/K)三氟乙酸的去离子水冲洗并收集分泌物，12 000 rpm离心15 min，取上清液冷冻干 燥，-80 °C低温保存。
[0022] S印hadex G-50凝胶过滤色谱：按上述方法获得沼水蛙皮肤分泌物冻干粉，溶解于 去离子水中，12 000 rpm离心15 min。取上清液用0.22 ym孔径微滤膜过滤后，上样到用 去离子水平衡的Sephadex G-50凝胶柱（1.6 cmX 100 cm)。用去离子水洗脱，流速0.3 mL/ min，于214 nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，得到两个洗脱峰峰1和峰2,如图 1所示。收集洗脱峰，冷冻干燥，进行抗菌活性测定。
[0023] 反向高效液相色谱：去离子水溶解上述峰1冻干粉，采用反相高效液相色谱进 一步分离。液相色谱系统为LC-20A，装配Gemini 5 y C18 (250 mmX 10 mm)反相柱 (Phenomenex，UK)，用含0.05%(F/K)的三氟乙酸的水和乙腈溶液构成的洗脱系统进行梯 度洗脱。洗脱梯度：〇~5 min，0~20%乙腈；5~40 min，20%~70%乙腈；洗脱流速I. 0 mL/min，检测波长214 nm，洗脱曲线如图3所示。收集所有洗脱峰，测定抗菌活性。
[0024] 收集具有较强抗菌活性的组分，冷冻干燥，，用自动氨基酸测序仪测序，得到抗菌 肽 A (SEQ ID:N0.1)和抗菌肽 B 的序列（SEQ ID:N0.2)。
[0025] 实施例2 琼脂涂布法检测凝胶过滤色谱分离组分的抑菌活性： 所用菌种大肠杆菌（Escherichia coli ATCC8099)和金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus CMCC26003)为本室保存。具体操作如下：选取单菌落接种于牛 肉膏蛋白胨液体培养基中，过夜振摇培养（37 °C，130 rpm)，将200 y L过夜培养菌液接种 于20 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，振摇培养4小时。培养好的菌悬液稀释1 000倍，取 100 y L加入平板培养基表面，涂布均匀。在涂布好菌液的平板培养基表面均匀地贴上直径 为5 m