m的圆形滤纸片，每个滤纸片上加10 yL待测样品。庆大霉素作为阳性对照，无菌水 做阴性对照。将加完样品的平板倒置于37 °C恒温培养箱中培养18~20 h，实验结果如图 2所示。添加庆大霉素(标记为" + "）和S印hadex G-50凝胶色谱分离组分Fl的样品(标记 为"1"）的滤纸片周围出现明显的抑菌圈，而加无菌水(标记为"一"）和S印hadex G-50凝 胶色谱分离组分F2的样品(标记为"2"）的滤纸片周围细菌正常生长，表明Sephadex G-50 凝胶色谱组分Fl对大肠杆菌（图2A)和金黄色葡萄球菌（图2B)都有明显的抑制作用，采用 高效液相色谱进一步分离。
[0026] 实施例3 利用液体生长抑制法检测本发明所述多肽对细菌的抑制活力： 本实施例所用抗菌肽由上海吉尔生化有限公司根据序列SEQ ID NO. 1和序列SEQ ID NO. 2合成，合成的抗菌肽保持原有的修饰，其中抗菌肽A的C端半胱氨酸形成二硫键，抗菌 肽B的C端酰胺化。两个合成肽纯度均不小于95%。采用96孔板法测定样品最小抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration，MIC)，具体操作如下： 菌种复苏，接种斜面37 °C培养过夜，挑单菌落接种于普通LB培养基中，37 °C培养过 夜，稀释菌液使菌浓度为IO4-IO5 CFU/mL，按每孔100 y L菌液接种于96孔板中，加入10 y L以一定比例稀释后的多肽，将96孔板置于37 °C过夜培养，用酶标仪检测630 nm波长 的吸光值，结果见表一。
[0027] 含有抗菌肽的细菌生长浓度（0D63。)与不加抗菌肽的细菌生长浓度的比值大于90% 时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度(定义为显著抑制细菌生长的最低浓度)。
[0028] 由检测结果可知，抗菌肽A和抗菌肽B对常见的细菌的最小抑菌浓度均达到微克 级，具有极强的抑菌活力。抗菌肽B对革兰氏阳性菌的杀灭作用尤为明显。
[0029] 表一：沼水蛙抗菌肽的最小抑菌浓度
注表示当抗菌肽浓度达到250 y g/mL时未发现对该细菌有抑制作用 实施例4 本实施例通过拔除小鼠眼球取血，测定溶血活性。
[0030] 取血后分离血红细胞：采集好的血液和抗凝剂充分混匀，3000 rpm离心3 min，去 除上清液。下层血红细胞用生理盐水重悬，再次离心，重复上述步骤，直至上清液不再呈红 色(处理4~5次)。最后用磷酸盐缓冲液（10mM，pH7. 4)将沉淀配制成5%(压缩体积）的血 红细胞溶液备用。
[0031] 测定样品溶血活性：用磷酸盐缓冲液将抗菌肽溶解，配制成浓度为500 yg/mL的 样品溶液，每个离心管加450 y L配制好的血红细胞溶液，加入50 y L样品溶液，置于37 °C恒温箱中反应30 min后，3 000 rpm离心3 min，取上清液于540 nm波长处测定吸光值。 以生理盐水为空白对照，1% ( F/K)的Triton X-100作为阳性对照，溶血率按照下面公式计
算。
[0032] 式中：A。阳性对照组的吸光值；A 1样品组的吸光值 经测定，沼水蛙抗菌肽A在125yg/mL时的溶血率仅为14%，溶血率较低。抗菌肽B在 浓度为15. 6yg/mL时的溶血率为11%，浓度为31. 3yg/mL时的溶血率达到24 %。与抗 菌肽A相比，抗菌肽B的溶血率较高，但由于其活性较强，与其最小抑菌浓度相比，其溶血性 相对较弱。上述结果表明抗菌肽A和B具有作为药物前体开发和利用的价值。
[0033] 实施例5 在室温下，用J-810圆二色谱仪测定抗菌肽A和B在不同浓度三氟乙醇（TFE)水溶液 (5%，10%，20%，30%，50%，100%冲的远紫外区的结构特征。样品池光径I mm，扫描速度为500 nm/min，扫描范围为190-260 nm，扫描的波长间隔为I nm，连续扫描三次取平均值，除去抗 菌肽以外的相同溶液作为基线扣除。
[0034] 经圆二色谱测定可知（图4)，在TFE浓度小于20%时，抗菌肽A的圆二色谱吸收弱， 仅在194 nm附近处出现一个负峰（图4A)，抗菌肽B在194 nm的负峰更为明显（图4B)，表 明此时溶液中的抗菌肽A和B主要是无规卷曲结构；当TFE浓度高于20%时，在194 nm波 长处出现明显的正峰，208nm和222 nm波长位置均出现负峰，是典型的a-螺旋结构特征 吸收。随着TFE浓度的提高，负峰吸收增强，表明当TFE溶液浓度大于20%时，抗菌肽A和 B都会从无规卷曲结构折叠成a-螺旋结构。上述实例表明沼水蛙抗菌肽A和B可能作用 于细胞膜。
[0035] 实施例6 为进一步研究沼水蛙抗菌肽的二级结构，将抗菌肽A序列（F1-R21)和抗菌肽B的全序 列绘制成a-螺旋轮状图，该图根据多肽的a-螺旋折叠规律绘制。灰色小球为疏水氨基 酸，白色小球为亲水氨基酸。
[0036] 如图5A所示，抗菌肽A的螺旋结构中，疏水氨基酸和亲水氨基酸都占据一定比例， 分别聚集在螺旋结构两侧，形成亲水面和疏水面，为两亲性的螺旋结构。由于抗菌肽A带+3 电荷，其可能通过静电作用吸附到带负电荷的细菌细胞膜表面，在细胞膜的疏水环境下，该 抗菌肽折叠成两亲性的a -螺旋结构，从而形成跨膜通道，破坏细胞膜，杀死细菌，发挥抗 菌作用。抗菌肽B的疏水氨基酸比例较高，未形成明显的疏水面和亲水面（图5B)。但是该 抗菌肽在模拟膜环境下同样会折叠成a-螺旋结构，且带有+2电荷，因而其作用位点也是 细胞膜，与抗菌肽A的作用机理相同。
[0037] 抗菌肽构效关系的研究有重要意义，对于人工设计新型抗菌肽分子起指导作用。 抗菌肽的特殊氨基酸、螺旋结构、正电荷和疏水性对抗菌肽的活性至关重要。根据抗菌肽的 构效关系，若将沼水蛙抗菌肽对应位置的氨基酸取代，可能会提高其抗菌活性或者降低其 溶血性，具有重要的研究意义。
[0038] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种沼水蛙抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽A氨基酸序列为SEQIDNO.I: FLQHIIGALSKIFLVSIDKVRCKVAGGCN，C端的两个半胱氨酸形成一对二硫键。2. -种如权利要求1所述的一种沼水蛙抗菌肽，其特征在于：所述序列与SEQID NO. 1具有80%及以上同源性的多肽，该多肽功能与SEQIDNO. 1相同或相似。3. -种如权利要求1或2所述的一种沼水蛙抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽序列的 前端、中端或者末端包含权利要求2所述抗菌肽，该多肽与权利要求2所述抗菌肽功能相同 或者相似。4. 一种如权利要求1或2所述的一种沼水蛙抗菌肽在抗菌药物开发上的应用。
【专利摘要】本发明涉及两种沼水蛙抗菌肽的序列、制备方法及其应用。本发明从沼水蛙皮肤分泌物中分离出两种抗菌肽，对其抗菌和溶血活性进行了检测，并对其在模拟膜环境下的二级结构进行了研究。得到2条抗菌肽：抗菌肽A，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所述；抗菌肽B，其序列如SEQ？ID？NO.2所述。本发明所述抗菌肽A对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都有抑制作用，抗菌肽B对枯草芽孢杆菌和大金黄色葡萄球菌杀灭效果很好。本发明所涉及的两种抗菌肽具有结构新颖、抗菌活力强等特点，在药物开发和应用方面具有重要价值。本发明对于抗菌肽抑菌机制的研究和抗菌肽的进一步改造和开发利用具有重要的意义。
【IPC分类】A61K38/17, C07K14/46, A61P31/04
【公开号】CN105175525
【申请号】
【发明人】洪晶, 汪少芸, 俞世宏
【申请人】福州大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年4月25日