细胞膜穿透肽hPP8及其用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学领域，具体讲，涉及一种细胞膜穿透肽及其用途。
【背景技术】
[0002]随着人类基因组计划的完成和蛋白质组学的兴起，人们发现越来越多的生物分子比如蛋白质、多肽、核酸等均有可能成为治疗药物。但是与传统药物不同的是，这些治疗分子在体内稳定性低，需要在胞内发挥功能的分子难以进入细胞，因而会限制其作为药物的推广应用。故开发能有效携带这些治疗性生物大分子进入靶细胞，且经济、安全的载体系统是亟需解决的问题。
[0003]近年来，非病毒药物运输载体以其安全性、低毒性、低免疫反应等优点被寄予厚望。迄今比较常用的生物大分子细胞内导入方式有电穿孔、脂质体转染和有机高分子纳米颗粒等。但可能存在着安全隐患如对细胞的毒性作用、胞内释放困难、难于组装及操作、难于应用到个体等这样或那样的缺点。因此寻找新型的、理想的非病毒药物输送系统引起了学者们的广泛兴趣(图1)。
[0004]在过去的20多年间，将核酸、多肽、蛋白等具有治疗作用的生物活性大分子跨膜转运至细胞内技术的基础研究取得了突破性进展。国内外学者在对一些病毒感染特性的研究中相继发现了一类蛋白结构域，如=HIV-1Tat (48?60)、VP22 (267?300)以及果蝇蛋白ANTP(43?58)等具有介导异源蛋白、寡聚核酸、金属螯合物等生物活性大分子直接跨过细胞膜进入胞浆和核内的功能，这一类富含阳离子、具有穿膜功能的短肽被称之为细胞膜穿透肽(cell-penetrating peptides，CPP)、穿膜肽或蛋白车专导域(protein transduct1n
domains，PTDs)。1988年Green和Frankel等首次发现TAT--人免疫缺陷病毒(HIV)
的转录调节蛋白可以穿透细胞膜/核膜进入细胞浆/细胞核，随后的研究发现，该蛋白第48-60位氨基酸残基(YGRKKRRQRRR)形成的肽段即可完全发挥其穿膜功能。以后又相继发现了多个源自病毒或其它生物的CPPjn I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virustype 1，HSV-1)蛋白的 VP22、果绳同源触角蛋白(drosophila hemeoprotein antennapediatranscript1n protein, ANTP)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)的前 S 抗原等。依据其来源不同可将已经发现的CPP大致分为两类:一类为如上面提及的TAT、VP22、ANTP和前S抗原来源于病毒的短肽等；另一类为根据天然CPP的特点人工合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-U MAP、transportan和各种基于不同信号序列合成的肽段等。CPP能在体外或体内作为载药多肽，介导一系列生物活性分子如DNA、SiRNA、多肽、蛋白质甚至纳米颗粒等进入细胞，发挥各自的生物学效应。这些CPP因其本身具有低毒、副作用小、不干扰所携带大分子生物活性等特点，被广泛用于体外或/和体内向细胞内运送生物活性分子，尤其是在抗肿瘤治疗的应用研究方面更是引人注目。CPP研究在基础生物学和应用研究上都具有极大意义，作为一种有效的胞内运载工具，有着广泛的应用前景(图2)。
[0005]然而来源于病毒或其他种属生物蛋白结构域的CPP，在临床应用上可能仍然存在一定的安全隐患，比如可能的细胞毒性和免疫原性问题。人们对TAT作为CPP进行了大量研究，腹腔注射Tat-β -半乳糖苷酶，能进入小鼠各种脏器组织，甚至可以透过血脑屏障进入脑组织。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全忧患，一直未能用于临床研究。另有报道称，应用TAT携带药物的上呼吸道喷雾引发了严重的肺部病理反应。可见，针对不同治疗需要，开发更为安全的、新型穿膜肽一一人源性穿膜肽(hCPP)是非常必要的。
[0006]2002年，Beck-Sickinger AG小组开创性地发现了第一个人源性穿膜肽--
来源于人降血钙素(hCT)的第9-32的残基。随后相继报道的人源性穿膜肽还有来自于hCLOCK蛋白(一种与生物节律调节有关的蛋白，2004年),Hph-1 ( 一种人源转录因子，2006年)、Bag-1蛋白(一种可与Bcl-2相互作用的激活糖皮质激素受体的蛋白，2006年)、P14ARF蛋白(一种人抑癌基因蛋白，2008年)、人乳铁蛋白(2009年)、人Cytc77-101及Cytc86-101 (2010年)和TCTP蛋白(来源于人翻译控制肿瘤蛋白氨基末端10个氨基酸残基，2011年)的CPP等。与其它物种蛋白来源的CPP相比，人源性CPP引起人体的免疫反应的可能性小，潜在的不安全因素相对少，作为人类疾病治疗的药物载体，具有绝对优势，有着更广阔的开发、应用前景。
[0007]Futaki S等发现穿膜肽的穿膜能力与多肽序列中精氨酸残基的数量和位置有很大的相关性。我们在从事细胞膜穿透肽研究中，通过对蛋白数据库中一级结构的检索、分析发现人源性的PHD转录因子蛋白(PHD transcript1n factor)的一段长为16个氨基酸的短肽的一级结构富含属于碱性氨基酸的精氨酸和赖氨酸，分布着很强的正电荷，这与大多数已知CPP的结构特点很相似，继而分析其二级结构，发现它可形成经典的α -螺旋构象。推测这段短肽可能是具有自主穿膜功能的新型的人源性穿膜肽。我们继而合成了这段短肽并命名为hPP8，观察了其对培养细胞的穿膜效率，细胞毒性及穿膜机制，同时还观察、评估了其向细胞内递送绿色荧光蛋白(GFP)的效果，为hPP8作为一种新型人源性药物运输载体的开发提供了科学依据。
【发明内容】
[0008]在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0009]如本文中所使用的，术语“生物分子”是指，存在于生物体中的分子的总称，包括但不限于，核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和小分子化合物以及其任意的复合物。
[0010]术语“寡肽”通常是指2-10个氨基酸组成的肽。术语“多肽”通常是指11个以上的氨基酸组成的肽。术语“蛋白质”通常是指含有51个以上的氨基酸残基的多肽链。
[0011]本发明的目的是提供一种新的细胞膜穿透肽hPP8，本发明提供的细胞膜穿透肽hPP8是源于人类PHD转录因子蛋白的一段多肽序列，所述多肽序列的长度在16个氨基酸以内，其具有细胞膜穿透能力。所述细胞膜来源的细胞优选真核细胞，更优选动物细胞，最优选哺乳动物细胞，例如肿瘤细胞。
[0012]本发明所述穿膜肽的多肽序列包含SEQ ID NO:1所示的序列，即Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Leu-Val-Met-His-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg (SEQ ID NO:1)(精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-赖氨酸-精氨酸-丝氨酸-亮氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸)，优选地，所述细胞膜穿透肽hPP8的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。本发明所述的细胞膜穿透肽hPP8，其为合成的或重组的。
[0013]本发明还提供了合成的或重组的融合蛋白，该融合蛋白由细胞膜穿透肽hPP8和目的蛋白例如可用作药物的蛋白或用做标记的蛋白，其中，所述细胞膜穿透肽hPP8直接或者通过接头与所述目的蛋白连接，优选地，所述可用作药物的蛋白如选自抗肿瘤的蛋白，所述用做标记的蛋白如选自绿色荧光蛋白GFP。
[0014]本发明还提供了编码所述细胞膜穿透肽hPP8或者编码所述融合蛋白的核酸。
[0015]含有编码所述细胞膜穿透肽hPP8或编码所述融合蛋白的核酸的载体，例如真核表达载体或原核表达载体。含有所述核酸或所述载体的宿主细胞或重组病毒，所述宿主细胞包括转基因细胞系或重组菌，例如重组细菌或重组真菌。本发明还提供了制备所述细胞膜穿透肽hPP8或所述融合蛋白的方法，其包括:培养所述宿主细胞或重组病毒，和，从培养物中回收所述的细胞膜穿透肽hPP8或者融合蛋白。
[0016]我们首次发现这一肽段具有穿透细胞膜的功能，并可携带蛋白质等生物分子跨膜进入体外多种细胞(包括贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、原代培养细胞及传代培养细胞等)内，是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体。因此，本发明还提供了所述细胞膜穿透肽hPP8用作药物运输载体的用途或在制备药物运输载体中的应用，特别是用作细胞内药物运输载体的应用，其中所述药物运输载体携带生物分子跨膜进入细胞，这些细胞包括贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、原代培养细胞及传代培养细胞等。其中，所述生物分子包括核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和小分子化合物以及其任意的复合物。
[0017]本发明还提供了包含药物运输载体的复合物，其特征在于所述药物运输载体为所述的细胞膜穿透肽hPP8，优选地，所述复合物还包含可用作药物的生物分子，优选地，所述药物运输载体直接或者通过接头与生物分子连接，优选地，所述复合物包含药物运输载体与可用作药物的蛋白，优选地，所述药物运输载体直接或者通过接头与可用作药物的蛋白连接。本发明还提供了一种制备所述复合物的方法，包括将所述的细胞膜穿透肽hPP8与生物分子直接连接或通过接头连接，得到所述复合物。其中所述生物分子可来自核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、纳米颗粒和小分子化合物以及其任意的复合物；所述复合物适合用于生产药物、保健品、美容或护肤品、转染试剂或诊断试剂。
[0018]本发明还提供了包含药物运输载体的细胞内药物，其特征在于所述药物运输载体为所述的细胞膜穿透肽hPP8。本发明还提供了一种制备细胞内药物的方法，是将所述的细胞膜穿透肽hPP8与可用作药物的生物分子连接，得到所述细胞内药物。所述生物分子为生物活性分子，如DNA、SiRNA、多肽、蛋白质或纳米颗粒，特别是抗肿瘤活性分子；所述细胞内药物可用于离体细胞，也可以用于体内细胞。
[0019]本发明的优点在于，与其它生物蛋白来源的CPP相比，对细胞基本无毒副作用，潜在的不安全因素相对较少。因此，作为临床应用的药物分子载体有着更为广阔的应用前景。
【附图说明】
[0020]图1是新型治疗分子胞内递送策略示意图。
[0021]图2是细胞膜穿透肽(CPP)及其可携带入胞的生物药物的工作原理示意图。
[0022]图3是本发明的新型人源性细胞膜穿透肽hPP8的二级轮状结构示意图。
[0023]图4是本发明的新型人源性细胞膜穿透肽hPP