一种鲤鱼重组抑菌蛋白及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鲤鱼重组抑菌蛋白及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 我国水域辽阔，水产资源十分丰富，尤其是鱼类资源非常丰富，其中蕴含了非常丰 富的遗传资源，具有极高的生物学价值。但长期以来我国的渔业养殖和鱼类加工均处在较 低层次的发展阶段，产生和丢弃了诸如鱼卵、肝胰、脾脏、垂体、血清以及皮等大量水产品加 工废弃副产物，因此鱼类资源的加工利用率低，经济效益较差。
[0003] 申请人多年来对鱼类生物资源的多方面应用进行了深入研究，发现鲤鱼中的部分 蛋白产物具有显著的抑菌作用，能够抑制多种微生物菌的生长、繁殖和存活，如果将其实现 批量制备，将有效提升渔业副产物的经济学价值，并为鱼类副产物的科学合理利用提供必 要的研究基础，在环境、资源、科学和经济等多方面具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 申请人在多年的科研中，发现了鲤鱼体内的抑菌蛋白，并经过深入研究实现了抑 菌蛋白的重组和制备，提高了鱼类资源的加工利用率，避免副产物随意抛弃而对自然环境 所产生的压力，提升了鱼类加工的综合效益。
[0005] 具体地说，本发明是通过如下技术方案实现的：
[0006] 首先，本发明公开了一种鲤鱼重组抑菌蛋白，具有序列表SEQIDNO: 1所示的氨基 酸序列，并由序列表SEQIDN0:2所示的碱基序列编码。
[0007] 其次，本发明公开了上述抑菌蛋白的重组制备方法，具体包括如下步骤：
[0008] 1)以上游引物Fl:5'-TAGGATCCACTGGGATTCCTGGAGGCCTTG-3'，下游引物Rl:5'_GC CCTCGAGCATGCAGGTGTTTTCAG-3?,通过PCR扩增序列表SEQIDNO: 2所示的碱基序列；
[0009] 2) PCR扩增基因片段，连接到pMD19-T载体上，转入JM109感受态细胞，提取阳性质 粒；
[0010] 3)用BamHI、XhoI双酶切阳性质粒和PET-30制备载体，连接所得制备载体转入 BL21大肠杆菌并在诱导剂IPTG作用下制备得到可溶形式的重组蛋白。
[0011] 在上述方法中，编码抑菌蛋白的碱基序列既可以从鲤鱼组织中提取总RNA经 RT-PCR处理获得，也可以通过人工合成的方式获得具有序列表SEQIDNO: 2所示的碱基序 列的基因片段。
[0012] 在上述方法中，本领域技术人员容易理解在获得重组蛋白后为了提高抑菌效果 对其进行纯化，纯化工艺采用生物学上的常用方法，例如目的蛋白经离心收集、用Buffer 八（含0.4-0.5111〇1/1恥(：1、0.5-1111〇1/1尿素、5%甘油、50臟〇1/11^18 - 11(：1，口117-9)透析、 浓缩、亲和层析进行纯化。
[0013] 最后，本发明还公开了上述蛋白在抑制微生物菌中的应用。此处所称的微生物菌 泛指常见的细菌、真菌等微生物，申请人经过研究证实，本发明的抑菌蛋白对荧光假单胞 菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌尤其具有理想的抑制效果，因此本发明的应用优选适用于上述 三种菌。
[0014] 本发明的技术方案，成功获得了能够高效抑制微生物菌株的抑菌蛋白，提高了渔 业和鱼类加工的经济价值和综合利用率。
【具体实施方式】
[0015] 为了充分说明本发明的技术方案，申请人提供了若干具体实现。如下所提供的实 施例仅为示意性的，并不对本发明的具体实施方法构成特别限定。
[0016] 实施例1
[0017] 从鲤鱼组织中提取总RNA，通过RT-PCR后得单链cDNA，以5' -TAGGATCCACTGGGATT CCTGGAGGCCTTG-3'，为上游引物，再以 5' -GCCCTCGAGCATGCAGGTGTTTTCAG-3' 为下游引物, 经PCR扩增得到基因片段。其中PCR反应条件设定为94°C预变性5min ;94°C 30s，58°C 30s， 72°C延伸lmin，35个循环；72°C最后延伸5min。
[0018] 扩增所得基因片段连接到pMD19-T载体上，转入JM109感受态细胞中，并进行蓝白 筛选，挑取阳性克隆，菌液活化后进行PCR检测。
[0019] 提取重组质粒，用BamH I、XhoI双酶切，经1. 2%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的 片段，与BamH I、XhoI双酶切的PET-30制备载体在T4作用下连接，转入BL21大肠杆菌。 并于诱导剂lmm〇l/LIPTG，30-35°C，2-3h的诱导条件下，制备可溶形式的重组蛋白。
[0020] 制备菌体沉淀经超声破碎后，离心分离上清得到的目的蛋白，用BufferA(含 0? 4-0. 5mol/LNaCl、0. 5-lmol/L尿素、5%甘油、50mmol/LTris-HCl，pH7-9)进行透析并浓 缩后，亲和层析纯化目的蛋白，在SDS-PAGE上呈现约14kD的单一条带，显示本发明成功实 现了目的蛋白的制备。
[0021] 通过滤纸片扩散法鉴定目的蛋白对荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌的抑 菌效果，重组抑菌蛋白加量范围为0. 21-0. 42mg/片。实验结果显示，荧光假单胞菌抑菌圈 直径范围为8-16mm ;铜绿假单胞菌抑菌圈直径范围为8-35mm ;大肠杆菌抑菌圈直径范围为 8-25mm〇
[0022] 实施例2
[0023] 人工合成具有序列表SEQ ID NO:2所示的碱基序列，以5?-TAGGATCCACTGGGATTCC TGGAGGCCTTG-3'，为上游引物，以 5? -GCCCTCGAGCATGCAGGTGTTTTCAG-3'为下游引物，通过 PCR扩增基因片段。PCR参数设定为：94°C预变性5min ;94°C 30s，53°C 30s，72°C延伸lmin， 33个循环；72°C最后延伸5min，得基因片段。
[0024] 所得扩增产物连接到PMD19-T载体上，转入JM109感受态细胞中，挑取阳性克隆， 提取重组质粒。
[0025] 用BamH I、XhoI双酶切重组质粒和PET-30制备载体并连接，转入BL21大肠杆菌， 并于诱导剂〇. 5mmol/L的IPTG，25-30°C，2-3h的诱导条件下，制备得到可溶形式的重组蛋 白。
[0026] 制备菌体沉淀经超声破碎后，离心分离上清得到的目的蛋白，经BufferA(含 0.4-0.5mol/LNaCl、0.5-lmol/L尿素、5%甘油、50mmol/LTris-HCl，pH7-9)进行透析，亲 和层析纯化目的蛋白，目的蛋白经SDS-PAGE检测为约14kD的单一条带。
[0027] 通过滤纸片扩散法鉴定目的蛋白对荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌的抑 菌效果，重组抑菌蛋白加量范围为〇. 21-0. 42mg/片。荧光假单胞菌抑菌圈直径范围为 8-16mm;铜绿假单胞菌抑菌圈直径范围为8-35mm;大肠杆菌抑菌圈直径范围为8-25mm。
【主权项】
1. 一种鲤鱼重组抑菌蛋白，其特征在于具有序列表SEQIDN0:1所示的氨基酸序列，并 由序列表SEQIDN0:2所示的碱基序列编码。2. 权利要求1的鲤鱼重组抑菌蛋白制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)以上游引 物Fl:5'-TAGGATCCACTGGGATTCCTGGAGGCCTTG-3'，下游引物Rl:5'-GCCCTCGAGCATGCAGGTGT TTTCAG-3'，通过PCR扩增序列表SEQIDNO: 2所示的碱基序列；2)PCR扩增基因片段，连接 至IJPMD19-T载体上，转入JM109感受态细胞，提取阳性质粒；3)用BamHI、XhoI双酶切阳 性质粒和PET-30制备载体，连接所得制备载体转入BL21大肠杆菌并在诱导剂IPTG作用下 制备得到可溶形式的重组蛋白。3. 权利要求1的鲤鱼重组抑菌蛋白在抑制微生物菌中的应用。4. 根据权利要求3的应用，其特征在于所述微生物菌包括荧光假单胞菌、铜绿假单胞 菌、大肠杆菌。
【专利摘要】本发明公开了一种鲤鱼重组抑菌蛋白及其制备方法，所述鲤鱼重组抑菌蛋白具有序列表SEQ？ID？NO:1所示的氨基酸序列，并由序列表SEQ？ID？NO:2所示的碱基序列编码。本发明所得抑菌蛋白能够有效抑制细菌、真菌等微生物的生长、繁殖和存活，拓宽了鱼类资源的加工利用。
【IPC分类】A61K38/17, C07K14/46, A61P31/04, C12N15/70, C12N1/21
【公开号】CN105175524
【申请号】
【发明人】李树红, 杨娟, 胡强, 钟海霞, 李冉, 李美良, 柯勤勤, 陈志光, 蒋然然
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月14日